DE2335145A1 - Verfahren zum entfernen von hepatitisantigen aus blutfluessigkeiten - Google Patents

Description

22. Juni 1973

w/K

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Research Corporation New York, New York (V.St.A.)

" Verfahren zum Entfernen von Hepatitis-Antigen aus

Blutflüssigkeiten ⁿ

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entfernen von Hepatitis-Antigen aus Blutflüssigkeiten.

Es ist bekannt, daß ein kleiner vom klinischen Standpunkt her gesehen jedoch statistisch exzessive Anteil von Blut, das für Transfusionszwecke zur Verfügung steht, durch Serum-Hepatitis

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verunreinigt ist. Dieser Anteil steigt steil an im Falle von Blut aus kommerziellen anstatt aus freiwilligen Quellen. Bisher ist der Großteil von Bemühungen zum Isolieren einer Serum-Hepatitis-Verunreinigung dem Patienten gegenüber der das Blut oder Teile davon erhält, auf das Feststellen des Vorhandenseins von Serum-Hepatitis-Antigen darin gerichtet worden. Selbst wenn diese Versuche wesentlich empfindlicher wären, als sie zur Zeit zur Verfügung stehen, würde eine positive Anzeige einer Verunreinigung das Unbrauchbarwerden der getesteten Blutcharge für Transfusionszwecke bewirken. In Anbetracht des extremen Mangels an Blut ist das naturbedingt ein unglücklich vergeudendes Verfahren. Andererseits ist eine negative Anzeige keine Gewähr dafür, daß das Blut vollkommen ohne Verunreinigungen ist. Bei der Verwendung von roten Blutzellen ist es bekannt, diese Zellen zu waschen, um das Serum-Hepatitis-Antigen daraus zu entfernen, und dieses Verfahren hat sich als zufriedenstellend erwiesen, es ist jedoch extrem teuer. Dieses Verfahren kann natürlich nicht für die Reinigung von Plasma verwendet werden, bei dem es sich um eines der Hauptflüssigkeiten handelt, die in Bluttransfusionen verwendet werden. Während natürliches Blut eine sehr begrenzte Lagerfähigkeit selbst unter optimalen Bedingungen hat, hat Plasma eine einigermaßen erhebliche Lagerfähigkeit, und es besteht deshalb ein hoher ^edarf daran, wenn frisches natürliches Blut nicht vorhanden ist.

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Die Kopplung eines Antikörpers mit einem Antigen ist ein bekanntes immunologisches Verfahren, das in seinen vielen Abwandlungen erhebliche Anwendung als eine Basis für diagnostische Tests gefunden hat, bei denen der Kontakt der beiden Partikel, von denen einer an einem Träger angebracht sein kann, zu einer Agglutination in der Testvorrichtung führt. Das Grundproblem bei der Erstreckung dieses Verfahrens zum Entfernen von Partikeln aus beispielsweise Plasma besteht darin, daß Antikörper selbst nicht dem Plasma zugesetzt werden kann, da das zu einer Antikörperverunreinigung im Blut führen würde.

Ein zweites Problem besteht in dem sehr teuren Wesen von Serum-Hepatitis- Antikörper. Es scheint, daß Serum-Hepatitis eine Krankheit ist, die im wesentlichen auf den Menschen beschränkt ist, obgleich es Berichte gibt, daß die Krankheit bei bestimmten Primaten hervorgerufen werden kann, beispielsweise Schimpansen. Jeder Antikörper, der erzeugt wird, muß deshalb von Serum-Hepatitis-Antigen menschlichen Ursprungs herrühren. Von einem-kommerziellen Standpunkt aus gesehen, wäre deshalb eine Einigungsmethode unter Verwendung von Antigen nur dann praktisch durchführbar, wenn die Natur des Verfahrens eine sehr erhebliche Wiederverwendung des Antikörpers ermöglicht, nachdem das Antigen, das von ihm aus der Blutflüssigkeit extrahiert worden ist, entfernt worden ist. Um durchführbar zu sein, muß ein solches Verfahren mit einem Regenerationsverlust von weniger als 1% arbeiten, vorzugsweise in der Größen-

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Ordnung von 0,1% Regenerationsverlust pro Durchgang.

Die Kopplung eines Antikörpers mit einem geeigneten Träger beispielsweise Agarose ist bekannt. Die neueste Arbeit aus diesem Gebiet wird von Cuatrecasas in Bio. Chem. Bio. Phys. Res. Com. 38, 947 (197o) berichtet, wo auch andere Arbeit in diesem Bereich zitiert worden ist. Die Arbeit von Coutrecasas berichtet die Kopplung von Insulin-Antikörpern mit einer Partikelform von Agarose, die als Sepharose 2B bekannt ist, wobei der Komplex verwendet wird, um kleine Mengen von Insulin aus Körperflüssigkeiten zu entfernen und den Sepharose/Antikörperkomplex zu regenerieren, indem das Insulin entfernt wird. Diese Arbeit zeigt jedoch einen Regenerationsverlust-verlust von 1o% pro Durchgang, was weit über einem kommerziell praktikablen Verfahren liegt. Die Entwicklung eines geeigneten Verfahrens zum Spalten des Antigen/Antikörperkomplexes in wirkungsvoller Weise ist deshalb von primärer Bedeutung.

Die Menge an Serum-Hepatitis-Antigenpartikeln, die in den · meisten Blutflüssigkeiten wie Plasma vorhanden sind, ändert sich im großen Umfang, jedoch enthalten solche Flüssigkeiten

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im allgemeinen zwischen 10 und 10 Partikel pro ml. Es sind viele Verfahren zum Feststellen von Serum-Hepatitis bekannt, jedoch sind in Anbetracht der praktischen Probleme, die von dem Vorhandensein von kleinen Mengen von Serum-Hepatitis-Antigenpartikeln hervorgerufen werden, umfangreiche Forschungsbe-

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mühungen darauf gerichtet worden, Spurenmengen von Antigen festzustellen. Bisher ist es möglich gewesen, die Technik der Immuno-Elekto-Osmo-Phorese (IEOP) zu verwenden, um den Em-

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mit einer bekannten I Radioaktivität zugesetzt wurde. Die Inkubation wurde weitere 18 Stunden lang fortgesetzt, und der Immunoniederschlag-Antikörper wurde dann dem Gemisch zugesetzt, und der Niederschlag wurde 24 Stunden später getrennt. Diese Methode ermöglicht die Feststellung von Partikeln bis zum Yfert

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von etwa 10 bis 10 Partikel pro ml. Wie zu sehen ist, macht der Zeitfaktor, nämlich 2 Tage, den Test jedoch einigermaßen fraglich für eine Routineprüfung von Blutproben vor der Verwendung. Ferner wäre eine Erhöhung in der Empfindlichkeit sehr erwünscht.

