DE2512586C3 - Mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Cholesteringehaltes von Flüssigkeiten - Google Patents

Description

dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht oder eine über der Reagensschicht angeordnete Schicht aus einem porösen für das Cholesterin durchlässigem Medium eine üpase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und eine Protease enthält, die nicht von dem eingesetzten Lipasepräparat stammt

2. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht auf einen pH-Wert von 5,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,9 bis 7,0 abgepuffert ist

3. Elemeal nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lipase enthält, die eine Esteraseaktivität aufweist, entsprechend der Freisetzung von mindestens 25 mg Cholesterin/100 ml in zwei Stunden bei 37°C unter Stickstoff, wenn 50 mg des Lipasepräparates in 5 ml einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 auf eine Dispersion von Cholesteryllinoleat hergestellt durch Dispergieren von 200 mg Cholesteryllinoleat in 5 ml Äthyläther und 100 ml siedendem Wasser mit 430 mg Natriumcholat angesetzt werden.

4. Element nach Anspruch 3. dadurch gekennzeichnet, daß es die Lipase in der Reagensschicht in einer Konzentration von etwa 90 000 bis etwa 270 000 Einheiten/m² und die Proteste in einer Konzentration von etwa 36 000 bis etwa 105 000 enthält

5. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Reagensschicht auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 abgepuffert ist

6. Element nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Lipase eine mikrobiologische Lipase enthält

7. Element nach Anspruch fc, dadurch gekennzeichnet daß die Lipase aus Candida cylindracea gewonnen wurde.

8. Element nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Lipase Weizenkeimlipase. eine pancreatische Lipase oder eine Lipase von Candida cylindracea enthält.

9. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß es eine Bacillus subtilis-Protease, eine Streptomyces griseus-Protease und/oder eine Aspergillus oryzae-Protease enthält

10. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen der oder dep Schichten aus einem porösen Medium und der Reagensschicht eine Trennschicht zur Verhinderung des Durchtritts der Protease in die Reagensschicht aufweist

11. Element nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennschicht aus Agarose aufgebaut ist

12. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht oder die porösen Schichten auf einen pH-Wert von 5 bis 9,5, insbesondere 5,5 bis 8,5 abgepuffert sind.

13. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der für Flüssigkeiten impermeable, für Strahlungsenergie durchlässige Schichtträger für Wellenlängen von etwa 200 bis etwa 900 nm durchlässig ist.

14. Element nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht oder die porösen Schichten auf einen pH-Wert von etwa 6,0 bis 7,0 abgepuffert ist bzw. sind.

Die Erfindung betrifft ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Cholesleringehaltes von Flüssigkeiten mit:

(1) einem für Flüssigkeiten impermeablen, für Strahlungsenergie durchlässigen Schichtträger,

(2) einer Reagensschicht auf einer Seite des Schichtträgers mit einem Indikatorsystem, welches mit einem oder mehreren Reaktionsprodukten der durch die Cholesterin-Oxidase induzierten Zerfallsreaktion des Cholesterins reagiert und zwar unter einer spektrophotometrisch quantitativ erfaßbaren Absorptionsverschiebung und einem in einem Bindemittel dispergierten Cholesterin-Oxidase-Enzym und

.... (3) mindestens einer über der Reagensschicht angeordneten Schicht aus einem porösen, für das Cholesterin der

|:| Flüssigkeit durchlassen Medium, das die Flüssigkeit derart ausbreitet, daß ein praktisch konstantes

'ίΐ Volumen der Flüssigkeit auf eine Flächeneinheit der Reagensschicht auftrifft.

,'ι 65 Die quantitative Analyse von Cholesterin in komplexen Mischungen, z. B. Blutserum, das sowohl freies als ·:[ auch verestcrtcs Cholesterin enthält, erfordert bekanntlich die Verwendung korrosiv wirkender Chemikalien

zum Zwecke der Hydrolyse der Cholesterinester in das freie Cholesterin sowie im allgemeinen die Verwendung ^: komolexer und nicht leicht zu automatisierender Methoden.

Aus der BE-PS 8 Ol 742 entsprechend der DE-OS 23 32 760 sind bereits mehrschichtige analytische Elemente für die quantitative Analyse komplexer Flüssigkeiten, z. B. Blutserum und Urin bekannt die bestehen aus: einem Schichtträger, einer Reagensschicht mit einem Testreagens, das einer quantitativen Reaktion mit einem Bestandteil der zu analysierenden und auf das Element aufgebrachten Flüssigkeit unterliegt, und einem porösen Medium, bestehend aus einer oder mehreren Schichten, durch welches der Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit auf die Reagensschicht gelangt, der mit dem in der Reagensschicht enthaltenden Reagens umgesetzt wird. Das poröse Medium ist dabei derart beschaffen, daß es die auf das Element aufgebrachte, zu analysierende Flüssigkeit derart ausbreitet, daß ein praktisch konstantes Volumen der zu analysierenden Flüssigkeit auf eine Flächeneinheit der Reagensschicht auftrifft

In der DE-OS 22 46 695 wird die Verwendung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms für die Bestimmung von freiem Cholesterin vorgeschlagen. Bei dem in der DE-OS vorgeschlagenen Verfahren handelt es sich um ein Lösungen verwendendes Bestimmungsverfahren, das die Verwendung korrosiver Chemikalien zur Hydrolyse der Cholesterinester erfordert, welche beispielsweise im Blutserum vorhanden sein können.

