DE2455970B2

DE2455970B2 - Verfahren und vorrichtung zur analyse von harnstoff

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Publication number: DE2455970B2
Application number: DE19742455970
Authority: DE
Priority date: 1973-12-21
Filing date: 1974-11-27
Publication date: 1977-07-21
Also published as: DE2455970C3; NL176308B; NL176308C; FR2255602B1; JPS5330035B2; US3926734A; DE2455970A1; AU7676174A; JPS5098396A; CA1039163A; GB1494490A; NL7415252A; FR2255602A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Harnstoffbestimmung in einer wäßrigen Probe, bei dem Harnstoff mittels Urease hydrolysiert, der entstandene Ammoniak nach Diffusion durch eine hydrophobe Membran bestimmt und anschließend die Ammoniakwerte in die äquivalente Probenharnstoffmenge umgerechnet werden.

Derartige Verfahren sind beispielsweise aus einem Artikel über Harnstoff (E. Bernt und H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 2. Auflage, 1970, Band 2, S. 1738 ff.) bekanntgeworden. Dort werden verschiedene quantitative Methoden zur Harnstoffbestimmung beschrieben, z. B. gravimetrische chemische Verfahren, verschiedene photometrische Bestimmungen und auch die enzymatische Hydrolyse von Harnstoff mittels Urease, wobei Ammoniak direkt gebildet wird. Anschließend diffundiert der Ammoniak durch eine Membran und wird titriert, oder nach einem anderen dort beschriebenen Verfahren wird der Ammoniak drei weiteren Folgereaktionen unterworfen, um 2-Indophenol herzustellen, dessen Gehalt dann kolorimetrisch bestimmt wird und proportional zur Harnstoffmenge ist. Dieses Verfahren ist dadurch besonders nachteilig, daß eine große Anzahl von Reagenzien notwendig ist, um die 4-Stufen-Reaktion ('5 durchzuführen, die zudem noch von p.a.-Qualität sein müssen. Ferner ist die Extinktion nur bis zu 20 g Harnstoff/100 ml Harn der Konzentration proportional, so daß keine Proben analysiert werden können, die einen größeren Harnstoffgehalt aufweisen. Weiterhin macht sich auch nachteilig bemerkbar, daß die Faibreaktion erst innerhalb von 20—30 Minuten beendet ist, so daß dieser Zeitfaktor bei Routinearbeiten besonders unvorteilhaft ist.

Ferner sind aus der US-PS 37 76 819 sowie aus dem IBM-Technical Disclosure Bulletin, Vol. 11, No. 4, September 1968, S. 374 und 375, auch sogenannte Enzymelektroden bekannt, bei denen die Harnstoffprobe über eine Hydrolysezone mit immobilisierter Urease geleitet wird. Danach werden derartige Harnstoffbestimmungen insbesondere bei biologischen Flüssigkeiten wie Blut angewendet. Dabei wird die immobilisierte Urease durch eine semipermeable Membran von der Probenlösung abgetrennt, um zu verhindern, daß die Urease direkt mit der Harnstofflösung in Kontakt kommt bzw. durch sie ausgelaugt wird, Lediglich Hiarnstoff kann die semipermeable Membran durchdringen, um mit der Urease zu reagieren. Nachteilig macht sich bei diesen Enzymelektroden bemerkbar, daß eine Membran erforderlich ist, um die Urease von der Probe abzutrennen, damit sie nicht angegriffen wird oder selbst in die Probenflüssigkeit übergeht. Bei der genannten US-PS ist es ferner notwendig, die Urease in Form eines besonderen Überzuges auf die Elektrode selbst aufzubringen, der dann wiederum mit der Membran beschichtet wird.

Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verfahren und eine Vorrichtung zur quantitativen Harnstoffanalyse zu schaffen, die die aufgezeigten Nachteile des Standes der Technik vermeiden und allgemein anwendbar sind und außerdem genau und zeitsparend arbeiten.

Bei einem Verfahren der eingangs genannten Art wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die Probe über in einer Hydrolysezone immobilisierte Urease geleitet und in dieser Zone unter Bildung von Ammonium-Ionen hydrolysiert wird, daß die Hydrolysemischung aus der Hydrolysezone entfernt und ihr pH-Wert auf mindestens etwa 11 angehoben wird, um die Ammonium-Ionen enthaltende Mischung in eine wäßrige Ammoniaklösung zu überführen und daß der durch die Membran diffundierte Ammoniak in einem Elektrolyten gelöst und der daraus entstandene Anstieg des pH-Wertes im Elektrolyten potentiometrirch bestimmt wird.

Durch das erfindungsgemälie Verfahren und die ao Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist die quantitative Harnstoff analyse insoweit verbessert worden, als nunmehr auf eine Membran zwischen Urease und Probenlösung sowie eine Diffusion des Harnstoffs durch diese Membran verzichtet werden kann, wobei außerdem keine besondere Beschichtung der Elektrode mit Urease mehr benötigt wird. Ferner können erfindungsgemäß exakte Werte schnell bei verschiedenen Anwendungsgebieten zuverlässig ermittelt werden, ohne daß eine umständliche Mehrstufenreaktion mit anschließender photometrischer Bestimmung des entstandenen Farbstoffs durchgeführt werden muß, sondern vielmehr eine potentiometrische Analyse vorgenommen werden kann, die keine Inaktivierung des immobilisierten Enzyms verursacht und auch bei Fremd-Kationen in der Harnstoffprobe einwandfrei arbeitet. Eine schnelle Analyse ist auch bei Anwesenheit von 1 wertigen Kationen, wie Lithium-, Natrium- und Kalium-Ionen möglich, da die immobilisierte Urease von der potentiometrischen Elektrode getrennt ist, die wiederum nur auf eine Änderung des pH-Wertes anspricht, für die ausschließlich das Ammoniakgas verantwortlich ist. Erfindungsgemäß wird eine Inaktivierung der immobilisierten Urease durch den für die Umwandlung der Ammonium-Ionen in Ammoniak notwendigen pH-Wert dadurch verhindert, daß die Hydrolysezone von dem Bereich räumlich getrennt ist, wo der Basenzusatz erfolgt, um eine stark alkalische Lösung mit einem pH-Wert von mindestens 11 herzustellen.

Im folgenden werden bevorzugte Ausfüiirungsformen der vorliegenden Erfindung an Hand der Figuren beschrieben:

Es zeigt

F i g. 1 ein schematisches Ablaufdiagramm,

F i g. 2 und 3 Querschnitte durch eine Ausführungsform einer pH-Elektrodenzelle mit einer hydrophoben ammoniakpermeablen Membran.

