DE2256838A1 - Wasserloesliches immunologisches adjuvans - Google Patents

Description

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Patentanwälte Dipl.-Ing. R We j c km'Ann, "■ · ι

DlPL,-1N-G. H. WeICKMANN₅ DlPL.-pHYS. Dr. K. FltiCKE DlPL₁-ING-RA₁WErCKMANN, DlPL.-ClTEM. B. HUB ER

8MONCnKNSO₁DEN POSTFACH S60 820; ".--."-" MÖHLS7RASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

AGTiNCIi: ITAI'TOITALE LE VALORTSATTON- TjE J;A E¹VCHrSCH^ Tour Auroru, Parif-Doiensc, P--92. Oourhovoie

Die Erfindung betrifft löbliche Mit-tcl,- äie als immimologi^che Adjuvantißn wirksam- ::inä, um in einem Wirtsorganiomus das ίτηκυηο-logische Anpprechen auf verschiedene Arten von Antigenen zu stimutieren. 'Die Erfindung "betrifft insbesondere . Adjuvantien,, die da?;u dicnori, die "Wirkung von schwachen Immunogenen zu verstärken und 2u steigern.

Die Erfindung bezieht eich ganz besonders auf lösliche Mittel, die als- Adjuvantien wirksam ein"d und die aur 'Imsiunisierung des Menschen und von V/armbiütlern gegen bakterielle Infektionen, Virufjinfektionen und parasitäre Infektionen· sowie gegen verschiedene Gewebeantigene normalen oder pathologischen. Ursprungs, insbesondere gegen Tumoren, verwendbar sind.

Substanzen .mit Adjuvirriseigenschaften sind seit langem bekannt. So weiss man beispielsweise wohl, dass Materialien, wie -Zellen und. ZellwKnde' von Fl.ycobaktcrien die Antikörperbildung in dem Wirtsorgaiiinjims erhöhen und insbesondere die .Resistenz des V/irtsorganicjLuc gegen Infektionon durch zahlreiche Mikroorganismen" steigern. ■

Die bekannten Substanzen dieses Typs, v.'io das vollständige Adjuvann n-'joh itTemi*, die voll-trlndige Mycobakterien-Zellen <■ Tj thai ten, haben, rich ±:n Hinblick auf ihre therapeutische Anwendung nls nich t V₁ ¹Unsehenswert einviesen, weil sie ungünstige ];r-fjl..tionen hervorrufen. Sie koniven beispieüsv/eise die

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üc?n r> ib.il.i tat des Y.Wiiorganisifrus gegen lü.dotoxir.'O erhöhen, eine HyperiieiisihilitUL gegenüber Tubtr'iulin erzeugen und Granulöse und cjne Jlyperpla^ic des I^iuphoidgfn^bos verursachen und hormon unter gcwissen Bedingungen eine experiKcntel·-- Ie Polyori:ltrjtis bei der Ratte hervorrufen. Außerdem waren die Adjuvantien auf Bau is von mycobakto.ricl3.en Substanzen

bis jetzt wegen ihrer Unlöüllenkeit nur schwierig zu reini gen .

Erfindungr-gemäß wurde nun festgostel.lt, daß in Wasser lösliche, aus liycobcikterien, Nocardia-Zullen oder verv/andtcn Mikroorganismen extrahierte losIiehe Mittel die Nachteile der bisher bekannten Mycobakterien-Substanzen nicht aufweisen.

Diese erfindungKgeiüäßen neuen Mittel zeigen als Adjuvans eine Aktivität, die im allgemeinen stärker ist als die von mycobakteriellen Präriaraten, die vollständige Mycobakterien-Zellen enthalten, und besitzen nicht die schädlichen Wirkungen, die den bisher bekannten Präparaten eigen sind. Darüberhinaus können diese neuen Kittel unter geeigneten Bedingungen ebenso ihre Adjuvans-V/irkung ausüben, wenn sie mit dem Antigen in einer wässerigen Lösung, gegebenenfalls in Gegenwart von Substanzen, wie Aluminiumhydroxyd und Kalziumphosphat, in Suspension gebracht werden. Aufierdein wird durch ihre Wasserlöslichkeit ihre Reinigung sehr erleichtert.

Die bevorzugten Mittel, die unter den erfindungsgemäßen Bereich fallen, besitzen alle vorteilhaften Eigenschaften von vollständigen Mycobakterien-Zellen, ohne ihre störenden Nebenwirkungen aufzuweisen. Diese Mittel werden in dem wässerigen Medium erhalten, in welchem Zellen von Mikroorganismen der Gruppe der Mycobakterien, Zellen von Nocardia oder von verwandten Mikroorganismen oder Zellwände dieser Mikroorganismen nach der vorhergehenden Entfernung von Lipoiden aus diesen Zellen oder Zellwänden, in Gegenwart eines murolytischen Enzyms, beispielsweise einer Furamidase, wie Lysozym, behandelt wurden.

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BADORIQtNAL

D.i e erfinclungsgcniäßon Mittel "werden- aus Zeilen von pathoge-;-ncxi vie auch von rsichtpathogenen I^Oobnlvüerion/ Zellen von Kooardia und von verwandten Milo'eor^anlsiiien LergestelltV /ils Beispiele für Kvcobakterico_f die. al f. />ur>&::j:ig;ii«üter.ia:l zur Herstellung dyr erflimuiigsgamäßon Adjuvantien venmn können Hvoobcctc/riuni tub^rculo^!«, var. ho ro in is oder insbenondere Bacillus Calmetto Guerin (BCG), Hycobactcrium kaiica'Dii, Hycobrurterium smeymatis oder andere zur Gattiuig lxKvbariuiii gehörige Organismen genannt werden.

Das erfinäiirjgsßfijiräße löslicbo· Adjuvans lean« durch Anv/endung. eiDOG nachstehend ixiSchT'iebenrm Verfahrons auf Zellen, die au« i.).iner Kultur von Mycobakterien gewonnen vurden_} Zellen von NooaräJ-a oder von mit' diesen verwandten Rikroorganismon" · erhalten v/erden« Die Sturen dieses Verfahrens bestehen in der Behandlung der vorstellend genannten ZeOlon oder dor durch Zersprengen dieser Zellen erhaltenen ZeHv/ande mit LÖsimgsroitteln zur Entfernung von Lipoiden. der anschließenden EehandlUrng der entfetteten P4atorialioia mit einem muroXytischen Enzym, "beispielsv;ei.se einer Muramidase, vie 3^/ßozym, dem-Ent-fernen der erhaltenen festen Fraktion und der Gewinnimg- der wässerigen Fraktion, die das lösliche-Adjuvans enthält.

Gemäß einer ersten- Auüführungsforrn des erfindungsgemäßen Ver~ fabreiiB züchtet man einen Stamm von Mycobakierien, Kocardia-Zellon oder verv/andter Hikroorganiüraen, gewinnt die Zellen aus de la gezüchteten Stamm, führt die Desintegration der Zellen durch, gewinnt die zersprengten".Zollwände, beispielsweise

durch DiffereutJalzentrifugation, trennt die Wachse, die freien Fette, die Proteine und d.i e Nucleinsäuren ab und entfernt sie, führt den Abbau des aus den Zellwanden stammenden, entfetteten Materials - mit Hilfe eines murolytischen Enzyms, beispielsweise einer Muramidase, wie Lysozym durch, entfernt den festen -Rückstand und. gewinnt die wässerige·-Fraktion, welche d.i ο erfindungßgemäßen löslichen Mittel eirbhält.

Vor:'.u;.;r.weise vordon die störenden Proteine entfernt, indem

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das Materini der zersprengten Zellwände mit protcolytii-irb.e'ii Enzymen behandelt wird, vie Trypsin und Chymotrypsin, und die Nucleinsäuren .werden durch Behandlung diesea Materials mit Desoxy.'.'-ibonuclcayo odor Di'Jano entfernt; die freien Fette und die Wachse wurden durcli Behandlung dieses Materials mit neutralen Lösungsmitteln, wie Aceton, Alkohol, Chloroform oder Ge mir. c ho η dieser Lösungsmittel entfernt.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens v;ird ein Stamm von Mycobakterien, Nocardia-Zcllen oder verwandter Mikroorganismen gezüchtet, die Zellen des gezüchteten Stammes v/erden gewonnen und mit Lösungsmitteln zur Lipoi el entfernung behandelt. Die von Lipoiden befreiten Zellen werden der Wirkung eine» muro3ytischen Enzyms, beispielsweise einer Muramidase, wie Lysozym, ausgesetzt, die feste Fraktion wird anschließend entfernt und die das erfindungßgemäße Adjuvant enthaltende flürjnige Fraktion wird gevonnen.

Die Entfettung bzw. Entfernung von Lipoiden wird vorteilhaft unter Rückfluß in einem Soxhlet» oder Kurnagawa-Extraktor durchgeführt, die von Lipoiden befreiten Zellen v/erden dann mit V/asser und danach mit einer 0,1 m Äinmoniumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,2 gewaschen, bevor sie der Einwirkung von Lysozym unterworfen werden. Diese Pufferlösung, die ermöglicht, daß Lysozym unter optimalen Bedingungen einwirkt, kann danach vollständig entfernt werden, insbesondere durch Lyophilisieren.

Die zv/eite Ausführungsforrn des erfindurigsgemäßoü Verfahrens ist nicht nur einfacher in der Verfahrensweise und führt zu höheren Ausbeuten, sondern ermöglicht es außerdem,· eine bestimmte Zahl von Nachteilen zu vermeiden, mit denen die vorstehend beschriebene erste Ausführungsfcrm behaftet ist. Diese Kachteile bestehen in der Schwierigkeit, gereinigte· Zollwände in größorcn Mengen herzustellen, in der .Notwendigkeit, Verfahreiiüßchritte z.um Aufbrechen der Zellen und zum

Abtrennen der aufgebrochenen Zellwände' anzuwenden, insbesondere durch Differentialzentrifugetion, wobei es sich um schwierige; und langwierige Vorfarirensschritte handelt, und schließlich iri den erhaltenen geringen-''Ausbeuten (maximal . 1 Gew.?*, bezogen auf den als Aus gangs material verwendeten trookenc-n Bazillus).

