DE2535782A1

DE2535782A1 - Verfahren zur zuechtung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2535782A1
Application number: DE19752535782
Authority: DE
Inventors: Lionel John Barnes; Harmannus Johannes Doddema; David Ernest Frester Harrison; John Harry Harwood
Original assignee: SHELL INT RESEARCH; Shell Internationale Research Maatschappij BV
Current assignee: SHELL INT RESEARCH; Shell Internationale Research Maatschappij BV
Priority date: 1974-08-12
Filing date: 1975-08-11
Publication date: 1976-02-26
Also published as: JPS5141488A; CA1050457A; FR2281981B1; BE832105A; NL7509531A; SU603348A3; NO752792L; US4003790A; GB1514485A; FR2281981A1

Description

betreffend
Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen. Es sind viele Mikroorganismen bekannt, die Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoff und/oder Energiequelle ausnutzen können. Die durch Züchtung derartiger Mikroorganismen erhältliche Biomasse, die häufig als Einzellenprotein
bezeichnet wird, 1st reich an Protein und kann als möglicher Nährstoff oder Nährstoffzusatz für Menschen und Tiere verwendet werden.

Ein Verfahren zur Züchtung von Kohlenwasserstoff-verwertenden Mikroorganismen umfaßt im allgemeinen die Züchtung derartiger Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Wachstumsmedium, umfassend neben der Kohlenstoffquelle assimilierbare Quellen für Stickstoff wie Stickstoffgas (N₂), Nitrationen, Ammoniumionen oder Harnstoff. Obwohl Stickstoffgas billig zur Verfügung steht, besitzt seine Verwendung als Stickstoffquelle Nachteile, da viel Energie erforderlich ist, um es dem Stoffwechsel zuzuführen und das
Verfahren dadurch bezüglich der Kohlenstoffqueile, die von den Mikroorganismen verwertet wird, teuer ist. Nitrationen

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sind ebenfalls aufwendig im Hinblick auf die Kohlenstoffquelle, da sie zu. Ammonium!oneη reduziert werden müssen, um für den Stoffwechsel der Mikroorganismen zugänglich zu sein. Ammoniumionen sind sowohl billig zugänglich als auch im Hinblick auf die Kohlenstoffquelle nicht aufwendig, aber sie besitzen den Nachteil, daß sie das Wachstum vieler Organismen, besonders vieler Methanol- und Methan-verwertender Mikroorganismen hemmen, wenn sie in dem flüssigen Wachstumsmedium in zu hoher Konzentration vorliegen. Schließlich kann Harnstoff, der auch billig verfügbar ist, und bezüglich der Kohlenstoff-

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quelle nicht aufwendig, nur von einer begrenzten Anzahl von Bakterienarten ausgenutzt werden.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung,ein verbessertes Verfahren zur Züchtung von Kohlenwasserstoff-verwertenden Mikroorganismen zu entwickeln, durch das die bei der Anwendung bestimmter Stickstoffquellen auftretenden Nachteile vermieden werden.

Die Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur Bildung bzw. Züchtung von Mikroorganismen, bei dem ein oder mehrere Kohlenwasserstoff-verwertende Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Wachstumsmedium gezüchtet werden, das Harnstoff und wesentliche Mineralsalze enthält, in Gegenwart eines Kohlenwasserstoffs und in Gegenwart von einem oder mehreren Kohlenwasserstoff-nicht-verwertenden Urease-positiven Mikroorganismen, die im Stande sind, die von den wachsenden Kohlenwasserstoff-verwertenden Mikroorganismen gebildeten organischen Substanzen zu metabolisieren.

Der Ausdruck "Kohlenwasserstoff", wie er hier gebraucht wird, ist so zu verstehen, daß er nicht nur reine Kohlenwasserstoffe, sondern auch deren oxidierte Derivate umfaßt.

Der Ausdruck "Mikroorganismus" wird hier in einem weiten Sinn gebraucht und umfaßt nicht nur Bakterien, sondern auch Hefen, Padenpilze, Actinomyceten und Protozoen.