Gemäß F i g. 1 fließt eine wäßrige Probe, die Harnstoff enthält, in ein Bett aus immobilisierter fto Urease, das als Hydrolysezone wirkt, indem die Probe eine Zeitlang auf einer Temperatur gehalten wird, die zur Hydrolyse des Harnstoffs zu Ammonium-Ionen ausreicht. Die Probe wird vorzugsweise so lange in Kontakt mit der immobilisierten Urease gehalten, bis ft.s der gesamte Harnstoff zu Ammonium-Ionen hydrolisiert wird. Diese Hydrolyse wird normalerweise in einigen Sekunden bis 30 Minuten oder länger bei Temperaturen von 0 bis etwa 5(TC und mehr vervollständigt. Die Hydrolysereaktion verläuft etwa nach folgender Gleichung:

Il

2H" + H₂O + H₂N-C-NH₂
Urease,

2NHi" + CO₂

2 H" + OH' + H₂O + H₂N-C-NH₂

Urease.

2NHi" +

Es wird angenommen, daß die Urease bei einem pH-Wert vcn etwa 5 bis 9 für die Hydrolyse des Harnstoffs am wirksamsten ist. Wegen dieser Tatsache wird die Harnstoffprobe, bevor sie mit der Urease in Kontakt tritt, gewöhnlich mit einem wäßrigen Verdünnungsmittel vermischt, das auf einen pH-Wert von 5 bis 9 abgepuffert ist.

Der Verdünnungsgrad der Harnstoffprobe mit dem abgepufferten Verdünnungsmittel variiert mit der Konzentration des Harnstoffes in der Probe. Bei physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut oder Urin, die innerhalb des erwarteten Konzentrationsbereiches eine unbekannte Konzentration aufweisen, ist ein Verhältnis von einem Volumenteil Probe auf 25 bis 50 Teile Verdünnungsmittel geeignet, um eine annehmbares Ansprechen der Elektrode zu erzielen. Gewöhnlich wird aus Sparsamkeits- und Wirtschaftlichkeitsgründen eine kleine Probe (etwa 10 bis 50 Mikroliter) zur Einführung in das Bett aus immobilisierter Urease in einen Strom eines abgepufferten Verdünnungsmittels, der mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 10 ml pro Minute fließt, eingegeben. Geeignete abgepufferte Verdünnungsmittel enthalten 0,01 M Natriumzitrat (pH 6,0), 0,01 M Natriummaleat (pH 6,2) und 0,01 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, eingestellt mit HCI auf einen pH-Wert von 7.

Zur Verzögerung der Inaktivierung der immobilisierten Urease und der Beschädigung des Trägermaterials können zusätzliche Reagenzien in das abgepufferte Verdünnungsmittel eingearbeitet werden. Dazu gehören Salze der Äthylendiamintetraessigsäure, um eine Vergiftung des Enzyms mit Schwermetallionen zu verhindern, 0-Mercaptoäthanol, um die Urease vor Oxydation zu schützen, und Natriumazid als Bakterieninhibitor.

Zur Immobilisierung von Urease auf einem unlöslichen Trägermaterial können sämtliche bekannte Verfahren Anwendung finden. Beispielsweise kann Urease kovalent mit einem aminofunktionellen Silan-Bindemittel an ein poröses Glasträgermaterial gebunden werden, wie es in dem Artikel »Urease Covalently Coupled to Porous Glass« von H. H. W e e t a 11 und LS. H e r s h , Biochim, Biophys. Acta, 185 (1969), Seiten 464—465, und in der US-Patentschrift 35 19 538 beschrieben ist, des weiteren kann Urease an wasserunlösliche Diazoniumsalze gebunden werden, wie es in dem Artikel »Preparation and Properties of Waterinsoluble Derivatives of Urease« von E. R i e s e 1 und E. Katchalski, journal of Biologial Chemistry, Vol. 239, No. 5 (1964), Seite 1521, beschrieben ist, oder Urease kann kovalent

an Nylon gebunden werden, mit dem Verfahren, das in dem Artikel »The Immobilization of Enzymes on Nylon Structures and their Use in Automated Analysis« von D. J. Inman und W. E. Hornby, Biochem. J. (1972), 129, Seiten 255—262, erwähnt ist, des weiteren kann Urease mit einem in dem Artikel »A Urea-Specific Enzyme Electrode« von G. G. G u i 1 b a u 11 und J. G. Mont al vo, Jr., Journal of American Chemical Society, 91 (1969), Seiten 2164—2165, beschriebenen Verfahren auf einem Polyacrylamidgel immobilisiert werden, oder Urease kann auf der Oberfläche von Kaolinit absorbiert werden, beschrieben in dem Artikel »Preparation and Properlies of Solid-Supported Urease« von P. V. Sundaram und E. M. Crook, Canadian Journal of Biochemistry, Vol. 49 (1971), Seiten 1388—1394, und schließlich kann Urease gemäß dem Verfahren des US-Patents 36 45 852 mit dem Titel »Method of Bindung Water-soluble Proteins and Watersoluble Peptides to Water-insoluble Polymers Using Cyanogen Halide« von R. Axen, J. Porath und E. Ernbach und dem Artikel »The Preparation and Characterization of Lyophilized Polyacrylamide Enzyme Gels for Chemical Analysis« von G. P. H i c k s und S. J. Updike, erschienen im Analytical Chemistry, Vol. 38, No. 6, Mai 1966, Seite 726, mit Zyanbromid immobilisiert werden. Bei der Ausbildung des Bettes aus immobilisierter Urease ist daher die Auswahl des Trägermaterials aus Materialien, wie poröses Glas, Ton, wasserunlösliche Polymerisate, und das Immobilisieren der Urease auf diesen Materialien auf chemischem oder physikalischem Wege bekannt.

Nach der Hydrolyse des Harnstoffes strömt die resultierende Hydrolysemischung, die die Ammoniumionen enthält, aus dem Bett der immobilisierten Urease heraus und wird in einer geeigneten Mischkammer in ausreichender Weise mit einer Base vermischt, um den pH-Wert der Mischung mindestens auf etwa 11 zu stellen. Bei diesem pH-Wert und darüber werden nahezu alle Ammoniumionen in eine wäßrige Ammoniaklösung umgewandelt. Die Mischkammer weist einen Einlaß für den hydrolysiertcn Harnstoff, einen Einlaß für die Base und einen Auslaß für die entstehende Reaktionsmischung auf. In der Mischkammer kann zum Vermischen der Base mit dem hydrolysiertcn Harnstoff jeder beliebige Mixertyp, beispielsweise ein Impeller oder ein Schaufelmischer Anwendung finden, obgleich mit einem kleinen magnetisch betätigten Mixerstab bereits befriedigende Ergebnisse erzielt wurden.

