DE2301800C3 - Verfahren zur Erweiterung des Schärfentiefebereiches bei der optischen und elektronenmikroskopischen Abbildung - Google Patents

Description

' = on

beschrieben werden kann und wenn b) die übertragungsfunktion D bekannt ist. Siehe dazu auch »Opt. Ada« 5, 1958, S. 256. In (2) sind Ö, Ö' die

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erwei- Ortsfrequenzspektren des Objektes bzw. des Bildes, terung des Schärfenliefebereiches bei der optischen Das Objekt O läßt sich dann aus dem Bildspek-

und elektronenmikroskopischen Abbildung. Der 60 trum mit
Schärfentiefebereich Ir erreichnet sich bei der konventionellen Abbildung aus der geforderten auflös- O =
baren Distanz Iv zweier Objcktpunklc nach

Ö'
D

Ir <

(I)

65 durch Fouriertransformation auf optischem Wege ermitteln, wie in »Opt. Spectra«. 1971. S. 31 beschrieben. Da bei der Abbildung eines in der Tiefe ausgcwobei /. die Wellenlänge der bei der Abbildung dehnten Objektes die übertragungsfunktion für jede

Objektebene eine andere ist, läßt sich eine Rückverschärfung nach (3) hier zunächst nicht anwenden (s. dazu auch H. H. Hopkins in »Proc Roy Soc«. A 231 [1955], S. 91).

Im ersten Schritt des zu patentierenden Verfahrens wird deshalb zunächst ein modifiziertes Bild des Objektes erzeugt, bei dem Einzelheiten jeder Objektebene mit annähernd der gleichen übertragungsfunktion abgebildet werden, und dieses Bild wird im zweiten Verfahrensschritt einer kohärenten Ortsfrequenzfilterung unterworfen.

Weitere Erläuterungen werden an Hand der Figuren gegeben. Es zeigt

Fig. 1 schematisch das Prinzip der Integration Suren Bewegung des Objektes entlang der optischen Achse,

Fig. 2a bis 2c die Übertragungsfunktion Tür den — bezüglich der Tiefe Randpunkt des Objektes bei verschiedenen Objekttiefen I«, wobei der Integrationsbereich ±it, 10, 20 und 50 optische Einheilen betrügt.

Wie F i g. 1 zeigt, wird das Objekt mit der Tiefe 2 Ir symmetrisch zur Ebene der scharfen Abbildung um die Strecke 2 z, bewegt. Das Objekt wird inkohärent beleuchtet und die Intensität in der Bildebene integriert. Damit der Abbildungsmaßstab unabhängig von der Defokussierung wird, muß der Strahlengang objcktseitig telezentrisch sein.

Wird zur Integration ein linearer Empfänger benutzt, so läßt sich die übertragungsfunktion dieses Prozesses aus dem Integral über alle Ubertragungsfunktionen abhängig von der Defokussierung errechnen:

Für den Objektpunkt 2 (bezüglich der Tiefenausdehnung des Objektes in der Mitte gelegen) wird die übertragungsfunktion des integrierten Bildes

D-

i, = Λ/ ■ J

Diz)dz.

(4)

40

S. 38). Das ist erkennbar aus den Diagrammen der Fig. 2a,_2b, 2c. In ihnen ist die übertragungsfunkiion D₁ für den Randpunkt bei verschiedenen Objekttiefen 12 über der normierten Ortsfrequenz S aufgetragen.

Verschiebungen auf der optischen Achse sind in optischen Einheiten angegeben: Die Größen z, und Iz werden durch Gleichung(6) mit «, und In verknüpft:

a = -k-z- sin²«.

Dabei ist k = 2 .τ//, und sin u die Apertur des abbildenden Systems. Je größer die Objekttiefe relativ zum Integrationsbereich wird, desto mehr weicht die übertragungsfunktion der Randebene von der der mittleren Objektebene ( \« = O) ab. Die Abweichung ist jedoch, wie die Diagramme zeigen, zu vernachlässigen, wenn die Objekttiefe nicht wesentlich größer als der halbe Integrationsbereich wird: Es ist kein Unterschied zwischen der Abbildungsqualität verschiedener Objektebenen erkennbar.

