DE2263289C3

DE2263289C3 - Process for the preparation of carrier-bound polypeptides

Info

Publication number: DE2263289C3
Application number: DE19722263289
Authority: DE
Inventors: Dieter Dipl.-Chem. Dr. 6500 Mainz; Lehmann Klaus Dr. 6101 Roßdorf; Pleiner Hermann Dipl.-Chem. Dr. 6100 Darmstadt Krämer
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Filing date: 1972-12-23
Publication date: 1976-07-15

Description

Die Anwendung trägergebundener Kiweißkörper gewinnt in Wissenschaft und Technik immer größere Bedeutung, da sie es auf die einfachste und sichersle Art gestatten. Wirkstoffe und Substrate nach ihrer Umsetzung wieder /u trennen. Aus diesem Grunde haben sich zahlreiche Eritwicklungslaboratorien /um Ziel gesetzt, Trägerkörper für proleinarlige Wirkstoffe zu entwickeln, die Eiweißstoffe aus wäßriger Lösung möglichst rasch und vollständig unter größtmöglicher Erhaltung ihrer biologischen Wirksamkeit aufnehmen und den Wirkstoff bei der Anwendung nicht wieder freisetzen. Nach der ansatzweisen Einwirkung auf ein Substrat soll der trägergebundene Wirkstoff durch Filtration schnell und restlos von der Substratlösung abtrennbar sein, und eine Schiiltung des Materials soll eine hohe Durchflußgeschwindigkeit bei kontinuierlichem Betrieb gestatten. Nachdem erste Präparate, die an synthetische oder vorbehandelte natürliche Makromoleküle gebundene Wirkstoffe, z. B. Enzyme, enthielten, noch als recht unvollkommen anzusehen 'varen, liegen als Ergebnis jahrelanger Entwicklungsarbeiten nun Produkte mit hohem Gehalt an aktiven Wirkstoffen und guter Fillrierbarkeit vor. ίο Bestimmte Nachteile dieser Produkte wurden bisher als grundsätzlich unvermeidbar angesehen. Die Trägerstoffe enthalten Gruppierungen, die gegenüber Polypeptiden, insbesondere deren end- und seitenständigen Aminogruppen, reaktiv sind und damit unter Bildung einer Amidgruppe zu reagieren vermögen. Diese Gruppen, wie z.B. Carbonsäureanhydride Carbonsäurechlorid- oder Phenylester-Gruppierungen, sind wassereniplindlich und werden zu einem beträchtlichen Teil hydrolysiert, bevor sie mit dem Eiweißkörper in Reaktion treten. Durch die Hydrolyse entstehen Carboxylgruppen, deren negative Ladungen bei der späteren Umsetzung mit ebenfalls negativ geladenen Substratmolekülen hinderlich sein können und außerdem die Matrixeigenschaften des Trägers erheblich verändern. Andere funktionell Gruppen, bei deren Hydrolyse keine Carboxylgruppen, sondern Amino- oder Hydroxylgruppen entstehen, reagieren so träge, daß es zur Bindung von Proteinen außerordentlich langer Reaktionszeiten oder aktivitätschädigender Reaktionsbedingungen bedarf. Weiterhin geht t.H der rbeiTiihrung der häufig funklionswichtigen basischen Aminogruppen eines Eiweißkörpers in nichtbasische Amidgruppen die biologische Wirksamkeit in vielen Fällen verloren, so daß stets nur derjenige Anteil des Wirkstoffes im gebundenen Zustand aktiv bleibt, bei dem die Bindung mehr oder wenig zufällig an einer nicht funktionswesentlichen Aminogruppe stattgefunden hat.The use of carrier-bound protein bodies is gaining more and more importance in science and technology Meaning as they allow it in the simplest and most secure way. Active ingredients and substrates according to their Implementation again / u separate. For this reason, numerous development laboratories have established themselves The aim is to develop carriers for proleinar active ingredients, the proteins from aqueous Solution as quickly and completely as possible while preserving its biological effectiveness as much as possible and do not release the active ingredient again during use. After the rudimentary exposure The carrier-bound active substance is to be removed from the substrate quickly and completely by filtration The substrate solution should be separable, and a layer of the material should result in a high flow rate Allow in continuous operation. Having first preparations sent to synthetic or pretreated active ingredients bound to natural macromolecules, e.g. B. enzymes contained, still to be regarded as quite imperfect As a result of years of development work, there are now products with a high content of active ingredients and good fillability. ίο Certain disadvantages of these products have been identified so far viewed as fundamentally unavoidable. The carriers contain groups that act against polypeptides, in particular their terminal and pendant amino groups are reactive and thus under formation able to react with an amide group. These groups, such as carboxylic acid anhydrides, carboxylic acid chloride or phenyl ester moieties, are hydrolytic and become a sizeable one Partly hydrolyzed before reacting with the protein body. Formed by hydrolysis Carboxyl groups whose negative charges in the later reaction with those which are also negatively charged Substrate molecules can be a hindrance and also the matrix properties of the carrier can be significant change. Other functional groups at whose Hydrolysis no carboxyl groups, but amino or hydroxyl groups are formed, react so sluggishly that it is extremely difficult to bind proteins long reaction times or activity-damaging reaction conditions. Furthermore, t.H the Production of the basic, which are often functionally important Amino groups of a protein body in non-basic amide groups the biological effectiveness in many Cases lost, so that only that portion of the active ingredient remains active in the bound state which the bond took place more or less by chance at a non-essential amino group has.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. Poly peptide unter schonenden Bedingungen an solche Trägerstoffe /u binden, die einfach herzustellen sind und keine Gruppen enthalten, die durch Hydrolyse oder Nebenreaktionen neue polare oder gar ionische Gruppen bilden. Die Bindung der Polypeptide soll bei Temperaturen und pH-Werten möglich sein, bei denen die biologische Aktivität der Polypeptide nicht beeinträchtigt wird, und soll zu einer möglichst weitgehenden Erhaltung der biologischen Aktivität des gebundenen Proteins führen. Das Reaklionsprodiikl soll je nach dem vorgesehenen Verwendungszweck wasserlöslich oder wasserquellbar sein und im letztgenannten Fall gut filtrierbar und auswaschbar sein. Fs wurde gefunden, daß die photochemische Bindung der Polypeptide an Trägei stoffe diese /ahlreichen Forderungen erfüllt.The invention is based on the object. Poly peptides bind under gentle conditions to such carriers / u that are easy to manufacture and do not contain any groups that create new polar or even ionic groups through hydrolysis or side reactions form. The binding of the polypeptides should be possible at temperatures and pH values which the biological activity of the polypeptides is not impaired, and should be as extensive as possible Maintain the biological activity of the bound protein. The Reaklionprodiikl should be water-soluble or water-swellable depending on the intended use and in the latter Case can be easily filtered and washed out. It was found that the photochemical bond of the polypeptides to inert substances fulfills these / many requirements.

Durch Arbeiten von I). F 1 a d und seiner Mitarbeiter (z. B. I). F 1 a d und .1. Sperling, Journ. Anicr. Chem.Soc. ^l>3, S. 967 bis 971: 1971) am Weizmann-Institut (Rehovoih. Israel) ist es bekannt, an Glycin oder glycinhaltige Polypeptide durch photochemischc Reaktion Toluol oder niedrige Olefine wie I-Buten, anzulagern. Dabei gehen die Glycineinheitcn in solche des Phenylalanins bzw. Norleucins über. Bei einer typischen Umsetzung dieser Art (J. S per Ii im. g 65 J.Amcr. Chem.Soc, 1969, Bd. 91, S. 5389 und 5390) wird ein aus 90% di -Alanin und 10% Glycin aufgebautes Poiypcplid vom Molekulargewicht 4800 in einer Lösung in Wasser, tcrl.-Butylalkohol und AcetonBy working from I). F 1 ad and its co-workers (e.g. I). F 1 ad and .1. Sperling, Journ. Anicr. Chem. Soc. ^l > 3, pp. 967 to 971: 1971) at the Weizmann Institute (Rehovoih. Israel) it is known to add toluene or lower olefins such as 1-butene to glycine or glycine-containing polypeptides by photochemical reaction. The glycine units change into those of phenylalanine or norleucine. In a typical implementation of this type (J. S per Ii im. G 65 J. Amcr. Chem. Soc, 1969, Vol. 91, pp. 5389 and 5390), a polypeptide composed of 90% di-alanine and 10% glycine is used with a molecular weight of 4800 in a solution in water, tert-butyl alcohol and acetone

ills Sensibilisator) rail i-Buten bzw. Toluol unter ,^tündiger Einwirkung von UV-Licht bei Raumtemperatur "umgesetzt. Dabei wurden Polypeptide eralten, die zum Teil löslich, zum Teil unlöslich waren d Q 5 bis 1 % an Norlcucin-Einheilen bzw. 2 bis 3% Phenylalanin-Einheilen enthielten. Das entspricht eier Umwandlung der vorhandenen Glycin-Einheiten von 5 bis 10% im Falle des Butens und von 20 bis 30% m Falle des Toluols. E1 a d (European Biophysical Con»ress Proceedings, 197111 S. 75 bis 78) fand weiterhin eine schwerwiegende Beeinträchtigung der biologischen Aktivität durch photochemische Reaktionen Durch Umsetzung mit Toluol oder Buten wurde Lysozym vollständig. RNase zu 90% inaktiviert. Aus zahlreichen Arbeiten verschiedener Forscher_ppen ist eine Vielzahl von weiteren photochemischen Reaktionen bekannt, von denen zusammenfassend gesagt werden kann, daß sie in unspezifischer Weise und mit niedrigen Ausbeuten ablaufen. Es war deshalb keineswegs naheliegend, photochemische Reaktionen zur Bindung von Polypeptiden an Trügerstoffe heranzuziehen, denn es ist ein allgemeiner Erfahrungssatz, daß Reaktionen zwischen Makromolekülen weniger leicht ablaufen als Reaktionen zwischen Makromolekülen und niedermolekularen Verbindungen Man hat zur Bindung von Polypeptiden an Trägerstoffe daher bisher nur solche Reaktionen herangezogen, die im niedermolekularen Bereich quantitativ ablaufen. Aber auch damit hat man nur die Bindung geringer Mengen von Polypeptiden erreichen können Aus diesem Grunde erschien die photochemische Addition zur Bindung zwischen Polypeptiden und Trägerstoffen zunächst als aussichtslos. Darüber hinaus war bei jeder Bindung /wischen Polypeptiden und Trägerstoffen mit einer nur geringen Erhaltung der biologischen Aktivität zu rechnen. So wird die Wirksamkeit von Trypsin durch Acylierung _mit Polyacrylsäure-Abkömmlingen auf einen Bruchteil des ursprünglichen Wertes herabgesetzt, wogegen Acetylierung die Aktivität von Trypsin nur unwesentlich beeinträchtigt. Die gleiche Beobachtung läßt sich an Insulin und vielen anderen biologisch aktiven Pro-ills sensitizer) rail i-butene or toluene under the action of UV light for hours at room temperature ". This resulted in polypeptides which were partly soluble, partly insoluble. 2 to 3% phenylalanine units. This corresponds to a conversion of the glycine units present of 5 to 10% in the case of butene and from 20 to 30% in the case of toluene . 75 to 78) was continued to a serious impairment of the biological activity by photochemical reactions by reaction with toluene or butene lysozyme completely. RNase was inactivated to 90%. _ppen numerous works by various researchers is a plurality of further photochemical reactions are known, of which collectively it can be said that they proceed in an unspecific manner and with low yields Binding of polypeptides to carrier substances should be used, because it is a general experience that reactions between macromolecules proceed less easily than reactions between macromolecules and low molecular weight compounds.Therefore, only those reactions have so far been used to bind polypeptides to carrier substances that take place quantitatively in the low molecular weight range. But even with this one could only achieve the binding of small amounts of polypeptides. For this reason, the photochemical addition to the binding between polypeptides and carrier substances initially appeared to be hopeless. In addition, with each binding / between polypeptides and carrier substances, only a slight preservation of the biological activity was to be expected. For example, the effectiveness of trypsin is reduced _{to a fraction of the original value by acylation with} polyacrylic acid derivatives, whereas acetylation only negatively affects the activity of trypsin. The same observation can be made for insulin and many other biologically active pro-

