DE2346147A1

DE2346147A1 - Verfahren zur selektiven abspaltung von aminoschutzgruppen

Info

Publication number: DE2346147A1
Application number: DE19732346147
Authority: DE
Inventors: Bruno Dr Kamber; Bernhard Dr Riniker; Peter Sieber
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1972-09-22
Filing date: 1973-09-13
Publication date: 1974-03-28
Also published as: CH577464A5; BE805147A; GB1448371A; HU169501B; JPS5724776B2; JPS4985003A; US3862113A; FR2200250B1; CA1007224A; FR2200250A1; NL7313077A

Description

CIBA-GEIGY AG, BASEL (SCHWEIZ)
Case 4-8418+

Verfahren zur selektiven Abspaltung von Aminoschutzgruppen.

Das Problem der Schutzgruppen bei der Peptidsynthese ist noch nicht in befriedigender Weise gelöst. Insbesondere besteht immer noch ein Bedürfnis nach selektiv in saurem Medium abspaltbaren Aminoschutzgruppen. Wie bekannt, kann ja die hydrogenolytische Abspaltung von Schutzgruppen bei schwefelhaltigen oder sehr langkettigen Peptiden nicht angewendet werden und die Abspaltung von Schutzgruppen im alkalischen Medium kommt bei vielen empfindlichen Peptiden auch nicht in Betracht. Bei der Peptidsynthese im allgemeinen am besten anwendbar ist die acidolytische Ab- —

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spaltung von Schutzgruppen. Hierfür stehen bereits einige sehr geeignete Gruppen zu Verfügung, insbesondere die tert. Butyloxycarbonyl (Boc)-gruppe und ähnliche Gruppen wie die tert.Amyloxycarbonyl- und die Adamantyloxycarbonylgruppe zum Schutz der Aminogruppe und entsprechende Ester.und Aether, z.B. tert. Butylester und tert.Butylather zum Schutz der Carboxy- bzw. Hydroxylgruppen. Ausserdem sind in neuerer Zeit einige noch sehr viel leichter acidolytisch abspaltbare Aralkyloxycarbonyl-Aminoschutzgruppen bekannt geworden, insbesondere die 2-(p-Biphenylyl) -2-isopropyloxycarbonyl(Bpoc)-gruppe, vgl. Sieber et al. ,HeIv. Chim. Acta 5JL, 614-622 und Schweizer Patent Nr. 509 266. Diese Gruppen können selektiv gegenüber der oben genannten Boc-Gruppe und ähnlichen Gruppen abgespalten werden. Eine weitere, unter milden sauren Bedingungen abspaltbare Aminoschutzgruppe ist die Tritylgruppe. Diese kann selektiv neben der Boc-Qruppe entfernt werden, jedoch ist es bisher nicht gelungen, sie selektiv gegenüber der Bpoc-Gruppe abzuspalten. So ist beispielsweise in 80%iger Essigsäure die Abspaltungsgeschwindigkeit der Tritylgruppe nur 7 mal grosser als die der Bpoc-Gruppe. Dieses Verhältnis genügt nicht für eine befriedigende selektive Abtrennung der Schutzgruppen. Um eine gute Selektivität (und damit möglichst T?enig Nebenprodukte ) zu erzielen, sollte das Verhältnis der

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Abspaltungsgeschwindigkeiten mindestens 1:100 betragen. Für Boc:Bpoc beträgt es beispielsweise 1:3000 in dem genannten Lösungsmittel.

Es besteht ein Bedürfnis danach, mindestens drei Arten von selektiv acidolytisch abspaltbaren Aminoschutzgruppen zur Verfügung zu haben. Die in der Natur vorkommenden langkettigen Peptide bestehen nämlich teilweise aus zwei Ketten, z.B. Insulin. Bei der Synthese solcher Peptide benötigt man erstens sauer abspaltbare Schutzgruppen für Aminogruppen (und ebenso für die Carboxyl- und Hydroxylgruppen der Seitenketten); diese Gruppen werden während der ganzen Synthese beibehalten (sogenannte "stabile" Schutzgruppen) und erst in der letzten, bzw. bei Cystin-haltigen Peptiden eventuell in der vorletzten Stufe, abgespalten. Hierfür geeignet sind beispielsweise die Boc-Gruppe und die entsprechenden tert.Butylester- und tert.Butyläthergruppen zum Schutz der Carboxyl- und Hydroxylgruppen der Seitenketten. Weiter benötigt man eine selektiv gegenüber diesen "stabilen" Schutzgruppen abspaltbare "labile" α-Aminoschutzgruppe für die eine der beiden Ketten, z.B. die Α-Kette des Insulins, und eine wiederum selektiv gegenüber dieser ersten "labilen" Aminoschutzgruppe abspaltbare zweite "labile" α-Aminoschutzgruppe für die zweite der beiden Ketten, z.B. die B-Kette des Insulins. Diese verschiedenen Arten von "labilen" cc-Aminoschutzgruppen sind erforderlich, weil der Aufbau der

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beiden Ketten durch wiederholte Ankondensation von

Aminosäuren oder Peptidfragmenten = ■—

am Aminoende der Ketten für beide Ketten getrennt erfolgen muss und die zunächst stilliegende Kette eine relativ stabilere a-Aminoschutzgruppe benötigt als die im Aufbau befindliche Kette. Als "labile" Aminoschutzgruppen z.B. gegenüber der Boc-Gruppe, geeignet sind die oben erwähnten Aralkyloxycarbonylgruppen oder die Tritylgruppe. Es war aber bisher nicht möglich, diese beiden Arten von "labilen" Aminoschutzgruppen gegenüber einander selektiv abzuspalten.