Aus der DE-AS 22 24 132 ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin bekannt bei dem Cholesterin in wäßrigem Medium mit Cholesterin-Oxidase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H₂O₂ bzw. Cholestenon bestimmt wird. Aus der DE-AS 22 24 132 ist es auch bekannt vor der Bestimmung gebundenes Cholesterin durch enzymatische Verseifung mit Esterase, vorzugsweise Cholesterin-Esterase aus Leber oder Pankreas, in freies Cholesterin zu überführen.

Es wurde ferner bereits vorgeschlagen (vgL DE-OS 23 15 501 und 25 0€ 712), bei der Bestimmung des Gesamtcholesteringehaltes einer Flüssigkeitsprobe aus Cholesterinestem Cholesterin mit Cholesterines'.tiase aus Mikroorganismen freizusetzen.

Es hat sich jedoch gezeigt daß die meisten im Serum enthaltenen Cholesterinester an Lipo-Proteine gebunden vorliegen und daß sich diese Cholesterinester-Lipo-Proteinkomplexe mit einer Esterase allein nur schwierig oder sehr langsam verseifen lassen.

Der vorliegenden Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß sie''! diese Schwierigkeit dadurch überwinden läßt daß man zur Hydrolyse sowohl eine Lipase (Cholesterin-Esterase-Aktivität) als auch eine Protease verwendet die nicht von dem eingesetzten Lipasepräparat stammt Durch die gleichzeitige Verwendung der Protease werden die Cholesterinester für die Hydrolyse durch die Lipase zugänglich gemacht Die Protease bewirkt dabei ganz offensichtlich die Aufspaltung der Ester-Lipo-Proteinkomplexe im Serum. Die Protease veruräachft dabei entweder das Aufbrechen der Komplexe oder katalysiert das Aufbrechen. Außerdem kann'die Protease selbst eine schwache Esterase-Aktivität aufweisen, welche die Hydrolyse begünstigt

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Cholesteringehaltes von Flüssigkeiten, wie es im Anspruch 1 gekennzeichnet ist

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Die Schichtenanordnung eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung ist aus der BE-PS 8 01 742 entsprechend der DE-OS 23 32 760 bekannt Demnach eignen sich die erfindungsgcmäßen Elemente insbesondere für die Verwendung im Rahmen automatisierter quantitativer Analyseverfahren. Sie besitzen einen vergleichsweise einfachen Aufbau, lassen sich leicht herstellen, sind nicht kostspielig und können in For^i von endlose*» Bändern oder Streifen verwendet werden, obgleich sie auch eine andere Form aufweisen können, z. B. die eines Blattes oder kurzen Streifens oder Abschnittes, die gegebenenfalls auf Kennkarten oder Daten speichernde Karten aufgebracht werden können.

Das Aufbringen einer zu analysierenden Flüssigkeit auf ein erfindungsgemäßes Element kann beispielsweise mittels einer automatisch arbeitenden Verteilervorrichtung erfolgen, die eine bestimmte Menge der zu testenden Flüssigkeit auf die richtige Stelle des Elements aufbringt

Die quaßtitative Analyse von Chorasterin, von beispielsweise Blutserum, läßt sich unter Verwendung üblicher Spektrophotometer und anderer Meßgeräte durchführen, und zwar in schneller und genauer Weise, wie sich aus der später folgenden Beschreibung noch ergeben wird.

In vorteilhafter Weise dient das aus einer oder mehrerer Schichten gebildeten poröse Medium nicht nur zum Ausbreiten der zu analysierenden Flüssigkeit, sondern vielmehr auch noch zur Filtration der zu testenden Flüssigkeit Außerdem kann das poröse Medium auch noch dazu dienen, um die reflektierende spektrophotome- so trische Andyse durch die Schichtträgerseite des Elements zu erleichtern.

Da das erfindungsgemäße Element eine integrale mehrschichtige Struktur aufweist, in welcher der Schichtträger und die verschiedenen Schichten miteinander verbunden 3inci und da es bei der Verwendung eines solchen Elements lediglich erforderlich ist, eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit auf die obere Schicht des Elements aufzubringen und das Element einer geeigneten Anaylse-Vorrichtung zuzuführen, vorzugsweise sinem Spektrophotometer, ist der Aufwand zur Durchführung der Analyse vergleichsweise gering.

Der Schichtträger eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung ist vorzugsweise für ultraviolettes und/oder sichtbares Licht durchlässig. Als besondecs vorteilhaft haben sich Schichtträger erwiesen, die für Wellenlängen von etwa 200 bis etwa 900 nm durchlässig sind. Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, einen Schichtträger zu verwenden, der für bestimmte, vergleichsweise enge Wellenlängenbereiahe durchlässig eo ist und für andere Wellenlängen opak oder undurchlässig ist Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen analytischen Elements können die verschiedensten polymeren Stoffe verwendet werden, beispielsweise Celluloseacetat, Polyethylenterephthalat, Polycarbonate sowie Polystyrol. Der Schichtträger kann verschieden stark sein. Vorzugsweise liegt die Schichtstärke des Schichtträgers bei etwa 0,05 bis 0,254 nm.