^tel ETwar^daher völlig überraschend, daß Polypeptide auf photochemischem Wege an Trägerstoffe der verschiedensten Art unter schonendsten Bedingungen quantitativ unter weitgehender Erhaltung ihrer biloeischen Aktivität gebunden werden können. Der Umstand daß die photochemische Reaktion nicht grundsätzlich an bestimmte reaktive organische Gruppen gebunden ist wenn auch, wie spater zu erörtern ist, einige bestimmte Gruppen recht förderlich sind gestattet es, die Trägerstoffe weitgehend nach den anwendungstechnischen Erfordernissen auszuwählen Man kann wasserlösliche Träger ebenso verwenden wie wasserunlösliche quellbare Gele oder Perlpolymerisate oder sogar mit organischen Verbindungen modifizierte anorganische Trager. ^tel etwar ^ therefore completely surprising that polypeptides can be bound by photochemical means to carriers of various types under the gentlest conditions quantitatively while largely preserving their biloeischen activity. The fact that the photochemical reaction is not fundamentally bound to certain reactive organic groups even though, as will be discussed later, some certain groups are quite beneficial, allows the carrier materials to be selected largely according to the application requirements. Water-soluble carriers can be used as well as water-insoluble swellable ones Gels or bead polymers or even inorganic carriers modified with organic compounds.

Der Umsetzung von Polypeptiden mit makromolekularen Trägerstoffen sollte es in jedem Falle zustatten kommen, daß eine kovalente Bindung schon durch die Reaktion von jeweils einer einzigen reaktiven Gruppierung des Polypeptide und des Trägermoleküls zustande kommt. Eine quantitative Reaktion aller reaktiven Gruppen beider Komponenten ist also car nicht erforderlich. Wenn trotzdem in den meisten Fällen eine schlechtere Ausbeute bei der Umsetzung v«n Pnlvnentiden mit Makromolekülen erreicht wird. als bei analogen Umsetzungen mit niedermolekularen Verbindungen, so läßt sich daran erkennen, in welch erheblichem Maße Reaktionen zwischen Makromolekülen gegenüber niedermolekularen Reaktionen be-S nacbteiligt sind. Es war deshalb nicht vorhersehbar, daß gerade bei der photochemischen Reaktion die Umsetzung makromolekularer Partner vollständiger abläuft als die Umsetzung von Polypeptiden mit niedermolekularen Verbindungen. Dieser überraschende Effekt kann — ohne damit die Erfindung auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen dahingehend gedeutet werden, daß bei den photochemischen Reaktionen, soweit ihr Mechanismus bisher bekannt ist, vorwiegend hydrophobe Molekülteile miteinander reagieren, z.B. die Methylengruppe des Glycinresies mit Buten oder Toluol. Da die Polypeptide als Ganzes eher hydrophil und chemischen Umsetzungen nur in wäßrigen oder anderen stark polaren Reaktionsmedien zugänglich sind, dürften die photochemisch reaktiven unpolaren Gruppen durch die stark s.)lvutisierten polaren Gruppen des Polvpeptids stark abgeschirmt und für kleine hydrophobe Moleküle nur schlecht zugänglich sein. Die im Verfahren der Erfindung verwendeten Trägerstoffe sind dagegen in der Regel hydrophil, so daß es zu einer Wechselwirkung und Aneinanderlagerung mit den hydrophilen Gruppen des Polypeptids kommt. Dadurch werden zwangsläufig auch die hydrophoben, photochemisch aktivierbaren Gruppen beider Makromoleküle in räumliche Nähe gebracht und ihre Umsetzung erleichtert.The conversion of polypeptides with macromolecular carrier substances should in any case allow come that a covalent bond is already made by the reaction of a single reactive Grouping of the polypeptide and the carrier molecule comes about. A quantitative response of all reactive groups of both components is therefore not required. If anyway in most of them In some cases, a poorer yield is achieved in the reaction of pnnentiden with macromolecules. than in analogous reactions with low molecular weight compounds, it can be seen in which considerable degree of reactions between macromolecules versus low molecular weight reactions be-S are involved. It was therefore not foreseeable that precisely in the photochemical reaction the Implementation of macromolecular partners is more complete than the implementation of polypeptides with low molecular weight compounds. This surprising effect can - without thereby the invention to want to commit to a certain theory to be interpreted as meaning that with the photochemical Reactions, as far as their mechanism is known so far, predominantly hydrophobic parts of the molecule react with each other, e.g. the methylene group of the glycine residue with butene or toluene. As the polypeptides as a whole rather hydrophilic and chemical reactions only strong in aqueous or otherwise polar reaction media are accessible, the photochemically reactive non-polar groups should through the strongly vutated polar groups of the polypeptide are strongly shielded and hydrophobic for small ones Molecules are difficult to access. The carriers used in the method of the invention are, however, usually hydrophilic, so that there is an interaction and agglomeration with comes from the hydrophilic groups of the polypeptide. This inevitably also reduces the hydrophobic, Photochemically activatable groups of both macromolecules brought into spatial proximity and their implementation facilitated.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung trägergebundener PoKpeptide, bei dem man die wäßrige Lösung eines Pol>peptids in Gegenwart einer nicht peptidurtigen makromolekularen Trägerverbindung und eines an sich bekannten Photosensibilisiitors in Abwesenheit von Sauerstoff mit ultraviolettem Licht oder bei zusätzlichen Anwesenheit eines organischen Peroxyds mit sichtbarem Licht bestrahlt.The invention relates to a method for producing carrier-bound PoK peptides in which one the aqueous solution of a Pol> peptide in the presence a non-peptide macromolecular carrier compound and a photosensitizer known per se in the absence of oxygen with ultraviolet light or with additional presence of an organic peroxide irradiated with visible light.

Der Begriff »Polypeptid« ist weit zu fassen. Es fallen nicht nur wasserlösliche natürliche Eiweißkörper darunter, wie Enzyme, Antikörper, Hormone mit Proteinstruktur, Inhibitoren, sondern auch aus wenigen Aminosäureinheiten aufgebaute natürliche oder synthetische Polypeptide, wie Dipeptide, oder Verbindungen, die nur teilweise peptidartig aufgebaut sind, wie Penicilline. Ferner kann man auch Substanzen, die keine Peptidstruktur haben, mit oligomeren Pep-50 tiden umsetzen und sie über diese Gruppe an Trägermoleküle binden.The term "polypeptide" can be interpreted broadly. It is not just water-soluble natural protein bodies that fall including such as enzymes, antibodies, hormones with protein structure, inhibitors, but also from a few Natural or synthetic polypeptides made up of amino acid units, such as dipeptides, or compounds, which are only partially constructed in the manner of peptides, such as penicillins. Furthermore, one can also use substances which have no peptide structure, react with oligomeric peptides and transfer them to carrier molecules via this group tie.

Der Begriff »Träger« ist hier umfassender gebraucht worden, als in der biochemischen Literatur sonst üblich. Er umfaßt nicht nur unlösliche Feststoffe. 55 sondern auch wasserlösliche Verbindungen, die als Vehikel Tür das gebundene Polypeptid fungieren und z. B. seinen Transport an bestimmte Stellen eines biologischen Systems, seine Permeabilität durch Grenzschichten oder Membranen, seine Verteilung 60 auf unterschiedliche Phasen u. dgl. beeinflussen.The term "carrier" has been used more comprehensively here than in the other biochemical literature common. It does not only include insoluble solids. 55 but also water-soluble compounds that are known as Act as vehicles for the bound polypeptide and e.g. B. its transport to certain points of a biological system, its permeability through boundary layers or membranes, its distribution 60 to influence different phases and the like.

Als makromolekulare Trägerverbindung kommt dank der geringen Spezifität der photochemischen Reaktion eine große Vielzahl von nicht peptidartigen Verbindungen in Betracht. Es handelt sich in der 65 überwiegenden Mehrzahl der Fälle um natürliche oder synthetische organische Polymere, jedoch können auch anorganische Träger verwendet werden, sofern sie für die aktivierende Strahlung genügendAs a macromolecular carrier compound comes thanks to the low specificity of the photochemical Reaction takes a wide variety of non-peptide-like compounds into account. It is in the The vast majority of cases involve natural or synthetic organic polymers, however Inorganic carriers can also be used, provided they are sufficient for the activating radiation

durchlässig sind, eine ausreichende innere Oberfläche haben und an dieser Oberfläche photochemiich aktivierbare organische Gruppe trauen. Als Beispiele für anorganische Träger dieser Art seien poröses Glas, quellbare Silikate, insbesondere Tonmineralien, oder hochdisperse Kieselsäure genannt, die mit solchen Siloxanen modifiziert sind, die Alkenyl-, Toluyl· oder andere, der photochemischen Addition zugängliche Gruppen enthalten,are permeable, a sufficient internal surface and trust photochemically activatable organic groups on this surface. As examples of Inorganic carriers of this type are porous glass, swellable silicates, in particular clay minerals, or called highly disperse silica, which are modified with such siloxanes as alkenyl, toluyl or contain other groups accessible to photochemical addition,

