DE2326944C2 - Process for the cultivation of plants from undifferentiated plant tissue - Google Patents
Process for the cultivation of plants from undifferentiated plant tissueInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zrchtung von Pflanzen aus undifferenziertem Pflanzengewebe in flüssiger Suspension in einem Nährmedium, welches Nährstoffe enthält, unter Einwirkung von Licht, wobei das undifferenzierte Pflanzengewebe nacheinander in verschiedenen Medien mit verschiedenen Nährstoffgehalten überführt wird und durch anschließende Anregung zur Differenzierung ganze Pflanzen gewonnen werden.The invention relates to a method for growing plants from undifferentiated plant tissue in liquid suspension in a nutrient medium which contains nutrients, under the action of light, wherein the undifferentiated plant tissue one after the other in different media with different nutrient contents is transferred and whole plants are obtained by subsequent stimulation for differentiation will.
Hierbei wird Pflanzengewebe durch Kultivierung eines Gewebekallus in einem Nährmedium, das einen Zucker und Nährstoffe enthält, gezüchtet. Unter geregelten Bedingungen wächst das Gewebe durch Zellteilung, wobei weiteres Gewebe gebildet wird, ohne daß Differenzierung des Gewebes stattfindet.Here, plant tissue is cultivated by cultivating a tissue callus in a nutrient medium that contains a Contains sugar and nutrients, bred. The tissue grows through under regulated conditions Cell division, whereby additional tissue is formed without differentiation of the tissue taking place.
Die Züchtung des Pflanzengewebes in vitro in flüssigen Schüttelkulturen oder auf Agar-Nährmedien ist eine Mehtode, die für die Züchtung zahlreicher Pflanzenarten angewandt wird. Ein solches Verfahren der eingangs umrissenen Gattung wird in American Journal of Botany, Jahrgang 50, 1963, S. 248—254, in einer Arbeit von A. C. Hildebrandt, J. C. Wilmar, H. Johns und A. J. Riker beschrieben. Im Prinzip besteht das Verfahren darin, daß man einen Kallus von einem Teil einer aseptischen Pflanze entnimmt, ihn auf ein Nährmedium überführt und das Gewebe dem Licht aussetzt. Das Gewebe wächst auf dem Nährmedium. Das Verfahren kann auch angewandt werden, um Pflanzenzellen in Suspension in einem flüssigen Nährmedium zu züchten.The cultivation of the plant tissue in vitro in liquid shake cultures or on agar culture media is a method used for the breeding of numerous types of plants. Such a procedure of the genus outlined at the beginning is described in American Journal of Botany, Volume 50, 1963, pp. 248-254, in a work by A. C. Hildebrandt, J. C. Wilmar, H. Johns and A. J. Riker. In principle there is the method of removing a callus from part of an aseptic plant on it Transferring nutrient medium and exposing the tissue to light. The tissue grows on the nutrient medium. The method can also be applied to plant cells in suspension in a liquid Grow nutrient medium.
Aus dem Artikel »Die Naturwissenschaften« 58, S. 318—320, (1971), ist ein Verfahren bekannt, bei welchem ebenso wie beim Anmeldungsgegenstand ganze Pflanzen aus undifferenziertem Pflanzengewebe erzeugt wurden. Bei diesem Verfahren wurde ebenfalls ein Teil des Pflanzengewebes entfernt und auf ein zweites Nährmedium überführt, in welchem der Zuckergehalt geändert wurde. Bei diesem Verfahren wird jedoch stets von einem älteren Kallusgewebe ausgegangen, welches bereits Wachstumspausen durchlaufen hat. Die am Ende erhaltenen ganzen Pflanzen sind meist in erheblichem Maße mißgebildet und nur selten völlig gesund. Auch bei diesem Verfahren wird das Pflanzengewebe nacheinander in verschiedene Medien mit verschiedenen Nährstoffgehalten überführt, wobei jedoch im Gegensatz zum Anmeldungsgegenstand der Zuckergehalt erhöht wird, um das Wachstum des noch undifferenzierten Gewebes zu beschleunigen.A method is known from the article "Die Naturwissenschaften" 58, pp. 318-320, (1971) which, as with the subject of the application, whole plants from undifferentiated plant tissue were generated. In this procedure, part of the plant tissue was also removed and placed on a transferred to a second nutrient medium in which the sugar content was changed. In this procedure however, it is always assumed that the callus tissue is older and has already passed through pauses in growth Has. The whole plants obtained at the end are mostly and only considerably malformed rarely completely healthy. In this process, too, the plant tissue is sequentially divided into different Media with different nutrient contents transferred, but in contrast to the subject of the application the sugar content is increased in order to accelerate the growth of the still undifferentiated tissue.