Die Reagensschicht kann sich direkt auf dem Schichtträger befinden oder aber auf einer Haft- oder Zwischenschicht auf dem SchicV.träger angeordnet sein, die Durchlässigkeitseigenschaften aufweist, die denen des Schichtträgers entsprechen oder mindestens ähnlich sind. Mittels einer derartigen Haft- oder Zwischenschicht kann die Reaeensschicht fester auf dem Schichtträger verankert werden.

Die Reagensschicht enthält Testreagenzien, die einer farbbildenden Reaktion unterliegen. Auf diese Weise können Reaktionsprodukt-Konzentrationen pro Flächeneinheit schnell und leicht bestimmt werden.

Die Reagensschicht kann unter Verwendung üblicher bekannter hydrophiler kolloidaler Bindemittel, beispielsweise Gelatine, Polyvinylalkohol und Agarose hergestellt werden. Gegebenenfalls kann die Reagensschicht auch aus mehreren diskreten Teilschichten bestehen, von denen eine jede eine bestimmte Funktion zu erfüllen hat. Gegebenenfalls können diese Teilschichten auch durch nicht störende Trenn- oder Zwischenschichten voneinander getrennt sein. Dies bedeutet, daß die Reagensschicht beispielsweise aus drei diskreten Teilschichten bestehen kann, die gegebenenfalls durch nicht störende Trenn- oder Zwischenschichten voneinander getrennt sein können. In diesem Fall kann die erste dieser Teiischichten die für die Cholesterinester-Hydrolyse

ίο erforderlichen Reagenzien enthalten, die zweite Schicht die Reagenzien für die Bestimmung des »freien« Cholesterins und die dritte Schicht farberzeugende Verbindungen.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand der Beschreibung der in der Zeichnung dargestellten Fi g. 1 bis 5 sowie an Hand von allgemeinen und speziellen Beispielen näher veranschaulicht.

In den F i g. 1 bis 5 sind stark vergrößerte Querschnitte der erfindungsgemäß verwendeten analytischen

is Elemente im Schema dargestellt. Im einzelnen sind dargestellt in

F i g. 1 ein analytisches Element, bestehend aus dem Schichtträger 10, einer hierauf aufgetragenen Reagensschicht 12, einer hierauf aufgetragenen reflektierenden Schicht 14, welche einen weißen Hintergrund für spektrophotometrische Reflexionsmessungen durch den Schichtträger 10 bietet, eine Filterschicht 16 und eine Ausbreitschicht 18. Die Reagensschicht 12 kann dabei beispielsweise bestehen aus einer Dispersion von einem oder mehreren Test-Reagenzien in einem Bindemittel, z. B. Gelatine, während jede der Schichten 14,16 und 18 aus einer »blush«-Polymerschicht bestehen kann, mit einer Porengröße, die der besonderen Funktion der Schichten angepaßt ist.

F i g. 2 ein weiteres analytisches Element, bestehend aus einem Schichtträger 20 mit einer hierauf aufgetragenen Reagensschicht 22 und einer hierauf aufgetragenen Schicht 24, welche die Funktion einer Ausbreitschicht und einer Filterschicht ausübt und die des weiteren einen geeigneten Hintergrund für spektrophotometrische Reflexionsmessungen durch den Schichtträger 20 bietet. Andererseits kann die Schicht 24 derart beschaffen sein, daß sie nicht reflektiert, in welchem Falle die quantitative Messung nach der Transmissions· oder Durchlässigkeitsmethode erfolgt Die Schicht 24 kann beispielsweise eine »blushw-Polymerschicht sein, die auf die Schicht 22 aufgetragen ist oder eine Schicht aus einer mikroporösen Filtermerm>ran, die auf die Schicht 22 auflaminiert ist.

F i g. 3 eine weitere Ausgestaltung eines analytischen Elements, bestehend aus dem Schichtträger 30, der Reagensschicht 32, einer Dialyseschicht 34, die von einer semipermeablen Membran gebildet wird und einer Schicht 316, z. B einer »blushw-Polymerschicht, welche die Funktion hat, die zu analysierende Probe auszubreiten und zu filtrieren und welche des weiteren einen geeigneten Hintergrund für spektrophotometrische Reflexionsmcssungcn durch den Schichtträger 30 bietet.

j5 Fig.4 eine weitere Ausgestaltung eines analytischen Elements, bestehend aus dem Schichtträger 40. einer ersten Reagensschichi 42, einer zweiten Reagensschicht 44, einer Schicht 46, die als Filter- und lichtreflektierende Schicht wirkt und einer Ausbreitschicht 48. Die Schicht 46 kann beispielsweise aus einer Dispersion von Titandioxyd in Ceiiuioseacetat bestehen, und die Schicht 48 kann beispielsweise aus einer Dispersion von Diatomeenerde in Celluloseacetat oder aus einer Dispersion von Glaskügelchen in Gelatine aufgebaut sein.

F i g. 5 eine weitere Ausgestaltung eines mehrschichtigen analytischen Elements, bestehend aus dem Schichtträger 50 mit einer hierauf aufgetragenen ersten Reagensschicht 52 mit einem Farbindikatorsystem, das im folgenden noch beschrieben wird, dispergjert in einem geeigneten Bindemittel, einer Trennschicht 54, deren Zweck später noch beschrieben werden wird, einer zweiten Reagensschicht 56, welche die Komponente des Cholesterinester-Hydrolysesystems enthält,d. h. ein Lipasepräparat, welches Cholesterinesterase-Aktivität zeigt und Protease und Cholesterinoxidase enthält. Auf der Schicht 56 befindet sich eine kombinierte Ausbreit-, Filter und reflektierende Schicht 58, einer Zusammensetzung, ähnlich der Zusammensetzung der Schichten 46 und 48 der in F i g. 4 dargestellten Ausführungsform.

