DE2526596C2 - Verfahren zur Abtrennung von Eisenverbindungen, die vom Hämoglobin stammen, von Globin in einer Blutsubstanzen enthaltenden Flüssigkeit - Google Patents

Description

Man hat bereits versucht, das Hämoglobin in Eisenpreteperphyrin (Hämin) und Globin aufzuspalten und diese zu trennen, um ein Protein (Globin) ohne Blutgeschmack (welcher vom Hämin stammt) zu erhalten.

Versuche. Hämin vom Globin durch Elektrophorese, lonenaustauschchromatographie, Gelfilterunj, Membranfilterung und ähnliche Verfahren zu trennen, haben sich in technischem Maßstab als zu teuer erwiesen. Die Extraktion von Hämin in Lösungsmitteln z. B. Aceton, Methylethylketon oder Dimethylformamid hat sich als unzulänglich erwiesen, weil kleine Mengen von diesen giftigen Lösungsmitteln im Globin zurückbleiben und dieses dann als Lebensmittel ungeeignet wäre.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und im technischen Maßstab realisierbares Verfahren für die Trennung der beiden Komponenten Hämin und Globin zu finden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung des Eisenprotoporphyrins und seiner Derivate oder Spaltungsprodukte (sog. Eisenkomponente) vom Globin in einer Blutsubstanzen enthaltenden Flüssigkeit, wobei man die Flüssigkeit in der Kälte mit einem angesäuerten organischen Lösungsmittel vermischt und ausgefälltes Globin gewinnt, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit auf eine Temperatur von 0°C bis —20°C abkühlt, den pH-Wert der Flüssigkeit auf einen Wert unter 4,5 einstellt, Äthanol oder Mischungen von Äthanol mit Glykol oder Glycerin in einer Menge, die mindestens 40 Vol.-%, bezogen auf die gesamte Flüssigkeitsmenge, beträgt, unter Beibehaltung der Abkühlungstemperatur zufügt und daß zunächst die ausgefällte Eisenkomponente von dieser Flüssigkeit abgetrennt wird, wonach das Globin aus der Flüssigkeit ausgefällt wird.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Verwendung von Äthanol oder Mischungen von Äthanol mit Glykol oder Glycerin und unter eventuellem Zusatz von Salzen, wie Natriumchlorid, Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat und Natriumbenzoat unter eventueller Beigabe eines pH-reguIierenden Mittels wie an-5 organische Säuren (z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure) oder organische Säuren (z. B. Essigsäure oder Zitronensäure) die Anwendung einer einfachen Prozeßtechnik ermöglicht Dadurch liefert die Erfindung eine technisch und Ökonom, ch realisierbare Methode zur Trennung

ίο von Eisenkomponente und Globin und gestattet die Verwendung des Globins für Futter und Lebensmittel.

Es hat sich weiterhin gezeigt, daß das Hämin 'n der aus der Lösung ausgefällten Paste in natürlicher (nativer) Form vorliegt und deshalb vom Körper absorbiert wird. Es ist somit auch ein attraktives Arzneimittel gegen Eisenanämie, weil es ein körpereigenes Produkt ist, ohne die Nachteile, welche bekanntlich den konventionellen Eisenpräparaten auf »non-Hämin-basis« anhaften.

Bei der Methode gemäß der Erfindung wird zuerst der Hauptteil der Eisenkomponente, die beispielsweise als Aggregat in konzentrierten Lösungen oder an Proteinmaterial adsorbiert vorliegt, und dessen Agglomeration durch Zusatz von z. B. Natriumchlorid gefördert werden kann, beispielsweise durch Zentrifugierung abgetrennt. Aus der auf diese Art durch Zentrifugierung erhaltenen Oberflüssigkeit wird dann das Globin ausgefällt, während der restliche Teil der Eisenkomponente in gelöster und/oder feinzerteilter Form in der Flüssigkeitsphase zurückbehalten wird.