Es wurde nun gefunden, dass man eine gute selektive acidolytische Abspaltung der N-Tritylgruppe gegenüber einer N-Aralkyloxycarbonylgruppe der Formel IR,.

R₉-C-O-CO- I,

¹ I

^R3.

worin R, für Niederalkyl, R_? für Niederalkyl oder Phenyl und R~ für Phenyl steht und worin die Phenylreste unsubstituiert oder durch Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Phenyl-, Nieder-

alky!phenyl- oder Niederalkoxyphenylgruppen

substituiert sind, erzielt, wenn man die Abspaltung der Tritylgruppe in 2,2,2-TrifluorMthanol vornimmt. Man kann absolutes oder wässeriges, beispielsweise 70 - 100%iges Trifluoräthanol verwenden. Vorzugsweise verwendet man 90 - 95%iges wässeriges Trifluoräthanol. Die Tritylgruppe wird in diesem Lösungsmittel bei einem pH von 3 bis 5 abgespalten. Vorzugsweise spaltet man sie bei pH 4 ab (gemessen mit einer Glaselektrode "kombinierte

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Einstab-Messkette" Typ EA 147X der Fa. Metrohm AG, Herisau, Schweiz ), in ca. 5-10 Minuten. Unter diesen Bedingungen bleibt die Aralkoxycarbony!gruppe unverändert erhalten. Sie wird erst bei viel stärker saurem pH (ca. 0 bis 2) abgespalten. Dies entspricht einem Verhältnis der Abspaltgeschwindigkeit von ca. 1000 : 1 für Trityl zu Aralkoxycarbonyl. Das pH kann mit einer anorganischen oder organischen Säure eingestellt werden. So kann man eine Mineralsäure wie eine Halogenwasserstoffsäure, z.B. Fluorwasserstoff oder vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure oder als organische Säure z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Chloressigsäure oder Trifluoressigsäure verwenden. Die Reaktion kann bei Temperaturen von -50 bis +60⁰C durchgeführt werden, vorzugsweise arbeitet man bei Raumtemperatur.

In der Aralkoxycarbonylgruppe der Formel I ist der Niederalkylrest vorzugsweise ein Aethyl- oder besonders ein Methylrest; R, und R~ stehen vorzugsweise für Methyl und Ro für Phenyl, ToIy1 oder p-Biphenylyl. DieAralkyloxycarbonylgruppe ist z.B. die 1,1-Diphenylä'thyloxycarbonylgruppe oder vor allem die 2-Phenylisopropyloxycarbonyl- oder 2-(p-Tolyl)-isopropyloxycarbonyl- oder in erster Linie die 2-(p-Biphenylyl)-2-isopropyloxycarbony!gruppe.

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Die Araiköxycarbonylgruppe kann, wenn erwünscht, ebenfalls in Trifluoräthanol abgespalten werden. Man kann sie aber auch in den bekannten sauren wässerigen Medien, z.B. in wässeriger Ameisensäure, Essigsäure oder Chloressigsäure oder Gemischen, z.B. Eisessig- 82,8% Ameisensäure-Wasser (7:2:1, Vol. teile) abspalten, vgl. die oben angegebene Literatur.

Das erfindungsgetnässe Verfahren kann bei der Synthese der oben skizzierten zweikettigen Peptide beispielsweise wie folgt angewandt werden: zum Schutz der Aminogruppen der Seitenketten verwendet man die Boc-Gruppe und gegebenenfalls, wenn erwünscht, zum Schutz von Carboxyl- und Hydroxylgruppen die tert.Butylester und tert.Butylathergruppe; die α-Aminogruppe der ersten Kette (z.B. Α-Kette des Insulins) wird durch die.Bpoc-Gruppe, die oc-Aminogruppe der zweiten Kette (B-Kette) durch die.Tritylgruppe geschützt. An dem Teilstück der bereits verbundenen beiden Ketten wird zunächst die B-Kette vervollständigt, indem man am Aminoende

jeweils die Tritylgruppe erfindungsgemäss abspaltet und Tritylgeschützte Aminosäuren bzw. Peptideinheiten ankondensiert. Die Aminosäure Nummer 1 der B-Kette wird nicht durch die Trityl-j sondern z.B durch die Boc-Gruppe geschützt. Dann spaltet man aus der Α-Kette die Bpoc-Gruppe ab, z.B. mit 80%iger wässeriger Essigsäure, und kondensiert am Aminoende jeweils Bpoc-geschützte Aminosäure bzw. Peptideinheiten an, bis die A-Kette vollständig synthetisiert ist. Schliesslich spaltet man in

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einer einzigen oder, wenn erwünscht, in mehreren Stufen die Seitenkettenschutzgruppen und die beiden oc-Aminoschutzgruppen ab.