Die in derMehrzahl der Fälle verwendeten organischen Trägerverbüidungen haben ein Molekulargewicht über 1000 und vorzugsweise über 10000. Sie können wasserlöslich sein, jedoch werden für die meisten Anwendungsfalle wasserunlsöliche Trägerstoffe verwendet, und zwar vorzugsweise solche, die überwiegend aus hydrophilen Monomereinheiten aufgebaut sind und ihre Wasserunlöslichkeit allein ihrer vernetzten Struktur verdanken, hür Trägerstoffe dieser Art lassen sich bekanntlich keine Molekularge-The organic ones used in the majority of cases Carrier compounds have a molecular weight above 1,000 and preferably above 10,000. They can be water-soluble, but for most applications they become water-insoluble carriers used, preferably those that are composed predominantly of hydrophilic monomer units and their insolubility in water are due solely to their cross-linked structure, these are the carrier substances It is well known that no molecular

haltigen PolymerendneC H-Bindungin «-Stelluii! zur Carbonamidgruppe unter Ausbildung eines C-Ra dikals gespalten {vgl. I. Rosenthal in »The Che mistry of Amides« von S. P a t a i und J. Z a b r i c k \ Intercience, New York 1970. S. 303). Homo- mit Mischpolymerisate des Methacrylamids, die keil n-C'Wasserstoffatom haben sind daher weniger renk tiv und weniger bevorzugt als Homo- und Misch polymerisate des Acrylamids oder Vinylpyrrolidon Da diese Monomereinheiten zugleich stark hydrophil sind, kommt es auf die Hydrophilie und pholochemische Reaktionsfähigkeit eventueller weiterer Comonomerer nicht entscheidend an, wenn auch hydrophile Comonomere grundsätzlich bevorzugt sind, wie z. B. Methacrylamid. Acryl- und Methacrylsäure sowie ihre wasserlöslichen Salze, Vinylpyrrolidon. Hydroxyulkylester der Acryl- oder Methacrylsäure, wie z. B. Hydroxyäthylacrylat, 2-Hydroxypropyl-acrylat. Butandiol-l,2-acrylal. Butandiol-l,4-acrylat oder diecontaining polymer endneC H bond in "-Stelluii! cleaved to the carbonamide group with the formation of a C radical {cf. I. Rosenthal in "The Chemistry of Amides" by S. Patai and J. Zabrick \ Intercience, New York 1970. p. 303). Homopolymers and copolymers of methacrylamide, which have wedge n-C ' hydrogen atoms, are therefore less reactive and less preferred than homopolymers and mixed polymers of acrylamide or vinylpyrrolidone not critical, although hydrophilic comonomers are generally preferred, such as. B. methacrylamide. Acrylic and methacrylic acid and their water-soluble salts, vinyl pyrrolidone. Hydroxyulkylester of acrylic or methacrylic acid, such as. B. hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxypropyl acrylate. Butanediol-1,2-acrylal. Butanediol-1,4-acrylate or the

wichte angeben. Die Vernetzung ist vorzugsweise so 20 entsprechenden Methacrylate, weiterhin Aminoalkyl-indicate weights. The crosslinking is preferably so 20 corresponding methacrylates, furthermore aminoalkyl

ester oder Aminoalkylamidc der Acryl- oder Me(hacrylsäure sowie deren Salze oder Quatcrnisierungsprodukte. wie Dimethylaminoäthylmethacnlat oder dessen Hydrochlorid oder Hydroacetat, M'ethacryl-esters or aminoalkylamides of acrylic or methacrylic acid and their salts or quaternization products. like Dimethylaminoäthylmethacnlat or its hydrochloride or hydroacetate, methacrylic

oxyäthyltrimethylammoniumchlorid.oxyäthyltrimethylammoniumchlorid.

Die Polymere können durch geringe Anteile \on Comonomeren mit zwei oder mehr polymerisiertren Doppelbindungen, wie Divinylbenzol, Glycoldiacnlat oder -dimethacrylat oder Triallylcyaniiral vernel/i sein.The polymers can be polymerized with two or more comonomers due to small proportions of comonomers Double bonds, such as divinylbenzene, glycol diacnlate or dimethacrylate or triallylcyaniiral vernel / i being.

Neben den genannten hydrophilem bzw. wasserlöslichen Monomeren können am Aufbau der Trägermoleküle auch dann, wenn sie wasserlöslich oder stark quellbar sein sollen, nicht wasserlösliche MonomereIn addition to the hydrophilic or water-soluble monomers mentioned, the structure of the carrier molecules even if they are to be water-soluble or highly swellable, non-water-soluble monomers

beteiligt sein. Die Triigerstoffc sind dann wasserlöslich oder gut quell bar, wenn sie aus einem Vinylpolymerisat bestehen, das gegebenenfalls neben einem vernetzenden Monomerenbe involved. The Triigerstoffc are then water-soluble or good swell bar if they consist of a vinyl polymer, optionally in addition to a crosslinking Monomers

gering, daß die Stoffe in Wasser quellbar sind. Durch eine Quellbarkeit auf wenigstens das Doppelte des Trockenvolumens wird bereits eine große »innere Oberfläche« zur Bindung von Polypeptiden freigesetzt. Um jedoch auch das Eindringen sehr großer Proteinmoleküle und nach deren photochemischer Bindung auch das Ein- und Ausdiffundieren großer Substratmoleküle zu gestatten, ist eine stärkere Quellbarkeit in Wasser, beispielsweise auf das Sfache, vorzugsweise auf das 10- bis 200fache des Trockenvolumens von Vorteil.little that the substances are swellable in water. Through a swellability to at least twice the dry volume already becomes a great inner one Surface «released for binding of polypeptides. However, in order to also penetrate very large Protein molecules and, after their photochemical binding, also the diffusion of large ones in and out Allowing substrate molecules is a stronger swellability in water, for example by a factor of preferably 10 to 200 times the dry volume is advantageous.

Wenn Trägerstoffe verwendet werden, die in der Lösung des Polypeptide nicht anquellen, so müssen sie. um eine hinreichende Menge an Polypeptiden binden zu können, in Form äußerst feiner Teilchen, z. B. Latex-Partikeln, vorliegen. An eine Vielzahl der bekannten natürlichen oder synthetischen Polymcrlalices können Polypeptide photochemisch angelagert werden. Solche beladenen Latexteilchen können dann ähnlich wie Blutkörperchen als Träger für biologisch aktive Substanzen dienen.If carriers are used, they are in the solution of the polypeptides do not swell, so they must. to bind a sufficient amount of polypeptides to be able to, in the form of extremely fine particles, e.g. B. latex particles are present. To a large number of known ones polypeptides can be attached photochemically to natural or synthetic polymeric complexes will. Such loaded latex particles can then be used, similar to blood cells, as carriers for biological serving active substances.

Unter den für das Verfahren der Erfindung grundsätzlich geeigneten wasserlöslichen oder in Wasser quellbaren Trägerstoffen zeichnen sich solche durch eine hohe photochemische Reaktionsfähigkeit aus. die ganz oder teilweise aus möglichst hydrophilen, zur Radikalbildung neigenden Monomereinheiten aufgebaut sind. Dies trifft für makromolekulare Verbindungen mit Carbonsäureamid-, Carbonsäureester-, Laelon-. Halbacetal- und cyclischen Äthergruppen zu. Als sehr reaktiv haben sich Homo- und Mischpolymerisate des Acrylamids oder des Vinylpyrroiidons sowie Polysaccharide erwiesen. I ^!ntcr den Polysacchariden werden wiederum die ohnehin in der Biochemie viel benutzten Trägermaterialien, wie Sepharose, Polydextrangele. Agarose-Gele. Cellulose in Form von Pulvern, Fasern. Vliesen (Filterpapier) oder Regeneratfolie usw., bevorzugt. Die Hydroxylgruppen der Polysaccharide können, beispielsweise, um die biologische Abbaubarkeil herabzusetzen, teilweise verethert oder verestert sein. Die radikalischc Reaktion greift im Falle der Polysaccharide wahrscheinlich an der dem Ringsaucrstoffatom benachbarten C—Η-Bindung an, wobei ein Wassersloffatom abgespalten und ein Kohlcnstoffradikal gebildet wird (vgl. I. R ösen 1ha I und D. El ad. Tetrahedron Letters 1967. Bd. 23. S. 3193 bis 3204).Among the water-soluble or water-swellable carrier substances which are fundamentally suitable for the process of the invention, those are distinguished by a high photochemical reactivity. which are wholly or partly built up from monomer units which are as hydrophilic as possible and tend to form free radicals. This applies to macromolecular compounds with carboxamide, carboxylic acid ester, laelon. Hemiacetal and cyclic ether groups. Homopolymers and copolymers of acrylamide or vinyl pyramidone and polysaccharides have proven to be very reactive. I ^! In addition to the polysaccharides, the carrier materials, such as Sepharose and polydextran gels, which are already widely used in biochemistry, are used. Agarose gels. Cellulose in the form of powder, fibers. Fleece (filter paper) or regenerated film, etc., preferred. The hydroxyl groups of the polysaccharides can be partially etherified or esterified, for example in order to reduce the biodegradability. In the case of the polysaccharides, the radical reaction probably attacks the C — Η bond adjacent to the ring oxygen atom, whereby a hydrogen atom is split off and a carbon radical is formed (cf. I. R osen 1ha I and D. El ad. Tetrahedron Letters 1967. Vol . 23. pp. 3193-3204).

In analoger Weise wird in carbonamidgruppcn-In an analogous manner, in carboxamide groups

a) zu wenigstens 80 Molprozent aus einem 1 lydroxj alkylester der A\cryl- oder Methacrylsäure odera) at least 80 mol percent from a hydroxyl alkyl ester acrylic or methacrylic acid or

b) zu wenigstens 60 Molprozcnt aus Acryl- oder Methacrylamid oder aus Vinylpyrrolidon oderb) at least 60 mol% of acrylic or methacrylamide or of vinylpyrrolidone or

c) zu wenigstens 40 Molprozent aus Acryl- oder Methacrylsäure oder aus deren Dialkylaminoalkylestern oderc) at least 40 mol percent from acrylic or methacrylic acid or from their dialkylaminoalkyl esters or

d) zu wenigstens 20 Molprozent aus wasserlöslichen Salzen der Acryl- oder Methacrylsäure oder aus Salzen oder Quaterr.-sierungsprodukten von Dialkylaminoalkylcslern Jer Acryl- oder Methacrylsäure d) at least 20 mole percent of water-soluble Salts of acrylic or methacrylic acid or from salts or quaternization products of dialkylaminoalkyl groups Jer acrylic or methacrylic acid

und zum übrigen Teil aus nicht wasserlöslichen Mononieren aufgebaut ist.and the remaining part is composed of water-insoluble monomers.

Wasserlösliche Trägerstoffe, die leicht unisctzbare funktioneile Gruppen, wie Hydroxyl- oder Carboxylgruppen, enthalten, lassen sich gewünschtenfalls auch nachträglich durch Umsetzung mit mchrfunktioncllcn Vernetzungsmittel!!, wie Diisocyanate^ Bis-epoxulcn. Harnstoff- Formaldehyd - Kondensaten usw.. auf jeden gewünschten Vcrnclzungs- bzw. Quellbarkeitsgrad einstellen.Water-soluble carriers that are easily unrecognizable functional groups, such as hydroxyl or carboxyl groups, can also be included if desired subsequently by reaction with functional crosslinking agents such as diisocyanates, bis-epoxides. Urea-formaldehyde condensates etc. to any desired degree of shortening or swelling to adjust.

Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur 1 lerstellung wasserunlöslicher Triigerstoffc ist in der deutschen Offcnlegiingsschrift 20 09 218 beschrieben. Man erhält nach diesem Verfahren quellbare vernetzte Trägerpolyniere in Form von Perlen von z. B. 0.1 bisA particularly advantageous method for producing water-insoluble Triigerstoffc is described in the German Offcnlegiingsschrift 20 09 218. This process gives swellable crosslinked carrier polymers in the form of beads of, for. B. 0.1 to

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I mm Durchmesser durch Polymerisation einer wäßringen Lösimg eines Vinylmonomercn und eines Vernetzungsmittels in einer organischen Phase. Eine sehr hohe Qucllburkcit wird bei diesen Polymeren dadurch erreicht, dall das Polymerisat von vornherein in Gegenwart einer großen Menge Wasser, d. h. im gequollenem Zustand, polymerisiert wird. I mm in diameter by polymerizing an aqueous solution of a vinyl monomer and a crosslinking agent in an organic phase. A very high degree of swelling is achieved with these polymers because the polymer is polymerized from the outset in the presence of a large amount of water, ie in the swollen state.