Das am Ende de-s erfindungsgeniäßen Verfahrens erhaltene, in der wässerigen Fraktion vorliegende Adjuvans wird vorteilhaft einer zusätzlichen Reinigurgsbehaidlun> unterworfen, .die insbesondere im Gefriertrocknen oder Lyophilisieren. dieser was-

serigen Fraktion, dem Aufnehmen des trockenen Extrakts mit Hilfe einer geeigneten wässerigen Lösung besteht, welche seine Filtration durch ein Molekularsieb ermöglicht, insbe-. sondere dem Aufnehmen in 0,1 m Essigsäure* Vorzugsweise werden eolche Molekularsiebe verwendet, wie sie unter den Be zeichnungen Sephadex, beispielsweise "Sephadex, G 75 oder G 50" im Handel erhältlich sind. "

Die Reinigung kann noch stärker durchgeführt werden, insbesondere durch Inkubieren des erhaltenen Mittels in Gegenwart eines proteolytischen Enzyms, wie Trypsin, im wässerigen Medium, insbesondere in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa 8,2.

Die erfindungsgemäßen Mittel, welche die üblichen Aminozucker und Aminosäuren der Zellwand enthalten, scheinen aus Oligomeren oder Teilen von Oligomeren aus Monomereinheiten zu bestehen, die eine ähnliche chemische Struktur haben, wie die Monomereinheiten der Zellwände von Mikroorganismen, aus denen sie extrahiert wurden, ausgenommen, daß der Lipoid~Te.il fehlen kann oder in allen Fällen sehr gering ist. Die Monomereinheiten der■Zellwand "enthalten ein Mucopeptid, das verbunden ist mit einem Glycolipoid, welches ein Arabinogalactan enthält. Eine hypothetische Struktur eines Monomeren der ZeIlwnmd von Mycobakterien (Molekulargewicht etwa 3.000) wurde von L¹. Lederer in einem Artikel über die Chemie der Zellwand

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BADORiGlNAL

von Kycobakt:·.·!?..··.- :■:..."Pure and Applied Chemistry, 2J3, 1971, Seite 135", vorgeschlagen.

Die eri"jiicIungi;gG!"!;u.ßen iJittsl sind besonders dadurch gekennzeichnet, daß sie folgenä.3 Bestandteile enthalten:

a) Keutrale Zucker (die insbesondere Galactose und Arabino.se umfassen),

b) Aminozucker (D-Glucosa-nin und D-i-iuraminsäure),

c) Aminosäuren (insbesondere L- und D-Alanine, D-Glutauinsäure und Heso-'.'/- >·-Diaminopimelinsäure),

d) gegebenenfalls Lipoide oder Fette in geringen Anteilen oder höchstens in Anteilen von 5%.

Die erfindungsgemäßen Mittel sind bei üblicher Umgebungstemperatur (Raumtemperatur) mindestens während einiger Monate stabil und können ohne Verlust ihrer Aktivität lyophilisiert werden. Mach dem Lyophilisieren stellen die gereinigten Mittel ein flockiges, schneeweißes tJaterial dar, das leicht in V/asser löslich ist und eine leicht opaleszierende Lösung ergibt. Die Mittel sind unlöslich in Äther, in Chloroform, in Aceton und in Äthanol-Chlor of orm-Gernischen.

Die nach der zweiten Ausführungsforin des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen rohen Adjuvantien enthalten einen größeren Anteil an Aminosäuren, als die nach der ersten AusfUhrungsform hergestellten. Dies kann auf die Tatsache zurückgeführt v/erden, daß die ersteren eine gewisse Anzahl anderer Aminosäuren als die von Peptidoglycari enthalten, die bei der vorstehend beschriebenen Behandlung nicht extrahiert wurden. Diese Aminosäuren lassen sich jedoch zumindest teilweise während der vorstehend angegebenen verstärkten Reinigungsbehandlung mit einem proteolytischen Enzym, wie Trypsin, entfernen.

Andere Besonderheiten der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung von bevorzugten Aus.führungsformen der Züchtungsund Extraktionsverfahren der erfindungsgöinäßcn Materi-

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allen ersichtlich. Diese als Beispiele angegebenen Ausführungsfornicn sollen lediglich der' Erläuterung der Erfindung, dienen. .'-"'■■

Zel3.cn .von Hycobacterium/sraegmatis, eines bei der American Typ«* Culture Collection unter der ATCC Nr. 21732 hiirfcerlegten Stammes' werden in Roux-Kolben auf einem Sauton-Hedium während'etwa. 12 Stunden bei 37^C gezüchtet, Sie- werden durch. Filtration auf-einem Papierfilter gesammelt, mit destilliertem Wasser gev-'aschon ■■ und bei -20⁰C bis zur Verwendung aufbewahrt.

100 β der Zellen v/erden in 500 ml destilliertem Wasser durch Kaltnischen in einem V/aring-Hischer, der vorher gekühlt worden ist» in Suspension gebracht, bis eine homogene Suspension erhalten wird. Dann"werden die Zellen in einer vorher gekühlten French-Presse, die in einem gekühlten Raum betrieben wird, unter 420 kg/era desintegriert. Nach einem ersten Durchgang wird 1 mg"DIJase zugesetzt, um die Viskosität zu vermindern. Dann wird die Suspension ein zweites Mal durch die French-Presse geschickt. Außer der Desintegration der Zellen durch mechanischen Druck läßt sich das Zerbrechen der Zellen auch durchführen, indem 30 ml der Suspension während 25 Hinuten (5 mal 5 PJinutoii) einer Schallvibration in einem gefühlten Raytheon-lMtraGCJialloszlllator von 10-IiKz ausgesetzt werden. Ebensogut kann das- Zerreißen der Zellen durch Gefrieren und Wiederauftauen, durch Zeolith-Behandlung, durch Rühren in Gegenwart von Glaskugeln oder durch alle anderen, üblicherweise zum Zerreißen von ICi kr ob er.z eil en angewendeten "Methoden erfolgen.

Die resultierende Suspension wird dreimal während 15 Minuten mit 800 g in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Die . aus nichtzerbrochenen Zellen bestehenden Kuchen werden· verworfen. Die letzte überstehende- Flüssigkeit wird während einer Stunde bßi 27·5CO g zentrifugiert; die aus Zellv/and-

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material bestehenden erhaltenen Kuchen v/erden wieder in ' 750 ml O₁OoG m Nati'iur-phosphat-Pufforlösung mit einem pH« l/ert von 7,G suspendiert, der 125 mg Trypsin, 125 mg Chymotrypsin u:<;c> eine gerinne Menge eines antiseptischen Mittels» wie To]uol, zugesetzt werden, um jegliche bakterielle Verunrc;inj;^r;;un^ zu vermeiden. Man läßt das Gemisch über Nacht in eine;;i jrikubator bei Raumtemperatur \inter Magnetrührirag und zentrifugiert anschließend das Gemisch während einer Stunde bei 27.!3OO g. Die Kuchen aus Zellwandinaterial werden· durch erneutes Suspendieren und Zentrifugieren dreimal mit kalter Phosphat-Pufferlösung und dreimal mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen.

Das Materia] der Zellwände wird dann bei gewöhnlicher .Umgebungstemperatur (Raumtemperatur) mit inerten bzw.: neutralen Lösungsrriittelu entfettet« Zu diesem Zweck v,^rird dieses Material erneut in etwa 30 Voluinteilen des Lösungsmittels in Suspension gebracht, welches man während etva einem Tag unter Rüljren einwirken läßt. Das Material der Zellwände wird auf diese Weise dreimal mit Aceton, dreimal mit Äthanol-Äther (1:1), dreimal mit Chloroform und dreimal mit Chloroform-Methanol (2:1) von Lipoiden befreit. Anschließend, wird dieses Material mit Aceton getrocknet. Das getrocknete und entfettete Zellwandmaterial kann danach bei Raumtemperatur bis zur Verwendung aufbewahrt werden.

1 g des so erhaltenen entfetteten Zeilwandniaterials wird in 250 ml einer 0,1 m Ainmoniumacetatlösiuig mit einem pH-V/ert von 6,2 wieder in Suspension gebracht und über Nacht in der Kälte unter Zusatz von einigen Tropfen Toluol als Konservierungsmittel aufbewahrt. D^nn wird das Material mit einer Glasfritte filtriert und mit Äthanol und Chloroform gewaschen, Das so gewaschene Zellwandmaterial wird darin erneut in 150 ml einer 0,1 m Ammoniuraacetatlösung .Qit einem pH-Wert von 6,2 suspendiert und der Suspension werden 12 mg Lysozyra und einige Troyfoii Toluol zugesetzt. Das Gemisch vdrd eine Hacht bei 37⁰C unter Rühren im Inkubator gehalten. Nach der Filtration

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mit einer Glasfritte wird der unlösliche Rückstand noch einmal unter den gleichen Bedingungen jni.t Lysozyrn behandelte Bio beiden Filtrate v/srdon vermischt, lyopliilisi&rt, errieut im Wasser gelöst und lyophilisiert, bis das, Ar;u::oniuinar.etat ent- fernt ist« Ausbeute: Etv;a 90 mg eines in V/asaer löslichen Rohprodukts pro g. des entfetteten getrockneten Zellwandmaterials. ' '

Das in Wasser lösliche Rohprodukt (500-mg) wird danach über eine Säule mit Sephadex G 50 (Höhe 80 cm, Durchmesser 2,5 cia), äquilibriert mit 0,1 η Essigsäure, geleitet. Der aus der Säule austretende erste Peak, der gut von verbleibenden Produkten abgetrennt ist, enthält das erfindungsgeraäße Mittel in gereinigter Form (150 mg)., das durch die nachstehend angege- * benen analytischen Daten gekennzeichnet wird.

G = 42,84#; H = 6',49#; N =■-3,9655; P = 0,190; S = O.

