DE2407899A1

DE2407899A1 - Furanonderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur fluoreszenzmarkierung

Info

Publication number: DE2407899A1
Application number: DE19742407899
Authority: DE
Inventors: Jun Roy Cleeland; Emanuel Grunberg; Willy Leimgruber; Manfred Weigele
Original assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1973-03-05
Filing date: 1974-02-19
Publication date: 1974-09-19
Also published as: NO750485L; AU473159B2; CH602905A5; DD111374A5; NL7402645A; NL156509B; DE2407899B2; JPS49134670A; JPS5443571B2; FR2221728B1; GB1433093A; ATA174174A; CA1022483A; IL44165A; IL44165A0; DE2407899C3; BE811825A; AU6534074A; FR2221728A1; IT1015815B

Description

PATENTANWÄLTE

DR. ING. A. VAN DERWERTH DR. FR AM Z LE DE RE R

21 HAMBURG 9O 3 VUNCIlEN 8O

W[LlTORFER STR S3 TEL. (040) 77 OS 61 .' UCIΞ CRAHN STR. 22 · TEL. (0B9I *7 29 *7

München, 5. Februar 1974 BAN 4090/58

F. HOEi¹MANN - LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT CH-4002 Basel/Schweiz

Furanonderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Fluoreszenzmarkierung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung eines eine primäre Aminogruppe enthaltenden Materials, welches die Behandlung dieses Materials mit einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel:

worin R^ ein niederer Alkyl- oder Phenyl-niederer-alkylrest, Rg ein Phenyl- oder substituierter Phenylrest und R, ein substituierter oder nicht-substituierter Phenyl-, Naphthyl- oder Indolylrest sind,

in einem wäßrxgen Medium umfaßt. Weiterhin betrifft die Erfindung primäre Aminogruppen enthaltende Materialien, welche mit einer Verbindung der Formel I markiert sind, und die Verwendung dieser Materialien bei diagnostischen Methoden.

409838/1073

DEUTSCHE BANK AO.. HARSURC 93/20 S 13 POSTSCHECK, HAMBURG 1173 20-206 TELEGRAMMEt LEDERERPATENT MÖNCHEN

-2- 24Q7899

Ferner betrifft die Erfindung neue Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel:

II

worin R¹,. ein niederer Alkyl- oder Phenyl-niederer-alkylrest, R*2 ein Phenyl- oder substituierter Phenylrest und R¹, ein substituierter oder nicht-substituierter Phenyl-, Naphthyl- oder Indolylrest sind, mit der Haßgabe, daß,wenn R¹ρ und R'^ beide Phenylreste sind, R¹. ein niederer Alkylrest mit mehr als einem kohlenstoffatom oder ein Phenyl-niederer-alkylrest mit mehr als 7 Kohlenstoffatomen ist,
sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Verbindungen.

Die rasche Identifizierung von Mikroorganismen und anderen pathogenen Antigenen mit Hilfe von fluoreszierenden Antikörpern ist ein äußerst wichtiges Beispiel für die diagnostische Verwendbarkeit von fluorophoren Proteinkonjugaten. Vorhandene Arbeitsweisen zur Fluoreszenzmarkierung von Proteinen, z. B. Markierung mit Fluoresceinisothionat (FITC.) sind auf Fluorophore mit reaktionsfähigen Funktionsgruppen angewiesen, welche sich kovalent an Proteine binden. Diese Methode ist jedoch von schweren Nachteilen belastet, welche hauptsächlich aus der Notwendigkeit einer ausgedehnten Reinigung herrühren, um irgendwelchesüberschüssiges Reagens zu entfernen, welches sonst bei immunologischen Prüfungen in nicht-spezifischer Weise stören würde.

Es wurde nun gefunden, daß die Verbindungen der Formel I selbst nicht fluoreszierend sind, jedoch mit primäre Aminogruppen enthaltenden Materialien unter Bildung von fluoreszierenden Verbindungen (Konjugaten) reagieren können, wodurch eine mühselige Reinigung vermieden wird.

409838/1073

In der Beschreibung bedeutet der Ausdruck "niederer Alkylrest" einen einwertigen, gesättigten, geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffsubstituenten, der bis zu einschließlich 8 Kohlenstoffatome besitzt. Beispiele solcher niederer Alkylreste sind der Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, η-Butyl-, Hexyl-, Octyl-, Isopropyl-, tert.-Butylrest usw.. Der Ausdruck "Phenylniederer-alkylrest" bezeichnet einen der oben definierten niederen Alkylreste, der an einem Phenylrest gebunden ist, z. B. den Benzyl-, Phenyläthyl-, Phenylpropylrest usw.. Der Ausdruck "substituiert", wie er in Verbindung mit dem Phenyl-, Naphthyl- oder Indolylrest verwendet wird, bezeichnet diese Gruppen,wenn sie mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sind: Halogen, d. h. Fluor, Chlor, Brom oder Jod, niederes Alkyl, Trifluormethyl, niederes Alkoxy, Nitro und Cyano. Der Ausdruck "niederer Alkoxyrest" bezeichnet einen Rest, der einen niederen Alkylrest gebunden an einen Äthersauerstoff aufweist und dessen Valenzbindung von dem Äthersauerstoff abstammt. Beispiele solcher niederer Alkoxyreste sind der Methoxy-, Äthoxy-, n-Propoxy-, n-Butoxy-, Isopropoxy-, tert.-Butoxyrest usw..

Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind solche, in denen der Rest R^. ein niederer Alkylrest und beide Reste Rp und R^ Phenylreste sind. Eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel I ist die Verbindung, in der R,. der Methylrest und Rp und R, Phenylreste sind,'d. h. 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon.

Verbindungen der Formel II können über eine vielstufige Synthese folge hergestellt werden, welche von leicht zugänglichen Ausgang smat er i alien der folgenden Formel ausgeht:

Ill 3

worin R¹ρ und R', die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

409838/1073

-A-

Verbindungen der Formel III, in denen R¹ ρ und R¹, Phenyl oder substituiertes Phenyl sind, werden im allgemeinen als Benzalacetophenone oder substituierte Benzalacetophenone bezeichnet.

In der ersten Stufe wird das Ausgangsmaterial der Formel III unter basischen Bedingungen unter Lieferung eines Epoxyketons der folgenden Formel:

TV

worin R¹ ^ und R¹, die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, epoxidiert.

Die Epoxidationsreaktion wird durch Behandlung einer Verbindung der Formel III mit einem Überschuß von Wasserstoffperoxid in Anwesenheit einer starken Base durchgeführt. Geeignete starke Basen für diese Reaktion umfassen Alkalimetallhydroxide, z. B. Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, sowie Alkalimetallcarbonate, z. B. Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat. Geeignete Lösungsmittel für die Epoxidationsreaktion sind Alkohole, insbesondere Methanol und Äthanol, sowie wäßrige Alkoholgemische. Die Reaktion wird im allgemeinen bei Temperaturen von etwa 10 ⁰C bis etwa 40 ⁰C, besonders bevorzugt von etwa 20 ⁰C bis etwa 30 ⁰C durchgeführt.

In der nächsten Stufe wird die Verbindung der Formel IV mit einer starken, wasserfreien Base behandelt, um den Epoxidring zu öffnen und ein Diketon der folgenden Formel:

R· Π

2 ο 3

worin R¹« und R¹ ■, die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, zu· liefern.

409838/1073

Geeignete starke, wasserfreie Basen für diese Öffnungsreaktion umfassen Alkalimetallalkoxide wie Natriummethoxid, Natriumäthoxid, Natriumisopropoxid, K.alium-tert.-butoxid usw. Als geeignete Lösungsmittel für die Öffnungsreaktion können wasserfreie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol und tert.-Butanol genannt werden. Im allgemeinen wird die Verwendung desselben Alkohols, von welchem die Alkoxidbase abstammt, bevorzugt. Jedoch ist dies nicht wesentlich, und falls ein hiervon verschiedener Alkohol als Lösungsmittel verwendet wird, tritt ein Austausch zwischen dem Alkohollösungsmittel und dem Alkoholanteil des Alkalimetallalkoxides auf. Die Öffnungsreaktion wird im allgemeinen bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt, vorzugsweise zwischen etwa 40 ⁰C und etwa 100 ⁰C, besonders bevorzugt beim Siedepunkt des Reaktionsmediums.

In der nächsten Stufe wird das Diketon der Formel V zu einem Enamin der folgenden Formel umgewandelt:

It ?

VI

worin R¹^ u^cL R¹ ζ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und R₂, und Rc, falls sie unabhängig voneinander sind, jeweils niedere Alkylreste sind, und falls sie zusammenhängen, mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6-gliedrigen, heterocyclischen Ring bilden, welcher höchstens ein zusätzliches Heteroatom aus der aus Stickstoff und Sauerstoff bestehenden Gruppe enthält.

Bei dieser Reaktion wird das Diketon der Formel V mit einem Aminomethenylierungsmittel zur Bildung des Enamins umgesetzt.

Geeignete Aminomethenylierungsmittel umfassen niedere Alkylacetale eines N,N-disubstituierten Formamids, z. B. Dimethylformamiddimethylacetal, Tris-(sec.-amino)-methane,

409838/1073

-G-

z. B. Tris-(dimethylamino)-methan und Tris-(piperidino)-methan, sowie Bis-(sec.-amino)-niedere-alkoxymethane, ζ. B. Bis-(dimethy1-amino)-t-butoxymethan.

/^-ti.
Die Aminoeinheit -Ν\π , wie sie in der Strukturformel für die

Verbindung VI gezeigt ist, wird aus dem Aminomethenylierungsmittel eingeführt. Acetale von Ν,Ν-disubstituierten Formamiden besitzen die allgemeinen Formel:

worin Eg und Er₇ jeweils ein niederer Alkylrest sind; Tris-(sec.-amino)-methane besitzen die folgende allgemeinen Formel:

und Bis-(sec.-amino)-niedere-alkoxymethane besitzen die folgende allgemeinen Formel:

worin Eg ein niederer Alkylrest ist.