Auch aus der Arbeit von G. Melchers, Genetical Aspects in Callus Culture-Work, Proc. Internat. Symp. Plant Growth-Substances, Calcutta 1968, and Abstract Internat. Sympos.of Plant Pathology, 27. 12. 66-1. 1.67, New Delhi, 1970, geht hervor, daß es praktisch unmöglich war, aus Kallus-Kulturen zuverlässig und gleichmäßig durch Differenzierung vollständige Pflanzen zu erhalten.Also from the work of G. Melchers, Genetical Aspects in Callus Culture-Work, Proc. Boarding school Symp. Plant Growth-Substances, Calcutta 1968, and Abstract Internat. Sympos. Of Plant Pathology, December 27, 66-1. 1.67, New Delhi, 1970, it emerges that it was reliable and practically impossible to obtain from callus cultures uniformly obtain complete plants by differentiation.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das eingangs umrissene Verfahren so weiter zu entwickeln, daß reproduzierbar gesunde Pflanzen entstehen, die sich problemlos weiterzüchten lassen. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man das undifferenzierte Pflanzengewebe von kontinuierlich in flüssiger Suspension wachsendem Gewebe abnimmt, das abgenommene Gewebe in ein zweites Medium überführt, in welchem in an sich bekannter Weise die Differenzierung ausgelöst wird, dann das differenzierte Gewebe aus dem zweiten Medium entnimmt und in ein drittes, praktisch zuckerfreies Medium überführt, auf dem die Züchtung von Pflanzen aus dem differenzierten Gewebe beginnt und schließlich d;e wachsende Pflanze auf ein Substrat überführt, wo die Züchtung fortgesetzt wird.The invention is based on the object of further developing the method outlined at the beginning so that that reproducibly healthy plants emerge which can be further cultivated without any problems. This task will solved by removing the undifferentiated plant tissue from continuously in liquid suspension growing tissue decreases, the removed tissue is transferred to a second medium, in which in the differentiation is triggered in a manner known per se, then the differentiated tissue from the second Medium is removed and transferred to a third, practically sugar-free medium, on which the cultivation begins by plants from the differentiated tissue and finally the plant growing onto a substrate transferred, where the breeding is continued.
Das erste erfindungswesentliche Kriterium ist die Verwendung von kontinuierlich in flüssiger Suspension wachsendem Gewebe. Nach dem Stand der Technik wurde meist von mehr oder weniger älteren Kalluskulturen ausgegangen, die Wachstumspausen durchlaufen hatten. Es wurde jetzt festgestettt, daß unerwünschte Differenzierung oder Abnormalitäten oder Schädigungen durch Infektionen, insbesondere durch Planzenviren, nur dann ausgeschlossen werden können, wenn das verwendete Pflanzengewebe sich stets im Stadium schneller Zellteilung befindet.The first essential criterion for the invention is the use of tissue that is continuously growing in liquid suspension. According to the prior art, more or less older callus cultures that had undergone growth pauses were mostly assumed. It has now been established that undesired differentiation or abnormalities or damage caused by infections, in particular by plant viruses, can only be excluded if the plant tissue used is always in the stage of rapid cell division.
Der zweite erfindungsgemäße Schritt besteht darin, das abgenommene Gewebe in ein zweites Medium zu überführen, in welchem in an sich bekannter Weise die Differenzierung ausgelöst wird. Die bekannteste Methode zur Differenzierung ist der Zusatz von Pflanzenhormon, insbesondere Auxin und/oder ein Cytokinin.The second step according to the invention consists in transferring the removed tissue to a second medium transfer, in which the differentiation is triggered in a manner known per se. The best known method for differentiation is the addition of plant hormones, in particular auxin and / or a cytokinin.