Es hat sich oftmals als zweckmäßig erwiesen, den Beschichtungsmassen Beschichtungshilfsmittel zuzusetzen, welche eine gleichförmige Beschichtung ermöglichen.

so Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Elemente können die verschiedensten üblichen Beschichtungshilfsmittei verwendet werden, solange sie die Lipase oder andere Reagenzien in einer der verschiedenen Reager > schichten nicht inhibieren. Als besonders vorteilhafte Beschichtungshilfsmittel für diesen Zweck haben sich nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen erwiesen, beispielsweise Octylphenoxypolyäthoxyäthanole, die im Handel erhältlich sind. Geeignete Beschichtungshilfsmittel sind des weiteren p-Nonylphenoxylglyzerine sowie Polyäthylenglykole, die im Handel erhältlich sind.

Obgleich die Beschichtungshilfsmittel dazu dienen, gleichförmige Schichten zu erzeugen, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn die Reagensschichi, welche die Cholesterin-Oxidase enthält, zusätzlich etwa 05 bis etwa 5 g/m², insbesondere etwa I bis etwa 3 g/m² einer oberflächenaktiven Verbindung enthält, welche eine Oxidation des freien Cholesterins durch das Oxidaseenzym gewährleistet. Konzentrationen an oberflächenaktiver Verbindung von über 5 g/m² soilen vermieden werden, da bei Konzentrationen von über 5 g/m² eine Beeinträchtigung der physikalischen Eigenschaften des analytischen Elements oder Bandes erfolgen kann. In vorteilhafter Weise werden übliche bekannte nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen verwendet, beispielsweise Nonylphenoxypolyäthoxyäthylene.
Das Reagers-System einer bevorzugten Ausgestaltung eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung läßt sich als ein aus drei Teilen aufgebautes Reagens-System bezeichnen.

Die chemischen Reaktionen, die in einem besonders vorteilhaften mehrschichtigen analytischen Element nach der Erfindung ablaufen können, ergeben sich aus dem folgenden Schema:

1. Cholesterin-l-eUsaure-Lipoprotein-Komplex + H₂O

Protease und oberflächenaktive Verbindung ...

■ * freies Cholesterin + Fettsäure

Lipase mit Esterase-Aktivität

oberflächenaktive Verbindung

2. Cholesterin + O₃ ► Cholestenon + H₂O₂

Cholesterin-Oxidase i⁽⁾

OH

Peroxidase

Reaktion (1) veranschaulicht das Freisetzen von freiem Cholesterin aus Cholesterin und Cholesterinestern, komplexgebunden mit Serum-Lipoproteinen. Die Gleichung (2) veranschaulicht die Cholesterin-Oxidasereaktion. Die Reaktion (3) veranschaulicht eine der vielen möglichen Farbstoff-Peroxidase-Systeme, die angewandt wc.den können, um das gebildete H₂O₂ zu bestimmen. Im Falle des angegebenen Schemas erfolgt eine Oxida- jo tion von 4-Aminoanlipyrin und 1,7-Dihydroxynaphthalin zu einer Verbindung mit einem Absorptionsmaximum bei 490 nm. Ein solches Farbsloffsystem ist durch eine besondere Empfindlichkeit, Stabilität und ferner dadurch gekennzeichnet, daß andere Serumkomponenten nicht stören.

Bei Verwendung von Elementen gleichen Aufbaues, jedoch ohne Oxidase, wurde keine wesentliche Änderung der optischen Dichte innerhalb der Zeiträume, die für die beschriebene Bestimmungsmethode angewandt wurden, erzielt.

Wie später noch näher beschrieben werden wird, können an Stelle des beschriebenen Reaktionssysterr.s die verschiedensten anderen quantitativen Meßsysteme angewandt werden.

Die Grundlage des gesamten Reaktionssystems in einem erfindungsgemäßen analytischen Element ist das Cholesterin-Oxidase-Enzym. Dies Enzym, das die Oxidation von Cholesterin zu Cholest-4-n-3-on und Wasser- ^r. stoffperoxyd in Gegenwart von Sauerstoff katalysiert, ist das Hauptreagens, welches es ermöglicht, daß eine Flüssigkeit mit Cholesterin und Cholesterinestern auf ein erfindungsgemäßes analytisches Element aufgetragen werden und eine direkte photometrische oder fluorometrische Messung der Cholesterinkonzentration im Element erfolgen kann.

Cholesterin-Oxidase kann man nach bekannten Methoden erhalten.

Eine Methode zur Herstellung des Enzyms ist beispielsweise bekannt aus der Arbeit von T. C. Stadtman, veröffentlicht in dem Buch »Methods of Enzymology«, Bd. 1, Herausgeber: S. P.Colowick und N.O.Kaplan, Verlag Academic Press Inc. Publishers, 1955, S. 678—681, und der Arbeit von T. C. Stadtman, A.Cherkes und J. Anfinsen in »Biol. Chem.« (1954), Bd. 206, S. 511. Als besonders vorteilhaft hat sich ein Element erwiesen, das ein Cholesterin-Oxidase-Enzym enthält, das, wie in den DE-OS 22 46 695 und 25 12 606 beschrieben, durch Züchtung von Mikroorganismen vom Typ Nocardia erhalten wird.

