DE2448320A1 - Zellenanalysevorrichtung - Google Patents

Description

United States Atomic Energy Commission, Washington, D.C. 20545, U.S.A.

Zellenanalysevorrichtung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur elektrischen Analyse von biologischen Zellen. Dabei wird eine öffnung mit zwei Potentialabfuhlelektroden in einen Behälter einer Salzlösung eingetaucht, in der die zu analysierenden Zellen suspendiert sind. Der Eingang der öffnung steht mit der Salzlösung in Verbindung, und der Ausgang der öffnung steht mit einer Vorrichtung zur Evakuierung der die Zelle enthaltenden Salzlösung durch die öffnung in Verbindung. Zwei in der Öffnung eingebettete Potentialabfuhlelektroden sind mit eijM^n^ine hohe Impedanz aufweisenden Differentialverstärker verbunden, der seine Ausgangsgrößen an einen Impulshöhenanalysator und an eine Anzeige- oder Aufzeichnungsvorrichtung liefert. Beim Betrieb wird an die öffnung durch externe Leistungselektroden eine Stromquelle angeschlossen, um an den Elektroden ein elektrisches Potential zu erzeugen. Die in der Lösung befindlichen durch

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die Öffnung laufenden Zellen ändern den Widerstand zwischen den Elektroden und somit die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden. Der eine hohe Impedanz aufweisende Differentialverstärker verstärkt diese Potentialdifferenzänderung, so daß diese Änderung vom Impulshöhenanalysator empfangen und aufgezeichnet oder angezeigt werden kann.

Allgemein bezieht sich die Erfindung also auf die Analyse von Zellen, und insbesondere auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur ein elektrisches Potential verwendenden Zellenanalyse.

Auf dem Gebiet der Zytologie besteht eine stets ansteigende Nachfrage nach einer automatischen Zellzählung, volumetrischer Differentiation sowie Analyse. Gegenwärtig wird die Überprüfung von zytologischem Material zum Zwecke der Feststellung krebsartiger und bösartiger Zellen und zur Größenbestimmung und Zählung der Zellen in einer bestimmten Materialmenge von Hand durch einen mit zwei Pegel arbeitenden Überprüfungs- oder Siebvorgang erreicht. Die Zellen werden zuerst durch einen Beobachter visuell gesiebt oder untersucht, wobei der Beobachter feststellt, welche Proben offensichtlich anormale Zellen enthalten/ und um die Zellengröße festzustellen, die man in einer Probe zu zählen hofft.

Die anormale Zellen enthaltenden Proben werden sodann durch einen ausgebildeten Zytotechniker oder einen Pathologen untersucht, der dann die endgültige Entscheidung trifft, ob die Zellen dieser Proben tatsächlich Krebszellen sind. Durch dieses Verfahren werden Krebszellen ziemlich genau festgestellt, es hat jedoch eine Reihe von Nachteilen. Als erstes ist zu erwähnen, daß dieses Verfahren sehr langsam ist und viel Technikerzeit erfordert. Zweitens ist es wegen der Verwendung von Arbeitszeit eines Menschen verhältnismäßig teuer. Drittens ist dieses Verfahren ein nicht quantitatives Verfahren insoferne als die Kriterien der Anormalität und auch die Menge der in einer bestimmten volumetrischen Probe vorhandenen Zellen in erster Linie subjektiv ist. Wegen der benötigten Zeit und der erforderlichen Kosten ist es im allgemeinen nicht möglich, große Zahlen von Menschen mit diesen bekannten Verfahren zu untersuchen.

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ORIGINAL INSPECTED

Darüber hinaus sind die meisten in einem medizinischen Labor untersuchten Zellproben normal. Es ist daher schwierig, die Aufmerksamkeit und das Interesse der die Untersuchung durchführenden Leute aufrechtzuerhalten. Beispielsweise haben bei der zytologischen Untersuchung auf cervikalen Uteruskrebs 98% der Frauen keinen Krebs. Infolgedessen ergibt sich ein beträchtlicher Personalwechsel und die Testergebnisse werden weniger quantitativ und teurer.

Es ist.daher erwünscht, ein System zur automatischen Bestimmung der volumetrisctien Verteilung einer Probe von Zellen vorzusehen. Ein Grund besteht darin, daß die Ausgangsgröße verwendet werden kann, um Lichtsignale von einem Zellenanalysator zu normalisieren.