Ein weiteres Problem, das mit den Techniken des Studiums von Serum-Hepatitis einhergeht, besteht in der Schwierigkeit zum

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Erhalten von reinem Serum-Hepatitis-Antikörper. Die Techniken der Antikörperproduktion sind bekannt, wenn jedoch das Antikörpererzeugungssystem mit proteinhaltigem Material verschiedener immunologischer Charakteristiken infundiert wird, kann es Antikörper erzeugen, die jedem dieser immunologischen Charakteristiken entsprechen. Ein Verfahren zur Isolierung von hochreinem Antigen ist also klar .als ein hochgradig erstrebenswertes Ziel anzusehen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird Serum-Hepatitis-Antikörper (Ziege) mit einer Trägerphase, beispielsweise Papier oder Agarose, geeigneterweise Sepharose 2B, nach der Zyanogen-Bromid-Methode gekoppelt ( siehe Porath u.a., Nature, 215, 1491 (1967). Der damit gebundene Antikörper (nachstehend BHAB) wird dann mit einer Blutflüssigkeit, zweckmäßigerweise Plasma, gemischt und bis zu 3o Stunden umgerührt. Das Plasma wird von dem BHAB/ HAA- Komplex durch Filtration getrennt. Der Komplex wird dadurch dissoziiert, daß ein Waschen mit Sohle bei einem pH-Wert von 9-12, zweckmäßigerweise 1o,5 bis 11,5 erfolgt, und die Sohlewäsche, die das HAA enthält, wird durch Dialyse konzentriert. Das BHAB wird dann erneut gewaschen und für die Entfernung von HAA aus einer weiteren Charge Plasma verwendet. In einer Abwandlung dieses Verfahrens kann das BHAB verwendet werden, um das Vorhandensein von HAA bis zu einem Wert vor 5 x 1o bis 10 Partikel pro ml zu testen. Bei diesem Verfahren

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wird BHAB mit dem Testplasma bei etwa 37° etwa 3 Stunden lang zu Inkubation gebracht, und eine gleiche Probe wird entsprechend in Sole zur Inkubation gebracht, um als Kontrolle zu dienen. "Das BHAB wird vom Testplasma getrennt, zweckmäßigerweise durch Filtration oder Schleudern, und es erfolgt eine Inkubation für die Dauer von 1 Stunde mit 125 I- etikettiertem Hepatitis-Antigen. Das Kontroll BHAB wird natürlich entsprechend behandelt. Die der Test- und der Kontrollprobe von BHAB zugeordnete Radioaktivität wird dann gemessen und das Verhältnis wird gegen ein Diagramm eines entsprechenden Verhältnisses gegen die Zahl von Antigenpartikeln in einer Testprobe verglichen, niedergelegt auf einer Standardkurve, die durch Serienverdünnungsmethoden erzeugt wird. Anstelle von Agaröse kann Filterpapier als ein Träger für das Testverfahren verwendet werden.

Das Verfahren der HAA-Entfernung, wie es vorstehend angegeben worden ist, kann auf die Herstellung von hepatitisfreiem Fibrinogen- erstreckt werden, ein Koagulationsfaktor großer Brauchbarkeit in der Behandlung von Hemophilia und entspechenden Zuständen. Bei diesem Verfahren wird Plasma mit BHAB wie vorstehend behandelt, und es erfolgt eine weitere Behandlung mit Agarose, mit dem Anti-Fibrinogen durch entsprechende Mittel gekoppelt worden ist. Das Fibrinogen wird dann von dem Agarose/ Aniti-Fibrinogenkomplex gespalten und ist zur Verwendung als

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ein hepatitisfreies Produkt verfügbar.

Die Erfindung ist nachstehend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher beschrieben. In den Zeichnungen sind:

Fig. 1 eine grafische Darstellung von IiAA-Partikeln pro ml geeichter Flüssigkeit auf der logarithmischen X-Achse gegen das Verhältnis von Radioaktivität einer BHAB/HAA-etikettierten HAA-Probe zur Radioaktivität einer BHAB etikettierten HAA-Probe, aufgetragen auf eine logarithmische Y-Achse,

Fig. 2 ein Mehrfachdiagramm der Anzahl von HAA-Partikeln die in einer Flüssigkeit verbleiben, die die Partikel enthält, nachdem eine Behandlung durch das Entfernungsverfahren gemäß der Erfindung erfolgt ist, wobei eine Wiedergewinnung durch Standard-Radiospurmethoden, durch die IEOP-Methode und durch Radioimmuno-Erfassungsmethode gemäß der Erfindung vorgesehen ist, aufgetragen auf eine logarithmische Y-Achse gegen die Kontaktzeit des Entfernungsmittels mit der durch HAA verunreinigten Flüssigkeit, aufgetragen auf eine lineare X-Achse,

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Fig. 3 ein Fließschema einer ersten HAA-Entfernungsmethode gemäß der Erfindung,

Fig. 4 ein Flief3schema der HAA-Erfassungsmethode gemäß der Erfindung und

Fig. 5 ein Fließschema einer zweiten HAA-Entfernungsmethode gemäß der Erfindung.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird Serum-Hepatitis-Antikörper (geeigneterweise, jedoch nicht notwendigerweise Ziegen-Antikörper) mit Agarosepartikeln gekoppelt, vorzugsweise Sepharose 2B, und zwar duch eine Abwendlung der Zyanogen-Bromid-Methode. Während sich Agarose als besonders brauchbar als eine Trägerphase (nachstehend BHAB-A) erwiesen hat, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Physikalisch stabile Träger, die Carbohydratgruppen enthalten, können eingesetzt werden. Beispielsweise haben sich Zellulose Materialien, wie Baumwolltuch, als wirksam heraus gestellt, und im übrigen ist bei der "Test"-Abwandlung der Erfindung Filterpapier hoher Qualität als Träger gewählt worden. Bei diesem Verfahren wird Zyanogen-Bromid mit dem Träger umgerührt, zweckmäßigerweise Agarose, und der pH-Wert erhöht sich auf to bis 12, zweckmäßigerweise auf etwa einen pH-Wert von 11, und er wird auf diesen Wert etwa 5 bis etwa 2o Minuten lang gehalten, zweckmäßigerweise etwa 8 bis etwa 1o Minuten lang. Das wässrige oben schwimmende