Damit ist das Ziel des ersten Schrittes erreicht. Es wurde ein modifiziertes Bild des Objektes hergestellt, wobei alle Objektebenen mit der gleichen übertragungsfunktion abgebildet werden.

Das wie beschrieben erzeugte inkohärend integrierte Bild wird im zweiten Schritt einer kohärenten Ortsfrequenzfilterung nach (3) unterworfen. Das Filier muß den Kontrast bei hohen Ortsfrequenzen anheben, der durch den ersten Schritt nach den Fi g. 2 a bis 2 c verringert wurde. Dies gelingt, wenn der Frequenzgang des Rückverschärfungsfilters proportional _der reziproken übertragungsfunktion l/D, * 1/D₂ ist. Da die übertragungsfunktion des integrierten Bildes vom Integrationsbereich abhängt, ist das Rückverschärfungsfilter auf den geforderten Schärfentiefebereich bzw. auf die Apertur des abbildenden Systems abzustimmen.

(N = Normierungsfaklor)

Für den bezüglich der Tiefe Randpunkt
wird die übertragungsfunktion

I), -- N

j D[z)dz.

(5)

Wenn keine Aberrationen vorliegen, gilt für den anderen Randpunkt 3 D, = D₂. Es genügt also, die Ubcrtragungsfimktioncn für die Objcklpunktc 1 und 2 gleich (bzw. möglichst ähnlich) zu machen, damit Purktc aller Objektebenen mit gleicher oder ähnlicher übertragungsfunktion abgebildet werden. Offensichtlich wird dieses Ziel erreicht, wenn der Integrationsbercieh t z, sehr viel größer ist als die Ticfcn.iusdchnimg ± Iz des Objektes. Um ein großes Signal-Rauschverliältnis zu erzielen, sollte jedoch die Verschiebung in Richtung der optischen Achse möglichst klein bleiben. Die Rechnung ergibt, daß die Differenz der übcrlragimgsfunklioncn D, und D₂ vernachlässigbar wird, wenn der Inlegrationsbcrcich etwa doppelt so groß wie die Objekllicfe ist (s. dazu auch Ci. Häusler in »Opi. Comni.«. 6 | 1972].

Vorteile des Verfahrens

Mit der Erfindung ist eine Erweiterung des Schärfentiefebereiches bei im Prinzip nicht verringerter Abbildungsqualitäl und Auflösung möglich. Der Grad der über die konventionelle Abbildung vielfach hinausgehenden Erweiterung hängt wesentlich nur vom Rauschen des zur Integration verwendeten Speichermaterials ab. In Vorversuchen mit Hilfe photographischcr Integration wurde eine 25fache Erweiterung des Schärfcntiefebereichcs erzielt. Eine weitere Steigerung erscheint möglich.

Das Rückverschärfungsfilte·- hat einen reellen Frequenzgang ohne Nullstellen. Das ist ein entscheidender Vorteil für die praktische Anwendung: Es ist mit geringem Aufwand optisch oder elektronisch zu realisieren. Dazu gehört auch, daß das Filter bei höheren Ortsfrequenzcn einen linear ansteigenden Frequenzgang hat.

Da die Bedingung »Objekttiefe gleich halber InIcgralionsbcreich« nicht genau eingehalten werden muß (s. F i g. 2). genügt für die praktische Anwendung ein Satz weniger Filter, um Objekte mit verschiedenen Tiefen zu verarbeiten.

Für die praktische Durchführung werden folgende Methoden beschrieben:

23 Ol 800

I. Anwendung auf das Lichtmikroskop im
off-line-Verfahren

Der erste Schritt, die Urzeugung des integrierten Bildes, eifolgl durch zeitlich gleichmäßiges Diirchfokussicrcn um eine Strecke etwa doppelt so groß wie die Objcktlicfc symmetrisch zur Mittenebene des Objektes. Während des Fokussierens etwa durch Motorantrieb des Feintriebes am Mikroskop wird in der Zwischenbildebenc eine Fotoplatte belichtet. Die Platte wird mit γ = -2 umkchrenlwiekclt und im zweiten Schritt einer kohärenten Filterung unterworfen. In der Brennebene der Fouriertransformationslinse der Filieranordnung entsteht das Spektrum des integrierten Bildes. In diese Ebene wird ein Hochpaßfiltcr gebracht, dessen Amplitudentransparenz proportional

I ID₂ = 2«₁.s-/Si(.i,.v(2-.s·))
(Si bedeutet Intcgralsinus)

(7)

ist. wenn konstanter Kontrast für alle Ortsfrcqueiizen erzielt werden soll. Die Filtercharakteristik hängt von der Verschiebung «, während der Aufnahme ab. Line ausreichende Näherung ist ein frequenzlincarer Hoehpaß. der zusätzlich einen Glcichanteil nach (7) durchläßt.