Da Cholesterin-Oxidase, wie die meisten Enzyme, nur innerhalb eines vergleichsweise engen pH-Wertbereiches besonders wirksam ist, ut es im allgemeinen erforderlich, die Reagensschicht, die dieses Enzym enthält, auf einen pH-Wertbereich innerhalb des wirksamen pH-Wertbereiches des Enzyms abzupuffern. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, die Reagensschicht mit der Cholesterin-Oxidase auf einen pH-Wertbereich von etwa 5,5 bis 85, insbesondere von 6,0 bis 7,0 abzupuffern, obgleich auch außerhalb des angegebenen breiten Bereiches eine gewisse Enzymaktivität festgestellt werden kann. Zum Abpuffern der Reagensschicht können bekannte übliche Methoden angewandt werden. Dies bedeutet, daß in der Beschichtungsmasse zur Erzeugung der Reagensschicht Puffersubstanzen gelöst oder dispergiert werden können. Geeignete Puffersubstanzen zum Abpuffern des pH-Wertes werden näher beispielsweise beschrieben von Good in der Zeitschrift »Biochemistry«, 5, (1966), S. 467. Besonders vorteilhafte Puffersubstanzen sind beispielsweise Phosphate, z. B. Kaliumphosphat, das sogenannte Tris (d. h. Tris(hydroxymethyi)arninornethan) und das sogenannte Hepes (d. h. N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure) sowie Dimethylglutarat

Ein erfindungsgemäßes mehrschichtiges analytisches Element kann ein beliebiges bekanntes Indikatorsystem für die Bestimmung von auf enzymatischem Wege erzeugtem Wasserstoffperoxyd aufweisen. Derartige Indikatorsysteme sind bekannt insbesondere für die Ermittlung von Glukose und Harnsäure. Aus den US-PS 30 92 465 und 29 81 606 beispielweise sind geeignete Indikator-Systeme, die sich zur Herstellung eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung eignen, bekannt Die Wasserstoffperoxyd-Indikatorsysteme weisen

im allgemeinen eine Substanz mit peroxidativer Aktivität, vorzugsweise Peroxidase auf und einen Indikator, welcher die Farbbildung oder Farbänderung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Sauerstoff unterliegt.

djj Ande-erseits kann der Indikator aus einer oder mehreren Substanzen bestehen, welche keiner wesentlichen

I Farbveränderung bei Oxidation in Gegenwart von H2O2 und Peroxidase unterliegen, welche jedoch in ihrer

I 5 oxidierten Form mit einer farbbildenden oder farbverändernden Verbindung reagieren, so daß eine quantitative

I Messung der stattgefundenen chemischen Reaktion ermöglicht wird. Ein solches Farb-Indikatorsystem ist

I beispielsweise aus der US-PS 29 81 606 bekannt. Ein solches Farbsystem, d. h. ein System, bei welchem eine

I farbige Substanz mittels einer Zwischenverbindung oder auf Grund einer Farbkupplungsreaktion erzeugt wird,

I läßt sich in bes&nders vorteilhafter Weise in einem mehrschichtigen analytischen Element nach der Erfindung

I 10 verwenden. Das Indikator-System wird der Reagensschicht mit dem Cholesterin·Oxidase-Enzym einverleibt.

1 Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß die Komponenten des Indikatorsystems in der zur Erzeugung ■'] der Reagensschicht bestimmten bindemittelhaltigen Beschichtungsmasse dispergiert werden, beispielsweise in <;': einer gelatinehaltigen Beschichtungsmasse, worauf sie auf den Schichtträger aufgetragen werden, beispielsweise ■j nach dem in der BE-PS 8 01 742 beschriebenen Verfahren.

j 15 Eine Peroxidase ist bekanntlich ein Enzym, welches eine Reaktion katalysiert, bei welcher Wasserstoffperoxid ;i eine andere Verbindung oxidiert. Bei den Peroxidasen handelt es sich im allgemeinen um konjugierte Proteine

.'; mit Eisenporphyrin, Peroxidase kommt beispielsweise bekanntlich in Meerrettich, Kartoffeln, Feigenbaumsaft

; und Rübenkraut vor (pflanzliche Peroxidase), ferner in Milch (Lacto-Peroxidase) sowie in weißen Blutkörper-

■; chen (Verdo-Peroxidase) sowie ferner in Mikroorganismen. Außer diesen Peroxidasen können auch synthetische

"' 20 Peroxidasen verwendet werden, wie sie beispielsweise aus der Arbeit von Theorell und Maehly in »Acta Chem. Scand.«, Bd. 4, S. 422 bis 434 (1950) bekannt sind. Weniger geeignet sind Substanzen, wie Hämin, Methämoglobin, ;' Oxihämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen,alkalisches Hämatin, Häminderivate und andere Komponenten,

^; welche peroxidative oder Peroxidase-gleiche Aktivität enthalten, d. h. die Fähigkeit haben, die Oxidation von

ι bestimmten Verbindungen mittels Wasserstoffperoxid und anderen Peroxiden zu katalysieren. Es wird ange-

":} 25 nommen.daß die verschiedenen Peroxidasen Hämatin enthalten.