Es soll erwähnt werden, dass drei Arten selektiv acidolytisch abspaltbarer Aminoschutzgruppen nicht nur bei zweikettigen Peptiden benötigt werden. Sie sind auch erwünscht, wenn man ein einkettiges Peptid mit mehreren Seitenkettenaminogruppen, die nicht in gleicher Weise substituiert sind, herstellen will, z.B. ein Peptid, das an einer Itf-Aminogruppe der Seitenkette acyliert ist und das eine weitere, jedoch freie Seitenkettenaminogruppe enthält.

Schliesslich ist zu beachten, dass das erfindungsgem'ässe Verfahren nicht nur angewandt werden kann, wenn drei Arten von selektiv abspaltbaren Aminoschutzgruppen benötigt werden. Wegen der leichteren und selektiven Abspaltbarkeit der Trityl- und der genannten Aralkyloxycarbonylgruppen im Vergleich zu anderen bekannten selektiv abspaltbaren Aminoschutz· gruppen ist es vorteilhaft, bei empfindlichen Peptiden sich dieser beiden Schutzgruppen zu bedienen, wobei dann die Tritylgruppe als die "labile" und die Aralkoxycarbonylgruppe als die "stabile" Aminpschutzgruppe verwendet wird.

Weiter hat sich gezeigt, dass das Verfahren der Abspaltung der N-Trityl- oder N-Aralkyloxycarbonylgruppe in Trifluoräthanol bei dem entsprechenden pH (pH = 3-5, besonders 4 für Trityl; pH = 0 bis 2 für Aralkyloxycarbonyl) auch mit

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Vorteil bei Peptidsynthesen angewendet werden kann, wenn nur eine dieser beiden Aminoschutzgruppen vorhanden ist, da diese Abspaltung sehr einfach und vor allem sehr schonend ist und die Üblichen Amino-, Hydroxy-, Carboxyl-, Mercapto- und IminoSchutzgruppen nicht angreift. So kann man die N-Trityl- oder die N-Aralkoxycarbonylgruppe in Trifluoräthanol bei dem genannten pH selektiv abspalten gegenüber den Gruppen vom tert.-Butyl-Typ, wie Boc, tert.ButylMther, tert.Butylester, und ähnlichen acidolytisch abspaltbaren Gruppen, z.B. tert. Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl und entsprechenden Aethern und Estern, oder gegenüber reduktiv oder basisch abspaltbaren Gruppen wie Benzyloxycarbonyl und substituiertem Benzyloxycarbonyl, wie Nitro-, Halogen-, Niederalkoxy- oder Phenylazo-substituiertem Benzyloxycarbonyl und entsprechenden Aethem und Estern wie Benzyläthern oder -estern, oder 2,2,2-Trichloräthyloxycarbonyl oder N-Acylgruppen, wie For my 1-, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Benzolsulfonyl, ρ-Toluolsulfonyl, oder Estergruppen, wie Methyl-, Aethyl, Benzoylmethylester, Phenyl- und substituierten Phenylestern wie Trichlorphenyl-, p-Nitrophenyl-, Pentachlorphenyl-, N-Hydroxysuccinimid-, N-Hydroxyphthalimid- oder N-Hydroxypiperidinester, oder gegenüber bekannten Mercaptoschutzgruppen wie Trityl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, Benzhydryl, Dimethoxybenzhydryl, Phenylcyclohexyl, u.a.

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(Ber. ΙΟΙ, 681 (1968)), Acylaminomethyl, z.B. Acetylaminomethyl u.a. (deutsche Offenlegungsschrift 2 060 969 (Case 4-6914/1+2)), Alkoxycarbonylsulfenyl, z.B. Methoxycarbonylsulfenyl u.a. (deutsche Offenlegungsschrift 2 231 775 (Case 4-7613/1+2)), Niederalkylthio, z.B. tert.Butylthio, Thiomethyl wie tert.Butylthiomethyl, Benzylthiomethyl, oder Iminoschutzgruppen wie Benzyl, Trityl, Carbobenzoxy, Adamantyloxycarbonyl, 2,2,2-Trifluor-l-tert.butyloxycarbonylaminoäthyl oder 2,2,2-Trifluor-l-benzyloxycarbonylaminoäthyl.

Die Ausgangsstoffe für das obige Verfahren - Peptide oder Peptidderivate, in denen eine Aminogruppe durch die Trity!gruppe und eine oder mehrere andere Aminogruppen durch die Bpoc-Gruppe geschützt sindj sind bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Die Art des zu synthetisierenden Peptides oder Peptidderivates spielt beim erfindungsgemässen Verfahren keine Rolle.