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Medium wird entfernt, zweckmäßigerweise durch Filtration, und die Suspension wird bei reduzierten Temperaturen gewaschen, zweckmäßigerweise zwischen etwa O⁰C und 1o°C, vorzugsweise bei etwa 4°C bei einem pH-Wert zwischen etwa 7 und etwa 8,5, zweckmäßigerweise etwa 7,8. Dieser Suspension aktivierter Agarose wird Antikörper zugesetzt. Die Menge an verwendetem Antikörper hängt natürlich von dem Titer des verwendeten Antikörpers ab. Es hat sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, etwa 2oo Milligramm proteinenthaltenden Antikörper auf 1o Milliliter beispielsweise Sepharose zu verwenden, wo das Hemagglutination-Titer des Antikörpers 1:128,000 beträgt. Der Kontakt zwischen dem Antikörper und dem aktivierten Träger wird etwa 12 Stunden lang mit sehr behutsamen Umrühren aufrechterhalten, und in dieser Zeit wird mehr als 90% des Antikörpers mit der Sepharose gebunden. Der Antikörper/Trägerkomplex, zweckmäßigerweise Antikörper/Sepharosekomplex (nachstehend BHAB) wird dann gründlich mit einer leicht alkalischen Spülung gewaschen, zweckmäßigerweise 0,1 M Natrium-Bicarbonat bei einem pH-Wert von 8, danach mit einer Azetatpufferlösung bei einem pH-Wert von etwa 4, und schließlich mit einer tris Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4. Zweckmäßigerweise enthält diese letzte Spülung eine Spur, geeigneterweise etwa 0,2% Rind-Serum-Albumin oder 2 M Äthanolamin mit einem pH-Wert von 8,5. Alle Schritte werden im Temperaturbereich von 0 bis 10 C durchgeführt.

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Bei der bevorzugten Abwandlung der Methode, beispielsweise bei der Entfernung von Serum-Hepatitis-Antigen (nachstehend HAA) wird das BHAB, zweckmäßigerweise BHAB-A, in Kontakt mit dem Plasma gebracht, und das Gemisch wird umgerührt. Die Umrührung wird zweckmäßigerweise durch behutsames Schütteln durchgeführt. Der Kontakt zwischen dem BHAB-A und dem Plasma, das das HAA enthält, kann bei irgendeiner temperatur zwischen etwa 0° und 45°C von-statten gehen. Die Temperatur, für die man sich entscheidet, ist das Ergebnis eines Kompromisses zwischen zwei im Widerstreit liegenden Faktoren, Je höher die Temperatur, desto schneller die Reaktion zwischen dem BHAB-A und dem HAA. Andererseits treten mit geringer Wahrscheinlichkeit Nebenreaktionen und eine Verschlechterung des Plasmas bei niedrigeren Temperaturen auf. Allgemein hat es sich am besten erwiesen, in dem Temperaturbereich zwischen 4°C und 10°C zu arbeiten, vorzugsweise um 6⁰C. Bei diesen Temperaturen ist bei der nachstehend beschriebenen Methode festgestellt worden, daß die Anzahl von HAA-Partikeln um etwa 90% alle zwei Stunden in einem im wesentlichen geradlinigen Logarithmus gegen die Zeit verhindert wird. Über eine Zeitdauer von etwa.

24 bis 3o Stunden, unter der Annahme einer durchschnittlichen

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Zahl von etwa 10 Partikeln pro ml sind unter den allgemeinen Zuständen des Verfahrens 99,99999999999% der Partikel von HAA entfernt worden (siehe Fig. 2). Das Verfahren wird durchgeführt wobei etwa 1 ml BHAB-A verwendet wird, wobei das BHAB-A

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2o mg/ml Antikörperprotein hat, das ihm zugeordnet ist, und zwar auf etwa 8 mm Plasma.

Es ist klar, daß diese Projektion nach vorn über die vorhandene Empfindlichkeit der Testmethode von bestimmten Voraussetzungen ausgeht. Nichtsdestoweniger dürften diese Voraussetzungen gültig sein, da der gleiche Weg in der Zerstörung von Clostridium-Botulinunin der Standard-Nahrungsmittel-Verarbeitung beschritten wird, wo angenommen wird, daß das Clostridium-Botulinum auf einen sicheren Wert unter bestimmten Bedingungen der Sterilisation in einer Situation reduziert wird, bei der die zur Verfugung stehende Testmethode derzeit keine ausreichende Empfindlichkeit hat, um diese Forderung zu beweisen (siehe Fundamentals of Food Engineering, 2. Ausgabe, Seite 189, Charm, Avi Pub. Comp. Westport, Connecticut (1971).

Der BHAB/HAA Komplex wird dann von der Blutflüssigkeit, beispielsweise dem Plasma, getrennt, und zwar mit BHAB-A/HAA, entweder durch Schleudern oder durch Filtration. Die eine Methode wie die andere ist vollkommen zufriedenstellend. Besonders bevorzugt wird jedoch ein Arbeiten mit einem Filter aus Polypropylentuch.

Der BHAB/HAA Komplex wird dann dissoziiert. Die Bedingungen der

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Dissoziation haben sich als kritisch erwiesen, wenn das in dieser Weise erzeugte BHAB/A erneut verwendet werden soll. Zwei getrennte Methoden sind jedoch funktionsfähig - alkalisch und azidisch. Bei der ersten Art wird der BHAB/HAA Komplex mit alkalischer Sole gewaschen, die geeigneterweise mit wässrigem Ammoniak alkalisch gemacht wird. Ein pH-Bereich von 9 Ms 12 ist funktionsfähig, jedoch schwillt bei einem pH-Wert von 12 ( mit BHAB-A/HAA) der Sepharoseträger, und während der Antikörper regeneriert und bei diesem pH-Wert wieder verwendet werden kann, ist ein solcher hoher pH-Wert für Zwecke einer vielfachen Wiederverwendung unzweckmäßig. Bei einem pH-Wert von 1o,5 ist die Dissoziationsgeschwindigkeit relativ langsam, während die beste Dissoziatiansgeschwindigkeit, d.h. eine hohe Geschwindigkeit ohne ein Schwellen der Sepharose, bei einem pH-Wert von 11 erreicht wird. Es ist deshalb am zweckmäßigsten, mit einem pH-Wert zwischen 1o,5 und 11 zu arbeiten.

Beim Dissoziationsschritt wird das BHAB verschiedenen Spülungen mit der Sole unterzogen, zweckmäßigerweise werden etwa 4 Spülungen angesetzt, wobei etwa 1o Volumen Sole für jedes Volumen BHAB-A verwendet wird, und dabei beträgt die Kontaktzeit in jedem Fall etwa 15 Minuten bis 1 Stunde.

Die das HAA enthaltene Sole wird durch Filtration getrennt, und das BHAB wird dann gespült, zweckmäßigerweise mit im we-

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sentlichen neutraler Sole, beispielsweise Sole mit einem pH-Wert von etwa 7,2. Die Spülung wird getrennt und. das regenerierte BHAB-A wird zur Behandlung von weiteren Proben wieder verwendet, beispielsweise Plasma entsprechend den vorstehend angegebenen Methoden.