J\ Andere Stoffe, welche keine Enzyme sind, jedoch eine Peroxidase-gleiche oder ähnliche Aktivität entfalten,

'.:* sind beispielsweise Eisensulfocyanat, Eisentannat, Ferroferrocyanid, Chromisalze, z. B. Kaliumchromisulfat. ab-

; sorbiert in Kieselsäuregel u. dgl. Auch derartige Substanzen sind verwendbar, obgleich sie nicht ganz so vorteil-

. haft wie Peroxidase selbst sind.

■£.' 30 Farberzeugende Substrate von Peroxidase und Peroxidase-gleichen oder ähnlichen Substanzen, welche zu einer Farberzeugung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase führen und welche im Indikatorsy-' stern eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung verwendet werden können, si i beispielsweise die im folgenden angegebenen Substanzen, gegebenenfalls in Kombination mit einem Kuppler, falls erforderlich:

i: 1) Monoamine, z. B.Anilin und Anilinderivate sowie ortho-Toluidin, para-Toluidin u.dgl.;

7. 2) Diamine, z. B. ortho-Phenylendiamin: N.N'-Dimethyl-para-phenylendiamin; N,N'-Diäthylphenylendiamin;

2 Benzidin (weiches einen biauen oder braunen Farbton hervorruft), Dianisidin (weiches nach Grün oder :■ Braun umschlägt) u. dgl.;

■•j 40 3) Phenole, z. B. Phenol selbst (das eine gelben Farbton hervorruft). Thymol, ο-, m- und p-KresoIe (die zu einem grüngelben Farbton, einem rosaroten Farbton bzw. einer milchigen Suspension führen), Λ-Naphthol (das zu einem purpurroten Farbton führt),/?-Naphthol (das zu einem weißen Niederschlag führt) u. dgl.;
4) Polyphenole, z. B. Brenzkatechin, Guaiacol (welches einen orangen Farbton herbeiführt), Orcinol, Pyrogallol (welches einen rötlichen oder gelben Farbton herbeiführt), ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl und Phloroglucinol; 45 5) aromatische Säuren, z. B. Salicylsäure, 2,3-Dihydroxybenzoesäure und Gallussäuren;

6) Leukofarbstoffe, z. B. Leukomalachitgrün, das zu Melachitgrün führt, und Leukophenolphthalein (das zweckmäßig in einem alkalischen Medium verwendet wird);

7) Farbstoffe, z. B. 2,6-Dichlorphenolindophenol;

8) verschiedene biologische Substanzen, wie beispielsweise Epinphrin, die Flavone, Tyrosin, Dihydroxypheny-50 lalanin (das zu einem orangerötlichen Farbton führt) und Tryptophan;

9) weitere Substanzen, wie beispielsweise Gum guaiac, Guaiaconsäure, Kalium-, Natrium- und andere in Wasser lösliche Jodide sowie Bilirubin (das zu einem grünlichen Farbton führt) und

10) spezielle Farbstoffe, wie beispielsweise 2,2'-Azin-di(3-äthylbenzothiazoIin-(6)-sulfonsäure) und 3,3'-Diamin-

obenzidin.
55

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthält das Fa^rbindikatorsystcm 4-Mcthoxy-1 -naphthol, das im oxidierten Zustand einer Selbstkupplung unterliegt, oder eine Kombination von 1,7-Dihydroxynaphthalin und 4-Aminoantipyrin (HCl). In dem zuletzt genannten System kuppelt die Pyrinverbindung mit dem Naphthalin. Die Konzentration der verschiedenen Farbindikatorsysteme in analytischen Elementen nach der 60 Erfindung können sehr verschieden sein. Im wesentlichen hängen die im Einzelfalle günstigsten Konzentrationen von dem Cholesteringehalt der zu testenden Probe ab, der Arbeitsweise des Analysegerätes u. dgl. Typische Konzentrationswerte ergeben sich aus den später folgenden Beispielen.

Eine besonders vorteilhafte Lipase, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist die Lipase M von Candida cylindracea, Hersteller Enzyme Development Co, USA, welche beispielsweise zu einer quantitativen 65 Hydrolyse von Serum-Cholesterinestern in einer Zeitspanne von etwa 10 Minuten bei 50"C führt.

Die erfindungsgemäß verwendbare Lipase kann pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein, muß jedoch eine Esterase-Aktivität aufweisen. Vorzugsweise wird eine mikrobiologische Lipase verwendet beispielsweise die Lipase von Candida cylindracea und Lipasen mit ähnlicher oder entsprechender Aktivität. Als besonders

vorteilhaft hat sich die Verwendung von handelsüblichen Lipasen, wie beispielsweise Weizenkeimlipase erwiesen, beispielsweise eine solche Weizenkeimlipase, wie sie von der Firma Miles Laboratories of Elkhart, Indiana, USA, vertrieben wird der eine Lipase vom Typ der Lipase 3000, die von der Firma Wilson Laboratories, angeboten oder Steapsin, die von der Firma Sigma Chemical Company, USA, vertrieben wird, wobei die beiden zuletzt genannten Enzyme pancreatische Enzyme sind, sowie die Lipase M (von Candida cylindracea), die von der Firma Enzyme Development Co., USA, hergestellt wird.

Zur Herstellung mehrschichtiger analytischer Elemente nach der Erfindung lassen sich somit handelsübliche Lipasen verwenden.