Beispiele von Aminoeinheiten ~^N^ß^ umfassen solche, in denen E^ und E₁-, falls sie unabhängig ^ voneinander sind, jeweils niedere Alkylreste sind, z. B. Dimethylamino und Diäthylamino,

409838/1073

und solche, in denen R^ und R₁- zusammen mit dem Stickstoff einen 5- oder 6-gliedrigen, heterocyclischen Ring bilden, z. B. den Piperidino-, Morpholino-, Pyrrolidino-, Piperazino-, Imidazolidine-, Pyrazolidinorest usw. Beispiele von niederen Alkoxyeinheiten ORg und OR₁-, sind der Methoxy-, Äthoxy-, Propoxy-, n-Butoxyrest usw. Beispiele von niederen Alkoxyeinheiten ORg sind der Methoxy-, Äthoxy-, tert.-Butoxyrest usw..

Diese Reaktion kann in einem beliebigen inerten, organischen Lösungsmittel durchgeführt werden. Bevorzugte Lösungsmittel umfassen Formamide, insbesondere Dimethylformamid. Ein Überschuß von Aminomethenylierungsmittel kann ebenfalls als Lösungsmittel angewandt werden.

Die Herstellung des Enamins kann in einem Temperaturbereich von etwa 0 ⁰C bis etwa 100 ⁰C durchgeführt werden, obwohl ein Temperaturbereich von etwa 10 ⁰C bis etwa 40 ⁰C bevorzugt ist. Eine Temperatur von etwa Zimmertemperatur ist besonders bevorzugt.

In der nächsten Stufe wird das Enamin der Formel VI in das Hydroxyfuranon der folgenden Formel:

R'
3

0 >=0

VII

R'

2
worin R'p und R¹, die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, umgewandelt.

Diese Umwandlung schließt eine'basische, wäßrige Hydrolyse ein. Geeignete Basen für diese Hydrolyse umfassen Alkalimetallhydroxide, z. B. Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, sowie Alkalimetallcarbonate, z. B. Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat. Geeignete Temperaturen zur Durchführung dieser Reaktion betragen von etwa 0 ⁰C bis etwa 40 ⁰C, besonders bevorzugt etwa Zimmertemperatur. Wenn

409 8.3 8/1073

die Hydrolyse abgeschlossen ist, wird die basische Lösung neutralisiert, um das Hydroxyfuranon der Formel VII zu liefern. Verbindungen der Formeln VI und VII, in denen R¹ und R¹ nicht beide Phenyl sind, sind neu. ^y

Das Hydroxyfuranon der Formel VII kann dann in das Furanon der Formel II durch Reaktion mit einem geeigneten Alkohol umgewandelt werden, d. h. einem Alkohol der Formel R¹.OH, worin R' die im Zusammenhang mit der oben genannten Formel II angegebene Bedeutung besitzt. Dieser Alkohol kann entweder ein niederes Alkanol oder ein Phenyl-niederes-alkanol sein, z. B. Methanol, Äthanol, Benzylalkohol, Phenylethylalkohol usw. Als Lösungsmittel für diese Reaktion können der Alkohol selbst oder ein Gemisch des Alkohols und eines inerten, organischen Lösungsmittels verwendet werden. Besonders bevorzugt wird die Reaktion nur in dem gewünschten Alkohol durchgeführt. Die Reaktion kann vorteilhafterweise bei Temperaturen von etwa Zimmertemperatur bis etwa zum Siedepunkt des Lösungsmittelmediums durchgeführt werden. Besonders bevorzugt wird die Reaktion bei einer Temperatur zwischen etwa 40 ⁰C und etwa 80 ⁰C ausgeführt.

Verbindungen der Formel I können ineinander umgewandelt werden, d. h. die Alkoxygruppe OR_x. kann durch Reaktion der Verbindung der Formel I mit einem geeigneten, niederen Alkanol oder Phenylniederen-alkanol ausgewechselt werden. So kann beispielsweise die Verbindung der Formel I, worin R^. den Methylrest bedeutet, in die entsprechende Verbindung umgewandelt werden, in welcher R,. der Benzylrest ist, indem die erstgenannte Verbindung mit einein Überschuß von Benzylalkohol erhitzt wird.

Die Fluorogene der Formel I sind in Wasser relativ unlöslich und reagieren langsam mit Wasser unter Bildung von Zersetzungsprodukten, welche nicht fluoreszierend sind. Die Fluorogene der Formel I sind in organischen Lösungsmitteln leicht löslich, und sie sind in

