DE2310462A1 - Neues verfahren zur herstellung von antibiotika der phleomycingruppe - Google Patents

Description

Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Tokyo/Japan

Neues Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der Phleomycingruppe

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der Phleomycingruppe, die eine Antitumorwirkung aufweisen.

Die Antibiotika der Phleomycingruppe umfassen elf Phleomycine, die durch Streptomyces verticillus (z.B. Strepto-

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myces verticillus 84>-l, ATCC Nr. 21890) erzeugt werden /"Maeda, Kosaka, Yagishita, Umezawa, Journal of Antibiotics, A 9, Seite 82 (1956); Ikekawa, Iwami, Hiranaka, Umezawa, Journal of Antibiotics, A I7, Seite 194 (19β4)_7, Substanzen die durch Streptomyces flavoviridis (z.B. Streptomyces flavoviridis MC-637 Y-I, ATCC Nr. 2I892) erzeugt werden {Japanische Patentanmeldung ITr. 5359^/7^ ^as Antibiotikum YA-56, hergestellt durch Streptomyces huraidus (NRRL 5885) ^"Ito, Ohashi, Egawa, Yamaguchi, Purumai, Enomoto., Okuda, Journal of Antibiotics, 24, Seite 727 (1971)_7und Zorbaraycine, die durch Streptomyces bikiniensis var. zorbonensls (NRRL j}684) /"Argoudelis, Bergy, Pyke, Journal of Antibiotics, 24, Seite 543, (197I) 7^erzeuSt werden.

Biese Antibiotika stellen aus Zuckern und Aminosäuren zü~ sassmengesetzte Glycopeptide dar, die eine starke Neigung zur Chelatisierung eines Cu (ll)-atoms besitzen. Sie haben die Eigenschaft, ein charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit Maxima in der ITähe von 244 m M und 30 m.n aufzuweisen. Von den Erfindern wurden Untersuchungen bezüglich der chemischen Struktur der Antibiotika der Phleoraycingruppe durchgeführt und als Ergebnis wurde gefunden, dass diese Antibiotika eine teilweise Endstruktur gemeinsam aufweisen, in welcher ein AmIn durch eine Peptldbindung mit der Carboxylgruppe von 2-/ 2-{2-A«3inoäthyl)-A -thlazolin-4-yl 7-thlazol-4-carbonsäure

N |CO-Y

- 3 309838/1241

in Verbindung steht. Als Ergebnis weiterer Untersuchungen der chemischen Struktur der Phleomycine wurde durch die Erfinder ermittelt, dass die Phleomycine die folgende Struktur, in der Y l-Amino-4-guanidinobutan für Phleomycin D, und l-(4-Aminobutyl)-J>- (4-guanidinobutyl)-guanidin für Phleomycin E. bedeuten, aufweist:

H₉CwN-CiI^
- * CH ^d

CH

/P/ O XlI ^C 'CH" NH mi I I Π I I! I I

.2 CH-. N_x JC /CH_n O ,CH CK

CH-

⁰ ^r-^N

i Λ

i H Λ

9H M Ii

"CH₂OH .0H

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Beispiel

NH

Il

Phleomycin D₁ . -NH-(CH₂)^-NH-O-NH₂

' NH

It

Phleomycin E i -NH-(CH₂)^-NH-C-NH-

NH
tt

Die Antibiotika der Phleomycingruppe zeigen nicht nur breite und starke antimikrobielle Wirkungen gegen Bakterien und ^imycetes sondern auch eine Antitumorwirkung^ die zur Inhibierung des Wachstums kultivierter HeLa Zellen führen und auch gegen Ehrlich Karcrnome inhibierend wirken. Jedoch weisen diese Phleojnycine einen Nachteil dahingehend auf, dass sie bei fortgesetzter Verabreichung die Niere nachteilig beeinflussen*

GeBÄss der Erfindung wurde in Betracht gezogen, dass es möglich wäre Antibiotika der PhIeomycingruppe mit geringer Toxizität gegenüber der Niere ohne Verminderung der Antitu- ©erwirkung durch Einführung eines spezifischen Aminrests für Y in das Molekül zu entwickeln, Weiter werden die Antibiotika der Pbleoi^feiiigruppe bei Behandlung ait einem Oxidationsmittel leicht in Antibiotika der Bleomycingruppe übergeführt ^""bezüglich Antibiotika der Bleo^-cingruppe vergleiche Journal of Antibiotics, A 19, Seite 200 (1966) J die

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eine Antibiotikagruppe darstellen, die in dem Molekül 2^f-(2-Aminoäthyl)-2,4^l-bithiazol-4-carbonsäure anstatt der vorstehend angeführten 2-/~2-(2-Aminoäthyl)-A²-thiazolin-4-yl 7thiazol-4-carbonsäure (US-Patentanmeldung Serial No. 280 O4]5) aufweisen. Dementsprechend besitzen die Antibiotika der Phleomycingruppe eine erhebliche industrielle Bedeutung, da sie ein wichtiges Ausgangsmaterial zur Herstellung der Antibiotika der Bleomycingruppe werden könnten, die gegenwärtig in der Therapie von schuppigen Zelltumoren verwendet werden.

Im Rahmen der Erfindung wurde gefunden, dass spezifische Antibiotika der Phleomycingruppe künstlich cürch biosynthetische Einführung eines spezifischen Amins in eine durch Y in der vorstehend angeführten allgemeinen Formel eingenommene Stellung erzeugt werden können. Auf dieser Tatsache beruht die Erfindung.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein neues Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der Phleomycingruppe mit Antitumorwirkung zur Verfügung zu stellen.

Die Erfindung hat sich weiter die Aufgabe gestellt, neuartige Antibiotika der Phleomycingruppe mit Antitumorwirkung zur Verfügung zu stellen, die die vorstehend angeführte allgemeine Formel besitzen.

Nachstehend wird die Erfindung ausführlich erläutert.

Wird ein Actinomycetestamm, der zur Erzeugung von Antibiotika der Phleomycingruppe fähig ist, z.B. Streptomyces verticillus 843-1 /""Fermentation Research Institute(under the Ministry

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of International Trade and Industry, Japan) Registrier Nr. 1350 ATCC 21890 7 unter aeroben Bedingungen in einem Medium kultiviert, das ein durch die nachstehende allgemeine Formel dargestelltes .Amin enthält, so kombiniert sich dieses Amin über die primäre Aminogruppe mit der Hauptphleomycinstruktur unter Bildung einer Restgruppe Y,und darüber hinaus wird das eine derartige Struktur aufweisende Phleomycin überwiegend erzeugt. Somit wird gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren eine Kulturlösung erhalten, die ein einziges Phleomycinspezies enthält, das dem Amin, das dem Kulturmedium hinzugefügt wurde, entspricht. Somit erlaubt das Verfahren eine leichtere und wirtschaftlichere Gewinnung des Produktes und ist somit wirtschaftlich gesehen vorteilhafter im Vergleich zu dem Fall, bei dem ein spezifisches Phleomycin aus einer üblichen Kulturlösung, die verschiedene Phleomycintypen enthält, gewonnen wird.