Aminozucker, die im wesentlichen aus D-Glucosamin

und D-Muraminsäure in äquimolaren Anteilen bestehen, 12 - 1

Aminosäuren, die im wesentlichen aus L- und D-Alanin, D-Glutaminsäure und .Meso/- \ - ti-Diaminopimelinsäure im Verhältnis 1,3:1 :1 bestehen 12-1

Neutrale Zucker,, die im wesentlichen aus D-Arabinose

und D-Galactose im Verhältnis etwa 2:1 bestehen . 60 -J

Lipoide weniger als 5%

J_D in Vfesser + 11,3° - 0,5°

Sedimentaticnskaeffizient in Phosphat-Pufferlösung,

pH 7,0, ja = 0,1 bei 20⁰C und einer Konzentration

C = 4,8 mg/ml, liegt in der Größenordnung von ^s?n ~ ^,05

Das UV-Spektrum weist eine kennzeichnende Endabsorption bei weniger als 230 nm auf. ■

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SAD

Das Irif r e r ot ~-8p ο ktrii::·, do^r^n boidc Teile in den beil.ic;· fanden Figuren 1 und 2 dargestellt sind, zeigt Banden bei 1650.und Ü)20 cnf'¹ (Amidbandon) und bsi 1000 bis 1100 cnf (Oli-Gruppcn).

In der Ultrazentrifuge verhalten sich die Losungen' wie ein

lc.ient pulyci.'-iporses r.;akromolol"ulares homogenes System.

In Figur 3 der beiliegenden Zeichnungen sind die Elutionskurven. der aus der Säule austretend.?]"!. Produkte dargestellt. Die?so Kurven wurden erhalten, indem der Gehalt von aufeinanderfolgenden 5 ml -Fraktionen an freien Aminogruppen nach der Methode von J.II. Ghuysen, D.J. Tipper, und J,L. Strominger, in "Methods in ijnzynology VIII, S· 685, Academic Press, Nev/ York, (1>66), an N-Acetylhexosa.minen, ausgedrückt als Äquivalente an W-Acetylglucosaiainon, nach 30-minütigem Erhitzen in einem alkalischen Puffer nach der Methode, die von den gleichen Autoren in der gleichen Veröffentlichung beschrieben ist,und an neutralen Zuckern durch Reaktion mit Orcinol nach der Methode von C.' Rimington, in Biochom. J., J54 , 931 (1940) analysiert wurde. Die Kurven der Figur 3 stellen die Veränderungen der Konzentrationen an freien Aminogruppen (Kurve a), an N-Acylhozosaminen (Kurve b) und neutralen Zuckern (Kurve c) in aufeinanderfolgenden 5 ml-Fraktionen dar, die in der Reihenfolge steigender Kummern auf der Abs™ zisse angegeben sind. Die Konzentrationen (in Millimol/ml) der Fraktionen der N-Acylhexo.saniine und der freien Aminogruppen sind auf der Ordinate (1), die der neutralen Zucker auf der Ordinate (2) aufgetragen.

Das Überleiten bzw. die Filtration über eine Säule aus Sepha- aex G 75 ergibt einen größeren Peak, der eine Schulter trägt. Dieser Peak scheint zv/si Fraktionen der gleichen Zusammensetzung zu enthalten, die sich wahrscheinlich nur durch ihre Molekulargewichte unterscheiden.

Die dem zweiten Peak der JSlution der Sophadex G 50-Säule entsprechenden Fraktionen, die sich von der ersten Fraktion -*' dieses V i 11 e 1B

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gut unterscheiden, enthalten /substanzen rait niedriger eta Molekulargewicht, die* ebenfalls in den Bereich der -Έτι indtmg f alle; r>. DiGsr; Sub s tan;?., ο η besitzen die neclistehend bc-üchrieberie pharinakolgoiscbe /aktivität und sind zu den. nachstehend be- , schriebanen Zwecken verwendbar.

Nachstehend v/ird mit "Substanz A" das ]>littel bezeichnet, das in den Fre.l:tionen der Elution bei Verwendung von Sephadex-Gel enthalten ist, die dem verstehend beschriebenen ersten Pe/ak entsprechen. ·

Kit "Substanz B" werden die Produkte bezeichnet", die durch Lyophilisieren der Fraktionen erhalten werden,-die dem zweiten Peak der Elution gemäß Beispiel 1 an Sephadex G 50 entsprechen.

Γ-in ähnliches Präparat wurde ujriter Verwendtmg von Hycobacterium tuberculosis var. bovis, Stamm BCG (Pasteur-Institut) erhalten. . * .

Die Baz.il3.ei5 vmrden 15 Tage ε-uf einem Saut on-Medium bei 37⁰C gezüchtet, ,Kit destilliertem Wasser gewaschen und bis zu ihrer Verwendung bei -2O⁰C aufbewahrt»

Die Zellwöride wurden durch Zersprengen mit einer French-Pres se und Difierentiali-'.entrifufjation erhalten und wurden dann mit Trypsin ima.Chysotr3rpsi.r1 behandelt und entfettet, was unter genau den gleichen Bedingungen wi,e" in Beispiel 1 unter Verwendung von M.siaegratis erfolgte. Sie wurden dann genau wie, im Beispiel 1 erneut in />i;<inoniumacetat suspendiert und mit Lysozym digeriert.

Das, erhaltene Filtrat wurde lyophylisiert und wieder mehrere Male in v.oiiser aufgenommen, um Ainraoniuinaeetat zu entfernen. Das so erhaltene Frodukt stellt ebenso ein Adjuvans dar, wie das gleichwertige Produkt, das aus K, sßegrnatis erhalten wur de. . ■ ' ,"--■'

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Ein analoges Präparat wurde unter Verwendung von Mycobacterium kansasil, Stamm P 21 Runyon erhalten. Die Bazillen v/urden 20 Tr^e auf einem Sauton-Medium bei 37⁰C kultiviert, danach während. MB Stunden mit i?ii-igom Phenol abgetötet, it!it destilliertem Wasser gewaschen und bei -P-O⁰O bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt. Sie werden dann nacheinander mit Mkohol-Äther (1:1), Chloroform, Chloroi'oria-Methanol (2;1) von Lipoidcn befreit und danach mit Aceton getrocknet. Das Entfernen von Lipoiden mit jedem dieser Lösungsmittel wurde dreimal wiederholt, Wobei ■ jedesmr-.l ein Volumen des Lösungsmittels gleich der 30-fachen Gewichtsmanko der als -Ausgangs-, material verwendeten Bazillen verwendet wurde.

Die Zellen werden dann in Suspension gebracht, wobei 1 g getrockneter Bazillen auf 25 nil destillierten Wassere verwendet werden und in Fraktionen von 30 ml während 25 Minuten in einer Ultrasohallvorriohtung von 250 V/ und 10 kHz mit Ultraschall behandelt. Die nichtaufgebrochenen Bazillen wer»· den durch Zentrifugieren während 10 Minuten bei 500 g entfernt, erneut in Suspension gebracht und zentrifugiert (dreimal) . Die Zellwände werden durch 50-rninütiges Zentrifugieren bei 27.500 g erhalten. Sie werden wie in den Beispielen 1 und 2 mit Trypsin und Chymotrypsin digeriertund danach gewaschen,

Sie werden dann unter den gleichen Bedingungen wie in den vorhergehenden Beispielen mit Lysozyrn digeriert. Das erhaltene Filtrat wird durch Lyophilisiercn von .Ammoniumacetat befreit. Das erhaltene Produkt; zeigt ebenfalls Adjuvans-EigenBchaften.

Beispiel Jl· . '

Herstellung von Fraktionen, die ein Adjuvans enthalten, aus vollständigen Zellen von M. srnegniatis.

Bazillen von Mycobacterium smegmatis, deren Stamm bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-lü¹. 21732 hinterlegt ist, werden 9 Tage bei 37°C in einem Roux-Kolben

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auf Sauton-Medium gezüchtet, durch Filtration gesammelt i-ukl mehrere Male mit" destilliertem Wasser gewaöclum,- Sie v/erdon. dann in die Hüls ο eine« Soxhlet-S.-rtroktors gegeben und nacheinander unter Rückfluß mit Aceton, Äthylalkohol,-Chloroform und einem Chloroform-Methanol-Gemis.ch (87:123) extrahiert und danach mit Äther getrocknet. Danach werden sie durch Suspen-■ dieren in der 10O-fachen Wassermenge, bezogen auf ihr Gewicht, gewaschen und anschließend zentrifugiert. Das Y/aschen wird, noch zweimal mit Wasser und danach zweimal mit 0,1 m. Aminoniumacetat vom pH-V.'ert 6,2 wiederholt. Die Bazillen- werden dann erneut in der 100-fachen Menge, bezogen auf ihr Anfangsgewicht, di.eser Pufferlösung suspendiert unti der Suspension wird Lysozym zugesetzt (1 Gew.^*, bezogen auf die entfetteten · Bazillen)„ Nach einer Inkubation von 18 Stunden bei 37 ¹C in Gegenwart von einigen Tropfen Toluol, um "bakterielle· Verunreinigungen zu vermeiden, wird die Suspension filtriert. Die Bazillen.werden erneut in Ammoniumacetat in. Suspension gebracht und unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Inkubation erneut in Gegenwart von Lysozym inkubiert. Die den beiden Inkubationen entsprechenden Filtrate werden- vereinigt und lyophilisiert.

Das erhaltene Lyophilisat, das als "rohe Substanz C" nachfolgend bezeichnet wird, zeigt Adjuvans-Aktivität und ißt praktisch frei von störenden Nebenwirkungen, wie an späterer Stelle angegeben wird* ■

Die "rohe·Substanz C" hat folgende Zusammensetzungι

Neutrale Zucker: kb% (Arabinose und Galactose) Aminozucker: Λ6% (Glucosamin und Muraminsäure

nach der Hydrolyse)

Aminosäuren: 23% (davon bestehen M% aus AIa-

- - nin (Alct), Glutaminsäure

(GIu) und Meso- '-.'- £--d.iam.i-r nopimelinsäure (DAP)) Phosphor; 0,3% „

Lipoide: "" weniger als 3%.

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Das vorstehend an/ver^bane Lyophiliiu-.t vurde außerdem stärker gereinigt, wos durch Auflosen in 0,1 m jiiißigsäuro und 'Filtration über eine oäule cv.s Sephadex G 75 c-iner Höhe von 80 cm und eines Durchmesser" von 2,5 οία erfolgte.

Die Substanz cles ernten aus der Säule austretenden Peaks, nachntehend als ⁿSubstanz C" bezeichnet, hat folgende Zusammensetzung:

Neutrale Zucker: 7% (Arabinose und Galactose) Aminozucker: 10-12^ (Glucosamin und l-iuraininsäu-

re nach der Hydrolyse)

Aminosäuren: 15/j (12iä bestehend aus Ala, GIu,

DAP)

Lipoide: weniger als 5?»