Bei der zweiten Art wird der BHAB-HAA Komplex mit einer wässrigen azidischen Lösung von Glycine gewaschen, zweckmäßigerweise Glycine-Hydrochlorid. Ein pH-Bereich von 2,5 bis 4 ist funktionsfähig, es ist jedoch am zweckmäßigsten, mit einem pH-Wert zwischen 2,8 und 2,0 zu arbeiten. Das kann dadurch erreicht werden, daß wässrige Lösungen von Glycine von 0,05 bis 0,15 M hergestellt werden, zweckmäßigerweise 0,1M, wobei der pH-Wert mit der entsprechenden Säure eingestellt wird. Beim Dissoziationsschritt wird das BHAB-A verschiedenen Waschgängen unterzogen, und zwar mit dem wässringen Glycine-Säuresalz, wobei zweckmäßigerweise etwa 4 Waschgänge angesetzt werden, bei denen mit 1o Volumen Sole für jedes Volumen BHAB gearbeitet wird. Die Kontaktzeit beträgt in jedem Fall etwa 15 Minuten bis 1 Stunde.

Das wässrige Medium, das das HAA enthält, wird durch Filtration getrennt, und das BHAB wird dann gewaschen, zweckmäßigerweise mit im wesentlichen neutraler Sole, beispielsweise Sole mit ■ einem pH-Wert von 7,2. Die Spülung wird getrennt und das rege-

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nerierte BHAB wird für die Behandlung von weiteren Proben verwendet, beispielsweise Plasma entsprechend den vorstehend angegebenen Methoden.

Die vorgenannten Solespülung, di das HAA enthält, wird dann dialysiert, und zwar in Dialyseröhren, die von trockener Sucrose oder PöLyäthylenglycol umschlossen sind, oder es erfolgt vorzugsweise eine Ultrafiltration. Die Konzentration von HAA wird auf das Hundertfache aus der Wäsche erhöht. Die alkalische Sole wird durch die Ultrafiltrationsmembrane entfernt. Der pH-Wert des HAA-Konzentrats beträgt etwa 7*0. Das durch Immuno-Elektrophorese getestete HAA enthält keine Plasmaproteine, mit denen es ursprünglich as-soziiert war. HAA im konzentrieten Zustand

14 15
kann 10 bis 10 Parikel pro ml haben.

12 15 Das dissoziierte, gereinigte HAA mit 10 bis 10 ^ Partikel pro ml wird mit Sepharose gemischt, die Antikörper enthält, und zwar in bezug auf menschliches Plasma, für die Dauer von 3 bis 16 Stunden. Damit werden eventuelle Spuren von menschlichem Plasma entfernt, die dem HAA zugeordnet sind. Die HAA-Lösung wird von der Sepharose entfernt, und Magnesiumchlorid wird der HAA-Lösung auf 0,5% zugesetzt. Damit wird eine Aggregation und eine Klumpenbildung der HAA-Partikel verhindert.

Unter Anwendung der Grundprinzipien gemäi3 der Erfindung kann die Feststellung von HAA-Partikeln bis zu einem Wert von min-

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destens 10 Partikeln pro ml durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren wird BHAB mit Testplasma zur Inkubation gebracht und gleichzeitig wird eine Inkubation einer entsprechenden Probe mit neutraler Sole als eine Kontrolle vorgenommen.

Während Mengen nicht kritisch sind, hates sich als zufriedenstellend erwiesen, mit BHAB-A zu arbeiten, das etwa 2o mg Antikörper enthält ( das -entspricht etwa 1 ml BHAB, das wie vorstehend hergestellt worden ist).

Während der Test mit BHAB-A funktionsfähig ist, hat es sich als zweckmäßiger erwiesen, unter Verwendung eines Antikörper/ Filterpapierkomplexes vorzugehen (BHAB-P). BHAB-P wird in einer V/eise hergestellt, die der ähnlich ist, wie sie für BHAB-A verwendet wird. Beim Kopplungsschritt hat es sich als zweckmäßig erwiesen, Filterpapiere mit etwa 25 bis 5o mm Fläche zu verwenden. Chromatografisches Papier Nr. 3 Whatman (hergestellt durch W. und R. Baiston Ltd., Maidenstone, England) hat sich als besonders geeignet erwiesen. Während das Verhältnis von Papier zu Antikörper nicht kritisch ist, hat es sich als zufriedenstellend erwiesen, 7o mg Antikörper in einer 1o ml Lösung von 0,1 M Natrium-Bicarbonat zur Suspension zu bringen, die etwa 2oo Stück Filterpapier der vorstehenden Abmessungen enthält.

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Die Inkubation wird zweckmäßigerweise zwischen etwa 3o und. 40 durchgeführt, zweckmäßigerweise bei etwa 37°C, und zwar für die Dauer von etwa 1 bis etwa 4 Stunden, vorzugsweise etwa 3 Stunden. Das BHAB wird dann durch Filtration oder Schleudern getrennt und mit neutraler Sole gewaschen, vorzugsweise zwei mal.

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Vor der Untersuchung wird HAA mit I oder einem entsprechenden Radioisotop etikettiert, das mit Proteinen verträglich ist und daran anbringbar ist, und zwar nach bekannten Methoden. Etwa 1o μΐ Antigen (HAA) mit einer Radioaktivitätzählung von etwa 2ooo bis etwa 8ooo, vorzugsweise etwa 5ooo Zählungen pro Minute in 0,5 ml neutraler Sole, werden zur Inkubation mit dem reagierten BHAB-A oder BHAB-P des vorhergehenden Schrittes gebracht. Vorzugsweise wird die Inkubation von etwa 30 bis etwa 40°, zweckmäßigerweise etwa 37°, etwa 3o Minuten lang bis etwa 2 Stunden lang durchgeführt, vorzugsweise etwa 1 Stunde, und zwar unter langsamem Umrühren.

Das BHAB-A oder BHAB-P, das HAA von dem Testplasma und das

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mit I etikettierter HAA darauf trägt, wird dann durch Schleudern oder vorzugsweise durch Filtration getrennt und gewaschen, zweckmäßigerweise drei mal, und zwar mit neutraler Sole, bis keine weitere Radioaktivität in der Spülung beobachtet wird. Die Radioaktivität des Kontrollträgers wird dann nach bekannter Art abgelesen. Diese Zählung wird als B be-

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zeichnet. Das Kontroll BHAB-A (oder BHAB-P), das in dem ersten Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung verwendet wird, wird in entsprechender Weise mit etikettiertem Antigen (HAA) behandelt und gewaschen, und die der Kontrolle zugeordnete Radioaktivität wird gezählt und als B bezeichnet.

Die tatsächliche Zahl von Partikeln von HAA pro Volumeneinheit in dem Testplasma kann bestimmt werden beispielsweise durch eine Methode direkter Rechnung oder durch Bestimmung aus einer Kurve.