Das im Rahmen der Erfindung angewandte Amin wird durch die allgemeine Formel wiedergegeben

R - ( CHp)_n - N^

O JF W

der H Β_Λ-ίΙΗ-, 53^-, (CH,)" ~ W-_Λ fiJff-C-, fOf-Ö-MH-

JJ Jj T £~ CL

f-, P^-,<^ Y, T^ \-, c( N-, oder

- 7 309838/1241

bedeuten (worin R₂ eine niedrige Alkyl-, Methoxypropyl-, Hydroxypropyl-, Halogenpropyl-, AHyI-, Cyclohexyl-, Benzyl- oder ö««-Me thy lben zyl gruppe und R, und R₂^ niedrige Alkylgruppen bedeuten), R, ein Wasserstoffatom oder die 3-Aminopropylgruppe darstellt und η = 2 oder 3 bedeutet. Beispiele der durch die vorstehend angeführten allgemeinen Formeln dargestellten Amine sind:

N,N-Dimethyl-l,2-diaminoäthan (CH^)₃~N-(CH₃)₂-N,N-Diäthyl-l,2-diaminoäthan T

N-Methyl-l,>diaminopropan CTUNH-

N,N-Dimethyl-l,>diaminopropan ()

^-Aminopropyl-trimethylammonium- (CT^) Ji-(CH₂) -5-halogenid £ Q

N,N-Diäthyl-l,>diaminopropan (C₃H₅) ₂-N-

N-n-Butyl-l,5-diaminopropan n-C^Hg-NH- (CT^) -5-

N-tert-Butyl-l,3-diaminopropan t-C^H₂₂

N-Allyl-l,3-diaminopropan CH₂=CH-CH₂-NH(CH₃),-NH₃

N-5¹-Hydroxypropyl-1,3-diamino-

propan HOCH₃CH₃CH₃-NH-(CH₃)3-

N-3¹,3^l-Dichlorpropyl-l,5-diami-

nopropan Cl2CTCHpCH₃-NH-(CH₃)3-

5-Aminopropyldimethylsulfonium- (CT,)₃S-(CH₃),-NH₃ halogenid j

N-Cyclohexyl-1,3-diaminopropan / H \ -NH- (CT₃) ,-NH₃ N-Benzyl-l,3-diaminopropan <ς ^-CH₃-NH-(CT₃) ,-

N- du-Methylbenzyl-l,>diamino- <ζ y-CH-NH-(CT₂). propan

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- 8 —

N-(^¹ -Dirne thylaminoäthyl)· 1» 5-diaminopropan

N-(3-Aminopropyl)pyrrolidin ^i-

N-(3-Aminopropyl)piperidin <^ N-

N-(3-Aminopropyl)piperazin HN

N-(3-Aminopropyl)morpholin

4-(2-Aminoäthyl)imidazol. /^NHv

J L

NH

Il

J5-Amidinopropylaniin H₂N-C-(CH O₃-ITO₂

NH

Il

>-Guanidinopropylamin H₀N-C

(C

N- ( 3* -Dimethyl aminopr opyl) - CH

H_(3«-eyciohe:xylafflinopropyl)- / H VhH-(CHg)₃-HH-(CH₂)₃-NH₂

N- (3^% -BeriEylaffiinoäthyl) -1, > ^ ^ -CHg-NH- (CH₀) _O-NH-dlaminopropan

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N-O'-Benzylaminopropyl)- <Χ\>-CH₂-NH-(CH₂) ,-NH-

1,3-diaminopropan ^N ()

N- (3¹ -d» -Methylbenzylaminopro- <ζ^ \-CH-NH- (CH₂) ,-NH-

pyl)-l,3-diaminopropan CH-,

N-(2'-Piperazinoäthyl)-

1,3-diaminopropan HN N-(CH₂J₂-NH(CH₂)

₂J₂-NH(CH₂

N-(2 *-4" - iraidascOyläthyl)-1,3-diaminopropan

N-(3'-Pyrrolidinopropyl)-1,3-di aminopropan

N-(y-Piperidinopropyl)-1,3- <^ ^N-(CHg)₃NH-

cT V,

diaminopropan

N-(3¹-Morpholinopropyl)-1,3-

diaminopropan . 6 "N-(CHg)₃-NH-(CHg)₃-NHg

N-(3¹-n-Butylaminopropyl)-

1,3-di aminopropan n-C^HgNH- (CHg) -,-NH- (CHg) ^-

Bei der Ausführung der Fermentierung gemäss der Erfindung ist kein Grundmedium einer speziellen Zusammensetzung erforderlich, es wird jedoch nur eine solche Zusammensetzung, die von höchster Produktivität erscheint, unter den gewöhnlich

309838/124 1 " ¹⁰ "

für die Erzeugung von Phleomycinen angewandten Medien ausgewählt, die als Hauptbestandteile Kohlehydrate und stickstoffhaltige, organische Substanzen, wie beispielsweise Glukose, Hirse- Gelee, Stärke, Sojabohnenmehl und Mais- bzw. Kornstärkesaft und geringere Mengen an anorganischen Substanzen, wie beispielsweise Kaliumphosphat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Natriumchlorid und Natriumni.trate und Toho Nr, (Warenzeichen für oberflächenaktive Mittel) als Antischaummittel (BE-PS 745 926) enthalten. _}

Zu einem derartigen .Grundmedium wird eine wässrige Lösung eines Salzes der vorstehend erwähnten Amine hinzugefügt, welches einer Sterilisierungsbehandlung unterworfen worden war. Was die Zeit des Zusatzes eines Amins anbetrifft,ist es vorteilhafter - obwohl es entweder zu Beginn der Kultivie rung oder portionsweise während der Kultivierung hinzugefügt werden kann - es bei einem relativ frühen Stadium der Kultivierung und am wirksamsten innerhalb %8 Stunden von Beginn der Kultivierung an zuzusetzen* Obgleich es um so besser ist, je grosser die zuzusetzende Amimnenge ist, wenn sich nicht eine Toxizität infolge des Amins entwickelt, liegt diese aus wirtschaftlichen Gründen geeignet innerhalb des Bereiches von 500 bis 2QQ)]BOg pro ml des Mediums, Der Fortgang der Kultivierung unterscheidet sich niehfc Im geringsten von jenem der üblichen ferment ativen Herstellung von Phleomycinen. Bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 25 bis 35°C erreicht die Produktion ein Maxissum in 8 bis 10 Tagen im Fall einer Schüttelkultur innerhalb eines Kolons, und in vier bis 7 Tagen im Fall einer belüfteten, in einem Fermentationstank untergetauchten Kultur»