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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bauen die Ureasepositiven Mikroorganismen nach und nach Harnstoff ab und bilden dabei in dem flüssigen Wachstumsmedium Ammoniumionen, die für die Kohlenwasserst off-verwertenden Mikroorganismen als leicht assimilierbare Stickstoffquelle zur Verfugung stehen. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der (Tatsache, daß die Ammoniumionen für die Kohlenwasserstoffverwertenden Mikroorganismen verfügbar werden, während ihre Konzentration durch die Kohlenwasserstoff-nicht-verwertenden Urease-positiven Mikroorganismen reguliert wird, wodurch die Bildung von hemmenden Konzentrationen an Ammoniumionen in dem flüssigen Wachstumsmedium vermieden wird.

Wenn die Kohlenwasserstoff-verwertenden Mikroorganismen schnell wachsen, ist die Geschwindigkeit der Bildung extra— zellulärer Produkte hoch und folglich die Wachsturnsgeschwindigkeit der Kohlenwasserstoff-nicht-verwertenden Ureasepositiven Mikroorganismen, die diese extrazellulären Produkte metabolisieren. Daher sind die zuletzt genannten Mikroorganismen im Stande, den zur Verfügung stehenden Harnstoff schnell zu Ammoniumionen abzubauen und diese Ammoniumionen sind für die Kohlenwasserstoff-verwertenden Organismen mit hoher Geschwindigkeit verfügbar entsprechend ihrem schnellen Wachstum.

Wenn jedoch die Kohlenwasserstoff—verwertenden Organismen langsam wachsen, ist die Geschwindigkeit der Bildung der extrazellulären Produkte niedrig und folglich die Wachstumsgeschwindigkeit der Kohlenwasserstoff-ntcht—verwertenden Urease-positiven Mikroorganismen. Daher sind die zuletzt genannten Mikroorganismen nicht im Stande, den zur Verfügung stehenden Harnstoff schnell zu Ammoniumionen abzubauen. Diese niedrige Geschwindigkeit der Bildung von Ammoniumionen stimmt mit der niedrigen Wachstumsgeschwindigkeit der Kohlenwasserstoff-verwertenden Mikroorganismen überein.

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So werden die Ammoniumionen den Kohlenwasserstoff-verwertenden Mikroorganismen immer mit einer solchen Geschwindigkeit zur Verfügung gestellt, die dem Erfordernis entspricht; das heißt, die der Wachstums geschwindigkeit der Kohlenwasserstoffverwertenden Mikroorganismen proportional ist. Folglich bleibt die Konzentration an Ammoniumionen in dem flüssigen Wachstums— medium verhältnismäßig konstant und erreicht in der Praxis eigentlich nie die Menge, bei der eine hemmende Wirkung auf das Wachstum eintritt.

Die einfachste Form der Züchtung von Mikroorganismen, wie sie erfindungsgemäß durchgeführt wird, umfaßt einen Kohlenwasserstoff -verwertenden Mikroorganismus, der üblicherweise keinen Harnstoff aber Ammoniumionen als Stickstoffquelle verwerten kann, zusammen mit einer oder mehreren Urease-positiven Koh— lenwasserstoff-nioht-verwertetönArten, die Harnstoff abbauen und Ammoniumionen in das Medium freisetzen können.

Der Kohlenwasserstoff-verwertende Mikroorganismus ist vorzugsweise ein Methan-verwertendes Bakterium, das in Gegenwart von Methan wächst oder ein Methanol-verwertendes Bakterium, das in Gegenwart von Methanol wächst. Gute Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Kultur sowohl ein Mathan-verwertendes Bakterium als auch ein Methanol-verwertendes Bakterium enthält und in Gegenwart von Methan durchgeführt wird.