40S838/1073

Lösungsmitteln wie Aceton und Dichlormethan "besonders löslich. Da die Verbindungen nur eine geringe Wasserlöslichkeit aufweisen, werden sie, falls sie mit Materialien umgesetzt werden sollen, die in wäßrigen Medium entweder als Lösung oder als Suspension vorliegen, entweder als Lösung in einem organischen Lösungsmittel, besonders bevorzugt einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel wie Aceton, zugesetzt, oder die Reaktion wird durchgeführt, wobei die Verbindung der Formel I auf einem festen Träger adsorbiert vorliegt. Diese letztgenannte Arbeitsweise der Adsorption auf einen festen Träger ist besonders bevorzugt, wenn das Fluorogen mit Materialien umgesetzt wird, die in dem wäßrigen Medium löslich sind, so daß alles nicht umgesetzte Fluorogen der Formel I, welches auf dem festen Träger adsorbiert ist, durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden kann. Geeignete feste Träger umfassen neutrale, inerte Materialien wie Diatomeenerde, Polysaccharide usw. Ein besonders bevorzugter, fester Träger ist Diatomeenerde. Die Adsorption der Verbindung der Formel 1 auf dem festen Träger kann nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden, z. B. durch Suspendieren des festen Trägers in einer die Verbindung der Formel I enthaltenden Lösung, z. B. einer Lösung in Aceton oder Methylenchlorid, und durch Verdampfen des Lösungsmittels aus dieser Suspension mit anschließendem gründlichen Trocknen mittels Luft oder Trocknen unter Vakuum. Besonders bevorzugt ist die Herstellung fester Träger, welche etwa von 0,1 bis etwa 5,0. Gew.-% der Verbindungen der Formel I und besonders bevorzugt von etwa 1 bis etwa 2 Gew.-% enthalten.

Fluorogene der Formel I reagieren mit primäre Aminogruppen enthaltenden Materialien unter Bildung von fluoreszierenden Produkten. Die mit primären Aminogruppen enthaltenden Materialien mit einem oder mehr als 2 Kohlenstoffatomen erhaltenen Produkte sind neu. Materialien, welche mit den Fluorogenen der Formel I umgesetzt werden können, umfassen primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, insbesondere solche von biologischer Signifikanz

409838/1073

wie Immunoglobuline (Antikörper), Virusarten, einzellige Organismen wie Bakterien, Protozoen, Algen und Pilze, sowie vielzellige Organismen, z. B. Würmer wie Bandwürmer. Die Wirkung der Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit einem der zuvor genannten Materialien besteht darin, in diesem Material eine fluoreszierende Markierung einzuführen. Die Einführung der fluoreszierenden Markierung erlaubt die rasche Identifizierung eines solchen Materials unter Verwendung von Fluoreszenz-Technologien, insbesondere der Fluoreszenzmikroskopie. Die Verwendung der Fluoreszenzmarkierung ist besonders auf dem Gebiet der Markierung von Proteinen wichtig, insbesondere für solche mit biologischer Wichtigkeit wie Antikörper. Ein Hauptvorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen liegt darin, daß sie selbst nicht fluoreszieren, jedoch bei Reaktio mit primäre Aminogruppen enthaltenden Materialien ein fluoreszierendes Material liefern. Darüber hinaus zersetzen sich die Verbindungen der Formel I bei Reaktion mit in dem Reaktionsmedium enthaltenen Wasser in Materialien, welche ebenfalls nicht fluoreszierend sind. Auf diese' Weise wird die Reinigung und Isolierung der fluoreszierend markierten Materialien in starkem Ausmaß vereinfacht, da es nicht erforderlich ist, diese Materialien von irgendwelchen nicht umgesetzten, fluorogenen Reagentien oder Zersetzungsproduktenhiervon abzutrennen, wie dies im Fall der vorbekannten Markierungsarbeitsweisen wie mittels Fluoresceinisothiocyanat der Fall ist.

Bevorzugte Materialien, welche mit den Verbindungen der Formel I markiert werden können, sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt:

Tabelle I I. Mikroorganismen

Bakterien

1. Gram-positive Kokken

Streptokokken (Pyogene, Feealis und Viridans) Staphylokokken (aureus und albus.) Pneumokokken (D. pneumoniae)

403838/1073

Gram-negative Kokken Neisseria C6^onorrk^{oeae un<}3- meningitidis)

3· Gram-positive, aerobe Bazillen Bacillus anthracis Corynebacterium dipntheriae Erysipelothrix Listeria monocytogenes

4-. Gram-positive, anaerobe Bazillen Clostridia tbotulinum, perfringens, welchii und tetani)

5. Gram-negative, anaerobe Bazillen Bacteroides

6. Gram-negative, intestinale Bazillen Escherichia Klebsiella Enterobacter Proteus Pseudomonas Salmonella Siiigella

7. Gram-negative, nicht intestinale Bazillen Pasteurella (pestis und tularensis) Hemophilus influenzae Bruceila (.melitensis, abortus und suis) Bordetella pertussis Malleomyces

8. Spirocheten Treponema pallidum Leptospira Borrelia

9· Mycoplasma

10. Mycobakterien

11. Vibrio

12. Actinomyces

Protozoen

1. Intestinale Protozoen Amöben

2. Flagellates Trichomonas Leishmania Trypanosomes Toxoplasma

3- Sporozoen

Plasmodia (.vivax, falciparum, malariae und ovale^

409 8 38/1073

A-. Intestinale Nematoden Madenwurm Hakenwurm Peitschenwurm

5· Gewebenematoden Trichinen Fadenwurm (wuchereria bancroftii) Dracunculus

6. Trematoden Schistosomes intestinale Saugwürmer G eweb e saugwürmer

7- Cestoden Bandwürmer

8. Toxoplasma (T. Gondii)

1. Sporotrichum

2. Cryptococcus 3· Blastomyces 4. Histoplasma 5- Coccidioides 6. Candida

Viren_und Rickettsien

1. Rickettsia

2. Viren
Hundehepatitis Shope papilloma "Influenza A & B Hühnerpest Herpes simplex Adenoviren PoIyοma Rous sarcoma Vaccinia Poliovirus Röteln