Ein weiterer erfindungswesentlicher Schritt ist die anschließende Überführung in ein drittes, praktisch zuckerfreies Medium, auf dem die Züchtung von Pflanzen aus dem differenzierten Gewebe beginnt. Schließlich werden die wachsenden Pflanzen auf ein Substrat überführt, wo die Züchtung fortgesetzt wird.Another step that is essential to the invention is the subsequent transfer to a third, practical step sugar-free medium on which the growth of plants from the differentiated tissue begins. Finally, the growing plants are transferred to a substrate where cultivation is continued.
Im Rahmen dieser Beschreibung ist unter Pflanzengewebe das Gewebe von Spermatophyta, d. h. Samenpflanzen, zu verstehen.For the purposes of this description is under plant tissue the tissue of spermatophyta, d. H. Seed plants, understand.
Unter »Neoembryos« sind nicht aus einem Samen gebildete Pflänzchen in einem rudimentären Entwicklungszustand zu verstehen.Under "neoembryos" are small plants not formed from a seed in a rudimentary state of development to understand.
Das in flüssiger Suspension wachsende Gewebe kann hergestellt werden, indem man ein Stück des apikalen Meristems (Teilungs- und Bildungsgewebe) oder des Epikotyls eines Pflänzchens nimmt und es auf Agar, das Zucker und ein Nährmedium enthält, überführt. Das hier gezüchtete Gewebe kann dann unter Bildung einer Suspension in die Flüssigkeit überführt werden.The tissue growing in liquid suspension can be made by cutting a piece of the apical Meristems (tissue that divides and forms) or the epicotyl of a plantlet and puts it on agar, the Containing sugar and a nutrient medium, transferred. The tissue grown here can then form a Suspension can be transferred into the liquid.
Die flüssige Suspension, in der das Pflanzengewebe gezüchtet wird, ist vorzugsweise in einem Chemostaten oder Fermenter enthalten, damit die Bedingungen geregelt werden können. Um das Wachstum des Gewebes aufrechtzuerhalten, werden dem wachsenden Gewebe Nährstoffe zugeführt und kontinuierlich Gewebe entfernt.The liquid suspension in which the plant tissue is grown is preferably in a chemostat or fermenters included so that the conditions can be regulated. To the growth of the To maintain tissue, nutrients are supplied to the growing tissue and continuously Tissue removed.
Auf diese Weise wird kontinuierlich in flüssiger Suspension wachsendes Gewebe erzeugt.In this way, tissue that grows continuously in liquid suspension is produced.
Es gibt zahlreiche bekannte Nährmedien, die für die Züchtung von Pflanzenzellgewebe verwendet werden. w Sie enthalten im allgemeinen verschiedene Mineralstof- % fe, die als Nährstoffe benötigt und zuweilen als Makroelemente bezeichnet werden, und verschiedene Metallsalze, die zuweilen als Mikroelemente bezeichnet werden. Ferner können verschiedene Aminosäuren, Vitamine und Pflanzenwachstumsregler vorhanden sein.There are numerous known nutrient media that are used for growing plant cell tissue. w They generally contain various mineral percentages , which are required as nutrients and are sometimes referred to as macro-elements, and various metal salts, which are sometimes referred to as micro-elements. Various amino acids, vitamins and plant growth regulators can also be present.
Als Beispiele gebräuchlicher Nahrmedien, die verwendet werden, sind die Nährmedien von Skoog, Heller, Knop, Gamborg, White und Street zu nennen. Diese Medien enthalten unterschiedliche Mengen der verschiedenen Bestandteile. Als Quelle für Zucker werden Saccharose, Glucose und Kokosnußmilch verwendetAs examples of common nutrient media that are used the culture media from Skoog, Heller, Knop, Gamborg, White and Street should be mentioned. These Media contain different amounts of the various components. Be used as a source of sugar Sucrose, glucose and coconut milk are used
Zu den typischen Makroelementen gehören Stickstoff, Phosphor, Kalium, Calcium und Magnesium. Beispiele typischer Mikroelemente sind Eisen. Mangan, Kupfer, Nickel, Molybdän und Bor.Typical macro-elements include nitrogen, phosphorus, potassium, calcium and magnesium. Examples of typical micro-elements are iron. Manganese, copper, nickel, molybdenum and boron.