Es können jedoch auch andere Mikroorganismen in dem Kulturme» dium vorhanden sein, zum Beispiel ein oder mehrere Kohlen-

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wasserstoff-nicht-verwertea- ürease-negative Mikroorganismen,die im Stande sind, organische Substanzen zu metabolisieren, die von dem wachsenden Kohlenwasserstoff-verwertenden Mikroorganismen gebildet werden und es können auch weitere Kohlenwasserstoffverwertende Mikroorganismen vorhanden sein»

Methan-verwertende Mikroorganismen, die günstig für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden können, sind zum Beispiel Methyloeoccus capsulatus, Methylococcus minimus,Methyl—

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obacter vinelandii, Methylosinus trichosporium, Methylocystis parnis und der Orgaaismus SM^ (NCIB 11084), der im einzelnen in der DT-OS 2 460 672 beschrieben ist. Geeignete Methanol-verwertende Mikroorganismen sind zum Beispiel Hyphomicrobium sp. (NCIB Nr.11040), Pseudomonas extorquens, Pseudomonas methylotropha (NCIB Nr. 10 508 bis 10 515 und 10 592 bis 10 596) und der Organismus OML (NCIB 11112), der ebenfalls im einzelnen in der DT-OS 2 460 672 beschrieben ist. Jedes Kohlenwasserstoff-nicht-verwertende Bakterium, das im Stande ist, Harnstoff zu verwerten und das in gemischten Kulturen mit Kohlenwasserstoff—verwertenden Bakterien wachsen kann, kann angewandt werden, zum Beispiel die Organismen M₁ (NCIB 11062), M₂ (NCIB 11061) und M₄ (NCIB 11065), die ebenfalls alle in der DT-OS 2 460 672 beschrieben sind. Eine bevorzugte gemischte Kultur für das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart von Methan ist die als T₅ (NCIB 11085) bezeichnete, die den Methan-verwertenden Mikroorganismus SM3 (NCIB 11084), den Methanol-verwertenden Mikroorganismus OML (NCIB 11112) und vier nicht-methylotrophe Mikroorganismen M-, Mp, M. und M₅ (NCIB 11063) umfaßt. M₅ ist ein Urease-negativer Mikroorganismus. Die Kultur T3 und ihre Bestandteile sind ebenfalls in der DT-OS 2 46O 672 beschrieben.

Harnstoff ist günstigerweise in dem flüssigen Wachstumsmedium in einer Konzentration von 3 bis 50 g/l vorhanden. Es ist offensichtlich, daß keine wesentliche Mengen von Ammoniumionen zu dem flüssigen Medium zugesetzt werden sollen, außer denen die durch den Abbau des Harnstoffs gebildet werden.

Andere Elemente, die vorzugsweise in dem Medium vorhanden sind, sind Phosphor, Schwefel, Magnesium und Eisen. Die Phosphorquelle ist vorzugsweise ein oder mehrere Phosphate, zum Beispiel K₂HPO., KH₂PO- oder Na₂HPO, oder Phosphorsäure, vorzugsweise in einer Konzentration von 3 bis 20 g/l. Die Schwefelquelle kann Schwefelsäure oder ein Sulfat sein, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 5 g/l· Die beiden Metalle werden in "Form des einen oder anderen ihrer Salze zur Verfügung gestellt, zum Beispiel MgSO..7H₂O in einer Konzentration von 0,2 bis 2,0 g/l und FeCl₅.6H₂O in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 g/l.

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Das Medium kann auch Spuren anderer Elemente in Form geeigneter Salze enthalten, zum Beispiel Calcium, Mangan, Zink, Kobalt, Molybdän und Bor. Ein Beispiel für ein geeignetes Medium ist in dem Beispiel angegeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise₍ halbkontinuierlich oder vorzugsweise in einer kontinuierlichen Fließkultur durchgeführt werden. Um ein Wachstum zu erzielen,

werden die Mikroorganismen durch Beimpfen in das Medium gegebracht wird.

bracht, das mit Sauerstoff in Berührung · Für einekontinuierliche Fließkultur können die Mikroorganismen in irgendeinem, geeigneten Fermentati onsgefäß gezüchtet werden, zum Beispiel in einem gerührten Ferment or mit Ablenkblechen oder einem Sprühturm-Ferment or, der entweder mit einer inneren Kühlung oder einer äußeren Rüeklauf-Kühlschleife versehen ist. Frisches Medium wird ,kontinuierlich mit Geschwindigkei-