Zur Einstellung des pH-Wertes auf mindestens etwa 11 kann jede beliebige Base verwendet werden, die keinen Ammoniak oder Ammoniumionen enthält. Geeignete Basen sind die Alkalimetallhydroxide [d. h. Ca(OH)₂ oder Mg(OH)₂], obgleich aus Wirtschaftlichkeils- und Sparsamkeitsgründen bei der pH-Werieinstellung verdünnte wäßrige Lösungen von Alkalimetallhydroxiden, insbesondere NaOH, mit Konzentrationen von etwa 0,01 bis etwa IN bevorzugt werden.

Nach Einstellung des pH-Wertes auf mindestens 11 wird die resultierende wäßrige Ammoniaklösung mit einer hydrophoben, ammoniakpermeablen Membran über einen Zeitraum in Kontakt gebracht, der ausreicht, den gasförmigen Ammoniak durch die Membran dringen zu lassen. Derartige hydrophobe Membranen lassen gasförmigen Ammoniak hindurchtreten, während sie wäßrige Lösungen zurückhalten, und können in der Form von hydrophoben porösen und mikroporösen Kunststoffllmen mit einer Stärke von etwa 0,1 bis etwa 10 mil, einer Porosität von etwa 10 bis etwa 33% und einem Porendurchmesser von etwa 0,05 bis 10 μι ausgebildet sein. Vorzugsweise weisen derartige mikroporöse Kunststoffilme eine Dicke von etwa 0,5 bis 5 mil, eine Porosität von etwa 25% bis 80% und einen durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 0,05 bis 5 μ auf. Geeignete Kunststoffmembranen sind in der Form von porösen Kopolymerisaten von Acrylnitril und Vinylchlorid auf einem Nylonträgermaterial, als poröses hydrophobes Zelluloseazetat, poröses Polytetrafluor-

ίο äthylen, als mikroporöses Polypropylen, als poröses Polyvinylidenfluorid und anderen Membranmaterialien, die in dem US-Patent 36 49 505 beschrieben sind, im Handel. Diese Membranen gestatten die Diffusion von gasförmigem Ammoniak, während einwertige Ionen,

is wie Na⁴, Kⁱ oder Li ⁺ , in der wäßrigen Lösung verbleiben, die nicht durch die Membran diffundiert.

Der durch die Membran dringende gasförmige Ammoniak wird danach zu einer pH-Elektrodenzelle geleitet, die eine wäßrige Elektrolytlösung enthält. Der gasförmige Ammoniak löst sich in dieser Elektrolytlösung und läßt auf diese Weise den pH-Wert der Lösung ansteigen. Dieser Anstieg des pH-Wertes wird mit einer pH-sensitiven Elektrode potentiometrisch gemessen.
Die Elektrolytlösung ist gewöhnlich eine verdünnte

2s Lösung eines Ammoniumsalzes (0,1 M NH⁴Cl), so daß auf diese Weise eine Basis-Ammoniumionenkonzentration geschaffen wird, gegenüber der ein Ansteigen des pH-Wertes rasch gemessen werden kann. Dieser Anstieg des pH-Wertes ist eine Funktion der Ammoniakgasmenge, die durch die Membran dringt. Die entsprechende potentiometrische Ablesung auf der pH-Elektrode kann rasch in die äquivalente Menge Harnstoff der ursprünglichen Probe umgewandelt werden. Die äquivalente Harnstoffmenge der Ursprunges liehen Probe wird normalerweise in mg Blut-Harnstoff-Stickstoff (BHS/lOOml Probe) angegeben. Diese Einheiten sind bei klinischen Anwendungszwecken gebräuchlich.
In Fig.2 ist ein Querschnitt durch eine pH-Elcktrodenzelle gezeigt, die erfindungsgemäß eingesetzt werden kann.

F i g. 3 ist eine Vergrößerung der F i g. 2, wobei Teile nicht gezeigt sind, in der die Membran und die Elektrode im Detail dargestellt sind. Wie man den F i g. 2 und 3 entnehmen kann, umfaßt die pH-Zelle 10 eine Elcktrodcnkammcr 10a, mit der das Membrangehäuse 106 über ein Schraubengewinde tOc in Eingriff steht. Die Kammer 10a enthält eine pH-sensitive Elektrode 11, die eine herkömmliche Glaselektrode sein kann, welche auf eine geeignete herkömmliche Standard-Bezugselektrode 12, beispielsweise einen Platindraht, der mit Silbcr/Silberchlorid beschichtet ist, bezogen ist. Beide Elektroden werden von der Elektrodenhalterung 20, die mit einem Dichtungsring 21 ausgerüstet ist,

S5 gehalten. Die Elektroden 11 und 12 sind elektrisch an ein herkömmliches potentiometrlsches pH-Meßwerk angeschlossen, das nicht gezeigt ist.

Die Abtastspitzen der Elektroden U und 12 erstrecken sich in den Elektrolythohlraum 13, der eine

fto wäßrige NHiCl-Lösung (0,1 M) enthält. Der Boden des Elektrolythohlraumes 13 wird von einer hydrophoben, ammoniakpermeablen Membran 14 gebildet, in deren unmittelbarer Nähe die Abtastspitze der Elektrode 11 angeordnet ist Mittels des Membrangehäuses 10b und

6_S der Membranhalterung 22 wird die Membran 14 mit dem Elektrolythohlraum 13 in Kontakt gehalten. Über den Dichtring 16 wird eine flüssigkeitsdichte Verbindung erzielt. Das Membrangehäuse' XOb ist darüber

hinaus mit einem engen Durchgang 17 versehen, durch den die den Ammoniak enthaltende Probe in die Durchdringungskammer 23 dringt. Der Durchgang 17 und die Durchdringungskammer 23 weisen solche Abmessungen auf, daß ein turbulentes Einströmen gesichert wird, um die Probe zum Erzielen eines wirksamen Ammoniakdurchganges der Membran 14 in maximaler Weise auszusetzen. Nach dem Kontakt mit der Membran 14 verläßt der Probenrest, der nunmehr keinen Ammoniak mehr aufweist, die Kammer über den Durchgang 18. Die potentiometrische Missung, die aus dem Ansteigen des pH-Wertes resultiert, wird mittels potentiometrischer Eichtechniken in die Harnstoffkonzentration der ursprünglichen Harnstoffprobe umgewandelt.