Unter Peptiden sind in erster Linie in der Natur vorkommende Peptide zu verstehen, wie sie z.B. in dem Werk "The Peptides" von Schröder und Ltibke, Academic Press, New York and London, Band I und II, 1965-1966, beschrieben

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sind, und auch synthetische Analoge solcher Peptide, die sich von diesen dadurch unterscheiden, dass in ihnen eine oder mehrere Aminosäuren gegen andere Aminosäuren ausgetauscht sind. Weiter sind unter Peptiden Partialsequenzen der erwähnten natürlichen oder synthetischen Peptide zu verstehen. Aminosäuren, die in den genannten Peptiden als Bausteine vorkommen, sind vor allem die 20 Gode-Aminosäuren, vgl. z.B. Sei. American, October 1960, S. 55, und Homologe, Struktur- und optische Isomere davon, z.B. Amino-niederalkansäuren mit höchstens 7 Kohlenstoffatomen, die von den Code-Aminosäuren verschieden sind, wie a-Aminobuttersäure, Norvalin, ß-Alanin, γ-Aminobuttersäure, α,β-Diaminopropionsäure, weiter z.B. Hydroxyprolin, Normethionin, Phenylglycin, Ornithin, Citrullin, O-Methyl-tyrosin, N-Methyl-tyrosin und andere N-Niederalkyl-aminosMuren, weiter racemische und D-Aminosäuren.

Derivate von Peptiden, die als Ausgangs- oder Endstoffe für das neue Verfahren in Betracht kommen, sind vor allem funktioneile Derivate wie Ester und Amide, ferner mit Schutzgruppen versehene Peptide. Als Ester sind besonders diejenigen zu erwähnen, die geeignete Zwischenprodukte für die Peptidsynthese sind, z.B. Niederalkylester und Halogen-

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substituierte Niederalkylester, z.B. Methylester, Aethylester, tert.Butylester, tert.Ämylester, 2,2,2-Trichloräthyl- ester, 2-Jodäthylester, 2-Chloräthylester, ferner Aryl- und Arylniederalfcylester wie gegebenenfalls durch Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen, Trifluormethyl oder Nitro substituierte Phenyl- oder Phenylniederalkylester, z.B. p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,6-Trinitrophenylester, 2,4,5 oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, Benzylester, p-Nitrobenzylester, p-Methoxybenzylester, weiter N-Hydrox} succinimidester, N-HydroxyphthaLimidester. Amide sind vor allem N-unsubstituierte und N-Mononiederalkyl- und Diniederalkyl-substituierte Amide.

Die folgenden Beispiele illustrieren das erfindungsgemässe Verfahren. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

In der DünnschichtChromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:

System 43: tert.Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (51:21:28) System 45 : see. Butanol-3%iges wässeriges Ammoniak (70:30) System 52 : n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21) System 87 : iso-Propanol-Ameisensäure-Wasser (77:4:19) System 100 : Aethylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11).

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. ₁₂ . 2346U7

Folgende Abkürzungen werden verwendet:

Boc = tert.Butyloxycarbonyl

Z = Carbobenzoxy

Trt - Trityl

But = tert.Butyl

Bpoc = 2-(p-Biphenylyl)-2-isopropyloxycarbonyl

DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid

HoBt = N-Hydroxybenzotriazol

DMF = Dimethylformamid

OSu = N-Hydroxysuccinimidester

ONp = p-Nitrophenylester

OPcp = Pentachlorphenylester

OMe = Methylester

Et₃N = Triäthylamin.

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-is-· . 2346H7

Beispiel 1:

Selektive Abspaltung der N^a-Tritylgrüppe im Human-Insulinfragment A¹⁴"²¹-B¹⁷"³⁰ (I)
But OBut But

I Il ·

Bpoc-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OBut

14 . j 21

I OBut But But Boc But

Trt-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OBut 17 30

(Dünnschichtchromatograram von I auf Silicagel: Rf₄₅ = 0,55; Rf₅₂ = 0,76; Rf₁₀₀ - 0,91; Kf(C^l₃-CH₃OH 8:2)= °>³⁸·

114 mg I-acetat werden in 0,6 ml Chloroform-Methanol (1:1) gelöst und zu 12 ml Trifluoräthanol-Wasser (9:1, V:V) zugegeben. Das Reaktionsgefäss ist mit einer Glaselektrode (der Fa. Metrohm, Typ EA 147X) versehen, die mit einem automatischen pH-Stat kombiniert ist. Sofort nach der Zugabe von I wird der pH-Wert auf 4,5 gestellt, was durch Zufügen 0,05-n. HCl in 80%igem Trifluoräthanol mittels pH-Stat erreicht wird. Der Säureverbrauch kommt nach ca. 15 Minuten zum Stillstand. Dies zeigt an, dass die Abspaltung der Tritylgruppe beendet ist. Durch pünnschichtchromatographie (s. unten) wird dies bestätigt. Man gibt 1 ml Py rid in zu der Lö'sung_s dampft .am.. Vakuum zur Trockne ein und verreibt den Rückstand mit Aether zur Entfernung von

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Triphenylcarbinol und Trityl-trifluor'äthylather,

filtriert und trocknet.