Xulturvolumina
ten entsprechend 0,02 bis 1,0 /h zugeführt und die Kultur wird mit einer solchen Geschwindigkeit abgezogen, daß das Volumen der Kultur konstant bleibt. Sauerstoff und möglicherweise Kohlendioxid werden vorzugsweise durch kontinuierliches Einleiten über eine Verteilerfritte am Boden des Gefäßes zugeführt. Die Säuerst offquelle für die Kultur kann Luft,Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherte Luft sein. Verbrauchtes Gas wird am Kopf des Gefäßes abgezogen. Das verbrauchte Gas kann entweder durch eine äußere Schleife zurückgeführt werden oder intern mit Hilfe eines Gaseinführpropellers.

Die Temperatur der Kultur wird im allgemeinen bei 30 bis 5O⁰C und vorzugsweise bei 38 bis 45⁰C gehalten. Der pH-Wert der Kultur wird üblicherweise auf 6 bis 8 und vorzugsweise 6,4 bis 7,4 eingestellt durch entsprechende Zugabe von Alkali, zum Beispiel FaOH, KOH und/oder einer Säure, zum Beispiel H₀SO. oderΉ^ΡΟ.ο

Die Mikroorganismus zellen können aus dem Wachs tu ms medi um nach irgendeinem der üblicherweise angewandten Standard-Verfahren gewonnen werden, zum Beispiel durch Ausflocken, Sedimentation und/oder Ausfällung und anschließendes Zentrifugieren und/oder

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Filtrieren. Die Biomasse wird dann getrocknet, zum Beispiel durch Gefrieren oder Sprühtrocknen und kann in dieser Form als Protein-Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz für Menschen oder Tiere verwendet werden.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:

Beispiel

Ein Biotec-Fermentationsgefäß mit einem Arbeitsvolumen von 2,5 1 wurde mit Medium beschickt und mit 100 ml der Kultur T3 (umfassend die Bakterien SM3, OML, M₁, M₂, M₅ und M₄) beschickt. Diese Kultur wurde wie in der DT-OS 2 460 672 hergestellt. Das Medium enthielt die folgenden Bestandteile:

1,6 g/i _{24 1j16}

Harnstoff 1,122 «

MgSO₄.7H₂O 0,08 »

FeSO ,7HpO 0,014 "

4
Ga(N0₃)₂.4H₂0 0,025 "

CuSO₄.5H₂O 8x10""⁶ »

ZnSO₄.7H₂O 6,8x10"⁷ "

MnSO₄.4H₂O 6,Ox1O~⁷ "

Na₂MoO₄.2H₂O 4,8x10~⁷ «

Die Fermentationstemperatur wurde auf 42⁰C gehalten und der pH-Wert auf 7,0. Ein Gemisch aus 25 i° Methan und 75 $ Luft wurde am Boden des Fermentationsgefäßes mit einer Geschwindigkeit von 600 ml/min eingeleitet. Der Fermentor wurde mit Hilfe eines einzelnen 6-blättrigen Propellers mit einer Geschwindigkeit von 1200 UpM gerührt.

Innerhalb von 24 h trat Wachstum auf und wenn die Spannung an gelöstem Sauerstoff 0 erreichte, wurde die kontinuierliche Kultur durchgeführt, wobei das Medium der oben angegebenen Zusammensetzung verwendet wurde. Die Verdünnungsgeschwindigkeit

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wurde in Intervallen von ungefähr 2 h in Stufen von ungefähr O,O2/h erhöht, bis eine Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,175/h erreicht war.