Die Zuckerkonzentrationen im ersten Nährmedium beim Verfahren gemäß der Erfindung betragen 2 bis 5 g/Liter.The sugar concentrations in the first nutrient medium in the method according to the invention are 2 to 5 g / liter.
Die Nahrmedien enthalten außerdem Pflanzenwachstumsregler, z. B. Auxine und Cytokinine, und Aminosäuren und Vitamine, z. B. Nicotinsäure, Thiamin, Glycin und Folsäure.The nutrient media also contain plant growth regulators, z. B. auxins and cytokinins, and amino acids and vitamins, e.g. B. nicotinic acid, thiamine, glycine and folic acid.
Vorzugsweise wird während der Züchtung des Pflanzengewebes eine erhöhte Lichtintensität angewendet Beispielsweise kann mit Lichtintensitäten von 2600 bis 10000 Lux, ζ. Β. etwa 7000 Lux, gearbeitet werden. Während der Züchtung des Pflanzengewebes wird die Konzentration von Kohlendioxid in der Atmosphäre vorzugsweise auf einen Wert von 3 bis 50Vol.-% erhöhtAn increased light intensity is preferably used during the cultivation of the plant tissue. For example, light intensities of 2600 to 10000 lux, ζ. Β. about 7000 lux. During the cultivation of the plant tissue, the concentration of carbon dioxide in the atmosphere is preferably increased to a value of 3 to 50% by volume
Wenn das Gewebe aus dem ersten Nährmedium genommen wird, kann eine Differenzierung und Neoembryobildung durch Einwirkung von Pflanzenwachstumshormonen, z. B. Auxinen und Cytokininen wie Acenanaphthen oder 6-substituierten Adeninen, z. B. 6-Furfurylaminopurin, 6-Benzylaminopurin und Zeatin, erreicht werden. Die Differenzierung kann ausgelöst werden, indem sowohl die absolute Konzentration im Nährmedium als auch das Mengenverhältnis von Auxin und Cytokinin verändert wird. In gewissen Geweben ist eine spontane Differenzierung auf Grund hormonaler Veränderungen möglich, wenn das Gewebe aus dem ersten Nährmedium genommen wird. In anderen Fällen findet eine Teildifferenzierung, z. B. Knospenbildung, statt, und eine weitere Differenzierung kann durch Überführung in ein anderes Medium ausgelöst werden.When the tissue is removed from the first nutrient medium, there can be a differentiation and Neoembryo formation through the action of plant growth hormones, e.g. B. auxins and cytokinins such as acene anaphthene or 6-substituted adenines, e.g. B. 6-furfurylaminopurine, 6-benzylaminopurine and Zeatin, to be achieved. Differentiation can be triggered by both absolute concentration in the nutrient medium as well as the quantitative ratio is altered by auxin and cytokinin. In certain tissues a spontaneous differentiation is due hormonal changes possible when the tissue is removed from the first nutrient medium. In in other cases there is a partial differentiation, e.g. B. Bud formation, instead, and a further differentiation can be triggered by transferring to another medium.
Vorzugsweise wird die aus dem ersten Nährmedium erhaltene flüssige Gewebesuspension auf einen Agar-Nährboden überführt, der mehr Nährmedium enthält.The liquid tissue suspension obtained from the first nutrient medium is preferably placed on an agar nutrient medium transferred, which contains more nutrient medium.
Das zweite Nährmedium ist vorzugsweise ein Agarsubstrat, das ein Nährmedium und Zucker enthält. Das Hormongleichgewicht des Nährmediums wird vorzugsweise durch Zusatz der erforderlichen Hormone zum Agar verändert.The second nutrient medium is preferably an agar substrate which contains a nutrient medium and sugar. The hormonal balance of the nutrient medium is preferably achieved by adding the necessary hormones changed to agar.
