DE2537127C3 - Kontrollserum für die klinischchemische Analyse mit einem bestimmten Gehalt an alkalischer Phosphatase - Google Patents

Description

zifische Eigenschaft von Mir¹'- und Cd"'-Ionen und konnte bei alitieren zweiwertigen oder anderswertigen Mctallioncn nicht gefunden werden.

Kontrollscrcn enthalten in der Regel mehrere Enzyme, beispielsweise 10 bis 20 Enzyme, bei denen siimtlich die Aktivität konstant gehalten werden muß. Normalerweise ist diese Konstanthaltung erforderlich, um einen Aktivitätsvcrlust zu verhindern. Nur die AP macht hier eine Ausnahme. Ein wesentlicher Vorteil von erfindungsgemäß hinsichtlich der Aktivitätskonstanz von AP stabilisiertem Kontrollserum besteht darin, daß hierdurch die Aktivität der übrigen, im Serum vorliegenden Enzyme nicht beeinflußt wird, die Stabilisicrungswirkung sich daher selektiv auf die AP erstreckt. is

Ein erfindungsgemäßes Konirollscrum enthüll vorzugsweise 0,1 bis 5 mgCrcatinin,(),l bis 5 mg Bilirubin, 50 bis 300 mg Glucose, 0,2 bis 5 mg Mn" oder Cd¹', alkalische Phosphalusc und gegebenenfalls weitere Enzyme in 100 ml natürlichem Serum oder serumartigen Zusammensetzungen in lyophilisicrler oder gelöster Form.

Besonders bevorzugt ist ein Konirollscrum, bestehend aus 0,5 bis 1,5 mg Creatinin, 0,5 bis 1,5 mg Bilirubin, 100 bis 200 mg Glukose. 1 bis 3 mg Mangan-(II)-chloridhydrat, Essigsäure zur Einstellung eines pH zwischen 6,0 und 7,0 alkalischer Phosphatase und weiteren Enzymen in 100 ml Serum.

Weitcrc Enzyme, die im Konirollscrum in bestimmter Menge enthalten sein können, sind z. B. Glutumat- y> Oxalacetat-Transaminase (CiOT), Glutamat-Pyruvat-Tninsaminasc (GPT), Lactat-Dchydrogcnasc (LDII), tf-Ilydroxybutyrat-Dchydrogcnase (a-llBDII), GIucosc-6-Phosphatdehydrogcnasc (G-6-i'DII), Crcatinphosphokinasc (CPK), Glutamat-Dchydrogenasc (GI-DH), Lcucin-Aminopcptidasc (LAP), a-Amylase, V-Glutamyltranspcptidasc (y-GT), Aldolase (ALD) und saure Phosphatase (SP).

Bei dem im Anspruch 1 angegebenen Bereich für die Zusätze an Mn'' bzw. Cd³' wird die beste Konstanz der AP-Aktivität erhalten. Bei Erhöhung über diese Grenzwerte hinaus besteht die Gefahr, dall die Aktivität abnimmt, bei einer Unlcrschrcitung der unteren Circnzc läßt sich eine für alle Rille ausreichende Konstanz der Aktivität häufig nicht mehr erzielen und man stellt eine allmähliche Zunahme der Aktivität fest. Diese Aktivilät.szunahmc liegt aber immer noch deutlich niedriger als ohne diese Zusätze.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erllndung.

Beispiel I

Ein handelsübliches lyophilisicrtes Kontrollscrum aus ursprünglich 3 ml Scrum mit einem bestimmten (ichalt an alkalischer Phosphatase wird mit 3 ml einer 0,1 mM MnClj-Lösung rekonstituiert. Die Aktivität der AP unmittelbar nach Rekonstitution und in bestimmten Zeitabständen danach wurde bestimmt. Die rekonstruierte Lösung wurde dabei konstant bei 25 Grad C gehalten. Die prozentuale Änderung zeigt nachstehende Tabelle:

0,05 mM MnCVLösung in Wasser. Die prozentuale Aktivitätsänderung wurde wiederum wie in Beispiel 1 bestimmt. Die erhaltenen Werte zeigt nachstehende Tabelle:

(Sld.)