Sediraentationskoeffizient in einem Phosphatpuffer, pH 7,0, U. = 0,1 bei 20 C und einer Konzentration c = A,8 mg/ml liegt in der Größenordnung von Sp₀ = 1,95·

Die Ultrazentrifugation zeigt, daß die Substanz C nur wenig pol}^rdispers i st.

Es wird festgestellt, daß 100 mg der Substanz C aus 2 g entretteten Bazillen gev/onnen werden, was eine um etwa das 10-fache bessere Ausbeute darstellt, als die bei dem j.n Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhaltene Ausbeute.

Es wird schließlich festgestellt, daß die dem zweiten EIutipnspeak entsprechende Fraktion auch Moso-^C -£.-diaminopimelinsäure und Aminozucker enthält, wie die Fraktion (Substanz B), die dem zweiten ."lutionspeak entspricht, der in der Endstufe der Reinigung eines Verfahrens erhalten wird, das unter¹ Ve rwendung de r gle i eheη Aus gango-Hikro Organismen durchge führt wird.

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Andere gereinigte Fraktionen, die ein Acljuvans enthielten, wurden aus anderen /inteilen von vollständigen Zellen von ]'].ewGgi:«r.t.i κ unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen erhalten, wie sie in Beispiel"4 beschrieben sind, mit der AbMnderung, daß die Entfernung der Lipoide, durch aufeinanderfolgende Extraktionen mit folgenden Lösungsmitteln durchgeführt wurde: . . ■

1. Vergällter absoluter Alkohol, um eine erste Entwässerung der Zellen zu erreichen,

danach, in einem Soxhlet-Extraktor", mit 21 absolutem vergälltem Alkohol,

3. Chloroform, - -

4. einem Chloroform-Methanol-Gemisch (87:13),

5. Petroläther (Siedebercich 96-11O⁰C).

Die nach der Reinigung an Sephadex-^Gel erhaltenen Fraktionen (erste Peaks) werden nachstehend mit der Bezeichnung "Substanz C1" und -"Substanz C2" 'benannt.

Herstellung von Frakt ;i on θ η, die ein Ad juvans enthalten, aus ganzen, vollständigen Zellen von Nocardia opaca.

Dieser Organismus wird unter mäßigern Belüften während 46 Stunden bei 30°C—in einem Fermenter auf folgendem Medium ge züchtet:

Fleischextrakt: ' 0,4%

Hefe: , . ._: . 0,2%

Bactopepton Difco: 2 %

WaCl: 0,5^o pH 7,2 '

Die Zellen werden mit Hilfe von Aceton getrocknet, dann in

- -'Ui 9 B■ ? W 1 1 f L-

BAD ORIGlNAl

einen Soxhlet-Extrnktor übergeführt und unter Rückfluß mit Aceton, Äther, Chloroform, Äthylalkohol und dann mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch (87:13) entfettet. Die Zellen werden anschließend mit Aceton getrocknet und dann in der 100-fachen Wassermenge, bezogen auf ihr Gewicht,· wieder in Suspension gebracht. Sie v/erden anschließend zentrifugiert, danach erneut mit Wasser und zweimal mit einer 0,1 m Amrnoniumacetat-Pufferlößimg vom pH-Wert 6,2 gewaschen. Sie werden schließlich in dem 100-fachen, bezogen auf ihr Gewicht, einer Ammoniumacetat-Pufferlösung suspendiert und während 18 Stunden bei 37⁰C in Gegenwart einiger Tropfen Toluol mit Lysozym (1 Gew.% der entfetteten Bazillen) inkubiert. Die Zellen werden anschließend durch Filtration mit Hilfe einer Glasfritte Nr. 4 abgetrennt und erneut unter den vorstehend angegebenen Bedingungen inkubiert. Die bei den beiden Inkubationen erhaltenen Filtrate werden vereinigt und lyophilisiert. Das Lyophilisat, das nachstehend als "roho Substanz D" bezeichnet wird, hat folgende Zusammensetzung:

Neutrale Zucker: 20 - 28% (entk. Galactose, Glucose,

Arabinose und Mannose)

Aminozucker: 8,8 % (Glucosamin und Muramin-

_# säure nach der Hydrolyse)

Aminosäuren: 40 - 44% (wovon 15 % aus Ala, GIu,

DAP bestehen)

Lipoide: 5 - 7 %

Phosphor: etwa 5 %

Die Ausbeute der rohen Substanz D beträgt 300 rag pro 15 g der von Lipoiden befreiten Bazillen.

Die Filtration einer Lösung der rohen Substanz D in 0,1 m Essigsäure durch eine Säule aus Sephadex G 75- Gel einer Höhe von 80 cm und mit einem Durchmesser von 2,5 cm ergibt bei der Elution 3 Peaks, die Fraktionen der folgenden Zusammensetzung enthalten:

309821/1

ORIGINAL

Neutrale Zucker:

Aminozucker:

Aminosäuren: ■'· Lipoide: Phosphor: kein DAP 42% (Glucose, Galactose, Riböse, Spuren von Mannose und Arabinose)

-2% (Glucosamin und Muramin-

säure nach der Hydrolyse)

40%

weniger, als 5%
etwa 2% ' .

Zweiter Peak:

Neutrale Zucker:

Aminozucker: Aminosäuren:

Lipoide: Phosphor:

.Dritter, Peak: Neutrale Zucker ϊ

Aminozucker:

Aminosäuren: Lipoide: Phosphor: 16% (die gleichen Zucker, wie bei der rohen Substanz D, ■. jedoch in anderen Anteilen)

- ■ 18-19$ (Glucosamin und Muramin-

säure nach der Hydrolyse)

39% (wovon 20% aus Ala, GIu, . DAP bestehen)

etwa 5% .--■-■- . etwa 2%

(Glucose, Galactose, Ribose, Spuren von Ri₁-bose)

14% (Glucosamin und Müramin-' säure nach der Hydrolyse)

19% (Ala, GIu und DAP: 11%) weniger als 5%
5%

Die vorstehend angegebenen Fraktionen, die aus 300 mg der rohen Substanz D erhalten wurden, umfassen 40 mg bei dem ersten Peak, 120 mg bei dem zweiten Peak und 14.0 mg bei dem dritten Peak,

Der zweite und der dritte Peak enthalten charakteristische

9 82171 164

Bestandteile dor erfindungsgernäßen Adjuvantien. Hauptfach-¹ lieh die Fraktion, die dem zweiten Peak entspricht und nachstehend als "Substanz D" bezeichnet wird, wurde pharmakologi~ sehen Tests unter den nachstehend angegebenen Bedingungen unterworfen.

Beispiel 7

50 mg eines Adjuvans, das aus M. smegnatis extrahiert wurde, und nach cbr Methode des Beispiels 4 hergestellt und, gereinigt wurde, werden einer zusätzlichen Reinigungsoperation durch Inkubation mit 50 mg unlöslichem Trypsin (hergestellt von der Firma Boehringer) in 4 ml 0,07 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,8 während 24 Stunden bei 37°C unter Rühren mit Hilfe eines Magnetriihrers unterworfen. Das Inkubationsgemisch wird dann zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wird in 0,1 η Essigsäure durch eine Sephadex G 75-Säule (Durchmesser 2,5 cm, Höhe 80 cm) geleitet. Der bei der Filtration erhaltene erste Peak enthält 35 mg des stark gereinigten Mittels (Substanz E1).

Beispiel 8

200 mg eines aus M. smegmatis extrahierten Adjuvans, das nach der Methode des Beispiels 4 hergestellt und gereinigt worden war, werden einer zusätzlichen Reinigungsoperation durch Inkubation mit 1 mg Trypsin unterworfen (hergestellt von der Societe CHOAY S.A.)· Die Reinigung erfolgt in 20 ml eines 0,07 ra Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,8 während 18 Stunden bei 37⁰C. Das nach der Inkubation erhaltene Geraisch wird anschließend durch Lyophilisieren auf 5 ml konzentriert und dann durch eine Säule geschickt, die ein Filtrationsmittel in Wasser enthält. Dieses Filtrationsmittel ist unter der Bezeichnung INDUBIOSE AcA 5/4 von der Societe Industrie Biologique Francaise im Handel erhältlich. Die Säule hat einen Durchmesser von 2,5 cm und eine Höhe von 80 cm.

309821/1164

Der bei der Filtration erhaltene erste Peak enthält 150 rag ·' des stark gereinigten Mittels (Substanz E2).

Analoge Ergebnisse wie in den Beispielen 7 und, 8 v/erden bei Verwendung von anderen Enzymen erhalten, wie Pronase, Chymotrypsin oder Subtilisin und/oder bei Verwendung anderer Puffer, welche die Einstellung eines pH-Werts von 7,5 bis 8,2 ermöglichen, wie eines Ammoniumcarbonatpuffers oder eines Tris(hydroxymeth37i)aminomethan-Puffers. ^s

Pharmakologische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mittel.

Die erfindungsgemäßen Mittel, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden, zeigen starke Aktivität als Adjuvantien und sind frei von ernsthaften Nachteilen, welche die therapeutische Anwendung der Mycobakterien und des. Freund'sehen Adjuvans verhindert haben. Diese äußerst günstigen Besonderheiten der erfindungsgemäßen Mittel werden durch die nachstehend beschriebenen pharmakologischen Versuche nachgewiesen.

A. Nachweis der Adjuvans-Aktivitat der erfindungsgemäßen Mittel. '

Bei der Durchführung der nachstehend beschriebenen Versuche wurden die zu prüfenden Substanzen in einem Mineralöl, das unter der Bezeichnung "Bayol F" bekannt ist, in Gegenwart eines Dispergiermittels, me Glycerinmonooleat oder des irn Handel unter der Bezeichnung "Arlacel A" erhältlichen Dispergiermittels suspendiert. In vielen Fällen v/erden die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mittel mit denen von vollständigen Mycobakterien oder Mycobakterien-Fraktionen, mit dem klassischen, vollständigen Freund'sehen Adjuvans (ACB"), demunvollständigen Freund¹sehen Adjuvans (AIF), d.h. dem Adjuvans, das keine Mycobakterien enthält, verglichen.