Hundestaupe Leukemia Humps

Newcastle-Krankheit (Haushuhnkrankheit) Sendai

ECHO

Maul- und Klauenseuche Psittacosis Rabis

Ectromelia Arborviren ^_9338n

II. Fremde Antigene

Polysaccharide Hyaluronidase Tetanus-toxin Eiovalbumin Schafserumalbumin menschliches Plasma-gamma-globulin menschliches Serum-albumin

III. Natürliche Antigene

1. Hormone

Pituitäre Hormone Insulin Glucagon Thyro i d-Eormone Choriongonadotrophin Chorion-Wachstumshormon - Prolactin

2.

Pancreas-chymotrypsinogen Procarboxypeptidase Deoxyribonuclease Kibonuclease Glyzerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase Catalase

Niere Leber Haut
Herz

gastrointestinaler Trakt Prostata Embryo-Antigene .Tumor-Antigene

Muskel Collagen Amyloid

5.

Isoantigene

Plättchen Fiegakary ο cy t en Leucocyten Erythrocyten Blutgruppensubstanzen Forssman-Antigen . Histoverträglichkeits-Äntigene

0 E <i 3 S

6. Plasmaproteine

Fibrin und Fibrinoid
Plasminogen und Plasmin

Myeloma, makroglobulinaemische und dysglobulinaemische Proteine

Rheumatoidfaktor

C-reaktionsfähiges Protein

IV. Natürliche Antikörper

1. Natürliches Gammaglobulin

Natürliche Antikörper - nephrotoxische Antikörper Komplement

2. Auto-Antikörger

antinuclearer Faktor

Thyroidautoantikörper.

Adrenalautoantikörper

Autoantikörper für gastrisch-parietale Zellen bei perniziöser Anämie

Anti-Dickdarm

Anti-Leber

Anti-Niere

Autoantikörper für Spermatozoen Anti-Herz

Muskel-Autoantikörper bei Myasthenie gravis Autoantikörper für Nervengewebe Autoantikörper gegen faserartiges Gewebe und Vaskularkomponenten

Autoantikörper gegen Plättchen und Megakaryocyten Antikörper gegen Trophoblasten

3. iⁿduzierte_Antikör£er_gegen|_

Immunoglobulinklassen Igb, IgIi, IgA oder unterschiedliche Spezien

Besonders bevorzugte Materialien, welche mit den Verbindungen der Formel I markiert werden können, sind Hymenolepis nana, Escherichia coli, Antikörper für Pneumococcus Typ II und Gammaglobulin.

Es wurde gefunden, daß die die Verbindungen der Formel I verwendende Reaktion zur Fluoreszenzmarkierung in starkem Maße von dem

409838/ 1 073

pH-Wert abhängig ist. Die Markierung tritt mit nennensv/erter Geschwindigkeit zwischen pH-Werten von etwa 8,0 und 10,5 auf. Ein optimaler pH-Wertbereich zur Durchführung der Markierung liegt zwischen etwa pH = 9*0 und etwa 9»5· Der pH-Wert kann durch an sich bekannte Arbeitsweisen zur Einstellung des pH-Wertes kontrolliert werden, einschließlich der Verwendung von Puffern. Jedoch sollte die Verwendung von Puffern, welche freie Aminogruppen enthalten, vermieden werden.

Das Ausmaß der Markierung eines bestimmten Substrates hängt sehr stark von der Konzentration des verwendeten Fluorogens und der Gesamtkontaktzeit zwischen dem Fluorogen und dem Substrat ab.

Das für irgendein bestimmtes Substrat und für irgendeinen bestimmten Zweck gewünschte Markierungsausmaß variiert natürlich von Fall zu Fall. Es wurde gefunden, daß eine ausgedehnte Markierung für die meisten Zwecke mit einer Kontaktzeit zwischen etwa 2 Minuten und 2 Stunden, besonders bevorzugt zwischen etwa 5 Minuten und 30 Minuten, erreicht werden kann.

Die Fluoreszenzanregungs- und -emissionsspektren der markierten Materialien variieren ebenfalls in Abhängigkeit von der Art des Materials. Als Beispiel sei ein typisches Fluoreszenzspektrum für eine mit einer Verbindung der Formel I markierten Gammaglobuliafraktion genannt, bei welchem zwei Anregungsmaxima bei 290 und 39O nm und ein Emissionsmaximum bei ^8O nm vorhanden sind.