Obwohl die vorstehend beschriebenen makromolekularen Stoffe Gruppen enthalten, die einer photochemischen Verknüpfung mit Polypeptiden zugang- ίο lieh sind, kann es vorkommen, daß nur nach langer und starker Bestrahlung eine ausreichende Zahl von Bindungen zwischen einem Polypeptid und einem Träger entsteht. Um eine Schädigung des Polypeptids durch überlange Bestrahlung und einen hohen Aufwand an Strahlungsenergie zu vermeiden, hat es sich in derartigen Fällen bewährt, in die Trägerstoffc solche organischen Gruppen einzubringen, die einer pholochemischen Reaktion besonders leicht zugänglich sind. Solche Gruppen sind seilenständige Alkcnylgruppen. besonders solche mit einer endständigen Doppclbindung, oder Alkylphcnylgruppen. hierunter vor allem der Toluyl-Rest. Diese Gruppen lassen sich in vielen Fällen durch Umsetzung des Trägerstoffcs mit Toluyl-Carbonsäurechlorid. Toloylsulfochlorid. Allylchlorid, Acrylsäurechlorid usw. einführen. Auf diese Weise kann man die photochemischc Reaktivität aller OH-gruppen- oder aminogruppenhaltigcn Trägcrmaterialien. seien sie per se photochemisch inert oder reaktiv, verbessern. Dies gilt vorzugsweise für Träger mil Polysaccharidstruktur. also Agarosc. Polydcxtran und Cellulose, sowie für hydroxyalkylsubstituiertc PoIyvinylverbindungen. wie Homo- oder Mischpolymerisate der Hydroxyalkyiesler oder N-Hydroxvalkylamide der Acryl- oder Methacrylsäure. Bei der Verwendung von Vinylpolymeren als Träger ist es vorteilhafter, schon bei ihrem Aufbau Monomere mit entsprechenden Seitengruppen milzuverwendcn. z. B. Vinyltoluol oder Allylacrylat- oder mclhacrylat. Der Anteil dieser Monomeren kann von Bruchteilen eines Prozents bis zu 50% oder mehr, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, betragen.Although the macromolecular substances described above contain groups that have a photochemical Linkage with polypeptides are accessible ίο, it can happen that only after a long time and strong irradiation, a sufficient number of bonds between a polypeptide and a Carrier arises. To avoid damage to the polypeptide due to long exposure to radiation and a great deal of effort To avoid radiation energy, it has proven useful in such cases to incorporate such into the carrier material bring in organic groups that form a pholochemical Reaction are particularly easily accessible. Such groups are rope-attached alkyl groups. especially those with a terminal double bond, or alkylphynyl groups. including above all the toluyl residue. These groups can be divided into many Cases by reaction of the carrier with toluene carboxylic acid chloride. Toloyl sulfochloride. Introduce allyl chloride, acrylic acid chloride, etc. In this way one can determine the photochemical reactivity of all carrier materials containing OH groups or amino groups. be they photochemically inert or reactive per se, improve. This is preferably true for carriers mil Polysaccharide structure. so Agarosc. Polydcxtran and cellulose, as well as for hydroxyalkyl-substituted polyvinyl compounds. such as homopolymers or copolymers of hydroxyalkylamides or N-hydroxyalkylamides acrylic or methacrylic acid. When using vinyl polymers as a carrier, it is more advantageous monomers with corresponding side groups must be used even in their construction. z. B. vinyl toluene or allyl acrylate or methacrylate. The proportion of these monomers can be fractions of a Percentages up to 50% or more based on the total weight of the monomers.

Obwohl auch Polypeptide untereinander photochemisch verbunden bzw. vernetzt werden können, spielen Polypeptide als Trägerstoffe im vorliegenden Verfahren keine Rolle und gehören deshalb nicht zum Umfang der Erfindung.Although polypeptides can also be photochemically linked or crosslinked, Polypeptides play no role as carriers in the present process and therefore do not belong to the Scope of the invention.

Die photochemische Reaktion zwischen dem Poly peptid und dem Trägerstoff findet in einer wäßrigen Lösung des Polypeptids statt. Hierunter werden auch Lösungen von Polypeptiden in Gemischen von Wasser mit niederen Alkoholen, wie z. B. Methanol, Äthanol, Propanol oder Bulanol, oder mit Aceton u. ä. verslanden. Die Konzentration des Polypeptids in der verwendeten Lösung sollte zweckmäßig im Bereich von 100 μg/ml bis 10 mg/ml liegen. Der Tragerstoff wird im allgemeinen in einer solchen Menge eingesetzt, daß das Polypeptid bei vollständiger Bindung an den Träger einen Anteil von 1 bis 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise 10 Gewichtsprozent bildet, jedoch kann man auch von diesen Mengen abweichen. The photochemical reaction between the polypeptide and the carrier takes place in an aqueous solution of the polypeptide. This also includes solutions of polypeptides in mixtures of water with lower alcohols, such as. B. methanol, ethanol, propanol or Bulanol, or with acetone and the like. The concentration of the polypeptide in the solution used should expediently be in the range from 100 μg / ml to 10 mg / ml. The carrier material is generally used in such an amount that the polypeptide, when fully bound to the carrier, forms a proportion of 1 to 50 percent by weight, preferably 10 percent by weight, but these amounts can also be deviated from.

Die eigentliche photochemische Reaktion wird durch Photosensibilisation ausgelöst. Photosensibilisatoren sind seit langem bekannt. Die Grundlagen auf diesem Gebiet wurden von G. O. S c h e η c k und Mitarbeitern erarbeitet und sind z.B. in »Organic Photochemistry«. R. O. K a η. New York: Mac Graw-HiIl 1966. S. 14 bis 17. beschrieben.The actual photochemical reaction is triggered by photosensitization. Photosensitizers have long been known. The basics in this area were developed by G. O. S c h e η c k and co-workers and are e.g. in »Organic Photochemistry «. R. O. K a η. New York: Mac Graw-HiIl 1966. pp. 14-17.

Man versteht unter Plioloscnsibilisierung die energetische Anregung eines Akzcptormoleküls (A) durch ein Donormolckül (D), welches die Strahlungsenergie (hi·) primär absorbiert. Im vorliegenden Fall fungieren Sensibilisatoren als Donormolckü.le, d. h., sie werden durch ultraviolettes Licht zunächst in ihren niedrigst angeregten Singlettzusland (S₁ ) gebracht, wonach sie durch lntcrsystemcrossing in den niedrigsten TriplctlzuslandCr,) übergehen. Dieser Zustand ist verhältnismäßig langlebig und daher in der Lage, durch diffusionskontrollierte Energieübertragung andere Moleküle zu Tripletlzuständcn anzuregen, aus welchen diese Moleküle radikalisch reagieren können. Diese Reaktionsfolte läßt sich so darstellen:Pliolosensitization is understood as the energetic excitation of an acceptor molecule (A) by a donor molecule (D), which primarily absorbs the radiation energy (hi). In the present case, sensitizers function as donor molecules, that is, they are first brought into their lowest excited singlet state (S ₁ ) by ultraviolet light, after which they are converted into the lowest triplicate region by intersystem crossing. This state is relatively long-lived and therefore capable of stimulating other molecules to triplet states through diffusion-controlled energy transfer, from which these molecules can react radically. This reaction sequence can be represented as follows:

D(S₁) —D (S ₁ ) -

D(T₁) + A —D (T ₁ ) + A -

D(S₁)D (S ₁ )

D(T₁)D (T ₁ )

D + A(T₁)D + A (T ₁ )

Das Akzeptormolekül A kann z. B. das Polypeptid oder das Trägcrmolekül sein.The acceptor molecule A can, for. Be the polypeptide or the carrier molecule.

Nach Hammond und Mitarbeitern (.1. Am. Soc. 86. 4537 [1964]) sollen gute Photosensibilisatorcn (Donoren) eine hohe Absorption der eingestrahlten Energie haben, wobei das UV-Spcktrum des Sensibilisator (Donors) möglichst nicht mit dem des Akzeptors überlappen und in längcrwclligcn Bereich liegen soll. Sie müssen ferner eine höhere Triplettenencrgic besitzen als der Akzeptor und außerdem ein möglichst effizientes Intersystemcrossing aufweisen. Schließlich sollte der Photosensibilisator selbst keine photochemischen Reaktionen eingehen, d. h. photochemisch möglichst inert sein. C a 1 ν e r t und Pitts haben nach Daten von H a m m ο η d et al und E 1 m ο 1 a e ν et al eine Anzahl von Verbindungen zusammengestellt, die als Photosensibilisatorcn wirksam sind und sich für das Verfahren der Erfindung eignen (J. G. CaI-vc rt und J. N. Pitts Jr.. »Photochemistry«. John Wiley et Sons. Inc.. New York. London. Sidney 1966. S. 298). Dazu gehören, nach abnehmender Energie des angeregten Triplclts-Zustandcs geordnet. Propiophenon, Xanthon. Acetophenon. Triacetylbcnzol. Isobutyrophenon, Diphenylpropanon. Benzaldehyd. Triphenylmethylketon. Carbazol. Diphenylenoxyd. Triphenylamin. Dibenzothiophen. o-Dibenzoyibenzol. Benzophenon. Dichlorbenzophenon. Diacetylbenzol. Fluoren und viele andere. Ketone haben sich als gut wirksam erwiesen. Außer den schon genannten Ketonen sind Aceton, Methylethylketon und Methylisobutylketon zu erwähnen. Acetophenon und Propiophenon sind besonders bevorzugt, da sie auf Grund ihres Absorptionsspektrums einen großen Teil der von einer Quecksilberhochdrucklampe ausgestrahlten Energie, namentlich im Bereich der 366nm- sowie 313 nm-Emissionslinien des Quecksilbers, absorbieren. According to Hammond and co-workers (.1. Am. Soc. 86. 4537 [1964]), good photosensitizers (donors) should have a high absorption of the irradiated energy, with the UV spectrum of the sensitizer (donor) not overlapping that of the acceptor as far as possible and should lie in a longitudinal area. They must also have a higher triplet energy than the acceptor and also have the most efficient possible intersystem crossing. Finally, the photosensitizer itself should not enter into any photochemical reactions, ie should be as photochemically inert as possible. According to data from H amm ο η d et al and E 1 mο 1 ae ν et al, C a 1 ν ert and Pitts have compiled a number of compounds which are effective as photosensitizers and are suitable for the process of the invention (JG CaI -vc rt and JN Pitts Jr. "Photochemistry." John Wiley et Sons. Inc. New York, London, Sidney 1966, p. 298). These include, ordered according to decreasing energy of the excited triplts state. Propiophenone, xanthone. Acetophenone. Triacetyl benzene. Isobutyrophenone, diphenylpropanone. Benzaldehyde. Triphenyl methyl ketone. Carbazole. Diphenylene oxide. Triphenylamine. Dibenzothiophene. o-dibenzoyibenzene. Benzophenone. Dichlorobenzophenone. Diacetylbenzene. Fluorene and many others. Ketones have been shown to be quite effective. In addition to the ketones already mentioned, acetone, methyl ethyl ketone and methyl isobutyl ketone should be mentioned. Acetophenone and propiophenone are particularly preferred because, due to their absorption spectrum, they absorb a large part of the energy emitted by a high-pressure mercury lamp, namely in the range of the 366 nm and 313 nm emission lines of mercury.