Das Milieu, das durch den relativ hohen Gehalt an erfindungsgemäßem Lösungsmittel und den vergleichsweise niedrigen Gehalt an Wasser mit einer gewissen lonstärke und einem niedrigen pH-Wert geschaffen wird, ist offenbar dafür geeignet, die feindispersen bzw. gelösten Formen der Eisenkomponente in der Flüssigkeit zurückzubehalten, während sich das Globin ausfällen und abzentrifugieren läßt.
Die Kühlung der zu verarbeitenden Flüssigkeit erfolgt auf eine Temperatur von 0⁰C bis —20⁰C. Wenn man die Verarbeitung beispielsweise bei 0⁰C durchzuführen wünscht, werden die Blutflüssigkeit und das organische Lösungsmittel sowie alle anderen Zusatzmittel auf 0° C gekühlt, möglichst bevor man sie mischt.

Der pH-Wert der Flüssigkeit wird auf einen Wert unter 4,5 eingestellt, insbesondere auf einen Wert von 2,5 bis 4,5. Äthanol oder Mischungen von Äthanol mit Glykol oder Glycerin werden in einer Menge, die mindestens 40 Vol.-%, bezogen auf die gesamte Flüssigkeitsmenge beträgt, zugesetzt, vorzugsweise beträgt die Menge mindestens 75 Vol.-%.

Die ausgefällte Eisenkomponente wird von der Flüssigkeit abgetrennt, vorzugsweise durch Aussalzen, wobei insbesondere Salze wie Kaliumchlorid oder Natriumcitrat zugegeben werden. Anschließend kann das Globin aus der Flüssigkeit ausgefällt werden.

Die Erfindung soll im folgenden anhand einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

In einer Lösung aus 20 ml 94%igem Äthanol und 1,1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von — 15°C wurden unter Umrühren und Kühlung 5 g Hämoglobinlösung (mit einem Trockensubstanzgehalt von 15% und einem Anteil von ca. 33% Äthanol mit einer Temperatur von —8°C) eingetropft. Nach dem Zusatz war die Temperatur — 15°C und der pH-Wert 2,9.

3

Die Mischung wurde 20 Minuten mit 27 000 - g zen- peratur war —12° C Diese schwarz-braune Mischung

trifugiert. wobei 05 g schwarze Paste (Eisenkomponen- wurde mit. 27 000 · g 10 Minuten lang zentrifugiert, wo-

te) mit einem Trockensubstanzgehalt von 83% gewon- bei 2,2 g schwarze Paste (Eisenkomponente) mit einem

nen wurden. Trockensubstanzgehalt von 2,7% und eine hellbraune

Der kräftig braun gefärbten Oberflüssigkeit wurden 5 Oberfiüssigkeit, die später eine gelartige Konsistenz anunter Umrühren und Kühlung 50 ml 94%iges Äthanol nahm, gewonnen wurden.

bei einer Temperatur von — 15°C zugesetzt, und das In die Oberflüssigkeit wurden unter Umrühren und

Globin wurde durch Zugabe von 10 ml Wasser und Kühlung 70 ml 94%iges kaltes Äthanol und danach

1,2 ml 20%igem Ammoniumsulfat ausgefällt 0,8 ml 4G%ige Ammoniumsulfatlösung und 8 ml Wasser

Der Niederschlag wurde mit 8000 · g in 10 Minuten 10 eingetropft Danach betrug die Temperatur—6° C.

abzentrifugiert die gewonnene Paste in 94%igem Ätha- Der so erhaltene Niederschlag wurde 10 Minuten mit

nol mit einer Temperatur von —15° C aufgeschlämmt 8000 - g zentrifugiert, wobei sich 1,7 g weiße Paste

und wie oben abzentrifugiert Hierbei ergaben sich 1,6 g (Globin) mit einer Trockensubstanz von 36% ergaben. Paste mit einem Trockensubstanzgehalt von 37,6%. In trockenem Zustand war die Paste hellgrau.