Das in dem Kulturmedium erzeugte Phleomycin wird durch

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wird durch ein bekanntes Verfahren wiedergewonnen /(P. Takita: J. Antibiotics, Ser. A. 12 (6), Seite 285 (1959)_7. Die Kulturlösung wird über eine Säule mit Kationenaustauscherharz, Amberlite IRC-50 (Η-Typ, Na-Typ oder eines Gemisches hiervon, (Warenzeichen für ein saures Kationenharz, das Karbonsäuregruppen enthält, hergestellt durch Rohm & Haas Company) oder mit aktivierter Kohle geführt, um die Adsorption von Phleomycin zu erlauben und sodann mit destilliertem Wasser, wässrigem Aceton, und saurem wässrigen Aceton in der angegebenen Reihenfolge eluiert. Fraktionen, die gegenüber einem Probeorganismus, Myc-obakterium smegraatis 6O7 aktiv sind (nachstehend zur Vereinfachung als aktive Fraktionen bezeichnet), werden gesammelt und zur Trockene unter Erhalt eines rohen Pulvers konzentriert. Das rohe Pulver wird in einer 80 $-igen, wässrigen Methanollösung aufgelöst und an einer neutralen Aluminiumoxidsäule, die mit dem gleichen Lösungsmittel gefüllt ist, adsorbieren gelassen und sodann mit dem gleichen Lösungsmittel unter Erhalt blauer bis grüner Fraktionen, die Phleomycin enthalten, entwickelt. Nach erfolgter Konzentrierung zur Trockene werden diese Fraktionen in destilliertem Wasser aufgelöst und der Säulenchromatographie mit Sephadex^ G-25 (Warenzeichen für ein Gelfiltrationsmittel, das aus Dextranderivaten zusammengesetzt ist, hergestellt durch die Pharmacia Fine Chemicals Inc) unterworfen. Die resultierenden blauen Fraktionen werden zur Trockene unter Erhalt eines blauen amorphen Phleomycinpulvers konzentriert. Das hierdurch erhaltene Pulver zeigt eine Zusammensetzung, die sich jener einer aus einer einzigen Komponente bestehen·* den Substanz annähert, die die Wirkung der Addition eines Amins im Vergleich zu einer Zusammensetzung (20.7 # Phleomycin D, 2J.4 % Phleomycin E, 6.9 % Phleomycin G, 30.0 #

- 12 -309838/1241

Phleomycin H, 19 % andere) welche ein durch herkömmliche Fermentierung erhaltenes Pulver aufweist, klar anzeigt.

Die vorstehend erwähnte Reinigung scheint für die tatsächliche Chemotherapie ausreichend zu sein. Zur weiteren Verbesserung der Reinheit zum Zweck der Aufklärung der physikalischen,

chemischen und biologischen Eigenschaften ist eine Säulenchromatographie unter Verwendung von CM-Cephadex^ C-25 (Warenzeichen für einen sauren Ionenaustauscher, der aus Carboxymethyl-Sephadex zusammengesetzt ist, hergestellt durch Pharmacia Fine Chemical Inc.X gut geeignet. Diese Chromatographie wird dadurch durchgeführt, dass man zuerst die Säule mit Phleomycin beladt und sodann die Säule snit einer wässrigen Hatriumchloridlösung eluiert, deren Konzentration allmählich von 0,05 molar auf 1 molar erhöht wird» Blaue Fhleos^fcine enthaltende Fraktionen werden gesammelt und durch ein bekanntes Verfahren., ζ,Β_Λ Chromatographie mit aktivierter Kohle, die als Adsorbient verwendet wird, untey Erhalt eines blau gefärbten amorphen Pulvers kupferhaltigen Phleoffiycins Im reinen Zustand entsalzt.

Das derart erhaltene Phleomycin zeigt die gleichen Eigenschaften wie jene herkösaslicher Phleomycin, dahingehend, dass es sich allmählich bei einer Temperatur von 188°C oder höher zersetzt \md sich gegenüber Biuret-, Molisch-, Fehlixig-, Tollens, Eisen-II-ehlorid-, und Ninhydrinreaktionen negativ und gegenüber Ehrlich-, l>ragendorff- und Permanganatreaktio- nen positiv verhalt« Die Beak tion nach SakaguoM ist nur dann positiv, wenn R in der vorstehend bezeichneten allgemeinen Formel eine Guanidingruppe darstellt* Wenn es einer zweidifflensionalen Chromatographie {eindimensional t Hochspannungspapierelektrophorese unter Druck j Ameisensäure-

- 13 309838/1241

Essigsäure-Wasser = 25 : 75 '> 900; zweidimensional: Papierchromatographie; n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser =
15 : 10 s 3 s 12) nachdem es vollständig in 6n-Chlorwasserstoff säure hydrolysiert worden war, unterworfen wird, ergibt das vorliegende Phleomycin 8 Farbpunkte, die gegenüber Ninhydrin positiv sind, unter denen ein Punkt oder Fleck mit jenem des zugefügten Amins zusammentrifft und die anderen
jene darstellen, die allen Phleomycinen einschliesslich bekannter Phleomycine gemeinsam sind. Die durch das vorliegende Verfahren erhaltenen Phleomycine und ihre Eigenschaften sind in Tabelle I zusammengefasst.

309838/ 1241 . 14 -

- 14 Tabelle I

ο ω οο ω οο

	2	Bezeichnung des zugefügten Amins	Bezeichnung des neuen Phleo- myclns	\usbeute pro Liter KuItürlösung mg
1	3	N,N*-Difflethyl~l, 2-dlamlno*- Si than	2-N,N-Dimethylaminoäthyl- äminophleomycin	17 .
4	N,H-Diäthyl»l,2-diamino- lithan	2~N>N-Diäthylaminoäthyl- aminophleomycin	15
5	N*-Methyl*l, 3-diaminopropan	3-N-Methylarainopropylamino- phleoitiycin	20
6	N»H-Diaethyl-1, j5-di amino- propan	3-^iN-Dimethylaminopropylamino- phleomycin	23
7	3-Aminopfopyitrimethyl*· ammoniumöhlorid	3-(N,N,N-Trimethylamino) propylaminophleomycinchlorid	19
N,N-Diäthyl«l,3-di amino- propan	3-N,N-Diäthylaminopropylamino- phleomycin	25 k> <*>
N*n-Butyl-1 > 3*-diaminopropan	3-M-n-Butylaminopropylamino- phleomycin	CD 12 j> cn X 4saJ

- I4a -

Elementaranalyse %	H	N ...	S	Cl	Cu	Wirkung ' ' Einheit/mg	TLC (2^ • Rf .	E 1# (?) h lern E (244 ayu) E (300 m/u)	ro OJ
C	5.72	16.12	4.18	4.63	4.02	718	0.35	. 154 56
42.63	5.84	15.98	4.05	4.38	3.87	882	O.52	150 54
43.42	5.72	16.27	4.31	4.73	4.05	688	O.56	148 53
42.64	5.73	16.11	' 4.37	4.83	3.89	648	0.35	149 53
43.01	5.92	15.82	4.30	4.75	4.08	506	O.43	150 53
43.52	5.99	15.70	4.38	4.25	4.04	829	O.43	158 58
44.17	5.95	15.74	4.00	4.78	3.95	3535	0.60	151 54
43.78