Soll durch die Filterung eine übertragungsfunktion proportional zu 1 — v/2 erreicht werden, so wird die Amplitudenlransparenz des Filters proportional

XiD₁ --- ,/,N (2 -.s-)/Si(a,s(2-.s·)).

Die vorliegenden Ergebnisse sind wegen der geschlossenen Darslcllungsniöglichkeil für eine quadratische Apertur angegeben. Sie unterscheiden sich von den numerischen Werten für die runde Pupille nur unwesentlich.

Das Filter kann etwa durch eine Photoplattc realisiert werden, die über eine rotierende Schablone so belichtet wurde, daß die Amplitudcntransparenz proportional /u (7) oder (8) wird. Phascnstörungcn werden durch Immersion kompensiert. In der Ausgangsbildcbene der Iilteranordnung entsteht dann das gefilterte Bild mit tiesleiuerlcm Schärfenticfebcreich.

2. Anwendung bei Fchlzeitverfahien

Für ein Fchtzeitverfahrcn. bei dem die phologr;:- phischc Verarbeitung entfällt, wird das Präparat auf

-^s einem Objekttisch montiert, der in Richtung der optischen Achse eine Dreieckschwingung ausführt: Die Schwingungsweite ist gleich der doppelten Objckttiefe. Die Schwingung erfolgt symmetrisch zur Mittenebene des Objektes.

ίο Das integrierte Bild wird auf der Kathode einer Fcrnsehaufnahmcröhrc (z. B. Image-Orthikon) erzeugt, wenn die Schwingungsfrequenz de? Objekttisches deich der Abtastfrequenz der Kamera ist. Das Videosignal enthält die Information über das integricrtc Bild. Im zweiten Schritt wird das Videosignal einer passenden Hochpaßfilterung unterworfen. Der Frequenzgang des Filters wurde unter 1 beschrieben.

Auf einem Monitor kann ein Bild des Objektes

mit gesteigertem Schärfcntiefebcreich beobachtet werden.

Bei diesem Verfahren ist die Filterung nur in Zeilenrichtung vollständig. Konturen, die nicht senkrecht zur Zcilenrichtung verlaufen, werden um so unvollständiger gefiltert, je mehr sie in Zeilenrichtung verlaufen. Da Tür den Bildeindruck dieser Nachteil nicht schwer wiegt, kann auf eine prinzipiell mögliche zweite Filterung senkrecht zur ersten verzichtet werden.

Der Vorteil des elektronischen Verfahrens besteht

ίο darin, daß der Frequenzgang des elektronischen Filters leicht zu verändern ist. Deshalb ist bei Objcktivwechscl oder verändertem Schärfentiefebereich die Anpassung schnell möglich. Durch die Echtzcitverarbeitung kann das Filter auch nach dem besten visuellen Bildeindruck eingestellt werden.