Bei dem oben beschriebenen Verfahren kann eine herkömmliche Ammoniakgaselektrode, beispielsweise eine handelsübliche Gastastelektrode oder eine Ammoniakelektrode Anwendung finden, bei denen die hydrophobe, ammoniakpermeable Membran in die pH-Elektrodenzelle eingearbeitet ist.

Bei der wirksamsten Ausführungsform für die klinische Laborarbeit werden das abgepufferte Verdünnungsmittel und die Base kontinuierlich durch das in Fig. 1 gezeigte System mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1 bis etwa 10 ml/Minute, gewöhnlich um etwa 1 ml/Minute, gepumpt. Etwa 10—25 Mikroliter Harnstoffprobe werden mit einer Spritze am Einlaß in das Bett aus immobilisierter Urease direkt in den Strom des abgepufferten Verdünnungsmittels eingegeben. Im Bett aus immobilisierter Urease wird der Harnstoff zu Ammoniumionen und Bicarbonationcn hydrolysiert. Nach dem Verlassen des Bettes mis immobilisierter Urease wird das Reaktionsprotlukt mit der Base vermischt, um zur Überführung de" Ammoniumionen in lösliches Ammoniakgas den pH-Wert auf mindestens etwa U ansteigen zu lassen. Bei diesem erhöhten pH-Wert werden die Bicarbonate nen in Carbonationen umgewandelt.

Der Strom des abgepufferten Verdünnungsmittels, der den gelösten Ammoniak enthält, tritt danach mit der hydrophoben, ammoniakpermcablon Membran in Berührung, wonach der Durchgang des Ammoniaks beginnt. Bevor jedoch auf beiden Seiten der Membran das Gleichgewicht erreicht ist, ist die Konzentration des gelösten Ammoniaks in dem abjiiepuffertcn Verdünnungsmittel auf einen Punkt abgesunken, bei dem Ammoniak aus der Elektrodcnclcktrolytlösung in den abgepufferien Verdünnungsmiilclsironi zurückdiffundiert.

Da die Harnstoffprobe in einer relativ hohen eingegrenzten Konzentration in den abgepufferten Verdünnungsmittelstrom eingegeben worden ist. tritt diese Reaktion schnell auf (d. h. innerhalb von etwa 2 oder 3 Minuten) und führt zu einem raschen Ansteigen des pH-Wertes, wodurch beim Ansprechen der potentiometrischen Elektrode eine scharfe Spitze entsteht. Die Änderungsrate des pH-Wertes ist eine Funktion der Konzentration, d.h., je höher die Konzentration von NH₃ in der Mikroumgebung der Elektrode ist, desto größer ist der Anstieg der pH-Kurve. Die Schärfe der Spitze Ist ebenfalls eine Funktion der Änderungsrate der NHj-Konzentration, d.h., die Schnelligkeit des Abfallens des pH-Wertes hangt davon ab, wie schnell der Ammoniak in den abgepufferten Verdünnungsmittelstrom zurückdiffundiert. Kleine Proben sollten schneller entfernt werden als große Proben. Die Höhe dieser scharfen Spitze ist ein Maß für die Harnstoffkonzentration. Die nächste Harnstoffprobe kann dann eingegeben werden, wenn die potentiometrische Ablesung zur Grundlinie oder an einen Punkt nahe der Grundlinie zurückgekehrt ist, so daß die nächste Harnstoffbestimmung nicht nachteilig beeinflußt wird.

Bei einer anderen Betriebsweise findet eine langsame Einführung der Harnstoffproben über längere Zeitperioden Anwendung, bis Gleichgewicht in der Ammo·

ίο niakdiffusion quer durch die Membran erreicht ist. Beispielsweise werden 10-25 Mikroliter einer Harnstoffprobe langsam und kontinuierlich unter vollständigem und gleichzeitigem Mischen über eine lOminütige Periode in einen abgepufferten Verdünnungsmittelstrom, der mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/Minute fließt, eingeführt. Dadurch wird mit einem konstanten pH-Wert im Elektrodenelektrolyten und einem entsprechend konstanten potentiometrischen Ansprechen Gleichgewicht erreicht. Nachdem die konstante AbIesung vorgenommen worden ist, wird die Einführung der Harnstoffprobe gestoppt, so daß die potentiometrische Ablesung zur Grundlinie zurückkehrt. Diese Technik wird jedoch weniger vorgezogen, da für jede Bestimmung ein längerer Zeitraum benötigt wird.

Nachstehend wird die Erfindung an Hand von Beispielen weiter erläutert, wobei alle Teile Gewichtsteile, alle Prozentsätze Gewichtsprozenlsätzc und alle Temperaluren in Grad Celsius angeführt sind, wenn nicht anders angegeben.

^J0 R e i s ρ i c I 1

In Beispiel 1 ist das abgepufferle Verdünnungsmittel eine wäßrige, O₁OlM Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomcthan, die auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt worden isi (mil HCI) und die Natriumäthylcndiamintetracssigsäure, /J-Mercaptoäthanol und Natriumazid jeweils in einer Konzentration von 0,001 M enthält.

Die zur Einstellung des pH-Wertes verwendete Base war eine 0,03 N-Natriumhydroxidlösung.

•ίο Das Ureasecnzym wurde von der Worthington Biochemical Corporation erhalten und wies eine Aktivität von 139 internationalen Einheilen pro mg auf.

Das Trägermaterial für die Immobilisierung des

Urcascen/yms war Agaroscgcl (ein stark poröses Polydcxlran), das unter der Warenbezeichnung Scpharose 4 B bei der Firma Pharmacia Fine Chemicals Inc.

erhältlich ist. Der Elektrolyt in dem Hohlraum 13 war 0,1MNH₄CI.

Als pH-Zelle wurde eine herkömmliche Glas-pll-

so Elektrode eingcsctzl unter Verwendung eines Silber-Silberchlorid-Elementes in einem IICI-Elcklrolylcn mit einer Silber-Silberchlorid-Bezugselektrode.

Als ammoniakpermeable, hydrophobe Membran wurde ein mikroporöser Polypropylenfilm mit einer Dicke von 1 mil, einer Porosität von 35%, einem durchschnittlichen Porendurchmesser von weniger al: 0,1 μ verwendet, der bei der Celanese Corporation untei der Warenbezeichnung Celgard 2400 erhältlich ist.