1. Adjuvans-Aktivität der Substanzen auf den Serum-Antlkörpergehalt gegenüber Ovalbumin bei Meerschweinchen;

η .q.R? 1 / Ii 1SR4

quantitative Precipitation und passive Iläniagglut inati on. '

Als zu prüfende Substanzen wurden die in den vorstehenden Beispielen angegebenen Substanzen geprüftί Rohe Substanz A (das wasserlösliche Produkt, das in Beispiel 1 durch Behandlung mit Lysozym erhalten wurde, jedoch nicht an Sephadex-GeI gereinigt wurde), Substanz A, Substanz B, rohe Substanz C, Substanz C, Substanz C1, Substanz C2 und Substanz D.

a. Tests mit Substanz A

Man gibt ein lösliches Antigen, in vorliegendem Fall Ovalbumin, zu der Substanz A, zu dem Wachs D (extrahiert aus M. tuberculosis), zu Trehalose~6,6'-dimycolat, das unter der Bezeichnung "Cordfactor" bekannt ist und nachstehend mit diesem Namen bezeichnet wird (extrahiert aus M. kansasii), und zu Mycosid C (extrahiert aus M. butyricum).

Das in jedem Fall erhaltene Gemisch wird mit dem unvollständigen Freund'sehen Adjuvans (AIF ) versetzt und danach in Form einer Wasser-in-öl-Emulsion in die Pfotenunterseite von Meerschweinchen injiziert. Als Vergleichsproben werden Ovalbumin mit dem unvollständigen Freund'sehen Adjuvans oder dem vollständigen Freund'sehen Adjuvans (ACF) verwendet, das aus AIF und Zellen von M. butyricum besteht. Man bestimmt den Antikörpergehalt gegen Ovalbumin 21 Tage nach der Injektion. Der Anteil der induzierten Antikörper wird durch quantitative Präzipitation nach der Methode bestimmt, die von Gierer und Schramm (Zeitsclirift für Naturforschung, 1956, 116_T Seite 138) beschrieben ist, und durch passive Hämagglutination von mit Ovalbumin beladenen Erythrocyten nach der von Stavitsky beschriebenen Methode (J. Immunol., 1954, J2, 360-368). Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefaßt.

Diese Tabelle zeigt den Antikörpergehalt nach der Verabreichung des Vehikels allein und nach der Verabreichung der

:< η 9 e 71 /ι1

Substanz A'in einem absolut identischen Vehikel. Sie verdeutlicht, daß ganz allgemein'die Substanz A die Bildimg von Antikörpern stärker·stimuliert, als das vollständige Freund'sehe Adjuvans. Sie gibt außerdem anhand eines Vergleiches an, daß das erfindungsgemäße Adjuvans aktiver ist als das Wachs D. Sie verdeutlicht ferner das Fehlen von Adjuvans-Eigenschaften bei zwei vorher isolierten Mycobakterien-Bestandteilen, wie dem Cordfactor und Mycdsid- C. -

Die in Tabelle I aufgeführten numerischen Werte stellen den Mittelwert dar, der unter Verwendung von ,Gruppen von 6 Meerschweinchen berechnet wurde. Die'Ergebnisse sind in-Mikrograrnm des Antigeh-Antikörper-Komplex pro Milliliter Serum im Fall der quantitativen Präzipitation und als Kehrwert des Serumtiters im Fall der Hämagglutination ausgedrückt.

Tabelle I .

Injiziertes Produkt und Dosis pro Meerschweinchen	Quantita tive Prä zipitation	Hämaggluti nati on (um gekehrt pro portionai dem Serum- titer)
ACF Vergleichsprobe AIF AIF + Substanz A 1 Ug AIF + Substanz A lO^ug AIF '+ Substanz A 50,Ug AIF -ι- Wachs D von M. tuberculosis 200 jug AIF + Cordfactor aus M. kansasii 50 ,Ug AIF + Hycosid C aus M. butyricum 50 ug	3532 . 747 2016 4715 686? 1573 • .. 584 - 716 .	.. 4200 . 1770 2240 ' 2660 5440 3730 400 400

30 9 8 2 1 / 1 1 S 4

BAD ORIGiNAi

Es konnte außerdem durch Immunelektrophorese gezeigt vrerden, daß ein Antigen in Gegenwart von Substanz A v/ie auch in Gegenwart des vollständigen Freund'sehen Adjuvans bestimmte, mit Y' 2 bezeichnete Immunoglobuline bildet.

b. Teats mit anderen Substanzen

(rohe Substanz C, Substanz C, Substanz C1, Substanz C2 und Substanz D).

Wie in den vorhergehenden Versuchen werden sämtliche dieser Substanzen mit Antigen in Gegenwart von 5 mg Ovalbumin in einer wässerigen Emulsion von Bayol F in Gegenwart eines Dispergiermittels, wie Glycerinmonooleat oder dem unter der Händelsbezeichnung Arlacel A vertriebenen Dispergiermittel, verabreicht. Jede zu prüfende Substanz v/ird Gruppen von 5 oder 6 Meerschweinchen verabreicht. Die Eigenschaften der zu prüfenden Substanzen werden mit den Eigenschaften des vollständigen, klassischen Freund'sehen Adjuvans (ACF) oder des unvollständigen Freund'sehen Adjuvans ('AIF), d.h. dem Adjuvans, das keine Mycobakterien enthält, verglichen.

In den nachstehenden Tabellen IA und IB sind die Mittelwerte angegeben, die in zwei Versuchsserien und durch Hämagglutinationsversuche einerseits sowie durch quantitative Präzipitation des Serums andererseits erhalten wurden. Bei der Durchführung dieser Versuche wurde das Serum 21 Tage nach der Injektion der zu prüfenden Substanzen mit Antigen in die Sohle von männlichen Meerschweinchen mit einem Gewicht von etwa 350 g entnommen. Aus dem in den beiden Tabellen durchgeführten Vergleich der mit Vergleichstieren und mit behandelten Tieren erhaltenen Ergebnisse geht hervor, daß die geprüften Substanzen die Antikörperbildung sehr heftig stimulieren. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Kehrwerte der Seruraverdünnung im Fall des Hämagglutinationstests und in Ug des Antigen-Antikörper-Komplexes pro ml Serum im Fall der quantitativen Präzipitationen.

309821/1 164

Tabelle 1 A

Injizierte Produkte und Dosis pro Meerschweinchen

Sergio ichsprobe -AIF Rohe Substanz C 200 jug

Hämagglut ination

2.880

10.130

Präzipitation (,Ug AG/AC pro ml Serum)

Tabelle.I B

■Injizierte" Produkte und	Hämagglutina-	Präzipitation
posis pro Meerschweinchen i ■ ν , , , .	tion	(^Ug AG/AC pro ml Serum)
■Vergleichsprobe AIF	840	- 616
Vergleichsprobe ACF	1.800	2.710
! !Substanz C 200 pg	3.330	5.020
I Substanz D 200 lug	3.200	4.340
Substanz C1 200 Ug	2.130	4.850^
Substanz C2 200 jug	2.000	4.750

2. Vergleich der Adjuvans-Eigenschaften von Substanz A, AIF und ACF nach der Methode von Jerrie an Mäusen unter Verwendung von Hammelerythrocyten als Antigene.

Die Substanz A verstärkt auch das immunologische Ansprechen auf spezielle Antigene, wie Hammelerythrocyten. Substanz Ä wird mit AlF intraperitoneal Mäusen verabreicht. Gleichzeitig werden 2 χ 10' Hammelerythrocyten nach der Methode verabreicht, die von N.K. Jerne, A.A. Nordin und C. Harry in "Cellbound Antibodies", Verlag B. Ames und H. Koprovski, Wistar Institute Press, Philadelphia, 1963» beschrieben ist.

3η 9821/1164

Als Vergloichßtierc v/ird eine erste Gruppe von Mäusen, die' eine einmalige Injektion von Hammelerythrocyten in isotonischer Lösung erhielten, eine zweite Gruppe von Mäusen, die eine einmalige Injektion von Hammelerythrocyten in unvollständigem Freund.'sehen Adjuvans erhielten und eine dritte Gruppe von Mäusen, die Hammelerythrocyten in vollständigem Freund'sehen Adjuvans erhielten, verwendet.

Drei Tage später v/ird die Anzahl der Antikörper-bildenden Zellen in der Milz bestimmt. Tabelle TIA zeigt einen Anstieg der Anzahl der Antikörper-bildenden Zellen in der HiIz an, wenn die Hammelerythrocyten gemeinsam mit AIF, mit ACF oder gemeinsam mit Substanz A verabreicht werden.

Tabelle HA ·

	Anzahl der Plaque- bildenden Zellen	Anstieg %
Vergleichsproben: Hammelerythro cyten + isotonische Lösung	646
Hammelerythro cyten + AIF	703	9
lammelerythrocyten + ACF	1554	141
■iainmelerythrocytcn + AIF + Substanz A 0,1 mg/kg	1092	69
iammelerythrocyten + AIF + Substanz A 1 mg/kg	1800	179

Die folgenden Versuche zeigen, daß das erfindungsgemäße Mittel auch in Abwesenheit von Mineralöl aktiv ist.

Man verabreicht einer Vergleichsgruppe von Mäusen durch Injektion Hammelerythrocyten, die in einer wässerigen Salzlösung oder in AIF suspendiert sind. Zwei andere Gruppen von

309821/116 4

BAD ORIGINAL

Mäusen werden mit Substanz A in einer wässerigen Salzlösung (erste Gruppe) und mit Substanz B in Suspension in AlF behandelt (zweite Gruppe). Sine dritte Gruppe wird mit. Substanz B in. einer wässerigen Salzlösung, behandelt.

Alle Tiere werden 4 Tage später getötet und die Anzahl der Plaquo-bildenden Zellen wird unter den gleichen Bedingungen wie ν or· crtehend .be· schrieben, bestimmt. Aus Tabelle .1IB ist ersichtlich, daß Substanz A -wie auch Substanz B ausgezeich» ' nete Adjuvans-Aktivität besitzen, wenn sie mit Hammelerythrocyten vermischt werden und daß diese Aktivität ebenso in Suspension in AIF wie auch in einer wässerigen Salzlösung· auftritt.