Das Fermentationssystem arbeitete dann unter den folgenden Bedingungen:

Absoluter Einlaßgasdruck 770 mm Hg Temperatur des eintretenden Gases 24⁰C

Gemessene Eintrittsgeschwindigkeit 116,8 s/l

Stickstoffgehalt (%) des eintretenden Gases 67,65

Metbangehalt (%) des eintretenden Gases 11,79

Kohlendioxidgehalt (%) des eintretenden Gases 0,50

Sauerstoffgehalt des eintretenden Gases 20,06

Stickstoffgehalt ($) des austretenden Gases 80,13

Methangehalt ($) des austretenden Gases 4,20

Kohlendioxidgehalt ($) des austretenden Gases 6,08

Sauerstoffgehalt ($) des austretenden Gases 9,59 l/h

Fließgeschwindigkeit des flüssigen Mediums 0,356/h

Fermentationsvolumen (1) 1,9

pH-Wert 7,1

Konzentration an Biomasse 3,22

Rührgeschwindigkeit 1380 UpM

Temperatur des Fermentationsgefäßes 41,8⁰C

Unter diesen Bedingungen wurde ein durch das Methan bestimmter Gleichgewichtszustand erreicht.

Die Analyse auf Harnstoff und Ammoniumionen (angegeben als ) ergab die folgenden Werte:

Konzentration in dem Medium Konzentration in

der Kultur

Harnstoff 1,122 g/l 0,250 g/l

- 0,051 g/l

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Daraus ist zu ersehen, daß Harnstoff verbraucht wird. Ammoniumionen werden in das Medium abgegeben und sind für die
Methan-verwertenden Bakterien als Stickstoffquelle verfügbar. Der Gehalt an Ammoniumionen in der lösung in der Kultur« brühe ist niedrig (51 mg/1) und erlaubt ein gutes Wachstum
der Methan-verwertenden Mikroorganismen, ohne daß das Wachstum gehemmt wird. Die Gesamtmenge an Reststickstoffquelle in der Kultur würde, wenn sie in Porm von Ammoniumionen vorliegen, ausreichen, um das Wachstum zu hemmen und zu einem Auswaschen der Kultur zu führen.

Patentansprüche

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Claims

Pateataasprüche

1 φ Verfahren zur Züchtuag voa Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet , daß maα einea oder mehrere Kohlenwasserstoff-verwertende Mikroorganismen uater aeroben Bediaguagea ia einem flüssigen Wachstumsmedium züchtet, das Harnstoff und wesentliche Mineralsalze enthält in Gegenwart eines Kohlenwasserstoffes und in Gegenwart von einem oder mehreren Kohlenwasserstoff-nieht-verwertenden Urease-positiven Mikroorganismen, die im Stande sind, organische Substanzen zu metabolisieren, die von den wachseaden Kohlenwasserst off -verwertenden Mikroorganismen gebildet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserst off-verwertenden Mikroorganismus ein Methan-verwertendes Bakterium und als Kohlenwasserstoff Methan verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Kohlenwasserst off-verwertenden Mikroorganismus ein Methanol-verwertendes Bakterium und als Kohlenwasserstoff Methanol verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man neben dem Methan-verwertenden Bakterium ein Methanol-verwertendes Bakterium anwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man als Kohlenwasserstoff~nicht-verwertenden TJrease-positiven Mikroorganismus ein Kohlenwasserstoff-nicht-verwerteades Urease-positives Bakterium verwendet.

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6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man neben dem Kohlenwasserstoff-verwertenden Mikroorganismen und dem Köhlenwasserstoff-nichtverwertenden Urease-positiven Mikroorganismen einen oder mehrere keinen Kohlenwasserstoff-verwertende Urease-negative Mikroorganismen anwendet, die im Stande sind, die organischen Substanzen zu metabolisieren^ie durch die wachsenden Kohlenwasserst off-verwertend en Mikroorganismen gebildet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß man äie als 13 bezeichnete gemischte Kultur mit der Hinterlegungsnunmier NCIB Wr-11085 in Gegenwart von Methan züchtet.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7> dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur im Bereich von 30 bis 50⁰O hält.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch g e ke η η zeichnet, daß man den pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 8,0 einstellt.

ORIGINAL INSPECTED

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