Der angeregte Photosensibilisator erzeugt durch Wechselwirkung mit dem Polypeptid oder dem Trägermolekül ein Kohlenstoff-Radikal. Typische Reaktionen dieser Art sind nachfolgend für die Glycingruppe(l) eines Polypeplids. für eine Glucoseeinheit {II) eines Polysaccharids. für eine Acrylamideinheit (IH) eines Vinylpolymeren und für ein Toluylgruppen(lV) enthaltendes Trägerpolymeres formel-The excited photosensitizer generates a carbon radical through interaction with the polypeptide or the carrier molecule. Typical reactions of this type are shown below for the glycine group (I) of a polypeptide. for a glucose unit {II) of a polysaccharide. for an acrylamide unit (IH) of a vinyl polymer and for a carrier polymer containing toluyl groups (IV) formula

609 629'241609 629,241

(ο(ο

ίοίο

maßii! dargestellt (C* bezeichnet ein Kohlenstoff- polymeren durch Addition und nachfolgende Radikal-
radikal). " übertragung mit einem beliebigen übertrager (AH)Maßii! (shown in C * indicates a carbon polymer by addition and subsequent radical
radical). "transmission with any transmitter (AH)

-NH- CO-NH- CO

— CONH- CONH

CH,CH,

-NH-CO-NH-CO

-CONH-CONH

(D(D

-NHCO-NHCO

CONHCONH

+ -CH₁CH-+ -CH ₁ CH-

CO-O-CH,-CH = CH,CO-O-CH, -CH = CH,

CHO-CHO- CHO-CHO- ISIS -CH₁--CH ₁ - CH-CH- / \/ \ HOCH OHIGH O HOCH OHIGH O CO-CO- HOCH CH-CH₁OH
\ /HIGH CH-CH ₁ OH
\ / V . !
HOCH C-CH₁OH
\ χ V. !
HIGH C-CH ₁ OH
\ χ 1010 \ /
CHO-\ /
CHO- \ -·
CHO-\ - ·
CHO-

(H)(H)

CO -O- CH, - CH - CH₁ - CHCO -O- CH, - CH - CH ₁ - CH

+ AH+ AH

CON ΗCON Η

Ν H CO-Ν H CO-

(III)(III)

-CH₁-CH- CONH-CH ₁ -CH- CONH

CO-O-CH₁-CH₁-CH₁-CHCO-O-CH ₁ -CH ₁ -CH ₁ -CH

NHCONHCO

CH₃ CH ₃

CH₁ CH ₁

CH₂ CH ₂

¹I ¹ I.

Die bevorzugte Reaktionsfähigkeit des Ghcinresies vor anderen Aminsäureresten wirkt sich auf das Verfahren der Erfindung vorteilhaft aus. da GIveinroste in fast allen natürlichen Eivveißkörpern vorkommen, aber oft nicht funktioiisvvichlig sind. Die photochemische Reaktion am Glycinrest hat daher häufig keinen oder nur geringen Einfluß auf die biologisch Wirksamkeit des gebundenen Polypcpiids.The preferred responsiveness of the Ghcinresies over other amino acid residues is advantageous for the method of the invention. da GIveinrste occur in almost all natural egg white bodies, but are often not functional. The photochemical The reaction at the glycine residue therefore often has little or no influence on the biological Effectiveness of the bound polypeptide.

Grundsätzlich ist die Auslösung von photochcmischen Reaktionen nicht von der Anwesenheit eines Pholosensibilisators abhängig. Es ist durchaus möglich, durch eine hinreichend energiereiche Strahlung das Polvpeptid bzw. das Trägermolekül unmittelbarBasically, the triggering is photochromic Reactions do not depend on the presence of a pholosensitizer. It is quite possible the polypeptide or the carrier molecule directly through a sufficiently high-energy radiation

₄<i anzuregen, d. h.in ein Radikal überzuführen. Wie aus Arbeiten von K. Dose und Mitarbeitern (Photochemistry and Phoiobiologv 1068. Vol. 7. S. 671 bis 673) bekannt ist. tritt bei der unmittelbaren \n- regung des Pohncpiids hautig Inaktivierung ein ₄ <i to suggest transferring a radical. As is known from the work of K. Dose and co-workers (Photochemistry and Phoiobiologv 1068. Vol. 7. pp. 671 to 673) . skin-like inactivation occurs with the immediate excitation of the pohncpiids

d.h.. die Moleküistruklur wird irreveribel zerstört Das Verfahren der Erfindung wird daher vorzugsweise mit einer Strahlung durchgeführt, deren Energie zur unmittelbaren Aktivierung des PoIv peptid* mehl ausreicht, die jedoch den Photosensibilisator an/ui.e. the molecular structure is irreversibly destroyed The method of the invention is therefore preferably carried out with radiation whose energy for the immediate activation of the PoIv peptide * flour sufficient, but the photosensitizer to / u regen vermag. Fine fur das Verfahren der Erfindung gut geeignete Strahlung ist ultraviolettes licht einer Wellenlänge von mehr als 2W nni Γ bliche Quceksilber-Hochdrucklampcn senden neben einer Strahlung in d«.m angegebenen Bereich auch härtererain is capable. Fine for the method of the invention Well suited radiation is one of ultraviolet light Wavelength of more than 2W. In addition to radiation in the specified range, the usual high-pressure silver lamps also emit harder ones Strahlungen im Bereich von -40 bis 2S0 nm aus Dieser Stiahlcnantcil wird zweckmäßig durch Pvrevglas herausgefilteri Die Dauer der Bestrahlung richtet sich nach der Starke der Strahlungsquelle und der Wirksamkeit dc> Photosensibilisators und kann imRadiations in the range from -40 to 20 nm This steel diameter is expediently filtered out through PVC glass. The duration of the irradiation is determined according to the strength of the radiation source and the effectiveness dc> Photosensitizers and can im

65 Bereich von 10 Minuten bis 50Stunden liegen Bei Verwendung dci gebräuchlichen Quecksilber-Hochdruck -Tauchlampcn. d. h. lampen mit einer Leistung oder mit olefinischen Seitengruppen des Träger- \,m 12S bis 500 Watt, hegen die Bcstrahlungs/eiten65 ranges from 10 minutes to 50 hours Use of the common high pressure mercury immersion lamps. d. H. lamps with one power or with olefinic side groups of the carrier- \, m 12S up to 500 watts, cherish the radiation

(IV)(IV)

Eine Vielzahl weiterer analoger Reaktionen an anderen Gruppen des Polypeptids. ?. B. an Einheilen des Cv steins. Cystins. Metnionins oder Trvptophans oder des Trägermolelcüls kann auftreten. Radikale dieser Art reagieren untereinander durch Rekombi nation :A variety of other analogous reactions on other groups of the polypeptide. ?. B. on the healing of the Cv stone. Cystine. Metnionine or Trvptophans or the carrier molecule can occur. Radicals of this kind react with one another through recombination :

-NHCO-NHCO

-CONH-CONH

+ — CH₂ — C —+ - CH ₂ - C -

— CONH CONH- CONH CONH

\ / CH\ / CH

> -CH₂-C-> -CH ₂ -C-

CONH,CONH,

im allgemeinen /wischen I und 30 Stunden. N;ieh Abschalten der Strahlenquelle ist die Reaktion sofort beendet; nicht umgesetztes Trägermaterial, Protein und die Piotein-Trägcr-Vcrbindungen sind stabil. und es besteht im Gegensatz zu anderen Bindungsverfahren keine Gefahr der hydrolytischen Spaltung der pholochcmisch erzeugten Bindungen.generally / between 1 and 30 hours. N; ieh If the radiation source is switched off, the reaction is ended immediately; unreacted carrier material, protein and the protein-carrier compounds are stable. and it is in contrast to other methods of attachment there is no risk of hydrolytic cleavage of the bonds created by the chemical process.

Die photochemische Reaktion kann auch mit einer Lichtstrahlung im sichtbaren Bereich ausgelöst werden, wenn neben einem durch sichtbares Licht anregbaren Pholosensibilisator. wie Biacetsl. ein Perowd, wie /. B. Di-tert.-Butylperoxid. \erwendet wird.The photochemical reaction can also be triggered with light radiation in the visible range, when next to a visible light stimulant phosensitizer. like Biacetsl. a perovd, how /. B. di-tert-butyl peroxide. \ is used.

Einer der wesentlichen Vorteile des pholochemisehen Bindiingsverfahrens gegenüber der rein chemischen Bindung ist die freie Wählbarkeil von Temperatur und pH-Wert. Man kann bei beliebig tiefen und - soweit es die Temperaturbeständigkeit des Polypeptids zuläßt beliebig hohen Temperaturen, beispielsweise zwischen —5 und 70" C, sowie im neutralen, sauren oder alkalischen Milieu arbeiten. Dadurch läßt sich das Verfahren den Stabilitätsbedingungen des Polypeptids optimal anpassen. Auch äußerst lemperaturempfindliche Proteine lassen sich unter schonendsten Bedingungen verarbeiten.One of the main advantages of the chemical bonding process over the purely chemical one Binding is the free choice of temperature and pH value. You can go at any depth and - as far as the temperature resistance of the polypeptide allows any high temperatures, for example between -5 and 70 "C, as well as in a neutral, acidic or alkaline environment the method can be optimally adapted to the stability conditions of the polypeptide. Also extremely sensitive to temperature Proteins can be processed under the most gentle of conditions.

Eine wichtige Voraussetzung für die Bindung des Polypeptids an den Träger ist die Abwesenheit von Sauerstoff. Sauerstoff wird bekanntlich sehr leicht in Gegenwart von Sensibilisatoren photochemisch angeregt und löst eine Vielzahl unerwünschter Nebenreaktionen aus. Es ist daher erforderlich, die Reaktion in einer sauerstofffreien Schutzgasatmosphäre, beispielsweise in Stickstoff oder Argon, durchzuführen. Um auch in der Peptidlösung enthaltenen Sauerstoff vollständig zu entfernen, läßt man vor Einwirkung der Strahlung ein sauerstofffreies Inertgas durch die Lösung perlen.An important requirement for binding of the polypeptide to the carrier is the absence of Oxygen. It is known that oxygen is very easily stimulated photochemically in the presence of sensitizers and triggers a large number of undesirable side reactions. It is therefore necessary to carry out the reaction in an oxygen-free protective gas atmosphere, for example in nitrogen or argon. Around to completely remove oxygen contained in the peptide solution, one leaves before the action of the Radiation bubbling an oxygen-free inert gas through the solution.

Nach Abschluß der Bestrahlung und Bindung des Polypeptids an den Träger kann die Reaktionslösung gegebenenfalls als solche für den vorgesehenen Verwendungszweck eingesetzt werden. An gelöste Träger gebundene biologisch wirksame Proteine können z.B. als pharmazeutische Präparate von verringerter Abbaubarkeit oder Resorbierbarkeil im Körper verwendet werden. Man kann die an lösliche Träger gebundenen Polypeptide aber auch in Substanz gewinnen, indem man Fällungsmittel. wie anorganische Salze oder Alkohole, zusetzt. Das ausgefallene Produkt kann dann abfiltriert und mit Salzlösungen oder Alkohol-Wasser-Gemischen ausgewaschen werden. In fester Form vorliegende Produkte können unmittelbar abfiltriert und mit Wasser gewaschen werden.After the completion of the irradiation and binding of the polypeptide to the carrier, the reaction solution can may be used as such for the intended purpose. To dissolved carriers bound biologically active proteins can be used, for example, as pharmaceutical preparations of reduced degradability or absorbable wedge can be used in the body. One can use those bound to soluble carriers Polypeptides can also be obtained in substance by using precipitants. like inorganic salts or alcohols. The precipitated product can then be filtered off and mixed with salt solutions or alcohol-water mixtures be washed out. Products in solid form can be filtered off immediately and washed with water.