Tabelle II B ' ·

Verabreichtes Mittel	Anzahl der Plaque~bil- denden Zel len	Anstieg %
Erythrocyteh + Salzlösung	3600
Erythrocyten + ACF	3300
[Erythrozyten + Salzlösung + Substanz A 1 mg/Kg	11500'	330
Erythrocyten + AIF -i- Sub stanz A 1 mg/kg	15500	. 460
Erythrocyten + Salzlösung + Substanz B 1mg/kg	22800	630

3. Erhöhte Bildung von Antikörpern gegen das Grippevirus im Anschluß an die Verabreichung von Substanz. A bei Mäusen.

Schweizer Mäusen von 10 g wird durch subkutane Injektion Grippevirus PR 8 verabreicht, das durch UV-Strahlung inaktiviert ist. /Die Verabreichung erfolgt im wässerigen Medium, in AIF-Medium und in AIF-Medium, das die in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Mengen der Substanz A enthält.

309821/1164

BAD ORiQiNAi

14, 21, 20, 33 bzw. 42 Tage nach den anfänglichen Injektionen wird den Mäusen in Fünfergruppen im Niveau des Retroorbital-Sinus Blut cntnoimnisn. Die Antikörpertiter v/erden nach der Methode der Häniagglutinations-IIommung an dem Serum bestimmt, das durch Vereinigung der Seren aus Mäusen derselben Gruppe erhalten vmrdo. Die Bestimmung erfolgte nach der Methode von G.K. Hirst, Science, 1941, £4, Seite 22.

Die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse stellen das geometrische Mittel aus 4 V/erten dar. Die Tabelle zeigt; an welchem Funkt Substanz A das immunologische Ansprechen stimuliert. In einer Dosis von 50 jug pro Haus verursacht sie eine 12-fache Vermehrung der durch das Virus allein induzierten Antikörpermenge.

Tabelle III

Adjuvans	Antikörper	21	titer	35	I i
Vergleichsprobe: Salzlösung + Virus Vergleichsprobe: AIF + Virus	14	8,0 19,0	28	16,0 45,0	"42 .
AIF + Virus + Substanz A 50 üg/Maus	4,0 11,3	64,0	13,4 32,0	305,0	. ! 16,0 64,0:
AIF + Virus + Substanz A 5 Ug/Maus AIF + Virus + Substanz A 0,5 Mg/Maus	32,0	32,0 8,0	215,0	108 45,0	i 722, Ο
11,3 4,0	90,0 22,0	Ι 52 108,0

4. Erhöhte Bildung von Antikörpern gegen das Columbia SK-Virus.

Die Eigenschaften der Substanz A v/erden außerdem im Hinblick auf andere Viren, wie Columbia SK-Virus aufgezeigt. Zur Herstellung einer Vakzine aus toten Viren wird ein Präparat des Columbia SK-Virus mit hohem Titer der Ultraviolettstrahlung

3 0 9821/1164

BAD ORIGINAL

2 2 F 5 8 3

ausgesetzt. In diesem .Versuch wird'der Titer,, ausgedrückt'¹ als Infektionsvermögen, von 8,32 auf 1,85 log ufp/ml vermindert. Man injiziert diesen Impfstoff entweder allein oder gemeinsam mit AIF mit oder ohne Substanz A den Mäusen. Wie Tabelle IV zeigt_} stimuliert die mit der Vakzine verabreichte Substanz A sehr stark das immunologische Ansprechen gemäß einer 14 Tage später durchgeführten Bestimmung.

Tabelle IV

.Behandlung	Antikörpertiter nach 14 Tagen
Vakzine allein Vakzine + AIF Vakzine + AIF + Substanz A 100 ug/Maus	2 37 181

5. Schutzwirkung der Substanz A- im Hinblick auf das Überleben von mit Columbia SK-Virus infizierten Mäusen.

In diesen Versuchen wird das'Virus in Konzentrationen verabreicht, die zum Tod des größten Tei3.s der behandelten Tiere führen. Wenn Substanz A mit AIF und einer homologen Virusvakzine 3 Wochen vor der Inokulation mit dem Virus verabreicht wird, "so- wird ein bedeutender Anteil der Tiere geschützt und ihre- Überleb'ensdauer wird merklich erhöht. In dieser Hinsicht ist Substanz A wirksamer als das vollständige Freund'sehe Adjuvans.

Π 9 R 2 1 / 1 1 ß U ■

BAD ORIGINAL

Tabelle V

	Mortalität	Anzahl der ver wendeten Tiere	Mittlere über]
Adjuvans	Anzahl der einge gangenen Tiere	29	lebensdauer in Tagen
Keines	26	28	5,59
AIF	26	26	6,25
/ICF	22	29	6,15
> AIF + Substanz Λ 1OO ng/Maus	20	'7,28

B. Nachweis der Unschädlichkeit der erfindungsgemäßen Sub«- stanzen.

1. Überempfindlichkeit gegen Endotoxine.

Es ist gut bekannt, daß Mycobakterien die Empfänglichkeit gegenüber der letalen Wirkung von Endotoxinen erhöhen (E.Su« ter, et al., 1958, Proc. Soc. Exp. Biol. Med, 1958, 99» 167J B.N. Halpern et al., CR. Soc. Biol. Paris, 1958, 152, 899). Es wird angenommen, daß diese Aktivität in Zusammenhang mit dem Cordfactor steht (E. Suter et al., Proc. Soc, Exp. Biol. Med. 1958, 22» 1967).

Mäuse wurden durch Injektionen mit BCG (Bacillus Calmette Guerin), die mit Phenol abgetötet v/aren und in Form von ganzen oder entfetteten Zellen verwendet wurden, oder mit ganzen Zellen von Mycobacterium smegmatis, die mit Phenol abgetötet waren, sensibilisiert und 14 Tage nach der Sensibilisierung mit einem Endotoxin behandelt. In jedem Fall wurde das zu prüfende Produkt, das entweder in isotonischer Lösung oder in Bayol suspendiert war, in einer Menge von 300 üg Mäusen intravenös injiziert .

Es isc zu bemerken, dai? es erforderlich ist, Bayol in einer

,30 9 821/1164

Endkonzontration von 50£ό-zu verwenden, um eine Adjuvans-Wirkung zu erzielen, wie es bei .Verwendung des vollständigen Freund'sehen Adjuvans der Fall ist. Jedoch wurde/in den Versuchen, die sich auf die Hypersensibilität gegenüber einem Endotoxin bezogen (Tabellen VIA, VIB, VI), .in-jedem. Falle eine Menge von 0$2 nil der' Mycobaktcrienpräparate injiziert, die in einem Λ0% Bayöl enthaltenden Medium suspendiert waren.

Sämtliche Mäuse"erhielten zwei Wochen später durch intravenöse Verabreichung ein Eiidotpxin-Präparat, das oxxs Salmonella enteriditis, Stamm Danysz extrahiert war. Der DL,-Q~Wert die-, ses Präparats in Suspension in isotonischer Lösung entspricht bei Verabreichung an normale Vergleichstiere durch Injektion/ 240 jug. . ■ ' .

a) Verwendung von Substanz A* Dieser Versuch wird in Tabelle VI gezeigt. "

a. Der DLe-Q-Wert des -End ο toxins wird urn das 200-fache erhöht, wenn ganzes BCG der Maus verabreicht worden war, während die Verabreichung von entfettetem BCG keine Wirkung hat, wenn die Zellen in einer isotonischen Lösung suspen-. diert sind. Wenn jedoch entfettetes BCG in Form einer Suspension in Bayol verwendet wird, wird die Sensibilisatorwirkung dieses Mycobakterienpräparats wieder hergestellt. Durch Injektion von Bayol allein bei den Vergleichstieren werden die Mäuse nicht gegenüber dem Endotoxin sensibilisiert.

309821/1

BAD ORIGINAL

Tabelle VI Hypersensibilität gegenüber einem Endotoxin

Sndotoxin (/as: t-ro ICaus)

0,15

15

50

DL

50

Vergleichsproben (Bayol)

*
BCG (isotonische Lösung) Entfettetes BCG* (isotonische Lösung) !Entfettetes BCG* (Bayol)

M. smegmatis* (isotonische Lösung)

M. smegmatis* (Bayol) !Rohe Substanz A* (isotonische Lösung) Rohe Substanz A* (Bayol) Substanz A * (Bayol)

0/18

0/8⁺ 0/8 I 0/15 \ 0/15

34/53
0/8
6/7
2/25

11/16
0/8
1/6

48/53 j 46/56; 45/45

0/8 j 1/33

7/7 ' 7/7

3/24j 4/26

13/16J12/16

0/18! 0/18

0/13j 0/14

4/33 7/7
11/25 8/8

1/35 0/14 1/1.0

>

1,3

>

37,9 1,1

>

>

>

⁺ Getötete Tiere/Gesamtmenge * In allen Fällen werden 300 ng pro Maus verwendet.

b. Die Verabreichung von ganzen Bakterien M. smegraatis ,· durch Hitzeeinwirkung abgetötet sind (der gleiche Stamm, aus welchem Substanz A gewonnen wurde), sensibilisiert weit weni ger als BCG gegenüber Ezidotoxinen, Dagegen führt das Suspendieren von M. smegmatis in Bayol zu einer kräftigen Sensibilisationder Haus gegen das Endotoxin.

c. Die rohe Substanz A sensibilisiert nicht gegenüber dem Endotoxin, wenn sie in Suspension .in einer isotonischen Lösung oder auch in Bayol angewendet wird. '

Die Tabelle VI gibt die Mengen des injizierten Endotoxins pro Maus an.

b) Verwendung der Substanz Ci und der Substanz C2.

Die DLj-Q-Y/erte eines Bndotoxinpräparats, das aus· Salmonella enteriditis, Stamm Danysz, extrahiert wurde, wurde an Mäusen geprüft, die 14 Tage vorher (14-T) durch intravenöses Injizieren der zu prüfenden Substanzen, gelöst in einer isotonischen Lösung, sensibilisiert wurden. In Tabelle VIA wird außerdem die Anzahl, der überlebenden Mäuse in jeder Gruppe (8 Mäuse pro Gruppe) angegeben, welche die in Tabelle VIA angegebenen Mengen des Endotoxins erhalten hatten. Die gleichen Bestimmungen wurden mit Vergleichstieren durchgeführt, die vorher mit BCG in Suspension in isotonischer Lösung behandelt wurden.

Wie die nachstehende Tabelle VIA zeigt, sind die DL_Rn-¥erte des Endotoxins bei Mäusen beträchtlich erhöht, die mit den erfindungsgemäßen Substanzen behandelt wurden, gegenüber Mäusen, die mit BCG behandelt .wurden.