TeIIA

44 ml einer wäßrigen Dispersion von 4 Gewichtspro zent des oben beschriebenen Agarosegels wurden ir einen Buchner-Trlchter gegossen und mit destillierten Wasser gewaschen. Die Agarose auf dem Filter wurd< in ein Becherglas gegeben, wonach destilliertes Wassei unter Agitation so lange zugegeben wurde, bis eini Dispersion von 40 ml erhalten wurde, die dann Ii Zentrifugenröhren bei etwa 1000 Umdrehungen pn

709 Β29/4Ϊ

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936

ίο

Minute 5 Minuten lang zentrifugiert wurde. Nach Dekantieren des Obenstehenden wurde die Agarose im Boden der Zentrifugenröhren wiederum in ein Becherglas gegeben, wonach destilliertes Wasser unter Rühren zur Bildung eines einheitlichen Gels mit einem Volumen von 40 ml zugesetzt wurde.

Teil B

400 mg der oben beschriebenen Urease wurden in einer wäßrigen Lösung von 20 ml 0,05 M Natriumborat, die mit 6 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 0,5 eingestellt worden war, gelöst. Die entstandene I ,ösung wurde in einem Eisbad für die in Teil C beschriebene Verwendung gelagert.

TeilC

4 g von als Reagenz geeigneten Cyanbromidkristallen wurden dem Agarosegel von Teil A zugesetzt, und der pH-Wert wurde unter kontinuierlichem Rühren schnell mit 6,OM Natriumhydroxid auf etwa 11 eingestellt. Durch Zugabe des erforderlichen Natriumhydroxids (6,0 N) wurde der pH-Wert der Mischung auf diesem Wert oder im Bereich dieses Wertes gehalten; während dieser Zeit lösten sich die Cyanbromidkristalle langsam auf und reagierten. Diese Lösungsreaktion erforderte etwa 15 Minuten, während denen zerdrücktes Eis lugegeben wurde, um die Temperatur unter 20⁰C zu halten. Eine Gesamtmenge von etwa 40 ml von 6,0 M Natriumhydroxid war über diese 15minütige Periode erforderlich, um den pH-Wert auf 11 zu halten. ₎₀

Nachdem sich das Cyanbromid vollständig aufgelöst hatte und reagiert war, wurde das entstandene Gel auf einem Trichter aus gesintertem Glas mit 300 ml einer kalten 0,05 M Natriumboratlösung, die mit NaOH auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt -.v^rden war, gewaschen.

Das entstandene Agarosegel wurde in einen 100 ml Becher gegeben, und es wurde die in Teil B hergestellte kalte Ureaselösung sofort ohne Rühren zugesetzt. Das Urease/Agarose-Gel wurde dann rasch gefroren und 5 Minuten lang in diesem Zustand belassen. Danach wurde es über 20 Stunden auf O⁰C gehalten, wobei mit einem Magnetrührer leicht gerührt wurde.

Das entstandene immobilisierte zusammengesetzte Urease/Agarose-Gel wurde auf einem Trichter aus gesintertem Glas unter Ansaugen filtriert und zuerst mit einer 0,5 M Natriumchloridlösung und danach mit destilliertem, deionisiertem Wasser gewaschen, bis die Fütratspülungen frei von Urease waren, was durch das NichtVorhandensein einer Absorption bei der charaktcristischen Wellenlänge von 272 nm angezeigt wurde. Das immobilisierte zusammengesetzte Urcusc/Agurose-Oel wurde In 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-amlnomethan-Pufferlösung (pH 7,3) bei 0-3⁰C gelagert.

TeIID ^ss

Die Aktivität des immobilisierten Urease-Agarose-OeIs von Tell C wurde bestimmt, Indem eine bekannte Menge OeI mit einer 0,15 M Harnstofflösung, die 0,003 molar in Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und (« 1,0 χ 10-' mole·· in Dlnatrlumäthylendiamintetraessigsäure Ist, vermischt und die Änderung des pH-Wertes mit der Zelt gemessen wurde. Die Änderungsrate des pH-Wertes wurde mittels des Verfahrens von L Jakobsen,K. Lindstrom-Lang,M. Ottesen t> und D. Olick Ed. In »Methods of Biochemical Analysis«, Vol. IV, Intersclence Publishers, N. Y., 1937, Seite 171, in Enzymaktivität umgewandelt. Diese analytische Technik liefert eine Aktivität für die Urease von 10001. U./ml Gel, die nach Lagerung des Gels über 2 Monate bei 0-4° C in 0,05 M Tris-(hydroxymethy!)-aminomethan auf etwa 400 I. U./ml absinkt.

Teil E

Aus einer 75 mm Borosilikatglaskapillarröhre wurde eine Glasröhre mit einem Innendurchmesser von 2,8 mm und einem Außendurchmesser von 6 mm hergestellt. An einem Ende der Röhre wurde eine Nylonscheibe (400 mesh) befestigt. Die Röhre wurde mit dem immobilisierten Urease/Agarose-Gel von Teil C gefüllt. Das Urease/Agarose-Gel verdichtete sich in der Röhre durch die Schwerkraft. Nachdem die Röhre is mit dem Urease/Agarose-Gel gefüllt worden war, wurde auch das andere Ende der Röhre mit einer 500 mesh Nylonscheibe versehen.

Die Röhrenenden wurden dann mit T-förmigen Kunststoffrohrverschraubungen zur Probeneinführung ausgestattet. Die T-Stücke waren mit einer Kunststoffmembran zur Probeneinführung mit einer hypodermischen Nadel versehen.