Der Rückstand (Des-Tritylderivat von I, als Hydrochlorid) weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel· folgende Rf-Werte auf: '

System . Rf

45 0,49

52 · 0,59

100 0,60

CHG1--CH₃OH(8:2) 0,25.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
1) H-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut

11,4 g Z-Lys(Boc)-OH und 6,1 g H-Thr(But)-OBut werden in 170 ml Chloroform gelöst und bei 0° mit 1,35 g HoBt und 6,6 g DCCI versetzt. Nach 22 Stunden bei 4° wird ab filtriert, das Filtrat mit 5%iger ZitronensMurelösung, 0,5 N-Natriumbiearbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach Trocknen und Eindampfen wird Z-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut erhalten. Rf in Essigester = 0,60. Die katalytische Hydrierung zu H-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut erfolgt in 200 ml Methanol in Gegenwart von 1,0 g Palladium-Kohle (10 %Pd). Rf in Chloroform-Methanol(9:1) - 0,40.

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2) H-Pro-Lys (Boc) -Thr (But) -OBut.

Zu 2.82 g Z-Pro-OH in 50 ml Essigester werden bei -10° 1,58 ml EtoN und 1,50 ml Isobutylchlorocarbonat gegeben. Nach 10 Minuten bei -10° versetzt man mit 5,80 g H-Lys(Boc)-Thr (But)-OBut in 50 ml Essigester. Man lasst 1 Stunde bei -10° und 20 Stunden bei 4° stehen und wäscht dann die Lösung mit 5%iger Zitronensäure-, 0,5 N-Natriumbicarbonatlösung und Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Der Rückstand (Z-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut) wird aus Aether-Petroläther umkristallisiert. F. 100 - 103°. Die Abspaltung der Benzyloxycarbonylgruppe erfolgt durch Hydrierung in 100 ml Essigester in Gegenwart von 0,5 g Palladium-Kohle (10% Pd). Rf des Produktes in Chloroform-Methanol (7:3) = 0,45.

3) H-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut.

4,07 g Z-Thr(But)-OSu und 5,57 g H-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut werden in 30 ml Essigester .gelöst. Nach 24 Stunden bei 20° wird mit 100 ml Essigester verdünnt und die Lösung mit' 5%iger Zitronensäure-, 0,5 N-Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird Z-Thr (But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut erhalten, welches durch Umfallen aus Aether-Petroläther gereinigt wird. Rf in Essigester = 0,35. H-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut wird durch katalytische

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Hydrierung in 100 ml Methanol in Gegenwart 0,8 g Palladium-Kohle (10% Pd) erhalten. Rf in Chloroform-Methanol (9:1) = 0,20.

4) H-Tyr(But)-Thr(But)-Prc-Lys(Boc)-Thr(But)-0But.

11,13 g Z-Tyr(But)-OSu und 16,4 g H-Thr(But)-Pro-Lys (Boc)-Thr(But)-OBut werden in 150 ml Essigester während 20 Stunden bei 20° umgesetzt. Nach Verdünnen mit 200,ml Essigester wird die Lösung mit 5%iger Zitronensäure-, 0,5 N-Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Umfallen aus Essigester-Petroläther gibt einheitliches Z-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr (But) OBut. Rf in Essigester = 0,50. Die katalytische Hydrierung zu H-Tyr (But)-Thr (But )-Pro-Ly s (Boc)-Thr (But)-OBut erfolgt in 200 ml Methanol in Gegenwart von 1,5 g Palladium-Kohle (10% Pd), Rf in Chloroform-Methanol (4:1) = 0,55.

5) H-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut.

2,65 g Z-Phe-OSu und 5,95 g H-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut lässt man in 30 ml Essigester während 20 Stunden bei 20° reagieren. Die Lösung wird dann mit 70 ml Essigester verdünnt, mit 5%iger Zitronensäure, 0,5 N-Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge- ' trocknet und eingedampft. Das Produkt wird durch Chromato-

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graphie an Silcagel gereinigt. Essigester eluiert das Z-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut in dünnschichtchromatographisch einheitlicher Form. Rf in Essigester - 0,40. Die Hydrierung zur Abspaltung von Z erfolgt in 100 ml Methanol in Gegenwart von 1,0 g Palladium-Kohle (1.0% Pd). Rf in Chloroform-Methanol (9:1) = 0,30.

6) H-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut.

Wie unter 5) beschrieben werden 2,36 g Z-Phe-OSu und 6,0 g H-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut in 30 ml Essigester umgesetzt, isoliert und gereinigt. Rf in Essigester = 0,50. Die katalytische Hydrierung von Z-Phe-Phe-Tyr (But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut erfolgt in 60 ml Methanol in Gegenwart von 0,8 g Palladium-Kohle (10% Pd). Rf in Toluol-Aceton (1:1) » 0,45.

7) H-Ar g-GIy-OMe. HCl.