Fortsetzung Tabelle I

	8	N-tert-Butyl-l,3-diamino- propan	3-N-tert-Butylaminopropylamino- phleomycin	10
	9	N-Allyl-1,3-diaminopropan	3-N-Propenylaminopropylamino- phleomycin	8
	10	N-3'-Hydroxypropyl-1,3- diaminopropan	3-N-(3-Hydroxypropyl)amino- prppylaminophleomycin	16
309838/	11	N-3T,3f-Dichlorpropyl-1,3- dlaminopropan	3-N-(3,3-Dichlorjpropyl)amino- propylaminophleomycin	9
1241	12	3-Aminopropyldimethyl- öulfoniumbromid	3-S,S-Dimethylmercaptopropyl- aminophleomycin	24
	13	N-Cyclohexyl-l,3-diamino- propan	3-N-CyGlohexylamlnopropyl- aminophleomycln	28
	14	N-Benzyl-l,3-diamino- propan	3-N-Benzylaminopropylamino- phleomycin	5
15	N- Φ-Methylbenzyl-1,3-diamino- propan	3-N-(1-Phenyläthyl)aminopropyl- aminophleomycin	14

mm rH	CVIVO mm rH	rH m mm rH	in vo mm rH	com mm rH	t-KN rH	CVJ ^t mm rH	OKN mm rH
0.62	co m d	0.61	0.72	KN d	Ο.62	0.57	VO ί ο
3520	2100	m co	O CVJ rH KN	m VO co	00 CVI	3373	O KN O .=*-
O ο-	in VO KN	00 00 • KN	O KN	3.75	vo KN	m 00 KN	ON O
4.66	0. co	rH KN -=£	8.61	4.77	co m	CVl KN	m O .=*
4.25	4.10	KN	3.73	6.04	4.01	co KN	VO VO KN
ο 00 in rH	0 vo ■ · in rH	15.57	ON O ιή «Η	14.80	ιή rH	rH ιή rH	ON CVJ ιή rH
CVI ON m	5.84	t- OO ιή	5.35	VO ιή	5.90	co t- ιή	O co ιή
KN 00 KN	KN VO KN	ο rH KN	rH ON rH	00 CV)	44.86	m 0 ιή •=J-	46.15

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Tabelle I

- 16 -

CO ο co co ca oo

K) J(N

16	N-(3-Amlnopropyl)pyrrolIdin	3-Pyrrolidinopropylamino- phleomycin	21
17	N*- (3- Aminopropyl) piperidin	3-Piperidinopropylamino- phleomycin	23
18	N-(3-Aminopropyl)piperaain	3-Piperazinopropylamino phl eorny ein	13 . -
19	N-(3-Aminopropyl)morpholin	3-Morpholinopropylamino phl eomy ein	5
20	4-(2-Afflinoäthyl)imidas5ol	2-(lmidazol-4-yl)äthylamino- phleomycin	26
21	3-Amidinopropylamlri.	3-Amidinopropylamino- phleomycin /	22
22	ti- (3* -Dimethyl artiinopropyl)- 1, >-di aminopropan	3-(3-N,N-Dimethylaminopropyl- amino)propylaminophleomyein	8
23	N-(3'-Cyolohexylafflinopropyl)- 1,3*diaminopropan	3-(3-N-Cyelohexy1aminopropylamino)- propylaminophleomyein	11

to CJ

	-	ovo	_^	2310462	KNm	COKN	t—CVI
		vom rH	mm r-l		mm	rH	rH
vom		CVl	m	t-vo	VO	τ-*	rH
mm T-i	mm rH	KN	VO	mm •Η	VO	r-l	KN
	co	O	O		O	O	O
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ο	O	co	t—	O		KN
ΚΛ	vo	m		co	CVI \	KN	m
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VO	VO	KN	KN			KN	KN
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KN	KN					CO	KN
rH	m			O	m	VO	VO
	m	t-	m			CJN	00
	■=4-	r-i		"*	^4"
CVI	m			KN	T-*	■=4-
O			vo	O	ON		rH
"■	'•=4-		KN	^	VO 1-4	CO
KN		vo rH	m	ON		m i-l	m rH.
CVI	^t	OO	O	CO	m	m	VO
vo i-l	m rH	co	co	VO i-l	m	ON	O
rH	VO	m	m	O	KN	m	VO
t-	co	O	CVl		T-t		O
m	m	-=4-	m	m	KN	co
vo		KN	KN	ON	■^	CVl
co		^4-		O			^4-
KN	iH KN		KN

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Portsetzung Tabelle 1

- 17 -

ω ο co 03 CO 00

24	N-(3f-Benzylaminopropyl)* 1,3"*di aminopropan	^-(3-N-Benzylaminopropylamino)- propylaminophleomycin	13
S5	N-. (31 - et-Me thylbenÄylamino propyl )-1,3-diaminopropan	5-5-N-(1-Phenylethyl)aminopropyl- aminc^propylaminophleomycin	16
26	N-(3f-Pyrrolidinopropyl)* 1, 5~di aminopr op an	3-(3-Pyrrölidinopropylamino)- propylaminophleomycin	12
2?	N~(3t-Piperidinopropyl)- 1,5"cii aminopropan	3-(3-Piperidinopropylamino)- propylaminophleomycin	10
28	N-(3f -Morphölinopropyl)- 1,3-diaminopropan	3-(3-Morpholinopropylamino)- propylaminophleomycin	8
29	N-(3'-η-Butylaminopropyl)- 1,3-*di aminopropan	3- (j5-N-n-Butyl aminopropyl amino )- propylaminophleomycin	26
	5-Ouanidinopropylamin	I 3-Guanidinopropylamino- ' phleomycin	I 18

ro co

CD ■f>-

-	in cm	VO OJ	«4 2	in Cu	COKN	31046.2	in in	ONKN	\	O
•^-in		-=f in	•=nn	KNrH	in in	-=r in	O
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KN	KN	ΙΛ	KN	CO	KN	O
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KN	KN		co	in tH	CO
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in		CO	o	in	ON
co	ο		KN	KN
^.	in	KN		-=t-	KN
		■^		KN	.=4-

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Pussnote: (1) die antimikrobielle Wirkung wurde durch ein

Zylinder-Agar-Plattenverfahren auf Basis von Bleomycin Ap (kupferfreie Base) angenommen als 1000 U/mg unter Verwendung von Myc-obakterium smegmatis 607 als Versuchsorganismus geprüft.

(2) entwickelt unter Verv/endung von Methanol-10^ Ammoniumacetat-10$ wässriger Ammoniak = 10 :' 9 : 1 und Silikagel G (Warenzeichen für ein Adsorbens für DünnschichtChromatographie, das aus Silikagel und Gips zusammengesetzt ist, hergestellt durch Merck Inc.)

gemessen in destilliertem Wasser.

Welter werden in den Pig. 1 bis 7 die UV-Absorptionsspektren, IB-Absorptionsspektren und ein HMR-Spektnua von einigen Beispielen der in Tabelle I angeführten Verbindungen gezeigt« M.e Fig, 1, 2 und J zeigen die UV-Absorptionsspektren, geiaes- sen in destilliertem Masser, von 3-MorpholinopropylaffiinophleüEßyeiü, J-H-Cycloiiexyl-ajBinopropylarainoplileowycin und 5- (>-M-n-B«tylaBiinopropylajaino ) propylaminophleofflyein. Die Fig. 4, 5 und 6 zeigen die IR-Äbsorptionsspektren, gemessen als Kaliumbromjdtablette, von jS-Morpholinopropylaminophleoi^cln, 3-^-Cyclohe3cylaminopropylaraiiiophleoniycin_> und 3-(3-H-n-Butylaminopropylamino)propylatninophieomyciii. Die Fig. 7 zeigt ein HMR-Spektrura von ^Morpholinopropylaminophleomycin^ gemessen in schwerem Masser bei 100 MHz unter Verwendung von

als äiasserem Standard»