Die oben beschriebenen Lösungen aus dem abgepufferten Verdünnungsmittel und der Base wurden durch die in Fig. 1 beschriebene Vorrichtung mit jeweils 1,0 ml/Minute gepumpt. 10 Mikroliter Doppelproben mit den oben beschriebenen Harnstoffkonzent-ationen wurden mit einer hypodermischen Nadel durch die Injektions-T-Stücke in die Röhre mit dem immobilisierten Enzym injiziert, wie in F i g. 1 gezeigt ist. Die Analyse wurde wie in Verbindung mit der Zeichnung beschrieben durchgeführt. Es wurden folgende Ablesungen in Millivolt erhalten:

Konzentration des	Änderung der elektromotorischen
llamslolTcs in	Krall (in Millivolt) am
Wasser	pll-MeUtseriü
0,1 M	l^l)4,5
	I¹M₁O
0,01 M	138,5
	137,5
0,001 M	78,0
	78.0

Es wurde ein Kichdiagramm hergestellt, in dem die Änderung der elektromotorischen Kraft in Millivolt gegen den Logarithmus der Harnstoffkon/.cntrulion aufgetragen wurde. Dieses Diugrumm ist im wesentlichen eine Gerade, die Nernstsches Verhalten anzeigt

Es wurde eine Blutserumprobe unbekannter Harnstoffkon/entration analysiert, indem Proben von Mikroliter unter Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens in die Röhre injiziert wurden. Etwa eine Minute nach injektion der Probe wurde eine maximale Ablesung in Millivolt erhalten. In Intervallen von etwa 1 einer Minute wurden weitere Proben in die Röhre Injiziert. Kine Gesamtmenge von 50 Proben des Serums führte /u einer Änderung der elektromotorischen Kraft von 1JO11,0 Millivolt. Diese Änderung der elektromotorischen Kraft entspricht in dem oben beschriebenen ι Eichdiagramm einer Konzentratton von 740 x 10' molar Harnstoff. Diese Konzentration entspricht einem Blut-Hurnstoff-Stickstoff-Wort von 21,0±0,8 mg Stickstoff/100 ml Serum.

Ähnliche Analysenergebnisse wurden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten, das ein Enzymbett aus einem vernetzten Polydextran, erhältlich von der Firma Pharmacia Fine Chemicals Inc. unter der Warenbezeichnung Sephadex G-200, hergestellt wurde. Man ließ ein Gramm des vernetzten Polydextrans, 4 g Cyanbromid, 6,5 ml 6 N-Natriumhydroxid und 200 mg Urease gemäß dem oben beschriebenen Verfahren reagieren und erhielt ein immobilisiertes Urease/Polydextran-Gel mit einer Aktivität von etwa 400 I. U./111I Gel. Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn als hydrophobe, ammoniakpermeable Membran ein Copolymerisat aus- Acrylnitril und Vinylchlorid, das bei der Firma Gelman Instrument Company unter der Warenbezeichnung Acropor ANH-3000 erhältlich ist, anstatt der Membran aus mikroporösem Polypropylen verwendet wird.

Beispiel 2

Dreizehn 20 Mikroliter-Proben eines Serums, das gemäß chemischer Analyse, welche auf herkömmliche klinische spektrophotometrische Art durchgeführt wurde, 15,9 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/IOOml enthielt, wurden gemäß den Verfahren des Beispiels 1 analysiert. Als Ergebnis wurde ein Blut-Harnstoff-Stickstoff-Wert von 16,1 mg/100 ml mit einer Standardabweichung von 0,2 mg/100 ml erhalten. Ähnliche genaue Resultate wurden erhalten, als die Analyse mit chemisch analysierten Proben, die 49 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/100 ml enthielten, wiederholt wurde.

Beispiel 3 Teil A

20 ml destilliertes Wasser wurden mit 10 ml (etwa 1 g) der in Beispiel 1 verwendeten Agarose zur Bildung einer Agarose-Suspension vermischt. Dieser Agarose-Suspension wurden 10 ml einer lOgewichtsprozentigen Lösung aus Cyanbromid zugesetzt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 3,0N-NaOH auf 11,0 .|o eingestellt, wobei die Temperatur der Agarose-Suspension bei etwa 22 bis 27°C, gegebenenfalls unter Zugabc von Eis, gehalten wurde.

Nach der Einstellung des pH-Wertes wurde die Agarose durch Vakui'mfiltration schnell mit etwa einem Liter einer kalten, wäßrigen 0,2 M Natriumborat-Puffcrlösung bei einem pH-Wert von 8.5 gewaschen. Eine Hälfte der entstandenen, durch Cyanbiomid »aktivier ten« Agarose wurde einer Urcaselösung zugesetzt, die durch Lösen von 20 mg Urease (92 internationale v> Einheilen/mg) in 5 ml der oben beschriebenen 0,2 M Nutriumboraipuffcrlösung, die auf O⁰C gekühlt worden war, hergestellt worden war. Die entstandene Urease/ Agarose-Suspension wurde bei 0-3°C über Nacht gertlhrt, um die Immobilisierungsreaktionen zu vervoll- nj ständigen.

Die Aktivität der entstandenen immobilisierten Urease wurde mit einem Labor-pH-Wert-Meßgerät (Modell pH R, erhältlich bei der Firma Sargent-Welch) und einer geeichten Elektrode für einwertige Kationen (10 (Bookman Model 39 137), die auf eine Standard-Calomel-Eloktrode bezogen war, bestimmt. Die Aktivität der Immobilisierten Urease wurde mit etwa 900 internationalen Einheiten pro Gramm Urease/Agarose-Gcl bestimmt

1,9 ml des Immobilisierten Urease/Agarose-Gel* wurden in eine Glasröhre mit einem Innendurchmesser von 4 mm eingebracht, und die Glasröhre wurde an jedem Ende mit einer Nylonscheibe (400 mesh) zur Bildung einer kleinen Säule aus immobilisierter Urease versehen. Danach ließ man destilliertes Wasser durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/Minute dringen, um die immobilisierte Urease in Form eines Bettes hydraulisch zu verdichten.

Die Röhre, die das immobilisierte Urease/Agarose-Gel enthielt, wurde wie das immobilisierte Ureasebett des Beispiels 1 angeschlossen. Es wurde eine geeichte Ammoniak-Elektrode verwendet, die eine hydrophobe ammoniakpermeable Membran und eine pH-Elektrodenzelle (erhältlich von der Firma Orion Corporation als Elektrode Model 95-10) enthielt.

Sechs Blutserumproben von sechs verschiedenen menschlichen Patienten wurden in einem Krankenhauslabor chemisch analysiert. Wie durch die Analyse festgestellt wurde, wiesen drei der Proben einen Blut-Harnstoff-Stickstoff-Wert von 5,0 mg/100 ml und drei der Proben einen Wert von 17,0 mg/100 ml auf. Diese Serumproben wurden in 0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung im Verhältnis 1 :25 verdünnt, und die verdünnten Serumproben wurden mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml/Minute in die Röhre mit der immobilisierten Urease dieses Beispiels eingeführt. Um den pH-Wert auf 13 einzustellen, wurden etwa 1 ml/Minute 0,2 N Natriumhydroxid zugesetzt.