Bei beiden Methoden sind die experimenten Vorgänge zur Lieferung der erforderlichen Daten die gleichen.

Die Anzahl von Partikeln von HAA pro Volumeneinheit in einer Ständardprobe (^S"*H) wird nach bekannten Methoden bestimmt, beispielsweise IEOP, die nicht so empfindlich sind wie die erfindungsgemäße Methode. Reinverdünnungen dieser Testprobe werden dann unter Verwendung von Rind-Serum-Albumin in neutraler Sole hergestellt, um eine Reihe von Testproben zu erzeugen, die einen bekannten ^S~H Wert haben, wobei einige dieser verdünnten Standardproben natürlich über die Empfindlichkeit des IEOP-Tests hinausgehen.

Nach den vorstehenden Verfahren wird der ¹¹B"-Wert für jede dieser verdünnten Normalproben bestimmt und als ^SB Einheiten

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-¹-⁹" 2335H5

Radioaktivität bezeichnet. Der Wert von B_Q ist natürlich der gleiche für jede Probe, die aus einer bestimmten Charge BHAB entnommen ist.

Die Radioaktivität des Verhältnisses des mit der Testprobe zur Reaktion gebrachten und mit HAA etikettierten BHAB und das mit der Kontrollprobe zur Reaktion gebrachten und mit HAA etikettierten, nämlich B/B_Q und ^SB/B_Q, wird für die unbekannte bzw. für die verdünnte Normalprobe errechnet. Im letzteren Fall ist die Anzahl von HAA-Partikeln ^S~H, die ^SB/B_Q entsprechen, bekannt. Deshalb kann die Gleichaung aufgestellt werden, daß

^{J S}B/B₀ = k ^S~H
wo k eine Konstante ist. Entsprechend gilt

B/B_o = k H
in der k wie vorstehend ist. Deshalb gilt

^SB B

.³H = B₀. H

und damit

H = B₀ ^S5 . B = B ^SH B B_Q ~

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"²⁰ " 2335H5

Damit kann H direkt für irgendeinen bestimmten Wert von B errechnet werden.

Anstelle der Errechnung des genauen Wertes von^sB und ^SH, was in Anbetracht von experimentellen Änderungen unerwünscht ist, läßt sich jedoch das gleiche Ergebnis erreichen, indem ^SB/B_Q gegen ^SH aufgetragen wird, vorzugsweise mit ^SB/B_Q auf eine logarithmische Skala (Fig. 1), wobei der gesuchte Wert von R abgelesen wird, der der gefundenen Ablesung B/B_Q entspricht.

Beispiell Herstellung von BHAB-A

5 ml dekantierte Sepharose 2B wurden mit 3oo mg CNBr pro ml Sepharose 2B gemischt. Der pH-Wert wird auf 11 mit 4N NaOH erhöht und auf diesem Wert durch Titration für die Dauer von 8 bis 1o Minuten gehalten. Die Suspension wird mit 0,1M NaHCO, (bei 4⁰C) mit einem pH-Wert von 7,8 gewaschen und behutsam bei 4⁰C mit 15o mg SerunhrHepatitis-Antikörper (Ziege) Firma Elektonuclenoics, Inc., Bethesda, Maryland) in ml Gemisch gerührt (Hemagglutination titer 1: 128,ooo). Bezogen' auf die Absorptionsfähigkeit (28o mp) in der Spülung werden etwa 77% des Antikörpers an die Sepharose gebunden. Das damit entstandene BHAB-A wird zweimal mit 1o mal Phosphat-Puffersole 0,o5 m mit einem pH-Wert von 7,2 gewaschen, dann entweder mit 1o ml 0,2% Rind-Serum-Albumin in 0,1 M tris Pufferlöseung mit einem pH-Wert von

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" ²¹ " 2335H5

7,4 oder mit 5 ml 2 M iVähanolamin füi- die Dauer von 2 Stunden gemischt, dsnn zweimal mit 10 mal Volumen 0_s1M Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4 und st-reiisal mit Io mal Volumen von Ö, IK NaHCQ,, gewaschen.

Plasma- Extrakt!on/Puriiikation

■ IP—^1 — ■■■ ■ — III ■—Il ■ Uli ■ Pl Hill Uli I W III »Ill B Hllllll H I I Il

Mit Sepharose 2B (BHAB-A) gebundener Antikörper, 1 ml, (dekantiertes Volumen mit 2o ing Porte!»?.} wird mit Plasma (etwa 8 ml) mit einem Gehalt- an HAA gemischt, erhalten, vom Roten Kr$uz von Massachusetts), und zwar bei 8 bis 9°C für die Dauer von 26 Stunden. Das Mischen wird unter behutsamen Umrühren oder Schütteln durchgeführt. .Plasma wird von dem BHAB-A/HAA Komplex durch Filtration durch Wahtman Nr.1 Filterpapier getrennt. Kleine Proben werden zu verschiedenen Zeiten entnommen und auf HAA getestet.

Nach dem vorstehenden Verfahren kann anstelle der Filtration durch Filterpapier Sararsfiltertuch verwendet werden (Feon No· Q¥A-M0D~6, - MK-7 Filtration Fabrics Div., Ametek» East Moline Illinois 61244). Diese Art ist besondere für größere Mengen an Plasma bevorzugt»

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Fig. 1 zeigt eine graa^pische Darstellung des Verhältnisses von HAA-Partikeln in mit BHAB-A behandeltem Plasma, das HAA enthält, bezogen auf die Anzalil von Partikeln in der ursprünglichen Plasmaprobe, v/ob ei die derzeitigen Grenzen der Erfaßbarkeit im Standard-Radio-Detektor, bei der IEOP-Technik und bei der modifizierten RadiD-lEisuno-Uritersachungsteclinik gemäß der Erfindung anger, eigt sind.

B e i s ρ i e 1 III

Regeneration von BHAB

Der BHAB-A/HÄA !Complex wird dissoziiert, indem ein Spülen mit ammoniakhaltiger Sole (h ;&&! Io ml) bei einem pH-Wert von 11 pro ml. des Komplexes erfolgt, und zwar bei 25⁰C für insgesamt 12o Minuten. Das BHAB-A wird mit Sole mit einem ph-Wert von 7,2 gewaschen, schließlich mit Destillwasser. Nach einer ab schließenden Vakuumfiltration zum Entfernen von Wasser ist das BHAB-A erneut gebrauchsfertig. Alle Spülungen für BHAB werden sterilisiert, ehe sie verwendet werden, um das Entwickeln von Mikroorganismen zu verhindern.