In der bevorzugten Ausführungsform eines an ein quellbares Perlpolymerisat gebundenen Polypeptids kann das Produkt unmittelbar in einer Substratlösung verteilt werden, wobei das Substrat mit dem gebundenen Polypeptid, beispielsweise einem Enzym, in Wechselwirkung tritt. Nach der Umsetzung des Substrats kann das trägergebundene Enzym durch einfache Filtration vollständig abgetrennt werden. Man kann auch das Perlpolymerisat in dichter Schüttung als Säulenfiillung verwenden und die Substratlösung durch die Säule fließen lassen. Bei Verwendung eines Perlpolymerisats, von einheitlicher Teilchengröße ist eine hohe Strömungsgeschwindigkeit in einer solchen Reaktionssäule zvi erreichen.In the preferred embodiment of a polypeptide bound to a swellable bead polymer, the product can be distributed directly in a substrate solution, the substrate interacting with the bound polypeptide, for example an enzyme . After the substrate has reacted, the carrier-bound enzyme can be completely separated off by simple filtration. You can also use the bead polymer in a dense bed as a column filling and allow the substrate solution to flow through the column. When using a bead polymer of uniform particle size, a high flow rate can be achieved in such a reaction column.

Das Verfahren der Erfindung kann in einer großen Vielfalt von Ausführungsformen verwirklicht werden, die sich hier nicht erschöpfend darstellen lassen Selbstverständlich ist es auch möglich, nacheinander oder gleichzeitig verschiedene Proteine an denselben Träger zu binden. Weitere Ausführungsformen der Erfindung und ihre Ergebnisse sind den nachfolgenden Beispielen zu entnehmen.The method of the invention can be practiced in a wide variety of embodiments, which cannot be presented exhaustively here. Of course, it is also possible one after the other or to bind different proteins to the same carrier at the same time. Further embodiments of the The invention and its results can be found in the following examples.

In manchen Fällen, z. B. bei der Affinitätschromatographie hochmolekularer Verbindungen an trägergebundenen affinen Proteinen, muß das Protein in ausreichendem Abstand von der Hauptkette des Trägerpolymeren gebunden sein. Man verwendet für solche Fälle Trägerverbindungen, die photochemisch besonders aktive Gruppen an längeren, z. B. 6 bis 12 C-Atome enthaltenden Seilenketten tragen. Beispiele für solche Träger sind Vinylpolymere mit Ein-In some cases, e.g. B. in affinity chromatography of high molecular weight compounds on carrier-bound affine proteins, the protein must be at a sufficient distance from the main chain of the carrier polymer be bound. In such cases, carrier compounds are used which are particularly photochemical active groups on longer, e.g. B. wear rope chains containing 6 to 12 carbon atoms. Examples for such carriers are vinyl polymers with

is heilen von Acryl- oder Methacrylsäureestern von höheren ungesättigten Alkoholen. Polysaccharide können mit entsprechend langkettigen ungesättigten Verbindungen modifiziert werden.is curing of acrylic or methacrylic acid esters of higher unsaturated alcohols. Polysaccharides can be modified with correspondingly long-chain unsaturated compounds.

Herstellung der TrägersubstanzenProduction of the carrier substances

A. Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats ausA. Production of a swellable bead polymer from

Acrylamid und AllylmethacrylatAcrylamide and allyl methacrylate

In einem Rundkolben (500ml) versehen mit Thermometer. Rührer. Rückflußkühler und CO₂-Emleitungsrohr werden 87 g n-Heptan und 55 g Perchloräthylen vorgelegt. Darin werden 0,25 g Benz.oylpcroxid und 0.01 g eines Stabilisators gelöst. Nach Entfernung von Sauerstoff mit etwa 2 g Trockeneis wird bei 25 C eine Monomerlösung zugegeben, bestehend au?In a round bottom flask (500ml) provided with a thermometer. Stirrer. 87 g of n-heptane and 55 g of perchlorethylene are placed in the reflux condenser and CO _{2 discharge pipe.} 0.25 g of benzoylproxide and 0.01 g of a stabilizer are dissolved therein. After removing oxygen with about 2 g of dry ice, a monomer solution is added at 25 C, consisting of?

12 g Acrylamid.
3 g Allylmethacrylat.
0.375 g Glykoldimethacrylat.
^⁵ 17.5 g Formamid.12 g of acrylamide.
3 grams of allyl methacrylate.
0.375 g glycol dimethacrylate.
^ ⁵ 17.5 g formamide.

0.044 g Poly-methacrylvlcholin-chlorid. gelöst in0.044 g of poly (methacrylic) choline chloride. solved in

Formamid als Verdickungsmittel.
0.1 g Emulgator (statist. Copolymerisat n-Butylmcihacrylat/Methacryioylcholin - chlorid =90/10).Formamide as a thickener.
0.1 g emulsifier (statistical copolymer n-butyl methyl acrylate / methacryioylcholine chloride = 90/10).

Die Monomerphase wird durch konstantes Rühren in der organischen Phase verteilt. Die Polymerisation wird durch Zugabe von 0,25 g Dimethylanilin ausgelöst. Die Polymerisation dauert 8 Stunden bei einer Temperatur unter 30 C und andauerndem Durchleiten von CO,. Die erhaltenen feinen Perlen werden durch Dekantieren und Absaugen von der organischen Phase befreit, in Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.The monomer phase is distributed in the organic phase by constant stirring. The polymerization is triggered by adding 0.25 g of dimethylaniline. The polymerization lasts 8 hours for one Temperature below 30 C and continuous passage of CO. The obtained fine pearls are through Decanting and suction freed of the organic phase, washed in acetone and in vacuo dried.

Durch Bromtitration wurde ein Gehalt von 3,5 Gewichtsprozent Allylmethacrylat ermittelt.A content of 3.5 percent by weight of allyl methacrylate was determined by bromine titration.

B. Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats aus Acrylamid und GlykolmonoacrylatB. Production of a swellable bead polymer from acrylamide and glycol monoacrylate

In einem 500-ml-Rundkolben, ausgerüstet wie in A, werdenIn a 500 ml round bottom flask equipped as in A, will

70 g n-Heptan.70 g n-heptane.

70 g Perchloräthylen70 g perchlorethylene

vorgelegt. Nach Entfernen des Sauerstoffes mittels 2 g Trockeneis wird unter Rühren eine Monomerlösung zugegeben, bestehend aussubmitted. After removing the oxygen by means of 2 g dry ice, a monomer solution is obtained with stirring added consisting of

9 g Acrylamid,9 g acrylamide,

9 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat,
0,2 g N.N -Methylenbis(methacrylamid).9 g of 2-hydroxyethyl methacrylate,
0.2 g NN -Methylene bis (methacrylamide).

0,9 g Emulgator (wie in A),
10g Wasser,0.9 g emulsifier (as in A),
10g water,

Ig 0,1 %ige wäßrige Lösung von Ammoniumperoxydisulfat, Ig 0.1% aqueous solution of ammonium peroxydisulfate,

1 g 0,1 %ige wäßrige Lösung von Fe'"-sulfat.1 g of 0.1% aqueous solution of Fe '"sulfate.

Die Monomerphase wird durch konst. Rühren in der organischen Phase verleih. Der Reaktionsslart erfolgt durch Zugabe von 0,4 g l%iger wäßriger Schwefligsäure. Bei einer Reaktionsdauer von 8 Stunden wird die Temperatur auf 30'C gehalten. Während der gesamten Reaktionsdauer wird CO₂ eingeleitet. Die erhaltenen feinen Perlen werden durch Dekantieren und kurzes Absaugen von der organischen Phase befreit, in Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.The monomer phase is lent by constant stirring in the organic phase. The reaction takes place by adding 0.4% strength aqueous sulfuric acid. With a reaction time of 8 hours, the temperature is kept at 30.degree. _{CO 2 is passed in} during the entire duration of the reaction. The fine beads obtained are freed from the organic phase by decanting and brief suction, washed in acetone and dried in vacuo.

C. Herstellung eines quellbaren Acrylamid-Perlpolymerisats C. Production of a swellable acrylamide bead polymer

15 g Acrylamid werden in der in A angegebenen Weise in Suspension polymerisiert.15 g of acrylamide are given in the in A. Way polymerized in suspension.

D. Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats aus Acrylamid und GlykolmonomethacrylatD. Production of a swellable bead polymer from acrylamide and glycol monomethacrylate

Ein Gemisch aus 14,25 g Acrylamid und 0.75 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat wird in H;r in A angegebenen Weise in Suspension polymerisiert.A mixture of 14.25 g of acrylamide and 0.75 g of 2-hydroxyethyl methacrylate is given in H; r in A. Way polymerized in suspension.

E. Herstellung eines wasserlöslichen Mischpolymerisats von Acrylamid und VinyltoluolE. Preparation of a water-soluble copolymer of acrylamide and vinyl toluene

4,68 g Vinyltoluol und 17.06g Acrylamid wurden in 216 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und 0.216 g Azoisobuttersäure-dinitril zugegeben. Die Luft wurde aus dem Reaktionsgefäß durch Stickstoff verdrängt. Nach 2 Stunden bei 65^r C war die Polymerisation beendet. Das Fällungspolymerisat wurde abfiltriert und mit Tetrahydorfuran mehrfach gewaschen und getrocknet.4.68 g of vinyl toluene and 17.06 g of acrylamide were dissolved in 216 ml of absolute tetrahydrofuran and 0.216 g of azoisobutyric acid dinitrile were added. The air was displaced from the reaction vessel with nitrogen. After 2 hours at 65 ^° C., the polymerization was complete. The precipitation polymer was filtered off, washed several times with tetrahydrofuran and dried.

Ausbeute: 9,58 g.Yield: 9.58 g.

Gehalt an Toluylgruppen (UV-spektrometrisch bestimmt) 9 Gewichtsprozent.Toluyl group content (determined by UV spectrometry) 9 percent by weight.

Das Produkt wurde in Wasser gelöst und durch Gelfiltration an einem mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrangel mit einer Wasseraufnahme von 100 g je 10 g Trockensubstanz in Fraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts getrennt. Der mit dem Ausschlußvolumen eluierte Anteil (MW größer als 100000) wurde lyophylisiert und ergab 2,8 g.The product was dissolved in water and crosslinked by gel filtration on an epichlorohydrin Dextran gel with a water absorption of 100 g per 10 g of dry matter in different fractions Separated by molecular weight. The fraction eluted with the exclusion volume (MW greater than 100,000) was lyophilized to give 2.8 g.

Durch kombinierte Gelchromatographie des Anteils mit einem Molekulargewicht unter 100000 konnten 530 mg des Polymerisats vom Molekulargewicht 5000 bis 10 000 gewonnen werden, indem zunächst durch Gelfiltration an einem mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrangel mit einer Wasseraufnahme von 50 g je 10 g Trockensubstanz der Anteil mit einem Molekulargewicht unter 10000 und durch Gelfiltration dieses Anteils an einem Dextrangel (Wasseraufnahme 25 g je 10 g Trockensubstanz), der Anteil mit einem Molekulargewicht über 5000 gewonnen wurde.Combined gel chromatography of the fraction with a molecular weight below 100,000 was able to 530 mg of the polymer with a molecular weight of 5000 to 10,000 are obtained by initially by gel filtration on a dextran gel crosslinked with epichlorohydrin with a water absorption of 50 g per 10 g of dry matter the portion with a molecular weight below 10,000 and by gel filtration this part of a dextran gel (water absorption 25 g per 10 g dry substance), the part with a molecular weight above 5000 was obtained.