Gegenwärtig verwenden die bekannten elektrischen Analysevorrichtungen eine einfache öffnung mit zwei Elektroden- an jedem Ende der öffnung, die in der umgebenden Salzlösung angeordnet ist. Eine einzelne, sich durch die öffnung bewegende Zelle verschiebt einen Teil des leitenden Strömungsmittels« in der öffnung. Da die Leitfähigkeit der Zelle kleiner ist als diejenige des durch sie verschobenen Strömungsmittels wird der Widerstand des Öffnungsinhalts infolge des Vorhandenseins der Zelle ansteigen. Mit den Elektroden verbundene elektrische Schaltungen fühlen diese Widerstandsänderung ab und erzeugen ein Impulssignal. In einer solchen Vorrichtung mischt sich das erwünschte Signal von der Zelle mit unerwünschten Rauschsignalen, die außerhalb der öffnung ihren Ursprung haben, weil nämlich die Abfühlelektroden außerhalb der öffnung angeordnet sind. Im Gegensatz dazu sieht die vorliegende Erfindung innerhalb der öffnung selbst angeordnete Abfühlelektroden vor. Daher ergibt die Differentialverstärkung des innerhalb der öffnung abgefühlten Potentials ein Impulssignal, welches von vielen der äußeren Rauschstörungen frei ist.

Zusammenfassung der Erfindung. Die Erfindung sieht - wie bereits bemerkt - eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Zelleanalyse vor, wobei ein elektrisches Potential abgefühlt wird. Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung verwendet einen Behälter,

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der eine Salzlösung enthält, in welcher die zu analysierenden Zellen suspendiert sind. In den Behälter ist eine neuartige öffnung eingetaucht, die eine Vielzahl von Elektroden aufweist, die mit den Wänden der Öffnung in Verbindung stehen und an denen ein elektrisches Potential abgefühlt wird. Der Eingang der öffnung steht mit der die Zellen enthaltenden Salzlösung im Behälter in Verbindung, und der Ausgang der öffnung steht mit einer Vorrichtung zur Evakuierung der die Zellen enthaltenden Salzlösung durch die öffnung in Verbindung. Ein eine hohe Impedanz aufweisender Differentialverstärker liegt an den Elektrodenausgängen und liefert seine Ausgangsgrößen an einen Impulshöhenanalysator und an eine Aufzeichnungs- oder Anzeigevorrichtung.

Wenn die Evakuierungsvorrichtung die die Zellen enthaltende Salzlösung aus dem Behälter durch die öffnung zieht, so laufen einzelne Zellen durch die öffnung und ändern den Widerstand in der öffnung und somit das Potential an den beiden Elektroden. Diese Potentialänderung wird von dem eine hohe Impedanz aufweisenden Differentialverstärker aufgenommen und verstärkt, um ein Impulssignal für den Impulshöhenanalysator zu erzeugen, dessen Ausgangsgröße angezeigt oder aufgezeichnet werden kann.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß man die automatische Zellenanalyse dadurch verbessert, indem man ein Ausgangssignal mit einem viel größeren Signal-zu-Rauschverhältnis vorsieht als dies mit den bekannten Fühlvorrichtungen der Fall ist. Ferner bezweckt die Erfindung, es möglich zu machen, daß man eine größere öffnung verwenden kann als bei bekannten elektrischen Zellanalysevorrichtungen, wodurch die Verstopfungstendenz der öffnung vermindert wird. Ferner hat sich die Erfindung zum Ziel gesetzt, eine größere öffnung vorzusehen, so daß größere Zellen als bei bekannten Vorrichtungen überprüft werden können. Schließlich sollen gemäß der Erfindung hohe Zellgeschwindigkeiten erreicht werden, und zwar durch Erzeugung von Signalen mit Impulsbreiten, die schmal sind verglichen mit den Impulsbreiten bekannter Vorrichtungen.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß infolge

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der großen Öffnung und der schmalen Impulsbreitensignale mehr Zellen pro Zeiteinheit gezählt werden können als dies mit bekannten Vorrichtungen der Fall ist. Ferner hat die Erfindung den Vorteil, daß größere Zellen gezählt werden können. Schließlich wird durch die Erfindung das bei bekannten Vorrichtungen auftretende Problem der Verstopfung drastisch reduziert. Die Erfindung hat auch den Vorteil, daß ein höheres Signal-zu-Rauschen-Verhältnis erreichbar ist,als bekannte Vorrichtungen und Verfahren dies ermöglichen.

Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich insbesondere auch aus den Ansprüchen.

Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen an Hand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 schematisch eine erfindungsgemäße Vorrichtung;

Fig. 2 eine Draufsicht auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Potentialabfühlöffnung;

Fig. 3 eine aufgeschnittene Querschnittsansicht des Ausführungsbeispiels der öffnung gemäß Fig. 2.

In Fig. 1 ist eine gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung ausgebildete ein Potential abfühlende Zellenanalysevorrichtung dargestellt. Ein Behälter 10 enthält eine Salzlösung 12, in welcher die zu analysierenden Zellen suspendiert sind. In die Lösung 12 ist ein eine öffnung enthaltender Block 14 eingetaucht. Die Eingangsseite 16 des Öffnungsblocks 14 steht mit der Salzlösung 12 im Behälter 10 in Verbindung. Die Ausgangsseite 18 des Öffnungsblocks 14 steht mit einer Vorrichtung 20 in Verbindung, um Zellen enthaltende Salzlösung 12 aus dem Behälter 10 durch die Öffnung abzuziehen. Vorzugsweise zieht ein an die'Vorrichtung 20 angelegtes Vakuum die Lösung 12 in die Vorrichtung 20.

Wie man in den Fig. 2 und 3 erkennt, kann der Block 14 zwei ge-

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trennte Elektroden 22 und 24 aufweisen, die zwischen Lagen aus einem Dielektrikum 26 geschichtet (laminiert) angeordnet sind; Dielektrikum 26 kann beispielsweise ein Kunststoff sein. Dem Fachmann ist klar, daß die in den Fig. 2 und 3 gezeigte Elektrodenstruktur lediglich ein Beispiel darstellt und die Erfindung nicht beschränkt. Beispielsweise kann eine Vielzahl von Elektroden - drei oder mehr - verwendet werden, und es können ebenso verschiedene dielektrische Schichten aufgebaut sein. Darüber hinaus können die Elektroden auch die öffnung teilweise an Stelle von ganz umgeben. Die Elektroden weisen vorzugsweise Platin auf, es können aber auch andere Metalle, wie beispielsweise Silber oder Kupfer, verwendet werden. Platin wird deshalb bevorzugt, weil es der Korrosion großen Widerstand entgegensetzt. In dem beispielhaften Ausführungsbeispiel der Fig. 2 und 3 sind folgende Abmessungen vorgesehen: Die öffnung ist 87 Mikrometer im Querschnitt und 412 Mikrometer lang; die Zone zwischen den Elektroden 22 und 24 ist 144 Mikrometer lang. Wie man in Fig. 3 erkennt, kann der Eingang und der Ausgang der öffnung rechtwinklig sein. Jedoch wird die Volumenauflösung mit einer derartigen öffnung vermindert, weil die Zellen in verschiedenen Positionen bezüglich der Längsachse der öffnung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die öffnung fließen. Die Strömungsgeschwindigkeiten der Zellen auf oder nahe der Mittelachse sind größer als die Strömungsgeschwindigkeiten der Zellen näher an den Wänden der öffnung. Bei typischen bekannten öffnungen sind die Durchmesser der Eingänge und Ausgänge der öffnungen relativ breit, wobei sich der Durchmesser kontinuierlich auf irgendeinen Innenpunkt hin verengert, wo er hinreichend klein ist, um gute Strömungs-.Charakteristiken an der Meßzone vorzusehen. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel einer gemäß der Erfindung vorgesehenen öffnung ist die öffnung - wie in Fig. 2 gezeigt - verhältnismäßig groß. Die Geometrie der öffnung ist daher nicht kritisch. Es ist jedoch noch immer vorteilhaft, die Zellen nach unten zur Mitte der öffnung hin zu kanalisieren, um genauere volumetrische Messungen (volumetrische Auflösung) sicherzustellen. Dies ist deshalb der Fall, weil die Impulsbreiten der infolge des Zellenvolumens erzeugten Signale von der Zellenströmungsgeschwindigkeit abhängen. Daher erzeugen diejenigen Zellen, die sich auf oder nahe der

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Mitte einer speziellen öfffnung befinden, Signale mit engeren Impulsbreiten als diejenigen Zellen, die weiter weg von der Mitte langsamer fließen, wobei natürlich gilt, daß je enger die Impulsbreite ist, desto höher die erreichbaren Zellenzählgeschwindigkeiten liegen. Dem Fachmann ist also klar, daß, obwohl die Eingänge und Ausgänge der öffnungen der Erfindung rechtwinklig sein können, dann, wenn sie gekrümmt sind, wie dies durch die gestrichelten Linien 28 in Fig. 3 gezeigt ist, oder kontinuierlich wie bei den bekannten Vorrichtungen ausgebildet sind, bessere Strömungsgeschwindigkeiten erreicht werden, welche bei der Erzeugung konsistent enger Impulsbreiten in den erzeugten Signalen unterstützend wirken.