Der Regenerationswirkungsgrad dieses Systems wurde dadurch gemessen, daß eine Reaktion von etwa 8 ml HAA enthaltenden Plaspa mit einer Charge von BHAB-A herbeigeführt wurde, die ursprünglich 2o,17 mg Protein enthaltendem Serum-Hepatitis-Antikörper

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enthielt, und zwar bei 37°. Das regenerierte Material wurde mit einer frischen Probe Plasma aus der gleichen Charge in Kontakt gebracht, und es wurde die Zeit festgestellt, die für eine negative HAA-Ablesung erforderlich war, und zwar unter Verwendung der IEOP-Technik. Diese Ergebnisse zeigen eine Zunahme ii/der Zeit zwischen der zweiten und der dritten Regeneration an, wahrscheinlich aufgrund von mechanischen Verlusten, jedoch keine weitere Zunahme in der Zeit zwischen der dritten und der zwanzigsten Regeneration, was anzeigt, daß nach einem Einlaufen bei den ersten Läufen das BHAB-System unter den Betriebsbedingungen gemäß der Erfindung stabil ist (siehe Tabelle 1).

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Test No,

	2335U5
Tabellel
Anzahl der	Zeit für negatives
Regenerxerungen	IEOP (Stunden)
O	3.0
1	3.0
2	3.0
3	3.5
4	3.5
VJl	3.5
6	3.5
7	3.5
8	3.5
9	3.5 '
ΊΟ	3.5
0	3.0
1	3.0
2	3.0
3	3.5
4	3.5
5	3.5
6	3.5
7	3.5
8	3.5
9	3.5
1o	3.5
11	3.5
12	3.5
13	3.5
14	3.5
15	3.5
16	3.5

309884/1471 " ^2b ~

2335H5

Test No, Anzahl der Zeit für negatives

Regenerierungen IEOP (Stunden)

5B 17 3.5

18 3.5

19 3.5

20 3.5

B e i s ρ i e 1 IV Regeneration von BHAB mit Säure

Der BHAB-A/HAA Komplex wird dissoziiert, indem ein Waschen mit wässrigem Glycine-Hydrochlorid ( 4 mal 1o ml) mit einem pH-Wert von 2,8 pro ml des Komplexes bei 25°C insgesamt 3o bis 12o Minuten lang erfolgt. Das BHAB-A wird mit Sole mit einem pH-Wert von 7t2 gewaschen, abschließend mit destilliertem Wasser. Nach einer abschließenden Vakuurafiltration zum Entfernen von Wasser ist'das BHAB-A wieder gebrauchsfertig. Alle Spülungen für BHAB werden sterilisiert, eher ein Gebrauch erfolgt, um das Entwickeln von Mikroorganismen zu verhindern.

Der Regenerationswirkungsgrad dieses Systems wurde dadurch gemessen, daß etwa 8 ml HAA enthaltenem Plasma mit einer Charge von BHAB-A zur Reaktion gebraucht wurden, die ursprünglich 2o, 17 mg Serum-Hepatitis-Antikörper enthielt, und zwar bei 37°. Das regenerierte Material wurde mit einer frischen Probe

30988A/U71 -26-

2335U5

Plasma aus der gleichen Charge in Kontakt gebracht, und es wurde die Zeit festgestellt, die für eine negative HAA-Ablesung erforderlich war, und zwar unter Verwendung der IEOP-Technik. Diese Ergebnisse zeigen eine Zunahme in der Zeit zwischen der ersten und der zweiten Regeneration an, wahrscheinlich als Folge von mechanischen Verlusten, jedoch keine weitere Zunahmeii der Zeit zwischen der zweiten und vierten Regeneration, was anzeigt, daß nach einem Einlaufen bei den ersten Läufen das BHAB-System unter den Betriebsbedingungen gemäß der Erfindung stabil ist, (siehe Tabelle 2).

T a b e 1 1 e II

Dissoziationen von BHAB-A/HAA Komplex mit Glycine-HCl, pH 2,8 und Wiederverwendung von BHAB-A,

Versuch Zeit für negatives Er

gebnis durch IEOP (Stunden)

0 3.0

1 3.0

2 3.5

3 3.5

4 3.5

- 27 -

309884/U71

-^2?- 2335U5

Beispiel' V Testverfahren

a) Normalkurve

Um den Wert von HAA-Verunreinigung in einer Plasmaprobe zu bestimmen, muß das bei dem Test verwendete BHAB-P geeicht werden. Eine Plasmaprobe, die HAA-Partikel enthält (^SH -Partikel pro Volumeneinheit) gemessen nach bekannten Techniken (d.h. Radiodetektor oder IEOP), wird hergestellt und einer Reihenverdünnung mit Sole (pH 7) unterzogen, enthaltend Rind-Serum-Albumin (0,2% in bezug auf Sole). ^SB/B_Q wird dann durch die vorstehend angegebenen Radio-Immuno-Untersuchungsmethoden bestimmt, und zwar für eine bestimmte Charge von BHAB-P, und ^SB/B wird gegen ^SH aufgetragen.

b) Herstellung von BHAB für die modifizierte Radio-Immunountersuchung auf HAA

Etwa 1oo Stücke chromatografisches Papier Whatman Nr. 3 ( 6 mm mal 6 mm) werden mit 0,6 g CNBr gemischt, während der pH-Wert auf 11,ο durch manuelle Titration von 4N NaOH eingestellt wird. Dieser Wert wird 8 bis 1o Minuten lang aufrechterhalten. Das Papier wird mit 0,1M NaHCO^ ( 4°C, pH 7,8) gewaschen und mit

- 28 30988WU71

" ²⁸ " 2335U5

7o mg Serum-Hepatitis-Antikörper gemischt (Ziege, ENI Maryland) in Suspension in 1 ο ml gemischt. Das Gemisch wird sehr behutsam bei 4°C über Nacht gerührt. Das damit gebildete BHAB-P wird zweimal mit 1o mal Phosphatpuffer-Sole 0,05M, pH 7,2 gewaschen, dann entweder mot 1o ml 0,2% Rind-Serum-Albumin in 0,1M tris Pufferlösung, pH-Wert 7,4 oder 5 ml 2M Äthanolamin für die Dauer von 2 Stunden gemischt, dann zweimal mit 1o mal Volumen 0,1M Acetat-Pufferlösung mit einem pH-Yfert von 4 und zweimal mit 1o mal Volumen von 0,1M NaHCCU gewaschen.

c) Arbeitsverfahren

1. Jedem Stück BHAB-P wird 1/2 ml Testplasma zugeführt; dann erfolgt eine Inkubation bei 37°C für die Dauer von 3 Stunden. Gleichzeitig wird ein anderes Stück BHAB-P mit 1/2 ml Sole als Kontrolle gemischt. Die Inkubation für beide geht für die Dauer von 3 Stunden weiter.