- 19 -309838/1241

Die Prüfung der Antitumorwirkung der neuen Phleomycine, beispielsweise von ^-S^-Dimethylmercapto-propylaminophleomycin und 3-Morpholinopropylaminophleomycin, die durch das erfindungsgemässe Verfahren erhalten wurden, zeigten eine deutliche Verlängerungswirkung auf die Überlebenszeit der ICR-SLC Maus, die mit Ehrlich Ascites Karcinomen beimpft wurde. Dies geht aus den Tabellen II und III hervor. Bemerkenswerter noch ist die Tatsache, dass bei Vergleich der Antitumorwirkung des zuletzt erwähnten Phleomycins mit jener von 3-Morpholinopropylaminobleomycin (Tabelle TV), das die gleiche., endständige Amingruppe, die durch Y in

bezeichnet ist der vorstehenden Formel/wie jene des Phleomycins aufweist, chemotherapeutische Indexe in praktisch gleicher Grössenordnung erhalten wurden. Diese Tatsache scheint die Möglichkeit zu eröffnen, dass die neuen Phleomycine als Chemotherapeutika gegen Tumore, ähnlich wie Bleomycine verwendet v/erden könnten, welche, und darauf wird hingewiesen, wirksame Antitumordrogen, die gegenwärtig für die Therapie schuppenförmiger Zeiltumore und dergleichen verwendet werden, darstellen. /"R.VLSonntag: Cancer Chemotherapy Reports, part 1, 6>6, Seite 197 (1972). A. Yagoda et al: Annals of Internal Medicine, J]_, Seite 861 (1972) J.

Prüfverfahren der Antitumorwirkung

Das Phleomycin wurde an 10 aneinanderfolgenden Tagen in die Peritonealhöhle der ICR-SLC Maus, in die Ehrlich Ascit es Karcinorae eingepflanzt worden waren, verabreicht. 50 Tage nach dem Beginn des Experimentes wurden Messungen zur Ermittlung

1. der Zahl toter Mäuse infolge der Toxizität,

2. der Zahl überlebender Mäuse,

3. der mittleren Überlebenszeit in 50 Tagen, und

309838/■ 1241

- 20 -

- 20 -

4. des Verhältnisses der mittleren Überlebensdauer zu jener der Bezugsmaus multipliziert mal 100 durchgeführt.

Der chemotherapeutische Index wurde aus den EDcq (50 ^ ige wirksame Dosis) und LD₅₀ (50 #-ige lethale Dosis) ermittelt, wie nachstehend angeführt ist. ^

ED_CA-Wert:
50

Die maximale Dosishöhe innerhalb des Bereiches des Lebensdauerverhältnisses von 100 : 200.

LD ,-,,-Wert:
50

Berechnet nach dem Behrens-Kärber-Verfahren auf Basis der Messergebnisse von (1) und (2)

Tabelle II

Antitumorwirkung von ^-Morpholino-propylamino-phleomycin

Dosis mg/kg/ Tag wäh rend 10 Tagen i.p.	(1) Toxizität Anzahl to ter Tiere/ Gesamtzahl	.. (2) Überleben (nach 50. Ta gen) Zahl der überlebenden Tiere/Gesamt zahl	(3) dur ch s chn i 11 - liehe Lebens* dauer (Be reich)	(1O Lebens- dauer- verhält- nis
25.Ο	5/5	0/5	26.2	215
12.5	2/5	3/5	39.2	321

309838/1241

- 21 -

Portsetzung Tabelle II

6.25	0/5	5/5	50.0	410
3.12	0/5	4/5	49.2	403
1.56	0/5	2/5	35.0	287
0.78	, 0/5	0/5	22.8	187
0.39	0/5	0/5	16.2	133
0.19	0/5	0/5	20.6	167
0	0/5	0/5	12.2	100

Chemotherapeutischer Index = LD50 = 15.0 = 19.2

ED₅₀ Ο.78

Tabelle III

Antitumorwirkung von 3-S,S-Dimethylmercaptopropylaminophleomycin.

Dosis	(D	Überleben	(3)	(4)
rog/kg/	Toxizität	(nach 50 Tagen)	Durchschnitt	Lebens-
Tag wäh	Anzahl to	Zahl der über	liche Lebens	dauer-
rend 10	ter Tiere/	lebenden Tiere/	dauer (Be	verhält-
Tagen	Gesamtzahl	Gesamtzahl	reich)	nis
i.p.

30983 8/124 1

- 22 -

- as -

Portsetzung Tabelle III

25.0	5/5	0/5	8.6	59
12.5	5/5	0/5	13.0	89'
6.25	3/5	1/5	33.8	232
3,12	0/5	4/5	44.0	301
1.56	0/5	3/5	36.8	252
O.T8	0/5	2/5	29.0	199
	0/5	0/5	21,0	144
0.19	0/5	0/5	18,0	123
0	0/15	0/15	14,6	100

Chemotherapeutischer Index =

^!5O 6.6

SD₅₀ 0.78

= 8.5

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Tabelle IV

Antitumorwirkung von 3-Morpholinopropylaminobleomycin

Dosis mg/kg/ Tag wäh rend 10 Tagen i.p.	(D Toxizität Anzahl to ter Tiere/ Gesamtzahl	.. (2) Überleben (nach 50 Tagen) Zahl der über lebenden Tiere/ Gesamtzahl	(3) Durchschnitt liche Lebens dauer (Be reich)	(4) Lebens dauer verhält - nis
25.0	5/5	\ 0/5	12.4	102
12.5	4/5	1/5	30.4	249
6.25	2/5	3/5	34.2	28Ο
3.12	0/5	4/5	45.2	370
1.56	0/5	3/5	36.6	300
Ο.78	0/5	2/5	33.0	270
0.39	0/5	0/5	11.8	97
0.I9 .	0/5	0/5	11.8	97
0	0/5	0/5	12.2	100

^LD

Chemotherapeutischer Index =

50 9.4

= 12.1

309838/1241

- 24 -

Die gemäss der Erfindung erhaltenen Antibiotika der Phleotnycingruppe können in entsprechende Bleomycine durch Oxidation mit Oxidationsmitteln in folgender Weise umgewandelt werden.

Ein 'Phleomycin wird in einem Medium aufgelöst, in dem es löslich ist, z.B. Wasser, Methanol etc. und der Lösung ein mildes Oxidationsmittel hinzugefügt. Wird Mangandioxid als Oxidationsmittel verwendet, so wird es in dem Medium dispergiert und bei 0 bis 5O⁰C während 20 bis 24o Stunden umgesetzt.

Das Reaktionsgemisch enthält das gewünschte Oxidationsprodukt, das die teilweise Struktur von 2^f-(2-Aminoäthyl)-2,4^tbithiazol-4-carbonsäure aufweist,und unumgesetztes Material. Um diese zu trennen, wird das Reaktionsgemisch z.B. in Wasser aufgelöst und durch eine mit CM-Sephadex ^ C-25 gefüllte Säule geführt, öle mit Natriumeiüoridlösung zur Adsorption der Bestandteile vorbehandelt wurde. Die adsorbierten Bestandteile werden mit einem Natriutnehlorid-Elutionsmittel eluiert, wodurch das unumgesetzte Material zuerst und sodann die gewünschen Antibiotika der Bleotnyeingruppe eluiert werden. Die die Antibiotika der Bleonjycingruppe enthaltende Lösung "wird einer herkömmliehen Adsorptionsbehandlung durch beispielsweise Hindurchführung durch eine mit aktivierter Kohle gefüllte Säule, unterworfen, Die Säule wird sodann mit Wasser zur Entfernung der anorganischen Salze gewaschen. Sodann wird ein verdünnte Chlorwasserstoffsäure-Acetongeaiiseh durch die Säule zur Elution des gewünschten Produktes geführt« Dem Eluat wird ein basisches Anionenaustauscherharz zur Einsteilung auf einen pH-Wert von 6,0 zugefügt und das Lösungsmittel durch Destillation unter Gewinnung des gewUnsch-

- 25 309838/1241

ten Produktes in Form des Hydrochloride entfernt.