Weiterhin wurde gefunden, daß das Markieren von lebenden Substraten wie von Bakterien oder Bandwürmern mit Fluorogenen der Formel I, falls überhaupt, nur einen geringen Einfluß auf ihre Lebensfähigkeit bzw. Entwicklungsfähigkeit besitzt. Daher liefert das erfindungsgemäße Verfahren eine leistungsfähige Methode zum Markieren lebender Organismen. Ferner wurde gefunden, daß das Markieren von biologisch wichtigen Proteinen wie Antikörpern, falls überhaupt,

409838/1073

nur einen geringen Einfluß auf ihre biologischen Eigenschaften besitzt. Falls z. B. Antikörper gegen Fneumococcus Typ II gemäß der oben angegebenen Verfahrensweise fluoreszierend markiert werden, bleibt der Antikörpertiter in weitem Maße unbeeinflußt, und was noch wichtiger ist, die Spezifität des Antikörpers bleibt unverändert. In diesem Falle waren z. B. die Antikörper immer noch spezifisch gegenüber Pneumococcus Typ II und vereinigten sich nicht mit Pneumococcus Typ I.

Ein weiteres Merkmal der markierten Materialien, welche nach der oben angegebenen Arbeitsweise hergestellt wurden, liegt darin, daß sie für lange Zeitspannen, selbst bei Zimmertemperatur und in Anwesenheit von Licht, außergewöhnlich stabil sind. Daher tritt nur eine geringe Zerstörung der Fluoreszenzmarkierung, welche in eine Vielzahl von Substraten einschließlich sowohl lebender als auch nicht lebender Substrate eingeführt wurden, während so langer Zeitspannen wie einem Monat auf.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von spezifischen Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1

Zu einer mechanisch gerührten Mischung von 85,2 g (0,3 Mol) Benzalacetophenon, 1000 ml Methanol und 120 ml 15 %igem Wasserstoffperoxid wurden 100 ml 2N Natriumhydroxidlösung hinzugegeben, während die Temperatur unterhalb von 30 ⁰C durch Außenkühlung gehalten wurde. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung bei Zimmertemperatur 20 Minuten stehengelassen. Der kristalline Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus Methanol umkristallisiert. Es wurden 59>6 g 1,3-Diphenyl-2,3-epoxy-1-propanon erhalten; F. 90 ⁰C.

409838/1073

2Λ07899

Beispiel 2

Zu einer siedenden Lösung von 30 S 1 ^-Diphenyl^^-epoxy-i-propanon in 500 ml Äthanol wurde rasch eine heiße Lösung von 30 g Kaliumt-butoxid in 500 ml Äthanol hinzugegeben. Das Gemisch wurde 2 Minuten auf einem Dampfbad am Sieden gehalten. Dann wurde es mit 3 1 Wasser verdünnt. Die wäßrige Lösung wurde mit Kohlendioxid durch Zugabe von kleinen Stücken aus Trockeneis gesättigt. Die entstandene Emulsion wurde mit Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden mit Benzol verdünnt, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Das zurückbleibende, dunkle öl wurde im Hochvakuum destilliert, wobei 19i5 g 1,3-Diphenyl-1,2-propandiön mit K. = 136 - 138 °C/0,1 mm anfielen.

Beispiel 3

Eine Lösung von 44,8 g 1,3-Diphenyl-1,2-propandion in 90 ml Ν,Ν-Dimethylformamiddimethylacetal wurde 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Sie wurde dann in 1 1 Eis/Wasser eingegossen. Das wäßrige Gemisch wurde dreimal mit Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte*wurden mit Wasser gewaschen, mit Benzol verdünnt, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wurde aus Äther/Petroläther kristallisiert, wobei 40,2 g des gewünschten Produktes anfielen. Eine zweite Menge von 3*1 g wurde aus der Mutterlauge nach Konzentration und Zugabe von Petroläther erhalten. Insgesamt wurden 43,3 g 1-Dimethylamino-2,4-diphenyl-1-buten-3,4-dion mit F. = 108 ⁰C erhalten.

Beispiel 4

Zu einer Lösung von 43,3 g 1-Dimethylamino-2,4-dipheny1-1-buten-3,4-dion in 500 ml Äthanol wurden 500 ml 2 %iges, wäßriges Kaliumhydroxid hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 2 Stunden gerührt. Dann wurde es mit 3 1 Wasser verdünnt und mit 10 %iger Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Das feste 2-Hydroxy-2,4-diphenyl-3(2HJ-furanon, das ausfiel, wurde abgenutscht. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ohne v/eitere Reinigung in 500 ml Methanol aufgelöst. Die methanolische Lösung wurde

409838/1073

20 Stunden unter Rückfluß gekocht und dann auf einem Dampfbad auf etwa 350 ml konzentriert. Beim Abkühlen wurde kristallines Produkt erhalten. Dieses wurde weiter durch zweimaliges Umkristallisieren aus Methanol gereinigt, wobei 25 ₅ 5 g des gewünschten Produktes mit F. β 93 bis 95 °^c erhalten wurden. Die Mutterlaugen wurden miteinander vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform erneut aufgelöst und durch 200 g Kieselerdegel (Silica gel) filtriert. Das Eluat wurde eingedampft, und der Rückstand wurde aus Äthanol umkristallisiert, wobei weitere 5,8 g Produkt mit F. = 93 - 95 °^c erhalten wurden. Insgesamt wurden 31,3 g 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon mit F. = 93 95 °C erhalten.