2	4	6	24	3	48
+ 5	+ 6	+ 9	+ 19	+ 24
			Beispiel

3 ml llumanserum, welchem die gewünschten Enzymmengen zugesetzt waren, wurden mit soviel MnCIi versetzt, daß die Endkonzentration an Mn 0,1 mM betrug. Dann wurde das Serum lyophilisiert.

Das lyophilisierte Serum wurde mit 3 ml bidest. Wasser rekonstituiert. Die Aktivitätsänderung der AP wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die erhaltenen prozentualen Werte zeigt nachstehende Tabelle:

2 4 6 24 48 (Std.)

+ 2 -I ±0 ±0 +14 (%)

Beispiel 4

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch erfolgte die Rekons'.itution mit 3 ml 0.05 mM wäßriger CdCU-Lösung. Anschließend erfolgte die Bestimmung der prozentualen Aktivitätsänderung nach Lagerung bei +25 Grad C in der oben beschriebenen Weise. Nachstehende Tabelle zeigt die erhaltenen Ergebnisse:

+ 2

4	6	24	5	48
±0	+	I +1	+ 6
		Beispiel

(Std.

Es wurde wie in Beispiel 4 beschrieber, vorgegangen, die Rekonstitu'iion erfolgte jedoch mit 3 ml 0,1 mM wäßriger CdCli-Lösung. Die erhaltenen Ergebnisse zeigt nachstehende Tabelle:

4	6	24	6	48	(Sdt.)
+ 1	+ 1	I -4	+ 9	(%)
		Beispiel

Das Verfahren von Beispiel I wurde wiederholt, jcdoch erfolgte die Rekonstitution des Lyophilisats mit 3 ml bidest. Wasser. Die Aktivitätsänderung nach Lagerung der rekonstituierten Probe bei +25 Grad C zeigt nachstehende Tabelle:

48

(SId.)

2
+ 17

4
+ 21

+ 27

+ 45

48
+ 66

(Std.)

-5

- 3 - 3 +-7

Beispiel ?.

Es wurde wie in Beispiel I beschrieben vorgegangen, die Rekonstitution erfolgte jedoch mit 3 ml einer

Beispiel 7

Aktivitiitskonstantes Kontrollserum

100 ml llumanserum wurden mit einem Enzymkonzentrat versetzt, welches die Enzyme AP, GOT, GPT,

CK, LDH, (r-HBDH, GI-DH, LAP, y-GT, saure Phosphatase, Amylase, Aldolase und G-6-PDH enthielt. Weiter wurden zugesetzt: 1 mg Creatinin, I mg Bilirubin, Glukose ad 150 mg, 2 mg MnCI₃-4 H₂O, Essigsäure auf pH 6,5.

Die erhaltene Lösung wurde klar nitriert, in Portionen von 3 ml in Fläschchen abgefüllt und lyophilisiert. Die lyophilisierten Proben wurden bei +4 Grad C gelagert.

Bei Rekonstitution des Kontrollserums mit 3 ml bidest. Wasser und Lagerung der rekonstituierten Lösung bei 25 Grad C ergibt sich innerhalb von 24 Stunden eine Aktivitätszunahme der AP von weniger als 1%.

Beispiel 8

Alkalische Phosphatase wurde in enlionisiertem Wasser gelöst. Die Aktivität der AP wurde .sofort nach Auflösung und in bestimmten Zeitabständen danach bestimmt. Dabei wurde die Temperatur bei 25 C konstant gehalten.

In weiteren Versuchen unter den o. a. Bedingungen wurde der Lösung MnCI₂ bis zu einer Konzentration von 0,1 mMol/l und 0,02 mMol/l zugesetzt Die prozentuale Änderung der AP-Aklivilät für die oben beschriebenen Versuche ist in nachstehender Tabelle zusammengefaßt:

MnCI2	Stunden	4	6	24	48
Zusatz	2	-4	-6	-8	-IO
_	+ 3	±0	+	±0	-I
0,1 mMol/l	-I	-1	-3		-5
0.02 mMol/l	+ 1

Die obigen Versuche mit AP-Lösungen mit und ohne MnCI₂-Zusatz wurden wiederholt, wobei jedoch anstelle von entionisiertem Wasser physiologische Kochsalzlösung (0,9% NaCI) verwendet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse entsprachen den oben angegebenen.