3 0 9Ä 2 171 164

- 32 Tabelle VIA

Behandlung (14-T)	■ Dosis des Endotoxins (Aar)	5	15	50	DL50
BCGi 300 Ug ί.ν. Substanz C1: 300 pg i.v. Substanz C2: 300 ug i'.v.	1,5	7/8	■ 8/8 0/8 0/8	0/8 0/8	^ 1,5 > 50 >50
6/8*

* Getötete Tiere/Gesamtmenge

309821/1164

Tabelle VII
Fehlen einer Hypertrophie der Lunge, Leber und der Milz nach der Verabreichung yen Substanz A

	Vergleichsprobe	Anzahl der Mäuse	Gewicht der (mg)	Leber	Gewicht der Mi (.mg)	± 38,8	Iz	Gev/icht Lungen	der (mg)
	BCG 100 /Jg ' \	8	1073 ± 186		123	±71,3		153 ±	13,7
	BCG 300 ^g \ -	7	1275 ±311		170	±107,3	170 £	14,9
α	M,' smegmatis 100^Ug yisotonische	7	1767**±269		338**	+ 28 ,		22,5
iO 35	M. smegmatis 300pg/ LösunS	7	1119 + 160		139	±■63,7		1932
	Substanz A 100jug /	6	'1215 ± 282		194*	±35,5		25.8
	Substanz A 300 jug/	7	1115 + 162		153	±35,8		9,9 j
	Vergleichsprobe x^· -	8	1065.± 117		158			14,5
	M. smegmatis 100 JUg\^^ ■	7	1029 ± 159		118	± 51 ,8	170 +	i 23,6 !
	M. smegmatis 300 jug J/ Bayol	8	1092 + 202.		1:56·	+ 89,3	163 ±	38,1
	Substanz A 100 .Ug /S	8	1761**^382		321**	± 64,6	182* +	31 ·
	Substanz A 300 ug/^. /	" 10 .	1050 + 269		142	±52,5	158 +	40,2
	9 '	1128 ±238		157.	161 +	21 ,■©
	160 +
196 +
225** ±
171 +
I 156 + j

Als Mäuse wurden in diesem Versuch Hybriden

Mikrogramm pro Maus angegeben. ■* P 0,05

** p, 0,01 , ■ , ■■■ '

(CBA/T6/T6 x AKR) yerv/endet. Die Dosen sind in

2. Lungengranuloni und Hyperplasie des Lymphoidgewebes.

Es ist nachgewiesen, daß Mycobakterien, wenn sie auf intravenösem Weg injiziert wei^den, eine Hypertrophie der Leber und der Milz und Lungengranulome verursachen, die 3 bis 14 Tage nach der Injektion durch Gcn/ichtsvergrÖßerung dieser Organe nachweisbar sind. Diese Aktivität kann auch durch den Cordfactor hem'orgerufen werden, der in Suspension in Paraffinöl vorliegt (Bekierkunst et al., J* Bacteriol, 1969, 100, 95-102). Bei den nachfolgend beschriebenen Versuchen wurden Mäusen entweder Zellen (abgetötet mit Hilfe von Phenol) von BCG oder M. smegmatis, oder Substanz; Ä verabreicht. Das BCG wurde in einer isotonischen Lösung suspendiert, während M. smegmatis und Substanz A entweder in isotonischer Lösung oder in Bayol in einer Konzentration von 10?6 suspendiert wurden. Sämtliche Injektionen erfolgten intravenös in einem Volumen von 0,2 ml und die Tiere wurden 14 Tage später getötet.

Wie Tabelle VII zeigt, verursachen 300^g BCG in Suspension ' in einer isotonischen Lösung eine starke Hepatomegalie und Splenomegalie. Als Suspension in einer isotonischen Lösung verursachen 300 lüg M. smegmatis eine Gewichtsvergrößerung der Lunge und der Milz. Diese Effekte werden beträchtlich verstärkt, wenn 300 jug M. smegmatis in Bayol suspendiert werden und in diesem Fall wird auch eine Hypertrophie der Leber beobachtet. Im Gegensatz dazu beobachtet man nach Injektion der Substanz A in Suspension in isotonischer Lösung sowie in Suspension in Bayol keine feststellbare Gewichtserhöhung der verschiedenen Organe gegenüber den Vergleichsproben.

In der nachstehenden Tabelle VIIA sind die Mittelwerte der mit Substanz C1 und Substanz C2 erhaltenen Ergebnisse (in jedem Fall wurden Serien von 10 Tieren verwendet) aufgeführt. Wie daraus ersichtlich ist, verursachen die erfindungsgemässen Mittel keine Hypertrophie im Gegensatz zu BCG.

Tabelle VII A

Behandlung	■Gewicht	■ 115 '	Leber "■(»fi)
(14-T) -	; körperge«-]-HiIz " wicht g '--J. (mg)	248	1.112
Vergleichsprobe	23	118.	1.559
BCG: 300 ^g i.v.	17,7	117,5	1.147 .
Substanz C1; 300 /ag i.v.	20,7		1.130
Substanz C2i 300 ^g i.v.	20

3« Sensibilität gegen Tuberkulin. ".-,'.

Meerschweinchen v/erden durch subkutane Injektion von; mit Phenol getöteten, ganzen Zellen von BCG (0,2 oder 2 mg), •M.smegraatis* (2 mg) oder M. kansasii (2 ing) sensibilisiert. Einige .-Meerschweinchen Zierden entweder mit roher Substanz A (0,2 oder 2 mg) oder mit verschiedenen Präparaten von gereinigter Substanz A (0,2 mg) behandelt. In allen Fällen werden die Mycobakterien-Substanzen in Suspension in unvollständigem . Freund'sehen Adjuvans (Endkonzentration an Bayql = 50%) verwendet.

Die Sensibilität der Tiere wird 21 Tage später durch intrakutane Injektion von 100 i.E.. oder 300 I.E. Tuberkulin-gemessen.» Als Vergleichssubstanz wird außerdem Glycerin injiziert. Wie in Tabelle VIII gezeigt ist, werden durch Tuberkulin Notzrese und starke Hautreaktionen verursacht, wenn die Meerschweinchen mit AIF seiisibilisiert.wurden, das BCG oder M. smegmatis oder, M-. kansasii enthielt| während diese Erscheinungen nicht auftraten, wenn die Tiere mit Substanz A, die unvollständigöm Freund'sehen Adjuvans zugesetzt war, sensibilisiert wurden.

309021/1164

Tabelle VIII

Fehlen einer Sensibilität gegenüber Tuberkulin "bei Bubstanz A.

Reaktion gegenüber 100 i.E. Tuberkulin j Reaktion gegenüber 3OO
! Tuberkulin

Durchmesser ■ Mtt- i In-

\lerer j ten-
\ Durch-j si-J. masserJ .tat...

Durchmesser

j lerer <
j Burch-j
imesssri

In-; tenf si-* tat'

AIF

jAIF

IL Iaif |aif

AIF AIF

BCG 0,2 mg BCG 2 mg

M. smegmatis 2 mg

M. kansasii 2 mg rohe Substanz A 0,2mg rohe Substanz A Substanz A 0,2

2-2-3-1-3-3 8-6-7-4-6-3-4-3-5-6-5 ί 2,3

0-0-1 0-0-2-0

0*0-0-0-0-0-0-0*0-0 5,2

0-2-2-3-1-3-2-2-2-7-6-6J 0,3

0_f25

2-2-5-4-4-4
10-8-12-9-10-8

8-7-8-9-6 ■
0-1-2
2-0
0-0-0-0-0-0-0-0-0-0

3,5

9,5

7,6

at σ>
co
co

4. Pyrog.ene Eigenschaften. "

Es ist gut bekannt, daß zahlreiche Bakterien fiebererzeugende Substanzen enthalten. Die übliche Methode zur Bestimmung der Pyrogenität besteht darin, die Substanzen Kaninchen zu injizieren und die resultierende Temperaturerhöhung zu messen.

Unter diesen Bedingungen verursacht 0,01 /ug/kg eines Endotoxins eine fiobrige Reaktion und 0,05 ug/kg eine merkliche Temperaturerhöhung. .

BCG (durch Phenol abgetötete, ganze Zellen) und Substanz A werden Kaninchen in Dosen von 5 bis 100/ag/kg injiziert und die Temperaturerhöhung wird in verschiedenen Zeitabständen nach der Verabreichung gemessen. Es wird festgestellt, daß 100 /ug BCG die gleiche Reaktion verursachen, wie 0,05 'Endotoxin und daß 100 ng Substanz A eine Temperaturerhöhung verursachen, die nur in der gleichen Größenordnung liegt, wie die mit 5 pg/kg BCG verursachte Temperaturerhöhung.'

Diese Ergebnisse sind in Tabelle IX aufgeführt.

Tabelle IX

Präparat'

Flächeninhalt in cm2 unter der Temperaturkurve

Maximale Tempe raturerhöhung

in

Bndotoxin (Difco LPS)

0,05 jug

BCG 5 jug■ '
BCG 100 jig .
Substanz A 5 tig Substanz A 100 jug

17,6 + 1,9
6,3 + 1,7

17,0 + 4,1
2,8+ 0,6
9,6 + 5,1

1,33 ±0,11 0,7.8 + 0,22 1,33 + 0,28 0,39 ±_0,11 0,78 + 0,39

5. Experimentelle Polyarthritis der Ratte.

Es wurde ein Gemisch aus Paraffinöl und abgetöteten Myco-

309821/1184

bakterien verwendet, um eine experimentelle Polyarthritis bei der Ratte hervorzurufen (Pearson und Wood, Arthr. and Rheum., 1959, 2. : 440-459). Man hat diese Erscheinung als Autoiinniunreaktion angesehen. Venn das vollständige Freund'sehe Adjuvans daher in die Sohlen der Pfoten von Ratten injiziert wird, beobachtet man ein Gelenködem, das am ausgeprägtesten in der Pfote ist. in welche das Freund'sehe Adjuvans injiziert wurde, das jedoch in allen anderen Gelenken sichtbar ist. Die Gelenkveränderungen, die durch das Volumen oder durch das Gewicht der Pfoten gemessen werden können, sind sehr ausgeprägt nach 7 Tagen und erreichen ihr Maximum 14 Tage nach dieser Injektion. Die in dieser Vieise verursachte Arthritis ist von Veränderungen des Verhältnisses Albumin/ Globulin im Blut begleitet.