Herstellung trägergebundener Polypeptide
Beispiel 1Production of carrier-bound polypeptides
example 1

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung von Trypsin an AgaroseBinding of trypsin to agarose photosensitized by acetone

Agarose-Perlen wurden mehrfach in Wasser suspendiert, gewaschen und abzentrifugiert. 10g des erhaltenen Feuchtgels (entsprechend 100 mg Agarose) wurden in Wasser-Aceton-Gemisch (90/10), enthaltend 50 mg gelöstes Trypsin, suspendiert und in einer Schcnckschcn Behchtung.sapparatur. bestehend aus einem Tauclischaehl, Kiihlschacht und dem Reaktionsgefäß mit sauerstofffreiem Stickstoff, welcher durch 10% wäßr. Aceton geleitet wurde, I Stunde lang begast und anschließend mit einer Quecksilber-Hochdrucklampe (125 Watt) 18 Stunden lang unterAgarose beads were repeatedly suspended in water, washed and centrifuged. 10g of the moist gel obtained (equivalent to 100 mg agarose) were in water-acetone mixture (90/10) containing 50 mg of dissolved trypsin, suspended and in a Comfortable watch-out apparatus. consisting of a Tauclischaehl, cooling shaft and the reaction vessel with oxygen-free nitrogen, which by 10% aq. Acetone was passed I hour long fumigated and then with a high pressure mercury lamp (125 watts) for 18 hours

ίο gutem Rühren und bei Wasserkühlung belichtet. Bei der Belichtuni! war die Apparatur mit Aluminiumfolie umwickelt.ίο good stirring and exposed with water cooling. at the exposure university! the apparatus was wrapped in aluminum foil.

Nach der Belichtung wurde das Material durch Abzentrifugicren gewonnen, mehrfach mit Wasser und 1 N-NaCI-Lösung gewaschen und zentrifugiert.After exposure, the material was obtained by centrifugation, several times with water and 1 N NaCl solution and centrifuged.

Protein bestimmungProtein determination

Das Feuchlgcl wurde noch weitere Sinai mit Wasser gewaschen und lyophylisiert. Der StickstofT-gehalt wurde nach K j c 1 d a h 1 bestimmt und hieraus der ProtCHigehalt berechnet. Protcingehalt: 21V Ausbeute an gebundenem Protein: 63%.The Feuchlgcl was still further Sinai with Washed with water and lyophilized. The nitrogen content was determined according to K j c 1 d a h 1 and from this the ProtCHi content was calculated. Protein content: 21V Bound protein yield: 63%.

Enzymatischc AktivitätEnzymatic activity

5 g Feuchlgcl wurde mehrfach mit 0.05-M Phosphatpuffer. pH 7.5. gewaschen und das durch Zcnlrifugation gewonnene Feuchtgcl mit 20 ml Cascin-Substratlösung (4% Casein nach H a m m a r s t e η in verdünnter Natronlauge: pH 8.0) unter gutem Riihren bei 37 C inkubiert, wobei der pH-Wert durch Titration mit einer durch eine Glaselektrode gesteuerten automatischen Bürette konstant gehalten wurde. Nach 3- bis 4maliger Wiederbenutzung des En/ynipräparates in der angegebenen Weise wird eine enzymatisehc Aktivität von 270 E pro 100 mg Trockenprodukt bzw. 12.9 E pro Milligramm gebundenes Protein ermittelt. Als 1 Einheit (Fj wird diejenige Enzymmenge bezeichnet, die innerhalb 6() Minuten i μ Äq. Pcptidbindungcn spaltet.5 g Feuchlgcl was repeatedly with 0.05-M phosphate buffer. pH 7.5. washed and the Feuchtgcl obtained by centrifugation with 20 ml of cascine substrate solution (4% casein according to H a m m a r s t e η in dilute sodium hydroxide solution: pH 8.0) with thorough stirring incubated at 37 C, the pH by titration with a controlled by a glass electrode automatic burette was kept constant. After 3 to 4 re-use of the en / ynipreparation in the manner indicated, an enzymatic activity of 270 U per 100 mg of dry product is obtained or 12.9 U per milligram bound Protein determined. As 1 unit (Fj that amount of enzyme is designated which within 6 () minutes i μ eq. Pcptide bonds cleave.

Wiederholte Verwendung als Kriterium für kovalcnte BindungRepeated use as a criterion for covalent bonding

Nach 5maligcr Wiederverwendung wird keine Aktivitätsabnahme festgestellt. Dies stellt ein wichtiges Kriterium Tür das Vorliegen einer kovalentcn Bindung zwischen Trypsin und Agarose dar. Nur wenn die Aktivität nach beliebig häufiger Verwendung mit einem hydrophilen, hochmolekularen Substrat (hier: Casein bei pH 8) nicht abnimmt, kann von kovalenter Bindung gesprochen werden, da solche Substrate sehr gut geeignet sind, unspezifisch an den Träger adsorbiertes Protein auszuwaschen.No decrease in activity is observed after 5 re-uses. This represents an important one Criterion for the presence of a covalent bond between trypsin and agarose. Only if the activity after any number of uses with a hydrophilic, high molecular substrate (here: casein at pH 8) does not decrease, can be from covalent Binding are spoken, since such substrates are very suitable, unspecific to the carrier Wash out adsorbed protein.

Example 2

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung
von Trypsin an CelluloseBinding photosensitized by acetone
from trypsin to cellulose

1 g Cellulose (mikrokristallin 20 bis 100 μΐη) wurde mehrfach mit Wasser gewaschen und in einem Gesamtvolumen von 50 ml Wasser-Aceton-Gemisch (90/10), enthaltend 100 mg Trypsin, in der für Beispiel I beschriebenen Weise belichtet. ' Belichtunuszeit: 40 Stunden.1 g of cellulose (microcrystalline 20 to 100 μm) was washed several times with water and in a total volume of 50 ml of water-acetone mixture (90/10), containing 100 mg of trypsin, in the example I exposed manner. Exposure time: 40 hours.

G₅ AufarbeitungG ₅ work-up

Waschen mit Wasser und 1 N-NaCl-Lösung, wobei das Produkt über eine Glasfritle abgesaugt wurde.
Proteingehalt: 4,8%.Washing with water and 1 N NaCl solution, the product being filtered off with suction through a glass fritle.
Protein content: 4.8%.

Ausbeule an gebundenem Protein: 53%. bezogen auf eingesetztes Protein.Bound protein bound: 53%. based on inserted protein.

Enzymatische Aktivität pro 100 mg Trockenprodüki: 27,8 E bzw. 5,8 E pro Milligramm gebundenes Protein.Enzymatic activity per 100 mg dry product: 27.8 U or 5.8 U per milligram of bound protein.

Nach 5mal wiederholter Verwendung wird keine Abnahme der Aktivität festgestellt.No decrease in activity is observed after 5 times of repeated use.

Example 3

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung
von Trypsin an toluylgruppenhaltige CelluloseBinding photosensitized by acetone
from trypsin to cellulose containing toluyl groups

Cellulose (wie im Beispiel 2) wurde mit 4-Methylbenzoylchlorid zu einem 3,5 Gewichtsprozent Toluylgruppen enthaltenden Produkt verestert.Cellulose (as in Example 2) was made with 4-methylbenzoyl chloride esterified to give a product containing 3.5 percent by weight of toluyl groups.

1 g dieses Produktes wurde mit Wasser mehrfach gewaschen und in der Tür Beispiel 2 beschriebenen Weise mit Trypsin umgesetzt.1 g of this product was washed several times with water and described in Example 2 door Way implemented with trypsin.

Belichtungszeit: 15 Stunden.Exposure time: 15 hours.

Proteingehalt: 7,2%.Protein content: 7.2%.

Ausbeute an gebundenem Protein: 83%.Bound protein yield: 83%.

Enzym. Aktivität pro 100 mg Trockenprodukl: 49 E bzw. 6,9 E pro Milligramm gebundenes Protein.Enzyme. Activity per 100 mg dry product: 49 units or 6.9 units per milligram of bound protein.

Beispi el 4Example 4

Durch Aceton pholosensibilisierte Bindung
von Trypsin an Polyacrylamid-PerlenBinding phospholosensitized by acetone
of trypsin on polyacrylamide beads

1 g Polyacrylamidperlen. hergestellt nach C, wurden in Wasser gequollen, mehrfach mit Wasser gewaschen und über eine Glasfritte abgesaugt: 9,4g Feuchtgel.1 g of polyacrylamide beads. produced according to C, were swollen in water, washed several times with water and sucked off through a glass frit: 9.4g wet gel.

Das gesamte Feuchtgel wurde in der für Beispiel 2 beschriebenen Weise mit 100 mg Trypsin umgesetzt und gewaschen.The entire wet gel was reacted with 100 mg of trypsin in the manner described for Example 2 and washed.

Belichtungszeit: 35 Stunden.Exposure time: 35 hours.

Proteingehalt: 6,5% (UV-spektrometrisch nach alkal. Hydrolyse).Protein content: 6.5% (UV spectrometry according to alkaline hydrolysis).

Ausbeute an gebundenem Protein: 73%.Yield of bound protein: 73%.

Enzymat. Aktivität pro 100mg Trockenprodukt: 52,8 E.Enzymat. Activity per 100mg dry product: 52.8 E.

Enzym. Aktivität pro Milligramm gebundenes Protein: 8,1 E.Enzyme. Activity per milligram bound protein: 8.1 E.

Example 5

Durch Aceton photosensibilisierte BindungBinding photosensitized by acetone

von Trypsin an ein Perlpolymerisat aus Acrylamidfrom trypsin to a bead polymer made of acrylamide

und Allylmethacrylatand allyl methacrylate

1 g des Perlpolymerisats nach A wurde in Wasser gequollen und mehrfach mit Wasser gewaschen und abgesaugt (9,8 g Feuchtprodukt).1 g of the bead polymer according to A was swollen in water and washed several times with water and sucked off (9.8 g moist product).

Das gesamte Feuchtprodukt wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 4 mit 100 mg Trypsin umgesetzt. The entire moist product was reacted with 100 mg of trypsin in the same way as in Example 4.

Belichtungszeit: 12 Stunden.Exposure time: 12 hours.

Ausbeute an gebundenem Protein: 91 %.Yield of bound protein: 91%.

Proteingehalt (UV-spektrometrisch nach alkalischer Hydrolyse):7,9%.Protein content (UV spectrometry after alkaline hydrolysis): 7.9%.

Enzymai. Aktivität pro 100mg Trockenprodukt: E.Enzymai. Activity per 100mg dry product: E.

Enzymat. Aktivität pro Milligramm gebundenes Protein: 11 E.Enzymat. Activity per milligram of bound protein: 11 E.

Example 6

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein PerlpolymerisatBinding of trypsin to a bead polymer, photosensitized by acetophenone

aus Acrylamid und Allylmethacrylatmade of acrylamide and allyl methacrylate

Das Verfahren vom Beispiel 5 wird wiederholt mit dem Unterschied, daß in 50 ml wäßrig gesättigter ίο Acetophenonlösung (Gehalt UV-spektrometrisch: 0,003 Mol/l) lediglich 2 Stunden lang belichtet wurde. Ausbeute an gebundenem Protein: 87%. Proteingehalt: 7,5%.The procedure of Example 5 is repeated with the difference that in 50 ml of aqueous saturated ίο Acetophenone solution (content by UV spectrometry: 0.003 mol / l) was only exposed for 2 hours. Yield of bound protein: 87%. Protein content: 7.5%.