Zur Herstellung mehrschichtiger analytischer Elemente nach der Erfindung besonders geeignete Lipasen sind solche mit einer Cholesterin-Esterase-Aktivität, die einem Freisetzen von mehr als etwa 25 mg/100 ml Cholesterin entspricht.

Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Esterase-Aktivität von Lipaseenzymen besteht darin, eine bestimmte Menge eines Lipasepräparates zu einer Standard-Cholesteryllinoleat-Lösung bei einem pH-Wert von 7,0 zuzugeben, das Ganze bei 37°C unter N2 zwei Stunden lang zu inkubieren und danach die in der Lösung verbliebene Estermenge nach der Hydroxyl-amin-Methode von J. Vonhoeffmayr und R. Fried, veröffentlicht in Z. Klin. Chem. U. KHn. Biochem,8,134 (1970) zu bestimmen.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Elemente können des weiteren die verschiedensten üblichen bekannten Proteasen verwendet werden, beispielsweise Chymotrypsin, Streptomyces griseus Protease (im Handel erhältlich unter der Handelsbezeichnung »Pronase«), Proteasen von Aspergi'lus oryzac, Bacillus subtiüs, Elastase, Papain uⁿ.d Bromelain. Auch können Mischungen derartiger Enzyme verwendet werden.

Das Hydrolysesystem kann in die Cholesterin-Oxidase-Reagensschicht eingebaut werden. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das Hydrolysesystem jedoch in die poröse Ausbreitschicht eingebaut, beispielsweise durch einfaches Dispergieren der Enzyme in einem lyophilisier'.en Zustand in dem Beschichtungsmedium, das zur Erzeugung der Ausbreitschicht verwendet wird, worauf die Beschichtungsmasse auf die Reagensschicht aufgetragen wird.

Bei Verwendung eines solchen analytischen Elements erfolgen Ausbreiten der zu analysierenden Probe und Hydrolyse vorhandener Cholesterinester gleichzeitig, so daß auf die Reagensschicht nur freies Cholesterin auftrifft.

Alternativ kann das Hydrolysesystem jedoch auch in einer besonderen Schicht oder Teilschicht zwischen Ausbreitschicht und eigentlicher Reagensschicht oder der die Cholesterin-Oxidase enthaltenden Teilschicht untergebracht werden, so daß eine Hydrolyse der Cholesterinester erfolgen kann, bevor diese auf die Reagensschicht mit der Cholesterin-Oxidase auftreffen.

Optimale Ergebnisse werden dann erhalten, wenn die Schicht oder Matrix, die das Hydrolysesystem enthält, auf einen pH-Wert von 5 bis 9,5, insbesondere von etwa 7,0 bis 8,0 abgepuffert ist. Wird das Hydrolysesystem beispielsweise in die Reagensschicht oder in eine andere Schicht mit der Cholesterin-Oxidase eingebaut, so werden in der Regel optimale Ergebnisse dann erhalten, wenn die Schicht einen pH-Wert von etwa 7,0 aufweist. Entsprechende oder ähnliche Werte werden vorzugsweise angewandt, wenn das Hydrolysesystem in einer zweiten Reagensschicht untergebracht wird.

Die Konzentrationen von Lipase und Protease können sehr verschieden sein, in we'eher Schicht auch immer das Hydrolysesystem vorhanden ist Ganz allgemein jedoch haben sich Lipase-Konzentrationen von etwa 90 000 bis 270 000 E/m² und Protease-Konzentrationen von etwa 36 000 bis etwa 105 000 E/m² als vorteilhaft erwiesen. Höhere Konzentrationen können angewandt werden, doch dürften derartige Konzentrationen vom kommerziellen Standpunkt her wenig zweckmäßig sein. Als vorteilhaft haben sich Lipase-Konzentrationen von <?twa 150 000 bis 200 000 E/m² Proteasekonzentrationen von etwa 72 000 bis etwa 90 000 E/m² erwiesen.

Wird die Protease in eine Reagensschicht eingearbeitet, deren Bindemittel oder Matrix primär aus Gelatine besteht, so können sich gewisse Stabilitätsprobleme ergeben, da die Protease die Gelatine angreifen kann. Obgleich Elemente, welche die Protease und demzufolge das Hydrolysesystem in einer Gelatine-Reagensschicht enthalten, für analytische Zwecke verwendbar sind, hat es sich doch als vorteilhaft erwiesen, das Hydrolysesystem in das polymere Bindemittel der Ausbreit-, Filter- und reflektierenden Schicht unterzubringen, welche gegenüber der Einwirkung von Protease resistent ist Als weitere Maßnahme zum Schutz der Gelatine der ersten Reagensschicht vor der Einwirkung von Protease kann eine Schutz- oder Trennschicht, entsprechend der Schicht 54 von F i g. 5 vorgesehen werden. Bei einer solchen Ausgestaltung eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung kann es des weiteren vorteilhaft sein, das Cholesterin-Oxidase-Enzym nahe zum Hydrolysesystem unterzubringen, derart, daß die Bestimmung in der ersten Reagensschicht 52 lediglich erfordert, daß die vergleichsweise kleinen Wasserstoffperoxidmoleküle die Trenn-Schicht durchdringen können, wohingegen die größeren Protease-Enzymmoleküle daran gehindert werden, zwischen der ersten und zweiten Reagensschicht zu wandern.