Unter diesen Bedingungen wurde chemisches Gleichgewicht erzielt, und die Änderung der elektromotorischen Kraft (in Millivolt) wurde gemessen. Der entsprechende Blut-Harnstoff-Stickstoff-Wert wurde aus dem Eichdiagramm bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

Serum	HIuH lamsloll-	Hlut-llarnslnlT-
probe	Stickstol'l-Wert	Stickstoll-Werl
	aus ehem. Analyse	aus crfinclungsgum.
		Verfahren
	(mg IiIIS/100 ml	(mg Bl !S/100 ml
	Scruniprobu)	Serum)
1	14	13,8
2	14	14,0
3	14	13,0
4	17	17,0
5	17	16,1
6	17	16,8

Beispiel 4

Urease wurde auf einem partikelförmigen porösen Aluminiumoxidträgermaterial immobilisiert, in dem 100 mg Urease und 1,0 g des partikelförmigen Aluminiumoxides in 200 ml 0,1 M Trls-(hydroxymethyl)-aminomethan (mit HCI auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt) bei 4O⁰C und einstündigem Rühren vermischt wurden. Das partikelförmige Aluminiumoxid wies eine PartlkelgröBe von -90 bis +100 mesh (US-Maschensieb) und einen durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 0,1 bis 0,2 μ auf. Das immobilisierte Urease/Alumlniumoxid-Reaktlonsprodukt ließ man bei 0° C Über Nacht stehen.

Das Reaktionsprodukt wurde danach auf einem Trichter aus gesintertem Glas vakuumfiltriert und zuerst mit 500 ml 0,5 M NaCI gewaschen, wonach es mit 1 bis 21 destilliertem Wasser gewaschen wurde. Das gewaschene Immobilisierte Urease-Reaktlonsprodukt

wurde bis zur Verwendung von 10—20 ml einer 0,01 M Tris-(hydroxymethyl)-arninomethan-Pufferlösung gelagert. Die Aktivität des immobilisierten Ureasc/Alumi· niumoxid-Produktes wurde mit 15001. UVcrn³ bestimmt.

Diese Aktivität fiel nach der Verwendung bei der Harnstoffhydrolyse infolge des Auslaugens der Urease aus dem Aluminiumoxidträgermaterial rapide ab. Das Material besitzt daher eine relativ kurze Lebensdauer, wenn es für die Harnstoffanalyse gemäß Beispiel 1 eingesetzt wird. ι ο

Beispiel 5

Es wurde eine Lösung von 1,2-Dibromäthan hergestellt, indem 0,25 ml 1,2-Dibromäthan in 20,0 ml Methanol gelöst wurden. Dieser Dibromäthanlösung wurden 200 ml einer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,2 zugesetzt. Der pH-Wert der entstandenen Lösung wurde durch tropfenweise Zugabe von 1,OM HC) auf 8,2 eingestellt und auf diesem Wert gehalten.

Der abgepufferten Dibromäthanlösung wurden unter Rühren, während die Temperatur bei 40°C gehalten wurde, 100 mg Urease und 1,0 g poröses Aluminiumoxidpulver (das gleiche Aluminiumoxidpulver wie in Beispiel 4) langsam zugesetzt. Dieses Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei 4O⁰C gerührt, wonach man es über Nacht bei 0°C stehenließ. Nach dem Filtrieren und Waschen wurde die immobilisierte Urease/Aluminiumoxid-Zusammensetzung untersucht, wobei festgestellt wurde, daß sie eine Aktivität von 6181. U./cm³ aufwies. Die Aktivität dieser Zusammensetzung fiel während des Grbrauches nur sehr langsam ab und wies in bezug auf die Harnstoffanalyse gemäß Beispiel 1 eine verbesserte Lebensdauer auf. Offensichtlich wirkt das Dibromäthan als Netzmittel bei der Immobilisierung der Urease auf dem porösen Aluminiumoxid.

Beispiel 6
Teil A

40

Urease wurde auf porösem Aluminiumoxid wie in Beispiel 5 immobilisiert, mit der Ausnahme, daß 0,25 ml 1,3-Dibrompropan als Netzmittel anstelle des 1,2-Dibromäthan verwendet wurden. Die immobilisierte Urease/Aluminiumoxid-Zusammensetzung besaß eine Aktivität von etwa 10001. U ./cm³.

Diese immobilisierte Urease/Aluminiumoxid-Zusammensetzung wurde in eine Röhre gepackt und zur Analyse von Harnstoffproben gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 verwendet. Es wurde ein Eichdiagramm hergestellt, indem die Änderung der elektromotorischen Kraft (in Millivolt) gegen die Harnstoffkonzentration von drei Serumproben mit 14, 28 und 70 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/IOOml Serum aufgetragen wurde. Diese Serumproben verursachten eine durchschnittliche Änderung von 70,90 und 111 Millivolt.

Teil B

Zwei Blutserumproben, die gemäß einer Kranken- (>o hausanalyse 12,2 und 30,7 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/ 100 ml Serum enthielten, wurden gemäß dem Verfahren von Teil A dieses Beispiels analysiert. Auf der Basis des Eichdiagrammes zeigte die potentiometrische Reaktion an, daß die Serumproben 12,2 ±0,4 und 30,8 ±0,6 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/lOO ml Serum aufwiesen.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Blut-Harnstoff-Stickstoff-Analyse erhalten, wenn als immobilisiertes Enzymbell ein Urease/Acrylamid-Gel eingesetzt wurde, das nach dem Verfahren des Artikels von Hicks und Updike, der vorstehend erwähnt wurde, hergestellt worden war. Ein derartiges zusammengesetztes Gel kann hergestellt werden, indem man 1.0 ml einer man 0,1 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 400 mg Acrylamid enthält, 4,0 ml einer Lösung der gleichen Puffersubstanz, die 23 mg N,N-Methylen-bis-(acrylamid) enthält, 1,0 ml der gleichen Pufferlösung, die 10 mg Urease enthält, und 0,03 mg Riboflavin sowie 0,03 mg Kaliumpersulfat zum Katalysieren einer Photopolymerisationsreaklion reagieren läßt. Dieses Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad gerührt, während es mit einem Anstrahler photolysiert wurde. Die Gelbildung tritt in etwa 10 Minuten ein. Das Gel wurde auf mechanischem Weg dispergiert und mit 0,1 M Phosphatpufferlösung gewaschen, bevor es gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 eingesetzt wurde.