Enzymat. Aktivität 103 E/100 mg Trocken produkt; 13,4 E/mg gebundenes Protein.Enzymat. Activity 103 U / 100 mg dry product; 13.4 U / mg bound protein.

Example 7

Durch Propiophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein Perlpolymerisat aus Acrylamid und AllylmethacrylatBinding of trypsin to a bead polymer, photosensitized by propiophenone made of acrylamide and allyl methacrylate

Beispiel 6 wirde mit dem Unterschied wiederholt, daß die wäßrige Phase 5% Methanol und 0,005 Mol/l Propionphenon enthielt.Example 6 is repeated with the difference that the aqueous phase contains 5% methanol and 0.005 mol / l Contained propionphenone.

Ausbeute an gebundenem Protein: 96%.Bound protein yield: 96%.

Proteingehalt: 8,1%.Protein content: 8.1%.

Enzymat. Aktivität 98 E/100mg Trockenprodukt; 12,1 E/mg gebundenes Protein.Enzymat. Activity 98 U / 100mg dry product; 12.1 U / mg bound protein.

Example 8

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein mit p-ToluylsulfochloridBinding of trypsin to a photosensitized by acetophenone with p-toluene sulfochloride

modifiziertes Mischpolymerisat aus Acrylamid undmodified copolymer of acrylamide and

2-HydroxyäthylmethacryIat (1 :1)2-hydroxyethyl methacrylate (1: 1)

Das Perlpolymerisat von A wurde zu einem 3,5 Gewichtsprozent Toluylgruppen enthaltenden Produkt tosyliert und wie im Beispiel 6 mit Trypsin in Gegenwart von Acetophenon umgesetzt ucd anschließend aufgearbeitet.
Belichtungszeit: 2 Stunden.The bead polymer from A was tosylated to a product containing 3.5 percent by weight of toluyl groups and reacted with trypsin in the presence of acetophenone as in Example 6 and then worked up.
Exposure time: 2 hours.

Ausbeute an gebundenem Protein: 78%.Bound protein yield: 78%.

Proteingehalt im Produkt: 6,8%.Protein content in the product: 6.8%.

Enzymat. Aktivität pro 100mg Trockenprodukt: E.Enzymat. Activity per 100mg dry product: E.

Enzymat. Aktivität pro Milligramm gebundenesEnzymat. Activity per milligram bound

Protein: 12,3 E.Protein: 12.3 E.

Example 9

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein Mischpolymerisat des Acrylamids mit 2-Hydroxyüthylmethacrylamid nach dessen chemischer Modifizierung mit 4-Methylphenyl-Binding of trypsin to a copolymer of acrylamide photosensitized by acetophenone with 2-Hydroxyüthylmethacrylamid after its chemical modification with 4-methylphenyl-

essigsäure-Chlorid 6o acetic acid chloride 6o

Das Perlpolyinerisat von D wurde durch Umsetzung mit 4-Methylphenylessigsäurechlorid zu einem 1,2% Toluylgruppen enthaltenden Produkt modifiziert. The Perlpolyinerisat from D was by reaction with 4-methylphenylacetic acid chloride to one Modified product containing 1.2% toluyl groups.

1 g des modifizierten Produkts wurde in der im Beispiel 6 beschriebenen Weise mit Trypsin in Gegenwart von Acetophenon umgesetzt. Belichtungszeit: 4 Stunden.1 g of the modified product was in the manner described in Example 6 with trypsin in the presence implemented by acetophenone. Exposure time: 4 hours.

609 629/241 609 629/241

Ausbeute an gebundenem Protein: 85%.Bound protein yield: 85%.

Proteingehalt im Produkt: 7,4%.Protein content in the product: 7.4%.

Enzymat. Aktivität pro ICOmg Trockenprodukt: 81,5 E.Enzymat. Activity per ICOmg dry product: 81.5 E.

Enzymat. Aktivität pro Milligramm gebundenes Trypsin: 11 E.Enzymat. Activity per milligram of bound trypsin: 11 E.

Example 10

Durch Acetophenon photosensibilisierte BindungBinding photosensitized by acetophenone

von Ribonuelease an ein Mischpolymerisat vonof ribonuelease to a copolymer of

Acrylamid und Vinyltoluol von MW über 10000Acrylamide and vinyl toluene of MW over 10,000

500 mg des löslichen Polymeren nach E und 40 mg Ribonuelease A (chromatographisch einheitlich, 50 E/mg) wurden in 50 ml mit Acetophenon gesättigtem Wasser gelöst und wie im Beispiel 6 2 Stunden belichtet. Das Produkt wurde lyophilisiert und zur Befreiung von Spuren Acetophenon mit Äther gewaschen. Ein Aliquot wurde in 0,05-M Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und an Dextrangel (100 g H₂O-Aufn./10 g Trockensubstanz) getrennt. Die mit dem Ausschlußvolumen eluierten Fraktionen wurden vereinigt, gegen Wasser dialysiert und lyophylisiert.500 mg of the soluble polymer according to E and 40 mg of ribonuelease A (chromatographically uniform, 50 U / mg) were dissolved in 50 ml of water saturated with acetophenone and exposed as in Example 6 for 2 hours. The product was lyophilized and washed with ether to remove traces of acetophenone. An aliquot was dissolved in 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5) and separated on dextran gel (100 g H ₂ O uptake / 10 g dry matter). The fractions eluted with the exclusion volume were combined, dialyzed against water and lyophilized.

Der nicht gebundene Anteil (freie RNase) wurden ebenfalls vereinigt lyophylisiert, in 10 ml Wasser gelöst und die Extinktion bei 280 nm gemessen, sie entsprach einer Gesamtmenge von 8,5 mg nichtgebundener RNase. Hieraus wurde der an den löslichen Träger gebundene Anteil zu 79% des eingesetzten Enzyms berechnet.The unbound portion (free RNase) were also combined, lyophilized and dissolved in 10 ml of water and the absorbance measured at 280 nm, it corresponded to a total of 8.5 mg unbound RNase. From this, 79% of the enzyme used was bound to the soluble carrier calculated.

Die enzymatische Aktivität wurde alkalimetrisch im Autotitrator bei pH 7,5 und 37^CC mit Hefenucleinsäure als Substrat bestimmt. Sie betrug 35%, bezogen auf nichtgebundenc: RNase und den RNasegehalt des Trägers.The enzymatic activity was determined alkalimetrically in an autotitrator at pH 7.5 and 37 ^C C with yeast nucleic acid as substrate. It was 35% based on unbound c: RNase and the RNase content of the carrier.

Bei einem Vergleichsversuch ohne Belichtung konnte keine Bindung von RNase an den Träger gefunden werden.In a comparative experiment without exposure, no binding of RNase to the carrier could be found will.

Beispiel 11
Durch Acetophenon photosensibilisierte BindungExample 11
Binding photosensitized by acetophenone

von Insulin an ein Mi^P«£5 ^lÄ
_und vinyltoluol vom MW 5000 bis IUlHR)of insulin to a Mi ^ P «£ 5 ^ lÄ
_and vinyl toluene from MW 5000 to IUlHR)

50 ml Wasser wurde mit Acetophenon gesättigt n insulin sowie 400 mg des in E erhaltenen50 ml of water was saturated with acetophenone n insulin and 400 mg of that obtained in E.

^I0SSztud^Lwr^^ie.m2Stundenb,
Durch Chromatographie an Dextrangel (5Og H₂O-Sn/10« Trockensubstanz) wurde nichtgebundenes Insulin von trägergebundenem Insulin getrennt Es ^I0 SSztud ^L wr ^^ ie.m2hoursb,
Non-bound insulin was separated from carrier-bound insulin by chromatography on dextran gel (50 g H _{2 O-Sn / 10% dry substance)}

,5 wurden 380 mg eines Produkts mit einem Molekular-Seht über 10000 mit einem Proteingehalt von fnnPwichtsDrozent gewonnen. Gelfiltration dieses £33 Äextranle! (100g H^Aufa/JO, Jrokkensubstanz) ergab ein MW > 100 000 fur den größten, 5 became 380 mg of a product with a molecular vision Obtained over 10,000 with a protein content of five percent by weight. Gel filtration this £ 33 eextranle! (100g H ^ Aufa / JO, Jrokken substance) resulted in a MW> 100,000 for the largest

^T<Bei einem Vergieichsversuch ohne Belichtung wurde keine Bindung von Insulin an den Träger gefunden. ^{T <} In a comparison test without exposure, no binding of insulin to the carrier was found.

Example 12

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung
von Insulin an DextranBinding photosensitized by acetophenone
from insulin to dextran

1000 mg Dextran 150 (MW 150000) und 100 mg Insulin wurden in 50 ml mit Acetophenon gesättigtem Wasser gelöst und die Lösung mit 0,5 ml 0,1 N-SaIzsäure auf pH 4,0 gebracht.1000 mg of dextran 150 (MW 150,000) and 100 mg of insulin were saturated in 50 ml with acetophenone Dissolved water and brought the solution to pH 4.0 with 0.5 ml of 0.1 N hydrochloric acid.

Belichtung wie beim Beispiel 11.Exposure as in Example 11.

Durch Gelfiltration an Dextrangel (100 g H₂O-By gel filtration on dextran gel (100 g H ₂ O-

Aufn/10 g Trockensubstanz) wurden ein Produkt mitAufn / 10 g dry substance) were a product with

einem Insulingehalt von 5,8% gewonnen, was etwaan insulin content of 5.8%, which is about

einer Ausbeute von 55%, bezogen auf eingesetztesa yield of 55%, based on the amount used

Insulin, entspricht.Insulin.

Claims

Γχ Patent claims:

1. A method for producing carrier-bound ^ polypeptides, characterized in that

^. that the aqueous solution of a polypeptide in the presence of a non-peptide macromolecular one Carrier compound and a photosensitizer known per se in the absence Hop. Oxygen with ultraviolet light or - at ^ additional presence of an organic peroxide - irradiated with visible light.

2. The method according to claim 1, characterized in that one is a light radiation with a Wavelength over 290 nm can act.

3. The method according to claims 1 and 2, characterized characterized in that the macromolecular carrier bond has a molecular weight above 1000. preferably over 10,000.

4. Verlahren according to claims 1 to 3, characterized in that the macromolecular Carrier compound is water-soluble or water-swellable.

5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the macromolecular Carrier compound is a water-insoluble, crosslinked compound.

6. The method according to claims 1 to 5, characterized in that the macromolecular Carrier compound contains pendant alkenyl and / or alkylphenyl groups.

7. The method according to claims 1 to 6, characterized in that the macromolecular Inert compound a polysaccharide or homo- or copolymer of acrylic amide or vinylpyrrolidone.

8. The method according to claims I to 7, characterized in that the macromolecular Carrier compound is a cross-linked bead polymer made from a predominant proportion of acrylamide and vinylpyrrolidone or hydroxyalkyl acrylate or methacrylate and optionally a smaller proportion Vinyl toluene, allyl acrylate or methacrylate or a polyallyl ester of a polybasic one Acid is.

9. The method according to claims 1 to 8, characterized in that the dissolved protein an enzyme. Is enzyme inhibitor, antibody, or hormone.