Beispiel 2

In eine Lösung von 40 ml 94%igem Äthanol und 1,1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von — 15°C wurden unter Umrühren und Kühlung tropfenweise 5 mg Hämoglobinlösung (Angaben wie in Beispiel 1) gegeben. Nach dem Zusatz betrug die Temperatur -15°C, und der pH-Wert war 2,9.

In diese Mischung wurden 5 ml 20%iges Natriumchlorid eingetropft, und die Flüssigkeit wurde mit 27 000 · g 20 Minuten lang zentrifugiert, wobei 1,4 g schwarze Paste (Eisenkomponente) mit einem Trockensubstanzgehalt von 11% gewonnen wurden.

Zu der Oberflüssigkeit wurden 12 ml Wasser und 1 ml 20%ige Ammoniumsulfatlösung gegeben, und dann wurde die Flüssigkeit mit 8000 · g 10 Minuten lang zentrifugiert. Hierbei erhielt man 3,8 g graue Paste Globin mit einem Trockensubstanzgehalt von 14,6%.

J5

Beispiel 3

Aus 5 g Hämoglobinlösung (mit Angaben wie in Beispiel 1) wurde das Hämoglobin durch Zusatz von 10 ml 94%igem Äthanol unter Umrühren und Kühlung bis auf eine Temperatur von —6°C ausgefällt. Der Niederschlag wurde 5 Minuten lang mit 2000 · g zentrifugiert, wobei man 6 g rote Paste gewann. Am Boden des Zentrifugenrohres hatte sich eine kleinere Menge schwarze Paste abgesetzt.

Zu der roten Paste gab man unter Umrühren und Kühlung eine Lösung aus 70 ml 94%igem Äthanol und 1,1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von — 12°C. Nach diesem Zusatz betrug der pH-Wert 2,9 und die Temperatur —12°C. Die Mischung wurde mit 27 000 · g 10 Minuten lang zentrifugiert, wobei man eine kleinere Menge schwarze Paste (Eisenkomponente) erhielt.

Zur Oberflüssigkeit gab man 2,0 ml einer 40%igen Ammoniumsulfatlösung und 10 ml Wasser. Die Temperatur war —8⁰C und der pH-Wert 3,4.

Der so erhaltene graue Niederschlag wurde 10 Minuten mit 8000 · g zentrifugiert, wobei 1,5 g graue Paste (Globin) mit einem Trockensubstanzgehalt von 39,3% gewonnen wurden.

Beispiel 4

Zu einer Lösung aus 20 ml 94%igem Äthanol und 1,1 ml 1 M Salzsäure mit einer Temperatur von —12° C gab man tropfenweise unter Umrühren und Kühlung 5 g Hämoglobinlösung (mit Angaben wie in Beispiel 1). Nach der Zugabe betrug der pH-Wert 2,9 und die Tem-

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Trennung des Eisenprotoporphyrins und seiner Derivate oder Spaltungsprodukte vom Globin in einer Blutsubstanzen enthaltenden Flüssigkeit, wobei man die Flüssigkeit in der Kälte mit einem angesäuerten organischen Lösungsmittel vermischt und ausgefälltes Globin gewinnt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit auf eine Temperatur von 0⁰C bis — 20⁰C abkühlt, den pH-Wert der Flüssigkeit auf einen Wert unter 4,5 einstellt Äthanol oder Mischungen von Äthanol mit Glykol oder Glycerin in einer Menge, die mindestens 40 Vol.-%, bezogen auf die gesamte Flüssigkeitsmenge, beträgt, unter Beibehaltung der Abkühlungstemperatur zufügt und daß zunächst die ausgefällte Eisenkomponente von dieser Flüssigkeit abgetrennt wird, wonach das Globin aus der Flüssigkeit ausgefällt wird.

2. Verfahren nach /Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Äthanol oder Mischungen von Äthanol mit Glykol oder Glycerin in einer Menge von mindestens 75 Voi.-%, bezogen auf die gesamte Flüssigkeitsmenge, zugesetzt wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung der Eisenkomponente durch Zugabe von Salzen gefördert wird.