Fig. 2 zeigt dielektrisches Material in Form von kreisförmigen Scheiben mit einem Durchmesser von 1 cm und rechteckigen, blattförmigen Platinelektroden, welche sich über die öffnung hinweg überschneiden.. Diese Geometrie ist lediglich aus Gründen der Bequemlichkeit angegeben und die Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Jede geometrische Konfiguration ist verwendbar, die in richtiger Weise mit Abstand angeordnete Elektroden und dielektrische Schichten ergibt.

Unter Bezugnahme auf Fig. 1 und die Vorrichtung zur Verwendung der öffnung erkennt man, daß der Block 14 derart befestigt ist, daß die Öffnung sich in einer horizontalen Stellung befindet. Die öffnung kann alternativ mit irgendeiner gewünschten Neigung gegenüber der Horizontalen angeordnet sein, beispielsweise in einer vertikalen oder in einer anderen derartigen Lage, um guten Zugang zu den Zellen in der Salzlösung vorzusehen.

Um eine Potentialdifferenz zwischen der Salzlösung im Behälter und derjenigen innerhalb der Vorrichtung 20 aufrechtzuerhalten, sind Elektroden 30 und 32 vorgesehen. Eine Konstantstromversorgung 34 liefert einen Strom, der durch die öffnung zwischen Elektroden 30 und 32 fließt. Ein eine hohe Impedanz aufweisender Differentialverstärker 20 empfängt Signale von den Öffnungselektroden 14 und 16 liefert das verstärkte Signal über Leitungen 40 und 42 an einen Impulshöhenänalysator und eine Anzeige oder Aufzeichnungs-

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- 8 Vorrichtung, wie dies durch den Block 44 dargestellt ist.

Im Betrieb läuft die die Zellen enthaltende Salzlösung 12 durch die Öffnung in die Vorrichtung 20, und zwar infolge eines daran angelegten Vakuums. Wenn eine Zelle durch die Zone zwischen den Elektroden 22 und 24 läuft, so ändert sie das an den Elektroden 22 und 24 liegende Potential, weil die Zellenleitfähigkeit sich von der Leitfähigkeit der Salzlösung selbst unterscheidet. Die Leitfähigkeitsänderung ist proportional zum Zellenvolumen. Dieser Leitfähigkeitsunterschied bewirkt eine Änderung im Widerstand der Öffnung, und zwar wegen des Vorhandenseins der Zelle innerhalb der Öffnung. Durch Multiplikation der Öffnungswiderstandsänderung ^r mit dem konstanten öffnüngsstrom I von der Versorgung 34 ergibt sich die Potentialänderung kV = I a.r. Die Potentialdifferenz (&V) gelangt zu dem eine hohe Impedanz aufweisenden Differentialverstärker 28, der das verstärkte Differenzsignal zu einer Impulshöhenanalysevorrichtung und Aufzeichnungs- oder Anzeigevorrichtung 44 schickt.

Wie dem Fachmann bekannt ist, ist die bei bekannten Vorrichtungen erzeugte Impulsbreite direkt proportional zur Gesamtlänge der öffnung, und zwar deshalb, weil die Impulsbreite proportional zur Durchgangszeit der Zelle durch die Öffnung ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Impulsbreite direkt proportional zum Abstand zwischen den Elektroden 22 und 24, der recht klein gemacht werden kann, d.h. eine solche Größe aufweisen kann, um Signale mit Impulsbreiten von ungefähr 1 Mikrosekunde bis ungefähr 5 MikroSekunden zu erzeugen. Für eine Öffnung mit gegebenem Durchmesser gilt, daß je dichter die Elektroden sind, desto kleiner die Impulshöhe des erzeugten Signals wird. Die Elektroden könnten natürlich weit voneinander über die Länge der Öffnung hin angeordnet sein und zwar an deren Eingang und Ausgang.