Claims (7)

1. 2δ 37 127 I

   1 2 I

   Insbesondere die alkalische Phosphatasc (AP; ■

   Patentansprüche: EC 3.1.3.1) zeigt in wäßrigen Lösungen, insbesondere

   in Serum, einen sehr starken Anstieg ihrer Aktivität.

   l.Konlrollserumfürdie klinisch-chemische Ana- Über diese erstaunliche und in einem Kontrollscrum lysc mit einem bestimmten Gehalt an alkalischer 5 äußerst unerwünschte Eigenschaft wird z. B. in Clin. Phosphatase neben den üMichen Bestandteilen von Chcm. 18, 366-373 (1972) und Ärztl. Lab. 8, 272-279 Humanserum, tienschem Serum oder sonstigen (1972) berichtet. Der rasche Anstieg der Aktivität, serumarligen Zusammensetzungen und gegebenen- der mehr als 100% innerhalb weniger Stunden befalls weiteren in bestimmter Menge vorliegenden tragen kann, zwingt dazu, nur ganz frisch rekonslitu-Enzymen und standardisierten Substraten in lyo- io iertcs Kontrollscrum einzusetzen.
   phiIisicrlcrodergelösterForm,gekennzcichnct Eis ist bekannt, diese Zunahme der Aktivität durch durch einen Gehalt von 0,05 bis 0,5 mMol/l Mn²' mehrstündiges Erhitzen des rekonstituierten Serums oder/und 0,05 bis 0,1 mMol/l Cd²',bezogen aur die (6 Stunden bei 37 Grad C) auszuschalten. Nach Abgelöste Form. lauf der Erhitzungsperiode ergibt sich eine annehm-
2. 2. KonlroHserum nach Anspruch 1, gekenn/.eich- >-, bare Aktivitätskonstan/ der AP. Dieses Verfahren hai net durch einen Gehalt von 0,1 bis 5 mg Crcatinin, jedoch schwerwiegende Nachteile. So wird durch den 0,1 bis 5 mg Bilirubin, 50 bis 300 mg Glukose, Erhilzungsschritl in der Regel die Aktivität weiterer 0,2 bis 5 mg Mn-" oder Cd²', alkalischer Phos- im Konlrollserum enthaltener Enzyme wesentlich verphatasc und gegebenenfalls weiteren Enzymen und ringcrt oder zerstört, so daß es für die üblichen Konslandardisicrtcn Substanzen in 100 ml Serum oder 20 trollseren, die stets mehrere Enzyme enthalten, imserumähnlichcn Zubereitungen in lyophilisierter brauchbar ist. Außerdem ist ein mehrstündiges Erhit- oder gelöster Form. zen bei exakt einzuhaltender Temperatur eine äußerst
3. 3. Verfahren /.ur Konstanthaltung der Aktivität umständliche Prozedur, welche in der Routineanalyse von alkalischer Phosphatasc in wäßriger Lösung, kaum akzeptabel ist.

   insbesondere in Serum und scrumartigen Zusam- 25 Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde,

   mcnsctzungen, dadurch gekennzeichnet, daß Mn² '- ein Kontrollserum zu schallen, das nach dem Re-

   oder/und Cd²'-Ionen zugesetzt werden. konstituieren über einen längeren Zeilraum hinweg
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- Aktivitälswertc für die AP liefern, die innerhalb der zeichnet, daß Mn²' auf eine Endkonzentration von Toleranzgrenzen liegen.