2. Die BHAB-Teile werden von dem Plasma bzw. von der Sole durch Filtration getrennt, und es erfolgt jeweils eine Spülung zweimal mit Sole (5 ml, 25⁰C).

125

3. 10 ul einer zuvor hergestellten Charge von I-Hepatitis-

Antigen ( 5ooo Zählungen pro Minute ) werden zur Inkubation mit jedem Teil BHAB aus Schritt 2 eine Stunde lang unter

- 29 309884/ 1471

" ²⁹ - 2335U5

langsamem Umrühren gebracht.

4. Die BHAB-P-Papiere werden jeweils getrennt und mit Sole 3 mal gewaschen ( 5ml jedes mal, 25°C )

5. Die Radioaktivität wird gezählt, die jedem BHAB-P-Stück zugeordnet ist, das mit der Testprobe zur Inkubation gebracht wurde. Diese Zählung wird als B bezeichnet.

6. Entsprechend wird die Radioaktivität gezählt, die dem Antikörper zugeordnet ist, der in der Kontrollprobe in Inkubation gebracht worden ist, und diese Zählung wird als B bezeichnet»

Der Wert von B/B_o wird errechnet, und dessen Entsprechung zur Zahl von Partikel von HAA pro Einheitswert (H) wird von der Eichkurve abgelesen, die im Abschnitt (a) dieses Beispiels hergestellt worden ist.

- 3o 30Ö884/U71

Claims (1)

1. - ^3o - 2335H5

   Patentansprüche

   (Tl Verfahren zur Entfernung von Serum Hepatitis-Antigen aus Blutflüssigkeiten, dadurch. gekennzeichnet, daß Serum Hepatitis-Antikörper mit einer Trägerphase gekoppelt v/ird, die aus Carbohydrat-Gruppen besteht, und daß der in dieser V/eise gebildete Antikörper/Trägerphasenkomplex "mit der su behandelnden Flüssigkeit, umgerührt wird.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß als Trägerphase Agarose oder ein Zellulosematerial gewählt wird.

   3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die Trägerphase mit Zyanogen-Bromid aktiviert.

   4· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß nacheinander die Trägerphase mit Zyanogen-Bromid behandelt wird, der pH-Wert des Gemisches auf einen pH-Yifert zwischen 10 und 12 erhöht wird, die überstehende Flüssigkeit entfernt v/ird, die Trägerphase bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8 gewaschen wird, den Gemisch Serum-Hepatitis-Antikörper zugesetzt wird, das Ge-

   - 31 309884/ 1 471

   - ³¹ - 2335H5

   misch von nicht in Reaktion getretenem Antikörper freigewaschen wird, der Trägerphasen-Antikörper-(BHAB-)Komplex auf einen pH-Wert von 7 bis 8 gepuffert wird und der in dieser Weise entstandene BHAB-Komplex mit Flüssigkeit umgerührt wird, die Serum-Hepatitis-Antigen (HAA) enthält.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennz e χ c hne t , daß der BHAB-Komplex mit der Flüssigkeit bei einer Temperatur zwischen 4° C und 45° C umgerührt wird.

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß zusätzlich der darin entstandene BHAB/HAA-Komplex von der Flüssigkeit getrennt wird.

   7· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß es sich bei der Flüssigkeit um Plasma handelt.

   8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß es sich bei der Trägerphase um Agarose handelt.

   9· Verfahren zum Entfernen von HAA aus einer Anzahl ύοπ Plasma-Chargen, die dasselbe enthält, wobei eine einzige Charge BIIAB für die Vielzahl von Extraktionen verwendet

   309884/1471

   " ³² " 2335H5.

   wird, dadurch gekennzeichnet, daß nacheinander Serum-Hepatitis-Antikörper mit der Trägerphase zum Liefern von BHAB gekoppelt wird, daß das BHAB mit einer ersten Charge von HAA enthaltendem Plasma umgerührt wird, daß der BHAB/HAA-Komplex aus dem Plasma entfernt wird, daß das HAA von dem BHAB/HAA-Komplex dadurch getrennt wird, daß' der BHAB/HAA-Komplex mit einer wässrigen Lösung behandelt wird, die einen pH-Wert zwischen 10,5 und 11,5 hat, wobei das dabei entstandene BHAB von der alkalischen Lösung getrennt wird, daß das regenerierte BHAB mit einer neutralen Lösung (pH 7,0 Sole) und anschließend mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 7 und 8 gewaschen wird, wobei das in dieser Weise regenerierte BHAB mit einer zweiten Plasma-Charge verwendet wird, das HAA enthält und mit dem es umgerührt wird, und daß die vorstehenden Schritte nach Erfordernis wiederholt werden .

   10. Verfahren nach Anspruch 9 zum Entfernen von HAA aus einer Vielzahl von Plasma-Chargen, die dasselbe enthalten, wobei als Trägerphase eine einzige Charge BHAB-A für die Vielzahl von Extraktionen verwendet wird, dadurch gekennzeichnet , daß nacheinander Serum-Hepatitis-Antikörper mit Agarose zur Lieferung von BHAB-A gekoppelt wird, daß das BHAB-A mit einer ersten Charge Plasma umgerührt wird, das HAA enthält, daß der BHAB-A/HAA-Komplex aus dem Plasma entfernt wird, daß das HAiI von dem

   309884/U71 -?->-

   BHAB-A/HAÄ-Komplex dadurch getrennt wird, daß der BHAB-A/ - HAA-Koiuplex mit einer wässrigen Lösung behandelt wird, die einen pH-Wert zwischen 10,5 und 11,5 hat, wobei das dabei entstandene BHAB-A von. der alkalischen. Lösung getrennt wird, daß das regenerierte BHAB mit einer neutralen Lösung (pH 7,0 3ole) und anschließend mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 7 und 8 gewaschen wird, daß das dabei entstandene regenerierte BHAB-A mit einer zweiten Charge Plasma dazu verwendet wird, das BHAB-A mit der Plasma-Charge umzurühren, die HAA enthält, und daß die vorstehenden Schritte nach Erfordernis wiederholt werden.

   11. Verfahren zum Entfernen, von HAA aus einer Vielzahl von Plasma-Chargen, die dasselbe enthalten, wobei eine einzige Charge BHiIB für die Vielzahl von Extraktionen verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß nacheinander Serum-Hepatitis-Antikörper mit Agarose zur .Lieferung von BHAB gekoppelt wird, daß das BHAB mit einer ersten Charge Plasma umgerührt wird, die HAA enthält, daß der BHÄB/HAA-Komplex aus dem Plasma entfernt wird, daß das HAA von dem BHAB/HAA-Komplex dadurch getrennt wird, daß der BHAB/HAA-Komplex mit einer wässrigen Lösung aus Glycine-Säuresals behandelt wird, die einen pH-Wert zwischen 2,5 und A hat j wobei das dabei entstandene BHAB von., der alkalischen Lösung getrennt wird, daß das regenerierte BHAB mit einer neutralen Lösung (pH 7»0 Sole) und anschließend

   309884/1471 " ^3k "

   - ³⁴ - 2335H5

   mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 7 und 8 gewaschen wird, wobei das dabei entstandene regenerierte BHAB mit einer zweiten Charge Plasma verwendet wird, die HAA enthält und mit der das regenerierte BHAB umgerührt wird, und daß die vorhergehenden Schritte nach Erfordernis wiederholt werden.