Die Erfindung gestattet die Verwendung einer gewünschten langen Öffnung, weil die Elektroden innerhalb der Öffnungswände angeordnet sind und recht dicht zueinander angeordnet werden können. Bei einer Öffnung mit außenliegenden Elektroden gemäß dem Stand der

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Technik stieg die Impulsbreite mit der Länge der öffnung. Wenn daher eine lange öffnung benutzt wurde, um gute Strömungscharakteristiken zu erhalten, so ergab sich eine verbreiterte Impulsbreite, wodurch die erreichbare Zählgeschwindigkeit_t abnahm. Eine lange öffnung ist deshalb erwünscht, weil sie die Zellenbewegungen beeinflußende Turbulenzen und andere Nichtlinearitäten glättet, bevor die Messung vorgenommen wird. Gemäß der Erfindung liegt deröffnungsdurchmesser vorzugsweise zwischen ungefähr 30 Mikrometern und ungefähr 250 Mikrometern und die Öffnungslänge liegt zwischen ungefähr 100 Mikrometern und ungefähr 5oo Mikrometern.

Aus der vorstehenden Beschreibung ergeben sich die verschiedenen Merkmale und Vorteile der Erfindung, wobei dem Fachmann weitere Merkmale und Vorteile bei Betrachtung des bevorzugten Ausführungsbeispiels erkennbar sind, ohne daß dabei der Bereich der Erfindung verlassen wird.

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Claims (9)

2U8320 PATENTANSPRÜCHE

1.yzellen-Abfühlvorrichtung gekennzeichnet durch Behältermittel - für ein Volumen von einer suspendierte Zellen enthaltenden Flüssigkeitslösung mit Mitteln (14), welche durch eine Öffnung gekennzeichnet sind, durch welche die die Zellen enthaltenden Flüssigkeiten aus dem Behälter herausgezogen werden können, wobei die Öffnung hinreichend lang ist, um das Hindurchtreten der Zellen zu gestatten, und wobei Elektroden mittel (22, 24) mit den Wänden der Öffnung in Verbindung stehen, um das elektrische Potential über die Öffnung hinweg abzufühlen, und wobei ferner Fühlmittel (40, 42, 28, 44) zum Abfühlen der Potentialänderung vorhanden sind, welche durch mindestens eine Zelle hervorgerufen wird, die durch die Öffnung läuft, um so das Vorhandensein der Zelle innerhalb der Öffnung anzuzeigen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenmittel Teile der Wände der Öffnung aufweisen. .

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenmittel mindestens zwei Elektroden aufweisen.

4. Vorrichtung nach Anspruch Ϊ, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenmittel Blätter aus elektrisch leitendem Material sind, die sandwichartig zwischen Bogen oder Blättern aus einem dielektrischen Material derart angeordnet sind, daß

abwechselnd leitende und isolierende Schichten mindestens teilweise die Öffnung umgeben.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein elektrisch leitender Bogen positiv und mindestens ein elektrisch leitender Bogen negativ geladen ist, und daß die positiv und negativ geladenen Bogen voneinander durch mindestens einen dielektrischen Bogen getrennt sind.

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6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser mehreremale die maximale Breite irgendeiner der Zellen ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abfühlmittel Mittel zum quantitativen Abfühlen der Potentialänderung, die durch das Vorhandensein der Zelle innerhalb der Öffnung bewirkt ist, aufweisen, und daß Mittel zur Erzeugung eines Ausgangssignals entsprechend der Potentialänderung vorgesehen sind, um auf diese Weise eine Anzeige für das Zellvolumen vorzusehen.

8. Verfahren zum Abfühlen des Volumens einer Zelle in einer Salzlösung unter Verwendung einer Öffnung mit darin mit Abstand angeordneten Elektroden, wobei folgende Verfahrensschritte vorgesehen sind:

Anlegen eines elektrischen Potentials an die Elektroden und auf diese Weise über die Öffnung hinweg; Bewegung der die volumetrisch zu messende Zelle enthaltenden Lösung durch die Öffnung hindurch und an den Elektroden vorbei, um eine Widerstandsänderung und somit eine Potentialänderung zwischen den Elektroden zu erzeugen, die durch das Vorhandensein der Zelle bewirkt ist; Abfühlen der Potentialänderung;

differentielles Verstärken der Potentialänderung zur Erzeugung eines Ausgangssignals, welches für das Volumen der abgefühlten Zelle repräsentativ ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung durch die Öffnung bewegt wird, so daß sich die Zelle durch die Mitte der Öffnung bewegt.

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