   0,05 bis 0,5 mMol/l zugesetzt wird. jo Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch
5. 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- ein Kontrollserum der eingangs genannten Art, welzeichncl, daß Cd²¹ auf eine Endkonzentralion von dies gekennzeichnet ist durch einen Gehalt von 0,05 0.05 bis 0,1 mMol/l zugesetzt wird. bis 0,5 mMol/l Mn" oder/und 0,05 bis o,l mMol/l
6. 6. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch ge- Cd²¹, bezogen auf die gelöste Form,
   kennzeichnet, dali Mn²'oder/und Cd²'dem Serum 15 Mn" und Cd" werden in Form ihrer gut wasservor der Lyophilisicrung zugesetzt wird. löslichen Salze eingesetzt, deren Anioncn keinen stö-
7. 7. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch ge- rcnden Einfluß auf andere Bestandteile des Konlrollkennzeichnet, daß Mn²' oder/und Cd²¹ dem /ur scrums ausüben. Als Anioncn werden daher vor/.ugs-Rekonstitution von lyophilisicrtcni Serum verwcn- weise solche verwendet, die ohnedies in natürlichem dclen Wasser zugesetzt wird. 40 Serum bereits vorhanden sind. Hierzu gehören neben

   den Anionen der weitverbreiteten Mineralsäuren, wie

   Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Borsäure u.dgl., auch die Anioncn organischer Säuren, wie

   Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure u.dgl. Dasver-4_s wendete Anion ist jedoch im Rahmen der Erfindung

   ohne Bedeutung, soweit es nur die obengenannte Be-Die Erfindung betrifft ein Kontrollscrum für die dingung erfüllt.

   klinisch-chemische Analyse mit den im Oberbegriff Die Erscheinung der unerwünschten Aktivitätsz.u-

   des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmalen, sowie nähme der AP tritt auf, gleichgültig ob das Serum in ein Verfahren zur Konstanthaltung der Aktivität von _so aufgetautem oder gefrorenem Zustand vorliegt. Bei in alkalischer Phosphatasc in wäßriger Lösung, insbe- lyophilisierter Form vorliegendem Serum tritt die sondere in rekonstituiertem Serum. Aklivitälscrhöhung auf, sobald das Lyophilisut mit

   Die Bestimmung der alkalischen Phosphatasc spielt Wasser wieder rekonstituiert wird. Das crfindungsgein der klinisch-chemischen Analyse eine wichtige mäße Kontrollserum kann daher sowohl in lyophili-RoIIe. Zur Kontrolle derartiger Analysen ist es crfor- ^ sicrter als auch in gelöster Form vorliegen,
   derlich, die Richtigkeit der Analyse ständig anhand Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren

   von KoiUrollprobcn mit bestimmtem bekannten Cic- zur Konstanthaltung der Aktivität von alkalischer halt an alkalischer Phosphatasc zu kontrollieren. Der- Phosphatase in wäßriger Lösung mit den im Patentartige Konlrollscrcn, hei alkalischer Phosphatasc vor- anspruch 3 angegebenen Merkmalen. Lyophilisiertcs wiegend llumanscren, müssen geeignet sein, für eine 60 Serum kann also entweder den erforderlichen Gehalt Vielzahl von Komponenten zur Überprüfung der an erfindungsgemäßem Stabilisatorzusatz bereits entRichtigkeit der Analysencrgcbnissc sogenannte Soll- halten oder es wird statt dessen zur Rekonstitulion ein Werte, die in der Kontrollscrumprobc in einem ToIc- wäßriges Lösungsmittel verwendet, in dem das Stabiliranzbercich wiedergefunden werden müssen, zu lic- sicrungsmittel enthalten ist. Die Rekonstitulion erfolgt lern. Dieses Konzept setzt voraus, daß die Kompo- (>$ dabei üblicherweise mit Wasser, insbesondere entioninenlen im gebrauchsfertigen Kontrollserum stabil sind. siertem oder bidestilliertem Wasser.
   Die Erreichung dieser Stabilität bei Enzymen wirft Die Fähigkeit zur Konstanthaltung der AP-Aktivität

   beträchtliche Probleme auf. unter den oben gescnilderten Umständen ist eine spe-