Die antimikrobielle Wirkung und die chemotherapeutischen Indices einer Zahl von Beispielen, von in der vorstehend erwähnten Weise erhaltenen Bleomycinsi sind in Tabelle V wiedergegeben.

Tabelle V

Antimikrobielle Wirkungen der von entsprechenden Phleomycinen abgeleiteten Bleomycine

Nr.	Name des Bleomycins	Wirkung Einheit/ mg .	Chemothe rapeutischer Index
1 2 3 4 5 6 7 8 9	2-N,N-Dime thylaminoäthyI- aminobleomycin 3-N,N-Dime thylaminopropy1- aminobleomycin 3-N,N-Diäthylaminopropyl- aminobleomycin 3-N-(3-Hydroxypropyl)-amino- propylaminobleomycin 3-S,S-Dimethylmercaptopropyl- aminobleomycin 3-N-Cyclohexylaminopropylami- nobleomycin 3-N-(1-Phenyläthyl)aminopro- pylaminobleomycin 3-Pyrrolidinopropylamino- bleomycin 3-Piperidinopropylamino bleomycin	897 806 1036 1021 920 6560 5320 IO66 1257	7.8 20.4 34.5 29.6 12.0 16.3 59.2 I9.2 14.4

309838/1241

- 26 -

Portsetzung Tabelle V

10	3-Morpholinopropylamino ble omy oin	592	21.7
11	3-/"3-N-C-1-Phenyläthyl)- amlnopropylamino 7p^opyl- arainobleomyoin " s	9470	18.I
12	propylatninobleomycin	3286	26.4
13	propylaminobleomycin	358O	16.8
14	3-{3-N-n-Butylaminopropylami no) -propylaminobleomycin	5840	59.2
15	3- (3-N,N-Diine thylaminopropyl- arninö)propylai!iinophleomy,oin	I670	54
16	3- (3-N-Cy el ohexyl aminopropyl- aiaino) propylaminobl eorayoin	i 2,335	39.5
17	3-i3-ii-Benzylajsinopropyl ami no I -propyl aainobleofliyciii	6.000	24.0 .

Fussnotej (1) Bei Prüfung durch ein Zyliiadsr-Ägar-Platten-

Verfahren unter· Verwendung von Myc-obakterium smegBiatis 607 als Versuehsorganismus wurde die Wirkung von Bleomycin A₃ (kupferrreie Base) als 1000 Einheit/ßsg angenommen.

(2) Ein Bleomycin wurde während 10 aufeinanderfolgenden Tagen in die Peritonealhöhle einer ICR-SLC Maus verabreicht, in die Ehrlich Ascites Karzinome eingepflanzt worden waren und 50 Tage nach dem Beginn des Versuches wurde die tatituraorwirieung best-inant.

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- 27 -

Im Vorstehenden wurde das neue Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der Phleomycingruppe unter Bezugnahme auf Streptomyces verticillus als Beispiel von Actinomycetes erklärt. Es muss Jedoch darauf hingewiesen werden, dass die vorliegende Erfindung in gleicher Y/eise auf die fermentative Herstellung von Antibiotika der Phleomycingruppe unter Verwendung der vorstehend erwähnten Actinomycetes wie Streptomyces flavoviridis, Streptomyces humidus und Streptomyces bikiniensis var. zor- -bonensis angewandt werden kann. \

Die Erfindung ist nachgehend im Detail unter Bezugnahme auf die Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Zu 100 Litern eines sterilisierten flüssigen Mediums (pH 7.2), das 0.5 # Glukose, 6.4 % Hirsegelee, 3.5 % Sojabohnenmehl, 0.75$ Mais- bzw. Getreidestärkesaft, 0.2 % NaNO,, 0.8 % NaCl, 0.1 # K₂HPO₁^, 0.05 # ZnSO^ . 7H₂O, 0.01 % CuSO^ . 5H₃O und 0.01 % Toho Nr. 1^ enthielt, wurde eine sterilisierte wässrige Lösung, die 50 g N-(3-Aminopropyl)-morpholindihydrochlorid (500 mcg/ml des Mediums) enthielt, zugefügt. Das resultierende Kulti-vierungsmedium wurde mit Streptomyces verticillus 843-1 (ATCC 21890) beimpft und einer belüfteten Kultivierung bei 27°C unterworfen. Die Erzeugung des Phleomycins erreichte das Maximum am fünften Tag.

Die Nährlösung wurde unter Erhalt von 90 Liter Kultivierungsfiltrat filtriert. Das Filtrat wurde durch eine mit 10 1 Amberlit® IRC-50 (H⁺ Typ) gefüllte Säule zur Adsorption des Phleomycins, das erzeugt worden war, geführt. Sodann wurde die Säule mit destiinertem Wasser und sodann mit 50 $-igem wässrigen Ace-

309838/12A1 .287

ton gewaschen -und mit einem 1 n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton (l : 1) Gemisch eluiert. 7·8 1 einer aktiven Fraktion der ausgeströmten Lösung wurden unter vermindertem Druck destillativ von dem Aceton befreit und durch eine Säule zur Adsorption des Phleomycins geführt, die mit 1.0 1 einer aktivierten Kohle (aktivierte Kohle für die Chromatographie, hergestellt durch Wako Junyaku Co.) gefüllt war. Die EIution wurde mit destilliertem V/asser, 50 ^-igem wässrigem Aceton und einem 0.02 n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton- (1:1) Gemisch in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt. Die aktiven Fraktionen (3·7 l) hauptsächlich von dem 50 ^-igen wässrigen Acetoneluat, wurden zur Trockene unter verringertem Druck unter Erhalt von '9·6 g eines rohen,braun gefärbten Pulvers konzentriert. Das rohe Pulver wurde in 100 ml 80 $-igeiB wässrigen Methanol aufgelöst,, durch Filtration von tanlöslicheB Materialien abgetrennt und durch eine Säule, die mit 50 al uetitraleia Altasiiaitsnoxiil /J^ _Q1<. {800 fflesh|/ gefüllt war, zur Absorption der aktiven Komponente geführt. Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt.

Die blauen Fraktionen des Abflusses wurden gesammelt und zur Trockene unter Erhalt von 4.73 S eines rohen bläulieh grün gefärbten Pulvers zur trockene eingedampft, Das rohe Pulver wurde erneut in destilliertem Wasser aufgelöst und durch eine mit 550 ml Sephaüei^G-25 gefüllte Säule geführt. Sodann wurde die Säule mit destilliertem Wasser eluiert und die bläuen Fraktionen des Ausflusses gesammelt, Bei der Gefriertrocknung ergaben die blau-en Fraktionen 1.05 S eines blauen Pulvers das 3-MorpholinopropylaMinophleofflycin (kupferhaltiges Hydrochlrldsalz) als Hauptbestandteil enthielt.