Beispiel 5

Unter Befolgung der Arbeitsweisen der Beispiele 1 bis 4 wurden die folgenden Verbindungen,einschließlich der entsprechenden Zwischenprodukte während ihrer Herstellung, hergestellt: 2-Äthoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon; F. = 87 ⁰C 2-Benzyloxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon; F. = 140 ⁰C 2-Methoxy-2-phenyl-4-(4-nitrophenyl)-3-(2H)-furanon; F. = 115-11? ⁰C

Beispiel 6

Unter Befolgung der Arbeitsweisen der Beispiele 1 bis 4 können folgende Verbindungen hergestellt werden:

2-Methoxy-2-phenyl-4-(2-naphthyi;-3C2H;-furanon; 2-Ilethoxy-2-(4-chlorphenyl)-4-phenyl-3C 2H)-f uranon; 2-Athoxy-2-(. 2,4-dimethoxyphenyl J -4- ( 3-indolyl) -3( 2H; -f uranon; 2-Methoxy-2-phenyl-4(2-trifluormethylphenyl)-3(2H)-furanon.

Beispiel 7

Bandwürmer von Hausen (.üymenolepis nana) in 9 ml wäßrigem Puffer mit einem pH-Wert von 9»5 wurden 10 Minuten bei 22 bis 26 ⁰C durch Zugabe von 1 ml einer Acetonlösung (mit verschiedenen Konzentrationen) von 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon gefärbt. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Waschen der Würmer in BHE-KuItürmedium (Eagle-Grundmedium) entfernt. Die Fluoreszenzintensität, welche mittels einer willkürlichen Skala von Nichtanfärben (θ)

409838/ 1 073

0,06	0,06	0,	06
0,37	0,37	0,	50
0,67	0,67	-
0,75	0,75	ο,	67

bis maximalem Anfärben (1,00) beurteilt wurde, wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (American Optical Fluorescent microscope) nach 1h, 22 h und 8 Tagen nach dem Anfärben bestimmt. Diese Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt. Sowohl die Gesamtmorphologie als auch die Aktivität der Würmer schien durch den Anfärbungsvorgang unbeeinflußt geblieben zu sein.

Konzentration mg/ml Zeit nach dem Anfärben

1h 22 h 8 Tage

0,0 0,5 0,1

. 0,2

Beispiel 8

■Escherichia coli wurde in 9 ml mit Borat gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 9,5 suspendiert, und 30 bis 60 Minuten bei Zimmertemperatur durch Zugabe von 1 ml einer Acetonlösung (verschiedener Konzentration) von 2 Methoxy-2,4-diphenyl-3(211)-furanon angefärbt. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Zentrifugieren entfernt, die Bakterien wurden erneut in Salzlösung suspendiert, bei 4- ⁰C aufbewahrt und Proben wurden auf Fluoreszenz.nach 24 Stunden, 8 Tagen und 16 Tagen nach dem Anfärben untersucht. Die Zeil-Lebensfähigkeit wurde 22 Stunden nach dem Anfärben nach einer standardmäßigen Plattenauszähltechnik abgeschätzt. Die Anfärbungsintensität wurde mittels einer willkürlichen Skala von Nichtanfärben (θ) bis maximalem Anfärben (1,00) beurteilt. Die Ergebnisse sind im folgenden zusammengestellt:

Konzentration mg/ml Zeit nach dem Anfärben Zellenlebensfähigkeit

1 Tag 8 Tage 16 Tage

0,0 0,00 0,00 0,00 2 χ

0,05 0,67 0,67 0,67

0,1 1,00 0,87 0,87 7 x

0,2 1,00 1,00 0,87 4,5 x

403838/1073

Beispiel 9

Spezifisches Typ II Kaninchen Antipneumokokken-Serum wurde in Puffer verdünnt, pH = 9,0, und 10 Minuten bei Zimmertemperatur mit Diatomeenerde (Warenbezeichnung Celite) umgesetzt, welche 1 % oder 2 % Gew./Gew. an 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon enthielt. Die Diatomeenerde wurde dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt, und das markierte Serum wurde bei A- ⁰C aufbewahrt. Die Salzlösungssuspension des Typs II der Pneumococcen wurde auf Mikroskopobjektträgern angeordnet. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Bakterien auf den Objektträgern mittels Wärme fixiert und mit markiertem Typ II Antiserum 10 bis 30 Minuten bei Zimmertemperatur angefärbt. Überschüssiges Antiserum wurde durch Waschen der Objektträger mit Salzlösung entfernt, und die Fluoreszenz wurde bei direkter ölimmersion bestimmt. Die Anfärbungsintensität wurde 10, 25 und 31 Tage nach dem Markieren gemessen, und sie wurde auf einer willkürlichen Skala eingestuft, die von Nichtanfärben (θ) bis maximalem Anfärben (1,00) reichte. Die Ergebnisse sind im folgenden zusammengestellt:

Zeit nach dem Markieren Verdünnung des markierten Serums (Tage) 1:10 1:100

Anfärbungsintensität

0 0,87

10 0,75 1,00

25. 0,75

' 31 0,87 1,00

Es konnte keine Fluoreszenz beobachtet werden, wenn der Pneumokokkentyp I als Antigen verwendet wurde. Dies zeigt an, daß die immunologische Spezifität beibehalten wurde.