3. Echtzeitverfahren mit phototropem Material

Das Objekt wird mit Hilfe eines Schwinglischcs nach 2 bewegt. Das integrierte Bild wird durch Ausbleichen eines vorher geschwärzten photolropen Materials in der Zwischenbildebene des Mikroskops erzeugt. Das Auslesen der Information und die Filterung erfolgt nach 1 durch kohärente Filterung bei einer Wellenlänge, die keine schwärzende oder bleichende Wirkung auf das phototropc Aufnahmemat.erial hat.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (9)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Vergrößerung des Schärfentiefebereiches über die durch die konventionelle Abbildung gegebene Grenze hinaus, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt durch überlagerung verschiedene defokussierter Bilder zunächst ein modifiziertes Bild des Objektes erzeugt wird, bei dem alle Objektebenen mit nahezu der gleichen übertragungsfunktion abgebildet werden, und daß im zweiten Schritt das so gewonnene Bild einer Hochpaßfilterung unterworfen wird, die den entstandenen Kontrastabfall bei hohen Ortsfrequenzen kornpensiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die überlagerung ein photographisches Aufnahmematerial verwendet wird und die Rückverschärfung durch kohärente optische Filterung erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die kohärente Filterung mit verschiedenen Filtern je nach der zu verarbeitenden Objekttiefe vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die überlagerung mit Hilfe einer Fernsehaufnahmeröhre erfolgt, während das Objekt auf einem Schwingtisch mit passender Frequenz in Richtung der optischen Achse bewegt wird, und daß die Filterung im zweiten Schritt durch passende Filterung des Videosignals erreicht wird.

5. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die überlagerung mit Hilfe eines photochromen Speichermateiials erfolgt, welches im zweiten Schritt das Objekt der kohärenten optischen Filterung wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei elektronenmikroskopischer Abbildung die Schärfentiefe vergrößert wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei elektronenmikroskopischer Abbildung die Fokussierungstoleranz vergrößert wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen I bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Schärfentiefe bei Blasenkammeraufnahmen vergrößert wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Schärfentiefe bei Röntgenschichtaufnahmen vergrößert wird.

benutzten Strahlung ist. Soll die Auflösung verdoppelt, also Ix halbiert werden, so folgt aus (I), daß der Tiefenbereich Iz, in dem die Abbildung scharf ist, auf ein Viertel halbiert wird. Erfindungsgemäß wird der Schärfentiefebereich über die durch (1) gegebene Grenze der konventionellen Abbildung hinaus wesentlich erweitert. Damit wird die Foderung nach hoher lateraler Auflösung und gleichzeitig hohem Schärfentiefebereich erfüllt. Dies ist allgemein bei der Abbildung mit hoher Apertur, speziell bei der mikroskopischen Abbildung von besonderem Interesse.

Es ist aus der DT-PS 10 29591 und aus der Zeitschrift »Applied Optics«, Jahrgang 1971, S. 208, daß durch Abtastung des Objektes in Tiefenrichtung eine Erweiterung des Schärfentiefebereiches erzielt werden kann. Dabei werden die verschiedenen Ebener, des Objektes periodisch durchfokussiert. Geschieht dies schnell genug, so überlagern sich die zeitlich nacheinander entstehenden Bilder: Der Beobachter erkennt Objekteinzelheiten in einem erweiterten Tiefenbereich.

Das Integrieren der Intensität über verschiedene ObjeKtebenen hat schwerwiegende Nachteile, die seine praktische Anwendung verhindern: Das integrierte Bild besteht aus der überlagerung mehr oder weniger unscharfer Bilder, darunter auch während einer kurzen Zeitspanne das scharfe Bild einer Objekteinzelheit. Die dem scharfen Bild überlagerten unscharfen Bilder verringern die Qualität des so erzeugten Bildes. Der Kontrast bei hohen Ortsfrequenzen wird niedrig, kleine Objekteinzelheiten werden nur unvollkommen wiedergegeben. Die Zusatzinformation über vorher nicht scharf wiedergegebene Objektebenen ist auf Kosten der vorher scharf abgebildeten Objekteinzelheiten gewonnen worden.

Aufgabe der Erfindung ist die Erweiterung des Schärfentiefebereiches bei vernachlässigbarer Einbuße an Bildqualität. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch einen Zweistufenprozeß gelöst, bei dem in einem ersten Schritt durch überlagerung verschieden defokussierter Bilder .;unächst ein modifiziertes Bild des Objektes erzeugt wird, bei dem alle Objektebenen mit nahezu der gleichen übertragungsfunktion abgebildet werden, und daß im zweiten Schritt das so gewonnene Bild einer Hochpaßfilterung unterworfen wird, die den entstandenen Kontrastabfall bei hohen Ortsfrequenzen kompensiert.

Das Verfahren geht von der Erkenntnis aus, daß ein von einem System mit geringer Qualität übertragenes Bild verbessert werden kann, wenn a) der Ubertragungsprozeß durch eine Gleichung nach