   2. Verfahren nach Anspruch Ii zum Entfernen von HAA aus einer Vielzahl von Plasma-Chargen, die dasselbe enthalten, wobei als Trägerphase eine einzige Charge BHAB-A für die Vielzahl von Exktraktionen verwendet wird, dadurch gekennzeichnet , daß nacheinander Serum-Hepatitis-Antikörper mit Agarose zum Liefern von BHAB-A gekoppelt wird, dai3 das BHAB-A mit einer ersten Charge Plasma umgerührt wird, die HAA enthält, daß der BHAB-A/ HAA-Komplex aus dem Plasma entfernt wird, daß das HAA von dem BHAB-A/HAA-Komplex dadurch getrennt wird, daß der BHAB-A/HAA-Komplex mi-, einer wässrigen Lösung Glycine-Hydrochlqrid behandelt wird, die einen pH-Wert zwischen 2,4 und 4 hat, wobei das dabei entstandene BHAB-A von der alkalischen Lösung getrennt wird, daß das regenerierte BHAB mit einer neutralen Lösung (pH 7,0 Sole) und anschließend mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 7 und 8 gewaschen wird, wobei das in dieser Weise entstandene regenerierte BHAB-A mit einer zweiten Charge Plasma verwendet

   - 35 -309884/U71

   wird, die HAA enthält und mit der es umgerührt wird, und daß die vorstehenden Schritte nach Erfordernis wiederholt' werden.

   13. Verfahren zur Herstellung von reinem HAA, dadurch gekennzeichnet , daß der nach Anspruch 6 hergestellte BHAB/HAA-Komplex mit einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert zwischen 10 und 12 zur Reaktion gebracht wird und daß HAA von der wässrigen Lösung getrennt wird.

   14· Verfahren nach Anspruch I3, dadurch gekennzeichnet , daß das HAA von. der wässrigen Lösung durch Ultrafiltration, getrennt wird.

   15· Verfahren nach Anspruch I3, dadurch gekennzeichnet , daß der BHAB/HAA-Komplex mit ammoniak- - haltiger Sole bei einem pH-Wert von 10,5 "bis 11,5 behandelt wird.

   16. Verfahren zur Herstellung von reinem HAA, dadurch gekennzeichnet , daß der nach Anspruch 6 hergestellte BHAB/HAA-Komplex mit einer wässrigen Lösung von Glycine-Säuresalz mit einem pH-Wert zwischen 2,5 und 4 zur Reaktion gebracht und daß HAA aus der wässrigen Lösung getrennt wird.

   -36-309884/147 1

   - ³⁶ - 2335H5

   17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß das HAA von der wässrigen Lösung durch Ultrafiltration getrennt wird.

   18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß der BHAB/HAA-Komplex mit wässrigem Grlycine-Hydrochlorid mit einem pH-Wert zwischen 2,5 und 4 behandelt wird·

   19. Verfahren zum Bestimmen des HAA-Gehaltes einer Flüssigkeit, die eine nicht bekannte Menge HAA-Partikel pro Einheitswert mit der Bezeichnung H enthält, dadurch gekennzeichnet , daß Serum-Hepatitis-Antikörper mit einer Trägerphase gekoppelt wird, bestehend aus Carbohydrat-Gruppen, welche mit BHAB "bezeichnet sind, daß für eine Inkubation eines bestimmten Teils des in dieser Weise entstandenen Trägerphasen/Antikörper-Komplexes in der HAA-enthaltenden Flüssigkeit gesorgt wird, daß der in dieser Weise erzeugte Trägerphasen/Antikörper/HAA-Komplex gewaschen wird, der als BHAB/HAAbezeichnet wird, daß für eine Inkubation des BHAB/HAA mit radioaktivem HAA gesorgt wird, daß der in dieser Weise erzeugte BHAB/HAA/radioaktiv-HAA-Komplex gewaschen, wird, daß die Radioaktivität des BHAB/HAA/radioaktiv-HAA-Komplexes gemessen wird, derart, daß man einen Wert erhält, der die Bezeichnung B-Einheiten Radioaktivität hat, daß für eine Inkubation, eines be-

   309884/U71 - 37 -

   stimmten Teils der Trägerphase aus Schritt (I) mit der Bezeichnung BHAB unte'r Verwendung der gleichen. Menge wie im Schritt (II) unter den gleichen, physikalischen Bedingungen der Inkubation, unter Verwendung von neutraler Sole als das Inkubatiionmedium gesorgt wird, wobei das dabei entstehende Produkt gewaschen wird und für eine Inkubation dieses. Produktes mit radioaktivem HiLA gesorgt wird, daß aus der im vierten Schritt verwendeten Probe für die gleiche Zeit unter den gleichen Bedingungen der Temperatur, des Drucks und dess pH-Viertes gewählt wird, wobei das dabei entstehende Produkt gewaschen wird und die Radioaktivität dieses Produktes gemessen, wird, derart, daß man einen Wert erhält, der mit B -Einheiten Radioaktivität bezeichnet wird, und daß die vorstehenden. Schritte mit Ausnahme der Kopplung des Serum-Hepatitis-An.tikörpers mit einer Trägerphase unter Verwendung einer Flüssigkeit wiederholt werden, die eine bestimmte Menge HAA-Partikel pro Einheitswert enthalten, bezeichnet -als ³H, um einen. Wert zu erhalten, der als ^-Einheiten-Radioaktivität bezeichnet wird.

   20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet , daß H entsprechend der Formel

   H = ⁸H . B

   MM

   bestimmt wird.

   309884/1471 " ³⁸ "

   2335U5

   21. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet , daß der letzte Schritt dieses Verfahrens unter Verwendung einer Vielzahl von Lösungen wiederholt wird, die bestimmte Mengen an HAA-Partikeln pro Einheitswert enthalten, derart, daß man dadurch eine Folge von Werten, für die Menge "B erhält, welche den "bestimmten Werten, von. ⁸H entsprechen.

   22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , de.;3 zusätzlich ein Ourchschnit tswert für S/ B errechnet wird und daß der V/ert von H entsprechend der Formel

   H = ^S3 . 3
   ⁸

   bestimmt wird.

   309884/U71