Der Einfluß des Markierens auf den Antikörpertiter wurde mittels standardmäßiger, immunologischer Untersuchungen bestimmt. Die Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt. Der Titer wird in Form des reziproken Wertes der letzten Serumverdünnung ausgedrückt, welcher eine positive Reaktion ergibt.

409838/1073

Immunologischer Test

Titer

markiertes nicht markiertes Serum Serum

Quellungsreaktion Latex-Objektträgeragglutination Fluoreszenzmikroskop:

14 Tage nach dem Markieren 31 Tage nach dem Markieren

100.	80
400	320-640
640-1280	0
400-800	0

Beispiel 10

50 mg gamma-Globulin (Pferd, > 98 °/o rein) wurden in 500 ml eines 0,05 ΙΊ Puffers mit variierendem pH-Wert aufgelöst. 200 mg Diatomeenerde (Warenbezeichnung Celite), welche 2 % Gew./Gew. 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon enthielten (hergestellt durch .Behandlung von 10 g Diatomeenerde mit einer Lösung von 200 mg des Furanons in Aceton und Eindampfen bis zur Trockene) wurden hinzugesetzt. Nach 15 Minuten Behandlung in einem Kagnetrührer bei Zimmertemperatur wurde das Gemisch durch einen feinen Trichter filtriert,
das Filtrat wurde in Trockeneis-Aceton gefroren und in einer
Gefriereinrichtung aufbewahrt. Nach dem Zentrifugieren wurde
die Fluoreszenz gemessen. Die relative Fluoreszenz ist in willkürlichen Einheiten angegeben:

pH-,Wert

relative Fluoreszenz

8,00 8,35 8,50 8,83 9,00 9,31 9,50

9,75 10,06

9,5 16

33

46

75

80,5

84

89

409838/1073

Identische Ergebnisse wurden erhalten, nachdem die Lösungen Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen worden waren.

Beispiel 11

ml von 1 %igen Lösungen von gamma-Globulin (Pferd, > 98 °/o) in Puffer, entweder mit einem pH-Wert von 9»00 oder 9,50, wurden durch Behandlung mit 200 mg Diatomeenerde, welche 2 Gew./Gew.-% 2-ttethoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furancn enthielten, während 10 Minuten bei Zimmertemperatur markiert. Die Lösungen wurden unmittelbar auf einen pH-Wert von 7,00 mit 1N HCl neutralisiert, zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Die relative Fluoreszenz wurde in verschiedenen Zeitintervallen gemessen (Aktivierung = 390 nm, Emission = 484 nm), und ist im folgenden in willkürlichen Einheiten angegeben.

pH-Wert =9,00
'I'age nach dem Markieren relative Fluoreszenz

0 ■ 56,0

1 56,0

2 55,5

4 56,0

6 ' 57,0 8 -

11 55,0

pH-Wert =9,50
Tage nach dem Markieren relative Fluoreszenz

0 89,5

1 89,0

2 88,0 4 88,0 6 89,0 8

11 86,0

409838/ 1 073

Claims

Patentansprüche

Furanonderivat, hergestellt durchUmsetzung eines eine primäre Aminogruppe enthaltenden Materials, welches ein oder mehr als zwei Kohlenstoffatome "besitzt, mit einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel:

^E3

worin IL ein niederer Alkyl- oder Phenyl-niederer-alkylrest ist, Rp ein Phenyl- oder substituierter Phenylrest ist und R₅. ein substituierter oder nicht-substituierter Phenyl-, Naphthyl- oder Indolylrest ist.

409838/ 1 073
2. Furanonderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substituenten R- und R- in der Verbindung der Formel I beide Phenylreste sind.
3. Furancnderivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet/ daß die Verbindung der Formel I 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon ist.
4. Furanonderivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I 2-Benzyloxy-2_r4-diphenyl-3(2H)-furanon ist.
5. Furanonderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch

gekennzeichnet, daß das primäre Aminogruppen enthaltende Material ein Protein ist.
6. Furanonderivat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Antikörper ist.
7. Furanonderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Aminogruppen enthaltende Material ein einzelliger oder vielzelliger Organismus ist.
8. Furanonderivat _nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Aminogruppen enthaltende Material Hymenolepis nana ist.
9. Furanonderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Aminogruppen enthaltende Material Escherichia coli ist.
10. Furanonderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Aminogruppen enthaltende Material ein Antikörper für Pneumococcus Typ II ist.

409838/1073

2A07899
11. Furanonderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Aminogruppen enthaltende Material Gammaglobulin ist.
12. Zusammensetzungen für diagnostische Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Furanonderivat nach Ansprüchen 1 bis 11 enthalten.
13. Diagnostische Methode, dadurch gekennzeichnet, daß ein Furanonderivat nach Ansprüchen 1 bis 11 verwendet wird.