Trennschichten des beschriebenen Typs eignen sich in entsprechender Weise zum Schutz von Reagensschichten, welche das Cholesterin-Oxidase-Enzym und das Indikatorsystem enthalten, da sie den Durchtritt von freiem Cholesterin aus dem porösen Ausbreitmedium in die Reagensschicht ermöglichen, während der Durchtritt der Protease verhindert wird.

Zur Herstellung der Trennschicht können die verschiedensten Stoffe verwendet werden. Vorzugsweise werden derartige Trennschichten aus hydrophilen Polymeren aufgebaut welche einen Durchtritt oder eine Wanderung des Wasserstoffperoxids sowie von freiem Cholesterin ermöglichen, während sie gleichzeitig den Durchtritt des Proteaseenzyms verhindern. Vorzugsweise wird zur Erzeugung einer derartigen Trennschicht Agarose verwendet, und zwar in einer Schichtstärke von vorzugsweise etwa 0,1 bis 1 g/m². Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird zur Herstellung einer derartigen Trennschicht Agarose in einer Konzentration von etwa 0,25 bis etwa 0,70 g/m² verwendet

Die folgenden speziellen Beispiele sollten die Erfindung noch näher veranschaulichen. Beispiel 1

Ein mehrschichtiges analytisches Element mit sämtlichen Reagenzien für die quantitative Analyse des Gesamtcholesterins eines Blutserums wurde in folgender Weise hergestellt:

Auf einen Polyäthylenterephthalatfilmschichtträger mit einer Gelatinehaftschicht einer Stärke von 0,18 mm wurden die folgenden Schichten aufgetragen. Die im folgenden angegebenen Konzentrationsangahen beziehen sich jeweils auf eine Schichtträgerfläche von 1 m²:

ίο Eine Reagensschicht aus 21,5 g Gelatine, 7000 Einheiten Peroxidase, 430 mg Bis(vinylsulfonylmethyl)äther, 1936 Einheiten Cholesterin-Oxidase, 2,7 g Octylphenoxypolyäthoxyäthanoi, 750 mg 4-Methoxy-l-naphthoI, 215 mgS^-DimethyU^-cyclo-hexandion und Phosphatpuffer zur Einstellung eines pH-Wertes von 6,43;

eine Zwischenschicht aus 323 mg Poly(n-isopropyl-acrylamid) und eine Ausbreitschicht aus 9,7 g Celluloseacetat, 64,5 g Titandioxid, 1,08 g Iipase M, 2,15 «-Chymotrypsin und 236 g Octyiphenoxypolyäthoxyäthanoi.

Zur Ermittlung der Wirksamkeit des hergestellten Elements wurden eine Reihe von Blutserumproben mit 122, 244 und 366 mg Cholesterin/100 ml hergestellt Auf das Element wurden dann 10 μΐ Tropfen aufgebracht worauf nach 12 Minuten bei 37°C spektrophotometrische Messungen mit einem 660-nm-Infrarotfilter durchgeführt wurden. Ermittelt wurde die Reflexionsdichte (Dr) des Elements und es wurden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse erhalten:

Test-Serum £>/<660nm

(mg/100 ml Cholesterin) (12Min.bei37°C)

122 0,12

244 0.18

366 0,19

Beispiel 2

Es wurde ein weiteres analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Gesamtcholesteringehaltes von Blutserum in folgender Weise hergestellt:

Auf einen Polyäthylenterephthalatfilmschichtträger mit einer Gelatinehaftschicht einer Stärke von 0,18 mm wurden die folgenden Schichten aufgetragen. Die im folgenden angegebenen Mengen beziehen sich dabei jeweils auf eine Schichtträgerfläche von 1 m².

Eine Reagensschicht aus 21,5 g Gelatine, 7000 Einheiten Peroxidase, 430 Einheiten Cholesterin-Oxidase, 656 mg 1,7-Dihydroxynaphthalin, 635 mg 4-Amino-antipyrinhydrochlorid und 10,8 mg 4-Amino-5,6-dihydroxy-2-methyIpyrimidin bei einem pH-Wert von 7,0; eine Trennschicht aus 108 mg Agarose;

eine Zwischenschicht aus 323 mg Poly-n-isopropyl-acrylamid und eine Ausbreitschicht mit Hydrolyseenzymen, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Das hergestellte Element wurde dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, getestet. Es wurden entsprechende Ergebnisse erhalten.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Cholesteringehaltcs von Flüssigkeiten mit:

(t) einem für Flüssigkeiten impermeablen, für Strahlungsenergie durchlässigen Schichtträger,

(2) einer Reagensschicht auf einer Seite des Schichtträgers mit einem Indikatorsystem, welches mit einem oder mehreren Reaktionsprodukten der durch die Cholesterin-Oxidase induzierten Zerfallsreaktion des Cholesterins reagiert, und zwar unter einer spektrophotometrisch quantitativ erfaßbaren Absorptkv.sverschiebung und einem in einem Bindemittel dispergierten Cholesterin-Oxidase-Enzym und

(3) mindestens einer über der Reagensschicht angeordneten Schicht aus einem porösen, für das Cholesterin der Flüssigkeit durchlässigen Medium, das die Flüssigkeit derart ausbreitet, daß ein praktisch konstantes Volumen der Flüssigkeit auf eine Flächeneinheit der Reagensschicht auftrifft,