Bei der Überführung des differenzierten Gewebes auf ein Medium, das im wesentlichen keinen Zucker enthält, verändert sich das wachsende Gewebe zu einem photosynthetisierenden Pflänzchen. Vorzugsweise wird jetzt der Kohlendioxidgehalt in der Atmosphäre erhöht. Dieses Nährmedium liegt vorzugsweise auf einer porösen Unterlage, wie Filterpapier, vor.When transferring the differentiated tissue to a medium containing essentially no sugar, the growing tissue changes into a photosynthetic plant. Preferably will now the carbon dioxide levels in the atmosphere are increasing. This nutrient medium is preferably on a porous surface such as filter paper.
Wenn die Pflänzchen wachsen, werden sie vorzugsweise in einem Zweistufenprozeß in den Boden überführt. In der ersten Stufe werden sie vorzugsweise auf Vermiculit in hydroponischer Lösung und von dort in den Erdboden überführt.As the plants grow, they are preferably put into the soil in a two-step process convicted. In the first stage they are preferably placed on vermiculite in hydroponic solution and from there transferred into the ground.
Vor der Überführung des differenzierten Gewebes auf ein Medium, das keinen Zucker enthält, kann weiteres Wachstum durch Bildung einer weiteren Zellsuspension und Überführung von Zellen aus dieser Suspension auf das dritte Medium, das keinen Zucker enthält, stattfinden.Before transferring the differentiated tissue to a medium that does not contain sugar, can further growth by forming another cell suspension and transferring cells from it Suspension to take place on the third medium that does not contain sugar.
Von einem Karottenstamm wurde ein Teil des Epikotyls auf Agar, das Skoog-Medium und Zucker in einer Konzentration von 3,0g/L;':er Medium enthielt, ". überführt Hier wurde das Gewebe gezüchtet Das auf dem Agar wachsende Gewebe wurde in Wasser, das Skoog-Medium enthielt und eine Zuckerkonzentration von 3,0 g/Liter hatte, überführt wobei eine Zellsuspension gebildet wurde. Nach der Züchtung in der ι ο Susoension wurde ein Teil der Zellen auf Agar überführt das Zucker in der gleichen Konzentration wie vorher enthielt, worauf Acenanaphthen zugesetzt wurde. Gewebeklone, die Embrogenbildung zeigten, wurden auf weiteres Wasser überführt das Zucker und ι s Skoog-Medium enthielt, wobei eine Zellsuspension gebildet wurde. Neoembryos wurden in Suspension gezüchtet Die Neoembryos wurden auf Filterpapier, das Skoog-Medium, aber keinen Zucker enthielt in einer Atmosphäre, die 2Vol.-°/o Kohlendioxid enthielt, überführt. Die Neoembryos wurden nach der Züchtung weiter auf Vermiculit in hydroponischer Lösung überführt und zu Pflänzchen entwickelt, die zum weiteren Wachstum in den Erdboden überführt wurden.A part of the epicotyl of a carrot stem was placed on agar, the Skoog medium and sugar in a concentration of 3.0g / L; ': he medium contained ". Here the tissue was grown The tissue growing on the agar was immersed in water that Containing Skoog medium and had a sugar concentration of 3.0 g / liter, a cell suspension was transferred was formed. After cultivation in the ι ο suspension, some of the cells were placed on agar transferred the sugar contained in the same concentration as before, whereupon acenanaphthene was added became. Tissue clones which showed embrogening were transferred to further water, the sugar and ι s Skoog medium, a cell suspension being formed. Neoembryos were in suspension The neoembryos were grown on filter paper that contained Skoog's medium, but no sugar an atmosphere containing 2% by volume of carbon dioxide. The neoembryos were after cultivation further transferred to vermiculite in hydroponic solution and developed into small plants that are used for further growth were transferred into the ground.