- 29 309838/1241

Das vorstehend angeführte blaue Pulver wurde in einer 0.1 molaren, wässrigen Natriumchloridlösung aufgelöst und durch eine Säule, die mit 100 ml CM Sephadest- G-25 (Na⁺ Typ) gefüllt war, zur Adsorption der aktiven Komponente geführt. Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmittel bewirkt. Die blauen Fraktionen des Ausflusses wurden durch eine mit 35 ml einer aktivierten Kohle gefüllte Säule zur Adsorption jdes vorstehend erwähnten Phleomycins geführt. Nach erfolgtem Waschen mit Wasser wurde die Säule mit V/asser, 50 #-igem wässrigen Aceton und 0.02 n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton (1 : 1) Gemisch in der^angegebenen Reihenfolge eluiert. Das Phleomycin wurde hauptsächlich in dem 50 $-igen wässrigen Acetoneluat aufgefunden, welches zur Trockene unter Erhalt von 467 mg eines blauen amorphen 3-Morpholino-propylaminophleomycinpulvers zur Trockene konzentriert wurde.

Beispiel 2

Jeweils 100 ml aus den 5 1 des flüssigen, in Beispiel 1 erwähnten Mediums wurden in 50 500 ml Erlenmeyer-Kolben eingegeben und sterilisiert. Zu jedem Kolben wurde eine sterilisierte wässrige Lösung von 3-Aminopropyldimethylsulfoniumdihydrobromid derart zugegeben, dass dessen Konzentration in dem Kolben 2v000 meg pro ml Medium betrug. Jeder der Kolben wurde mit Streptomyces verticillus 843-1 beimpft und auf <
Tagen inkubiert.

beimpft und auf einem Drehschüttler bei 27°C während 8

Die Kulturlösung in jedem Kolben wurde filtriert und 3.6 der kombinierten Filtrate durch eine mit 300 ml aktivierter Kohle gefüllte Säule zur Adsorption des Phleomycins, das

309838/1241 - 30 -

erzeugt worden war, geführt. Sodann wurde die Säule mit destilliertem Wasser, 50 #-igem wässrigen Aceton und einem 0.02 n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton (1:1) Gemisch in der angegebenen Reihenfolge eluiert. Das 50 ^ige wässrige Acetöueluat {1650 ml), in der sich die aktive Komponente überwiegend angesammelt hatte, wurde zur Trockene unter Erhalt von 2.08 g eines braun gefärbten rohen Pulvers konzentriert« Das rohe Pulver wurde succsesiv einer Aluminiumoxid- und SephadedP G-25 Säulenchromatographie in 'ähnlicher Weise wie In Beispiel 1 unter Erhalt von I83 mg eines blauen Pulvers unterworfen, das ^-SiS-Dimethyl-mercaptopropylaminophleomyoin als Hauptbestandteil enthielt. Das Pulver wurde weiter einer säulenehromatographie unter Verwendung von CM-Sepha- aeiß C-25 (Na⁺ Typ) in ähnlicher Weise zu Beispiel 1 unter Erhalt von 120 rag eines blauen amorphen Pulvers von 5-3,S-Biffiethylmercapto-propylaminophleoiByüin (kupferhaltiges Hydrochlorid) unterworfen.

Beispiel 3

Eine Schüttelkultivierung wurde in der gleichen Weise wie In Beispiel 2 durchgeführt» mit der Ausnahme, dass N-{3^?- ^-Methylbenzylaminopropyl5-l,3-diaminopropan derart hinzugefügt wurde, so dass dessen Konzentration in dem Medium 1*000 fflcg/jal betrug»

In einer zu Beispiel 1 ähnlichen Weise wurden 5·0δ 1 des Kultttrlösungsfiltrates unter Erhalt von 78 mg von 5-/~5-S-(I-Phenyl-äthylJ-aininopropylaJBino^/p^opyla^inophleoH^cin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

- 31 -309838/1241

-sr

Beispiel 4

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 mit der Ausnahme durchgeführt, dass ^-Amidino-propyl· amindihydrochlorid derart zugefügt wurde, dass dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2.000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 1 ähnlicher Weise wurden 4.2 1 des Nährlösungsfiltrates unter Erhalt von 110 mg eines blauen amorphen Pulvers von 3-Amidinopropylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) behandelt.

Beispiel 5

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie in
Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, dass
>-Aminopropyltrimethylammoniumdihydrochlorid derart zugesetzt wurde, dass dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2.000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 1 ähnlicher Weise wurden 3·4 1 des Kulti- vierlösungsfiltrates unter Erhalt von 95 mg J5-N,N,N-Trimethylaminopropylaminophleomycinchlorid (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 6

Die Schüttelkultur bzw. -kultivierung wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2, Jedoch mit der Ausnahme durchge-

309838/1241

führt, dass J5~N,N-Dimethylaminopropylamindihydrochlorid derart zugefügt wurde, dass dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2,000 mcg/rnl betrug.

In₍einer zu Beispiel 2 ähnlichen Weise wurden 3*8 1 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 113 mg eines blauen Pulvers von 3-N,N-Dimethylaminoprⁱopylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) behandelt.

Beispiel 7

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, dass 2-N-N-Diäthylaminoäthylamin-dihydrochiorid zugefügt wurdervsodass dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2.000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 2 ähnlicher V/eise wurden 3·5 1 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 75 ^S eines blauen amorphen 2-N, N-Diäthylaminoäthylamiiiophleoinyöinpulvers {kupferlialtiges Dihydrochloriä) behandelt*

Beispiel 8

Die SeMittelkultur wurde in der gleichen Weise wie In Beispiel 2, mit täer Ausnahme jedoch durchgeführt, dass 4-{2-Aminoäthyl)-imiäazoldihydroelilorid derart zugefügt wurde, dass dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2,000 Bio&/ml betrug,

In zn Beispiel 2 ähnlicher Weise warden 3·7 1 des KuIturlösungsfiltrats unter Erhalt von 127 &ig ^on 2~Imidazol-

309838/1241

A-yl)-äthylaminophleomycin (kupferhaltiges. Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 9

Jeweils 100 ml von 5 1 des flüssigen Mediums, das in Beispiel 1 erwähnt wurde, wurden in 50 500 ml Erlenmeyer-Kolben eingeführt und sterilisiert. Jeder Kolben wurde mit Streptomyces verticillus 843-1 beimpft und in einem Drehschüttler bei 27°C inkubiert. Nach 48 Stunden von Beginn der Kultivierung wurde eine sterilisierte wässrige Lösung von N-(3^f -n-Butylaminopropyl)-l,3-diaminopropartri-hydrochlorid jedem Kolben derart zugefügt, dass dessen Konzentration in dem Kulturmedium 500 mcg/ml betrug. Die Kultivierung wurde' für weitere 6 Tage fortgesetzt.

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 4.28 1 des KuIturlösungsftitrates unter Erhalt von 130 mg 3-(3-N-n-Butyla mino-propylamino)propylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 10

Die Schüttelkultur wurde in zu Beispiel 9 ähnlicher Weise unter Verwendung von 50 Kolben begonnen. Zu jedem Kolben wurde eine sterilisierte wässrige Lösung von 50 mg N-(3-Amino-propyl)piperazintrihydrochlorid portionsweise am Tag des Beginns des Experimentes und am ersten, zweiten, dritten und vierten Tag hinzugegeben. Die Kultivierung wurde ins-

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gesamt während 8 Tagen durchgeführt.