Ähnliche Ergebnisse bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Blut-Harnstoff-Stickstoff-Analyse wurden erhalten, wenn das immobilisierte Enzymbett aus einer Urease/K !olinit-Zusammensetzung hergestellt worden war, die nach dem Verfahren des Artikels von Sundaram und Crook, der vorstehend erwähnt wurde, zubereitet wurde. Eine derartige Zusammensetzung kann hergestellt werden, indem man 200 g pulverisiertes Kaolinit (durchschnittliche Partikelgröße kleiner als 0,1 μ), das in 8 ml Tris-(hydroxymethy!)-aminomethan-Pufferlösung suspendiert ist, mit 12 mg Urease in einem Reaktionsgefäß bei 30⁰C unter Rühren 20 Minuten reagieren läßt. Die entstandene immobilisierte Urease/ Kaolinit-Zusammensetzung wurde gewaschen, um die restliche lösliche Urease zu entfernen, bevor die Zusammensetzung in das Verfahren von Beispiel 1 eingeführt wurde.

Ähnliche Ergebnisse in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Blut-Harnstoff-Stickstoff-Analyse wurden erhalten, als das immobilisierte Enzymbett nach dem vorstehend erwähnten US-Patent 35 19 528 hergestellt wurde. Eine derartige Zusammensetzung kann hergestellt werden, indem man Urease chemisch an 96%iges Quarzglaspulver (etwa 100 mesh) mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 0,1 μ bindet. Daher wurden 1,0 g des porösen Glanzes mit 50 ml einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthosilan in Toluol kombiniert. Dieses Gemisch wurae über Nacht unter kontinuierlichem Rückfluß gerührt, filtriert und mit Aceton gewaschen. Nach weiterer Reaktion mit p-Nitrobenzoesäure und Reduktion der eingearbeiteten Nitrogruppe und deren nachfolgender Diazotierung ließ man das auf diese Weise aktivierte poröse Glas mit 10 mg Urease in 10 ml 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung (pH-Wert 7,5) reagieren. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 5°C gerührt, abfiltriert und mit einer Pufferlösung gewaschen, bevor es in dem Verfahren von Beispiel 1 eingesetzt wurde.

Ähnliche Ergebnisse bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Blut-Harnstoff-Stickstoff-Analyse wurden erhalten, wenn als immobilisiertes Enzymbett eine Urease-Nylon-Zusammensetzung eingesetzt wurde, die nach dem Verfahren des vorstehend erwähnten Artikels von Inman und Hornby hergestellt worden war. Bei dem Nylonmaterial handelte es sich um ein Typ 6-Polymerisat mit niedrigem Molekulargewicht in Pulverform (120—150 mesh). Die Vorbehandlung des Nylonmaterials mit Glutaraldehyd wurde ausgeführt,

indem 250 mg des pulverisierten Nylons in 10,5 ml von 12,5%igem (Gewicht pro Volumen) Glutaraldehyd suspendiert wurden. Die zuletztgenannte Reagenz wurde in einer 0,1 M Natriumbomt-Pufferlösung, deren pH-Wert auf 8,5 eingestellt worden war, gelöst. Das Nylon-Glutaraldehyd-Gemisch wurde 20 Minuten lang schnell bei O⁰C gerührt und dann auf einem Trichter aus gesiniertem Glas abfiltriert und mit einer 0,2 M Natriumboratpufferlösung gewaschen. Das gewaschene aktivierte Nylonpulver wurde in 5 ml einer Ureaselö-

sung, die 10 mg Urease enthielt, 25 Mikromol Äthylendiamintetraessigsäure und 5 Mikromol Mercaptoäthanol in 0,05 M KHjPO^-Pufferlösung, die mit verdünntem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war, suspendiert. Das Urease/Nylon-Gemisch wurde 16 Stunden lang bei etwa I⁰C gerührt. Die Suspension der immobilisierten Urease/Nylon-Zusammensetzung wurde mit einer 0,2 M Natriumchloridlösung zur Entfernung der nichtreagierten Urease gewaschen, wonach sie in das Verfahren von Beispiel 1 eingeführt wurde.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Harnstoffbestimmung in einer wäßrigen Probe, bei dem Harnstoff mittels Urease hydrolysiert, der entstandene Ammoniak nach Diffusion durch eine hydrophobe Membran be-

, stimmt und anschließend die Ammoniakwerte in die äquivalente Probenharnstoffmenge umgerechnet werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe über in einer Hydrolysezone immobiliersierte Urease geleitet und in dieser Zone unter Bildung von Ammonium-Ionen hydrolysiert wird, daß die Hydrolysemischung aus der Hydrolysezone entfernt und ihr pH-Wert auf mindestens etwa 11 angehoben wird, um die Ammonium-Ionen enthaltende Mischung in eine wäßrige Ammoniaklösung zu * überführen, und daß der durch die Membran diffundierte Ammoniak in einem Elektrolyten gelöst und der daraus entstandene Anstieg des pH-Wertes im Elektrolyten potentiometrisch bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige, Harnstoff enthaltende Probe eine wäßrige Lösung ist, die auf einen pH-Wert von etwa 5 bis 9 abgepuffert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Elektrolyt eine verdünnte wäßrige Lösung von Ammoniumchlorid verwendet wird.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch

a) eine einen Probeneinlaß und einen Auslaß für das Hydrolyseprodukt aufweisende Hydrolysekammer, die immobilisierte Urease enthält,

b) eine mit dem Auslaß für das Hydrolyseprodukt verbundene Mischkammer mit einem Einlaß für eine Base, einem Mischer zum Vermischen des Hydrolyseproduktes mit der Base und einem Auslaß für das entstandene Gemisch,

c) eine hydrophobe, ammoniakgaspermeable Membran, deren eine Fläche in innigem physikalischem Kontakt mit der aus dem Auslaß der Mischkammer strömenden Flüssigkeit steht und deren gegenüberliegende Fläche einen Teil eines Reservoirs an flüssigem Elektrolyten derart bildet, daß sich der Elektrolyt in innigem physikalischem Kontakt mit dieser gegenüberliegenden Fläche befindet,

d) eine pH-sensitive Elektrode, die in den Elektrolyten eingetaucht und elektrisch so geschaltet ist, daß sie auf ein Ansteigen des pH-Wertes in dem Elektrolyten anspricht.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnst, daß die Urease in der Hydrolysekammer auf einem Bett aus einem festen Trägermaterial immobilisiert ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischer magnetisch betätigt werden kann.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran eine dünne Lage aus porösem Kunststoff mit einer Stärke von etwa 0,1 bis etwa 10 mil, einer Porosität von etwa 10% bis etwa 85% und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 0,05 bis etwa 10 μ ist.