Beispiel 2 2'Example 2 2 '
Von einem Stamm von Psoralea bituminosa wurde ein Teil des Epikotyls in Agar, das Skoog-Medium und Zucker in einer Konzentration von 3,0 g/Liter enthielt, überführt und gezüchtet. Das auf dem Agar gezüchtete Gewebe wurde in Wasser, das Skoog-Medium und Zucker in einer Konzentration von 3,0 g/Liier enthielt, überführt, wobei eine Zellsuspension gebildet wurde. Nach der Züchtung der Suspension wurde ein Teil des Gewebes in Agar überführt das Skoog-Medium und Zucker in der gleichen Konzentration wie vorher enthielt. Einige der Klone des Gewebes bildeten spontan Knospen, und diese Klone wurden in Agar überführt das Heller-Medium und Zucker enthielt In diesem Medium fand Wurzelbildung statt Die Pflänzchen mit Knospen und Wurzeln wurden auf Filterpapier, das Skoog-Medium, aber keinen Zucker enthielt, in einer Atmosphäre, die 2 VoI.-°/o Kohlendioxid enthielt, überführt Die Pflänzchen wurden auf Vermiculit in hydroponischer Lösung und nach dem Wachstum in den Erdboden zum weiteren Wachstum überführt.Part of the epicotyl of a strain of Psoralea bituminosa was found in agar, Skoog's medium and Containing sugar at a concentration of 3.0 g / liter, transferred and cultured. The one grown on the agar Tissue was immersed in water containing Skoog's medium and sugar at a concentration of 3.0 g / Liier, transferred, whereby a cell suspension was formed. After the suspension was cultured, part of the Tissue in agar transfers the Skoog medium and sugar in the same concentration as before contained. Some of the clones of the tissue spontaneously budded and these clones were grown in agar transferred the Heller medium and contained sugar. In this medium, roots were formed. The little plants with buds and roots were placed on filter paper containing Skoog's medium but no sugar in an atmosphere containing 2% by volume of carbon dioxide. The little plants were transferred to vermiculite in hydroponic solution and after growth transferred into the ground for further growth.
Von einer Salatplanze der Sorte »Grand Rapid« wurde ein Teil des Epikotyls in Agar überführt, das Skoog-Medium und Zucker in einer Konzentration von 3,0 g/Liter enthielt, wo das Pflanzengewebe gezüchtet wurde. Aus dem Agar wurde Gewebe entnommen und in eine wäßrige Lösung von Skoog-Medium, das 3,0 g Zucker pro Liter enthielt überführt, worauf das Gewebe in der Zellsuspension gezüchtet wurde. Ein Teil des Gewebes wurde aus der Suspension genommen und auf Agar überführt das Skoog-Medium und 3,0 g Zucker pro Liter enthielt. Es wurde festgestellt, daß einige Klo.ie des Gewebes Knospen und Wurzeln gebildet hatten. Diese Klone wurden auf Filterpapier, das Skoog-Medium, aber keinen Zucker enthielt, in einer Atmosphäre, die 2 Vol.-% Kohlendioxid enthielt, überführt. Die Pflänzchen wurden gezüchtet und dann auf Vermiculit in hydroponischer Lösung überführt. Nach dem Wachstum wurden die Pflänzchen zum weiteren Wachstum in den Erdboden überführt.Part of the epicotyl of a lettuce plant of the »Grand Rapid« variety was transferred to agar Skoog medium and sugar at a concentration of 3.0 g / liter contained where the plant tissue was grown became. Tissue was removed from the agar and placed in an aqueous solution of Skoog's medium containing 3.0 g Sugar per liter contained transferred, whereupon the tissue was grown in the cell suspension. Part of the Tissue was removed from the suspension and transferred to agar, the Skoog medium and 3.0 g of sugar contained per liter. It was found that some loo.ie of the tissue formed buds and roots had. These clones were on filter paper that contained Skoog's medium but no sugar in a Atmosphere containing 2% by volume of carbon dioxide transferred. The little plants were grown and then up Vermiculite transferred to hydroponic solution. After the growth, the little plants became another Growth transferred into the ground.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OD | Request for examination | ||
| D2 | Grant after examination | ||
| 8363 | Opposition against the patent | ||
| 8331 | Complete revocation |