In zu Beispiel 2 ähnlicher V/eise wurden 3.9 1 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 65 mg 3~Piperazinopropylamino-phleo~ tnycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Bezugsbeispiel:

Es wurde 3-Morpholinopropylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) mit einem Absorptionsmaximum von E J³ I50

bei 244 m/U und dem anderen Absorptionsmaximum von E J^ bei 300 m.u und einer Endabsorption des ultravioletten Abs οrptionsspektrums in destilliertem Wasser verwendet. 20 mg pulverförmiges 3-Morpholinopropylaminophleomycin wurde in 1 ml Wasser aufgelöst und in der Lösung wurden 20 mg Mangandioxid suspendiert und bei Raumtemperatur während 40 Stunden unter Rührung umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgesiiseh filtriert und das Filtrat durch eine Säule, die mit CM-Sephadex® C-25,gefüllt und mit -0.05 m Natriumchloridlösung vorbehandelt war, zur Adsorption des Reaktionsproduktes geführt. Sodann wurde die Konzentration der Matriuiachloridlösung als elulerendes Medium linear von 0.05 la zu lsi zur Elution des Reaktionsproduktes erhöht * Als Ergebnis wurde unumgesetztes ^-Morpholinopropylaminophleo-•myein in der Fraktion des 0.50 m Matriumchloridlösungelutionsmitteli und das Reaktiousprodukt 3-MorphoIinopropylamijiobleomyein in der Fraktion des 0.35 m Uatriumchloridelutionsmitteiseluiert. Die zuletzt-genannte Fraktion wurde durch eine Säule, die mit einem ml aktivierter Kohle gefüllt war

.- 35 309838/1241

zur Adsorption von 3-Morpholinopropylaminobleomycin Geführt. Sodann wurde die Säule mit Wasser zur Entfernung der anorganischen Salze gexvasehen und ein Eluiermittel aus 0.02 n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton (l : 1) Gemisch wurde durch die Säule unter Elution einer hlauen Lösung, die 3-Morpholinopropylarainobleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) enthielt, geführt.

Dowex 44 (OH" Typus) (Warenzeichen für Anionenaustauscherharz, hergestellt durch Dow Chemical Comp.) wurde dem Eluat . zugefügt um auf einen pH-Wert 6.0 einzustellen und das Elutionsmittel wurde filtriert und das Lösungsmittel verdampft und unter Erhalt von 14 mg blauem 3-Morpholinopropylaminobleomycinpulver,(kupferhaltiges Hydrochlorid) getrocknet.

Die resultierende Verbindung besitzt das spezifische ultraviolette Absorptionsspektrum, xvelches für Bleomycin charak-

l/£ teristisch ist und vielst ein Absorptionsmaximum von E C

1% bei 244 m/U und das weitere Adsorptionsmaximum von E ^ bei 293 m/U und eine Endabsorption in destilliertem Wasser auf.

Die resultierende Verbindung besitzt einen Rf Viert von O.65 bei Silikageldünnschichtchrornatographie (CH OH : 10 #- CH,COONH^ : 10 ^-NH^OH = 10 : 9 : 1) und einen Rf Wert von 0.53 bei Aviceldünnschi cht Chromatographie (n-C-,Η,,ΟΗ : Pyridin : CH₃COOH : H₃O = 15 : 10 : 3 : 12), welches die gleichen wie die von 3-Morpholinopropylaminophleomycin sind.

Die antimikrobielle Wirkung gegenüber Mycobakterium smegmatis 607 nach dem Zylinder-Agar-Platten-Verfahren. (Standard kupferfreies Bleomycin A₃ freie Base, 1,000 u/mg) betrug 605 U/mg.

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- 36 -

Claims (1)

1. Patentansprüche

   Neues Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der Phleomycingruppe durch Beimpfung eines Nährmediums mit Actinomycetalen, die zur Erzeugung von Antibiotika der Phleomycingruppe fähig sind, Aussetzung des beimpften Mediums in aerobe Kultivierungsbedingungen, und Gewinnung der erzeugten Antibiotika aus der Kulturlösung in bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Kulturmedium ein Amin hinzufügt, das durch die allgemeine Formel

   - H.

   ist, worin B Ψ

   fl^f j^~, <C >N**

   (CH^)^ U-,

   bedeuten {worin R₂ eine niedrige Alkyl-, Methoxypropyl-, i^drosypropyl-, eine Halogeiipropyl-, eine Allyl-, Cyclohexyl-_# Benzyl- oder Φ -Methylbenzylgruppe bedeuten, und und Bj^ niedrige Alkylgruppen darstellen) R₁ ein Wasser-

   30983B/1241

   -»·-. 2 31 O A 6 2

   stoffatom oder die 3-Aminopropylgruppe darstellt und η = 2 oder 3 ist, um Antibiotika der Phleomycingruppe zu erzeugen, die eine Seitenkettenstruktur aufweisen, die dem Amin entspricht.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Antibiotika der Phleomycingruppe Phleomycine darstellen.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η τ zeichnet, dass man als Stamm der Antibiotika der Phleomycingruppe erzeugt einen unter Streptomyces verticillus 843-1 (ATCC 21890) und Streptomyces flavoviridis MC 637.SYl (ATCC 21 892) verwendet.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stamm,der Antibiotika der Phleomycingruppe erzeugt, Streptomyces verticillus 84>1 (ATCC 2I890) verwendet.

   5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Menge des hinzuzufügenden Amines von 500 bis 2000 incg pro ml des Kulturmediums verwendet.

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Amin innerhalb 48 Stunden von Beginn der Kultivierung an hinzufügt.

   7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeich net, dass man die Kultivierung bei 25 bis 35°C während 4 bis 7 Tagen im Fall einer belüfteten,

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   untergetauchten Kultur in einem Fermentationstank durchführt.

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeich net, dass man die aerobe Kultivierung bei 25 bis 35°C während 8 bis 10 Tagen im Falle einer Schuttelkultür in einem Kolben durchführt.

   Phleomycine einer Struktur, die durch die Formel

   * ClI

   /T

   '2 CH^ N.

   N ³ H

   ■ U 2

   QH

   H-C' ΐΓ^-c OH ' H

   f

   I!

   O CH X CH MH Π I Ii I I CH O CH CH

   Ν^^!-Η H

   H 5^Η3

   CH₂OH .0H

   ^Χ2

   O I!

   CsV

   wiedergegeben sind^worin Y -JiH-

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   -B oder -HH-

   - 39 -

   R.

   (CH₀K-NH-(CH₀) -R bedeutet, worin R R₀-Mi-,

   NH NH

   Il Il

   ^)Jn-, h₂n-c-, H₂N-C-NH-, (Ch^)₂ = s-,

   V.

   -, HN_n

   :n-, ο

   N-, oder

   darstellt (worin Rp eine niedrige Alkyl-, Methoxy- -propyl-, eine Halogenpropyl-, Allyl-, Cyclohexyl-, Benzyl- oder ^-Methylbenzylgruppe und R^. und Rl niedrige Äkylgruppen darstellen und η 2 oder 3 bedeutet).

   10. Antibiotika der Phleomycingruppe, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 1.

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