1,54 g Z-Arg-OH und 0,63 g H-GIy-OMe.HCl in 20 ml DMF werden bei 0° mit 1,14 g DCCI versetzt und 15 Stunden bei 20° reagieren lassen. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt. Der unlösliche Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat lyophilisiert. Rf in Chloroform-

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Methanol(1:1) = 0,50. Die Hydrierung von Z-Arg-GIy-OMe.HGl erfolgt in 30 ml Methanol in Gegenwart von 0,5 g Palladium-Kohle (10% Pd).

8) Z-Glu(OBut)-Arg-Gly-OMe.HCl.

1,69 g Z-Glu(OBut)-OH, 1,50 g H-Arg-Gly-OMe.HCl und 1,14 g DCCI in 20 ml DMF werden 2 Stunden bei 0° und 22 Stunden bei 4° reagieren gelassen . Man filtriert dann ab, dampft das FiItrat ein und fällt den Rückstand aus Methanol-Aether um. Rf in Chloroform-Methanol (1:1) = 0,50.

9) Z-Glu(0But)-Arg-Gly-0H.

12,02 g Z-GIu(OtBu)-Arg-Gly-OMe.HCl in 50 ml Methanol und 30 ml Wasser werden am pH-Stat mit 2.0 N-NaOH bei pH 11,4 verseift (Dauer: 1.1/4 Stunden). Mit 1,0 N-HCl wird pH 6. 7 eingestellt, das Methanol abgedampft und der Rückstand 20 Stunden bei 0° gehalten. Man filtriert ab und trocknet über Kaliumhydroxyd. Rf im System 87 = 0,60.

10) H-Glu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut.

Zu 1,11 g Z-GIu(OBut)-Arg-Gly-OH in 30 ml DMF gibt man bei 0° 1,025 ml 2,15-N HCl in Essigester, 2,40 g H-Phe-Phe-Tyr-(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut, 0,1 g HoBt und

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0,45 g DCCI. Nach 2 Stunden bei 0° und 20 Stunden bei 20° filtriert man und dampft das Filtrat ein. Der Rückstand wird durch eine Gegenstromverteilung im System MeOH, Puffer, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff (10 + 3 + 5 + 4) gereinigt [Puffer: 38,6 g Ammonacetat und 57,2 ml Eisessig werden mit Wasser auf 2 Liter aufgefüllt]. K = 0,3. Rf im System 43 = 0,55. Man erhält Z-GIu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc}-Thr(But)-OBut. Zur Abspaltung der Benzyloxycarbonylgruppe wird in" 50 ml 90%igem Methanol in Gegenwart von 0,2 g Palladium-Kohle (10% Pd) hydriert. Rf im System 100 = 0,30.

11) H-Asn-Tyr(But)-0Me.

7,75 g Z-Asn-0Np und 5,0 g H-Tyr(But)-OMe werden in 60 ml DMF bei 20° während 15 Stunden reagieren gelassen. Die Lösung wird dann eingedampft, der Rückstand in 50 ml Methanol gelöst und mit 300 ml Aether gefällt. Den Niederschlag kristal· lisiert man aus Methanol um. F. 173-175°. Die katalytische Hydrierung von Z-Asn-Tyr (But)-OMe erfolgt in 400 ml Methanol in Gegenwart von 3.0 g Palladium-Kohle (10% Pd). Rf in Chloroform-Methanoi (4:1) « 0,40.

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12) H-GIu(OBut)-Asn-Tyr(But)-OMe.

1,85 g Z-Glu(OBut)-ONp und 1,49 g H-Asn-Tyr(But)-OMe werden in 30 ml DMF während 24 Stunden bei 20° umgesetzt. Die Isolierung von. Z-GIu(OBut)-Asn-Tyr(But)-OMe erfolgt wie unter 11). Umkristallisation aus Isopropylalkohol. F. 192-195°. Die katalytische Hydrierung wird in 100 ml Methanol in Gegenwart von 0,2 g Palladium-Kohle (10% Pd) vorgenommen. Rf in Chloroform-Methanol (7:3) = 0,45.

13) H-Leu-Glu(OBut) -Asn-Tyr (But) -OMe.

0,97 g Z-Leu-ONp und 1,34 g H-GIu(OBut)-Asn-Tyr

(But)-OMe werden in 5 ml DMF während 20 Stunden bei 20° umgesetzt. Zur Reaktionslösung werden 50 ml Aether gegeben, es wird filtriert und der Rückstand Z-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr (But)-OMe mit Essigester gewaschen. Rf in Chloroform-Methanol (9:1) = 0,50. Die Abspaltung von Z erfolgt durch katalytische Hydrierung in 60 ml Methanol.in Gegenwart von 0,2 g Palladium-Kohle (10% Pd). Rf in Chloroform-Methanol (7:3) = 0,60.

14) H-GIn-Leu-Glu (OBut) -Asn-Tyr (But) -OMe.

0,60 g Z-GIn-ONp und 0,99 g H-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr (But)-OMe werden in 10 ml DMF während 15 Stunden bei

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umgesetzt. Das Produkt Z-GIn-Leu-GIu(OBut)-Asn-Tyr(But)-OMe wird durch Zugabe von Aether aus der Reaktionslösung ausgefällt und dann aus heissem Methanol umkristallisiert. F. 229-231°. Die katalytische Hydrierung erfolgt in 30 ml Trifluoräthanol in Gegenwart von 0,15 g Palladium-Kohle (10% Pd)₃ wobei mit 0,7 N HCl in Methanol das pH mittels eines pH-Stats bei 4,5 gehalten wird. Rf im System 100 = 0,35.

15) Bpoc-Tyr(But)-GIn-Leu-GIu(OBut)-Asn-Tyr(But)-OMe.

4,85 g Bpoc-Tyr(But)-OPcp und 5,56 g HCl.H-Gln-Leu-GIu(OBut)-Asn-Tyr(But)-OMe werden in 40 ml DMF mit 0,94 ml Et-N versetzt und 20 Stunden bei 20° reagieren gelassen. Die Reaktionslösung wird dann eingedampft und der Rückstand durch Umfallen aus Methanol-Aether gereinigt. Rf in Chloroform-Methanol (4:1) = 0,65.

16) Bpoc-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-NH-NH₂-

2,5 g des Methylesters werden in 30 ml DMF gelöst und bei 0° mit 3,0 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 16 Stunden bei 20° wird das Produkt durch Zugabe von 200 ml Wasser ausgefällt, abfiltriert und Über Kaliumhydroxid getrocknet. Rf in Chloroform-Methanol (7:3) = 0,60.

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-22- 23A6U7

17) Bpoc-Tyr (But)-GIn-LeU-GIu(OBUt) -Asn-Tyr (But) -Cys-Asn-OBut

Trt-Leu-Val-Cys-Gly-OH

1,87 g Bpoc-Tyr (But)-GIn-LeU-GIu(OBUt)-Asn-Tyr (But)-NH-NH₂ werden in 15 ml DMF gelöst und bei -15° mit 1,3 ml 2,84 N-HCl in Essigester und 0,208 ml tert.Butylnitrit versetzt. Nach 10 Minuten bei -15° gibt man 1,52 g H-Cys-Asn-OBut

Trt-Leu-Val-Cys-Gly-OH ,

(vgl. belgisches Patent 785 933, Case 4-7613/1+2) und 1,0 ml N-Aethylmorpholin in 15 ml DMF zu. Nach 1 Stunde bei -10° und 15 Stunden bei 4° wird die Lösung bei 0° in 150 ml l%ige Essigsäure gegossen, der Niederschlag abfiltriert und durch Gegenstromverteilung im System Methanol-0,1 M Ammoniumacetat (pH 7)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) gereinigt. K= 0,3. Rf im System 45 = 0,60.

18) Bpoc-Tyr (But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr (But)-Cys-Asn-OBut

Trt-LeU-VaI-CyS-GIy-GIu(OBUt) -Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But) Thr (tBu) -Pro-Lys (Boc) -Thr (But) -OBut

4,28 g II und 3,56 g H-GIu(OBut)-Arg-GIy-Phe-Phe-Tyr (But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut in 60 ml DMF werden mit 0,4 g HoBt und 2,06 g DCCI versetzt und 2 Stunden bei 40° gehalten. Die Reakt ions lösung wird dann auf ca. 30 ml eingeengt, filtriert und in 250 ml Wasser gegossen. Der Nie-

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_ ₂₃ . 2346 U7

derschlag wird abfiltriert und durch Gegenstromverteilung im System Methanol-0,1 M Ammonacetat(pH 7)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) gereinigt. K= 0,06. Rf im System 45 =0,55.

Beispiel 2:

Man geht von einer Verbindung der Formel I wie im Beispiel 1 aus, worin jedoch die Bpοc-Schutzgruppe durch die 2-Phenylisopropyloxycarbonyl-gruppe ersetzt ist. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 wird das entsprechende Des-Trityl-Peptid erhalten. Es weist im Dünnschichtchrο-matogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf: Rf. = 0,47 (Trityl-geschütztes Produkt: 0,53); Rf = 0,60 (Trityl-geschütztes Produkt: 0,90); Rf in CHCl₃-CH₃OH (8:2) = 0,24 (Trityl-geschütztes produkt:0,37).

Beispiel 3:

Selektive Abspaltung von Bpoc aus Bpoc-Ser(But)-Thr(But)-Cys (Trt)-Val-Leu-OMe.

0,61 g Bpoc-Ser(But)-Thr(But)-Cys(Trt)-Val-Leu-OMe (vgl. brit. Patent 1 259 017) werden in 10 ml Trifluoräthanol-Wasser (9:1, v/v) gelöst..Mit 0,05 N HCl in Trifluoräthanol-

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_₂₄. 2346H7

Wasser (4:1 v/v) wird auf ein pH von 0,5 gestellt und durch den pH-Start auf diesem Wert gehalten. Wenn keine weitere Säure mehr aufgenommen wird (nach ca. 40 Minuten) wird 1 ml Pyridin zugegeben, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Aether verrieben. Es resultiert ein dünnschichtchromatographisch einheitliches.Produkt, H-Ser(But)-Thr(But)-Cys(Trt)-Val-Leu-OMe, Rf in Chloroform-Aceton (1:1) = 0,50.

Beispiel 4:

Selektive Abspaltung von N-Trt aus Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-GIy-OMe

1,2 g Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-GIy-OMe (vgl. belgisches Patent 785 933) werden in 100 ml Trifluoräthanol-Wasser (9:1, v/v) aufgenommen, mit 0,05 N HCl in Trifluoräthanol-Wasser (4:1, v/v) auf pH 4,0 eingestellt und durch den pH-Stat auf diesem Wert gehaltem Nach beendeter Säureaufnahme (nach ca. 20 Minuten) werden 2 ml Pyridin dazugegeben und die Lösung wird eingedampft. Der mit Aether verriebene Rückstand von H-Leu-Val-Cys(Trt)-GIy-OMe erweist sich im DUnnschichtchromatogramm als einheitlich. Rf in Toluol-Aceton (1:1) = 0,45.

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Claims

-25- 2346U7 Patentansprüche :

1. Verfahren zur selektiven Abspaltung von Aminoschutzgruppen bei der¹ Peptidsynthese unter Anwendung zweier Arten von "labilen" Aminoschutzgruppen, nämlich einer Trity!gruppe einerseits und einer Aralkyloxycarbonylgruppe der Formel I R^

-C-O-

R₂-C-O- CO-

3
worin R, für Niederalkyl, R2 für Niederalkyl oder Phenyl und R₁, für Phenyl steht and worin die Phenylreste unsubstituiert oder durch Niederalkyl, Niederalkoxy, Phenyl, Niederalkylphenyl oder Niederalkoxyphenyl substituiert sind, andererseits, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abspaltung der Tritylgruppe in 2,2,2-Triflüoräthanol bei einem pH von 3 bis 5 vornimmt.

2. Verfahren zur selektiven Abspaltung von Aminoschutzgruppen bei der Peptidsynthese, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aminoschutzgruppen die Tritylgruppe verwendet und dass man .die Abspaltung dieser Gruppe in 2,2,2-Trifluoräthanol bei einem pH von 3-5 vornimmt.

3. Verfahren zur selektiven Abspaltung von Aminoschutzgruppen bei der Peptidsynthese, dadurch gekennzeichnet,.dass man als Aminoschutzgruppe eine Aralkyloxycarbonylgruppe der Formel I

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2346U7

R₂ -J-O

-CO-

"3

worin R, für Niederalkyl, R~ für Niederalkyl oder Phenyl und R„ für Phenyl steht und worin die Phenylreste unsubstituiert oder durch Niederalkyl, Niederalkoxy, Phenyl, Nieder alky !phenyl oder Niederalkoxyphenyl substituiert sind, verwendet und dass man die Abspaltung dieser Gruppe in 2,2,2-Trifluoräthanol bei einem pH von 0-2 vornimmt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man 70 - 100%iges Trifluoräthanol verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man 90 - 95%iges wässeriges Trifluoräthanol verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abspaltung der Tritylgruppe bei einem pH von ca. 4 vornimmt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3-5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abspaltung der Aralkyl-

k 0 9 8 1 3 / 1 1 5 6

_ ₂₇ _ 2346U7

oxycarbonylgruppe bei pH ca. 1 vornimmt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3-7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aralkoxycarbonylgruppe eine Gruppe der Forme.l I verwendet, worin Niederalkyl eine Methyl- oder Aethy!gruppe ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3-7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aralkoxycarbony!gruppe eine Gruppe der Formel I verwendet, worin R, und B^ für Methyl und R-, für Phenyl, Tolyl oder p-Biphenylyl stehen.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aralkoxycarbonylgruppe die 2-Phenylisopropyloxycarbonylgruppe verwendet.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3-7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aralkoxycarbonylgruppe die 2-(p-Biphenylyl)-2-isopropyloxycarbonylgruppe verwendet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4-11, zur Synthese zweikettiger Peptide, dadurch gekennzeich-

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net, dass man in einem TeilstUck, welches die beiden Ketten verbunden enthält, die a-Aminogruppe der einen Kette durch die Tritylgruppe und die α-Atninogruppe der anderen Kette durch eine. Aralkoxycarbonylgruppe der Formel I , in der R,, R₂ und R₃ die angegebene Bedeutung haben, schützt und dass man die Tritylgruppe in Trifluoräthanol abspaltet und die betreffende Kette durch Ankondensation Trityl-geschützter Aminosäuren oder Peptideinheiten und jeweilige Abspaltung der Tritylgruppe in Trifluoräthanol vervollständigt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aralkoxycarbonylgruppe die 2-(p-Biphenylyl)-2-isopropyloxycarbonylgruppe verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass man Teilsequenzen von Insulin synthetisiert.

15. Verfahren zur Herstellung von Peptiden wie in den Beispielen beschrieben.

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