In dem folgenden Versuch (Tabelle X) erhielten Gruppen von 10 Ratten AIF, das entweder Zellen von M. tuberculosis (5 oder 2 mg/ml) oder Substanz A (2 mg/ml) enthielt. Außerdem wurde 2 Gruppen von Vergleichstieren entweder eine Injektion der isotonischen Lösung allein oder eine isotonische Lösung, welche Substanz A enthielt (2 mg/ml), verabreicht. Alle Injektionen erfolgten in einem Volumen von 0,1 ml in die Hinterpfoten. Die Ratten wurden 17 Tage später getötet.

Es wurde festgestellt, daß das Gemisch aus AIF und Mycobakterien (selbst in einer Dosis von 2 mg/ml)das Volumen der beiden Hinterpfoten beträchtlich erhöht hatte, eine Vergrösserung des Körpergewichts vermindert hatte und das Verhältnis Albumin/Globulin umgekehrt hatte. Die Tiere, welche die Substanz A in isotonischer Lösung erhalten hatten, verhielten sich dagegen wie die normalen Vergleichstiere und selbst dann, wenn die Substanz A im Gemisch mit AIF verabreicht wurde, v/aren das Verhältnis von Albumin zu Globulin und das Körpergewicht nicht beeinträchtigt, und das Volumen der beiden Pfoten war nur geringfügig vergrößert (Tabelle X). Diese leichte Vergrößerung wird darüberhinaus in Gegenwart von AIF für sich verursacht, wie der folgende Versuch zeigt.

309821/1164

In diesem Versuch (Tabelle XI)'wurde Gruppen von 10 Ratten ein Gemisch aus AIF entweder mit Mycobakterien (5 mg/ml) oder mit Substanz A (5 mg/ml und 0,3 mg/ml) verabreicht. Außerdem erhielten 2 Vergleichsgruppen eine Injektion der isotonischen Lösung oder von AIF, Die.Injektionen erfolgten unter den gleichen Bedingungen wie \^rorher, die Ratten wurden jedoch 14 Tage später getötet und die Arthritis wurde aufgrund der Vergrößerung des Gewichts der Pfoten gegenüber dem bei den Vergleichstieren festgestellt.

Es wurde gefunden, daß die Substanz A selbst in einer Dosis von 5: mg/ml nur zu einer leichten Entzündung führte, die vergleichbar mit der bei Vergleichstieren auftretenden ist, die nur AIF erhalten hatten und die weit geringer ist als sie mit AIF und 5 mg Mycobakterien verursacht wird. Ebenso .vermindert Substanz A nicht die Zunahme des Körpergewichts, wie das Gemisch aus Mycobakterien und AIP (Tabelle Xl).

0 9821 M1S4

Tabelle X

	Hinterpfoten	Vergrös- serung(^)	Erhöhung des	Verhältnis
	Volumen	_	Körpergewichts	Albuiain/Globu- ! lin
ί Isotonische Lösung (Vergleich)	4,85 + 0,064	100	100	- 2,18 + 0,165
iAIF + Mycobafeerien 5 mg/ml	8,31 + 0,471	72	42	0,70 + 0,094
AIF + Mycobakterien 2 mg/ml	7,34 + 0,315	0	71	0,68 + 0,091
Isotonische Lösung + Sub stanz A 2 mg/ml	4,71 ± 0,094	19	105	1,97 + 0,165
AIF + Substanz A 2 mg/ml	5,50 + 0,136	104	1,73 + 0,071

cn σ> oo

Tabelle XI

	Isotonische Lösung AIF (Vergleich)	(Vergleich)	mg/ml	Hinterpfoten	27,08	I ιDurch Injektion be- I handelte Pfote	Vergröße rung (%)	, Erhöhung des Körpergewichts t
	AIF	+ Mycobakterien 5 mg/ml	,5 mg/ml	Gewicht Vergröße- . (g) rung (%)	100	I Gewicht (g) :	24,7	·' 100 84,5 !
CaJ O CD	AIF	+ Substanz A 5	3,47 j 4,04 η	30,7	1,74 +0,073 2,31 + 0,141	100	32,5
OO	AIF	+ Substanz A 0	5,62 η	27,1	4,05 + 0,143	26	89
		4,10 η	2,34 + 0,123	24,7	95 l
-—* —a CO	4,02 η	2,31 £ 0,126
	: 0,121 : 0,235
	: 0,146
: 0,170
: 0,242

Ebenfalls günstige Ergebnisse wurden mit den anderen Sub-¹ stanzen erzielt, die in der nachstehenden Tabelle XI A angegeben sind. In dieser Tabelle wird gezeigt, daß die mit diesen anderen Substanzen behandelten Tiere sich bei dem Test ebenso verhielten, wie die normalen Vergleichstiere, die nur AIF erhalten hatten.

Tabelle XI A

	Körper! Beginn	^ev/.icht nach 14 Ta gen	Gev/icht der rech ten Pfote
Vergleich (AIF)	250,4	284,6	2.938
AIF + BCG: 500 jug	250,5	243,7*	3.940
AIF + rohe Substanz C: 500 jug	251,1	289,1	2.796
AIF + Substanz C: 500 jug	251	276,6	2.725
AIF + Substanz : 500 ^g	250,5	286,6	2.747
AIF + Substanz C1: 500 jug	250,5	272	2.857
AIF + Substanz C2: 500 ug	250,6	285,6	2,709

(?. Sensibilität gegenüber Histamin.

Es ist anerkannt, daß ein Tier nach Suprarenalectomie sowie ein mit Bordetella pertussis behandeltes Tier sehr sensibel gegenüber Endotoxinen und Histamin v/ird. Munoz und Suter (Proc. Soc. Sxp. Biol. Med., 1963, 114, 211) haben mitgeteilt, daß man im Gegensatz zu der bei B. pertussis gemachten Beobachtung BCG nicht gegen Histamin und gegenüber dem passiven anaphyla ktischen Schock sensibilisiert. V/ie nachstehend gezeigt v/ird, v/urde bestätigt, daß diese vorteilhafte Eigenschaft in den erfindungsgemäßen Adjuvantien beibehalten w:rd.

309821/1 164

Steigende Dosen an Histamin werden Anteilen von 5 Mausen ' der Schweizer Rasse verabreicht, die 7 Tage vorher (7-T) mit Dosen von 1 mg des in der nachstehenden Tabelle XII angege- ■ benen Mittels behandelt worden waren. Die gleiche Verabrei-^ chung erfolg-te an Vergleichstiere. Alle Injektionen erfolgten auf intravenösem Weg. V/ie aus Tabelle XII ersichtlich ist, wurden die Mäuse, die das erfindungsgemäße Mittel erhalten hatten, praktisch nicht sensible!·" gegenüber Histamin. ■ Inder Tabelle ist das Verhältnis der eingegangenen Mäuse zu der Gesamtzahl der Mäuse jeder Gruppe für jede Histamindosis aufgeführt.

Tabelle XII
Sensibilität gegenüber Histamin -

Behandlung

Histamin-Dosen '4' mg j 8 mg j Ib mg

DL

Normale Vergleichstiere Substanz C2 1 mg i.v.

0/8 0/8

0/8 S 8/8 2/8 : 8/8

12,5 10

C. Vergleich der Adjuvans-Aktivität von Präparaten, die aus 3 verschiedenen Mycobakterienstärcmen extrahiert wurden.

Alle vorstehend angegebenen biologischen Ergebnisse wurden mit Substanz A, extrahiert aus M. smegmatis erhalten-. Diese wasserlösliche Fraktion wurde auch aus M. kansasii oder aus BCG (Herstellungsbeispiele 2 und 3) hergestellt. Die so erhaltenen Präparate besitzen ebenfalls Adjuyans-Aktivität. Diese Aktivität wurde durch Bestimmung der Serumantikörper bei Meerschweinchen geprüft, die mit Ovalbumin immunisiert waren. In dem nachfolgenden Versuch (Tabelle XIII) wird dieses Antigen mit roher Substanz ~Ä vermischt (vor dem Fraktio-

3 0 9821 /1

nieren an Sephadex), die aus BCG oder M. kansasii extrahiert wurde, und das erhaltene Gemisch wird in unvollständigem Freund'sehen Adjuvans suspendiert. Wie vorher wird Ovalbümin entweder mit AIF oder rait ACF Vergleichstieren verabreicht. Die Versuchsbedingungen sind die gleichem wie sie in Beispiel 1 in Zusammenhang mit Tabelle I beschrieben wurden.

Die in der nachstehenden Tabelle XIII angegebenen numerischen Werte stellen das Mittel dar, das aus Gruppen von 6 Meerschweinchen berechnet wurde. Die Ergebnisse sind in jug Antigen-Antikörper-Komplex pro ml Serum im Fall der quantitativen Präzipitation und als Kehrwert des Serumtiters im Fall der Hämagglutination angegeben.. Es kann daher festgestellt werden, daß Substanz A, gleichgültig ob sie aus M. smegmatis, BCG oder M. kansasii extrahiert ist, die Antikörperbildung stimuliert, wie das vollständige Freund'sehe Adjuvans.

Tabelle XIII

	Quanti tative Präzipi tation	Hämagglutina tion (Kehrwert des Serumtiters
ACF	2060	,4640
AIF (Vergleichsprobe)	100	'440
AIF + rohe Substanz A BCG*	3940	5600
AIF + rohe Substanz A M.kansasii*	3950	4640

* 200 jug pro Meerschweinchen

D. Adjuvans-Aktivität von Substanzen, die in Fraktionen entsprechend dem zweiten Elutionspeak von Produkten gewonnen wurden, die aus M. semgmatis extrahiert wurden.

Das Produkt (Substanz B), das durch Lyophilisieren der Frak-

309821 /1164

tionen erhalten wurde, die dem zweiten Elutionspeak des Beispiels 1 entsprechen, besitzt ebenfalls, wie bereits festgestellt wurde, Adjuvans-Wirkung. Diese Wirkung wurde ebenfalls durch Bestimmung der Serumantikörper -nachgewiesen, die durch Ovalbumin, verabreicht im Gemisch mit Substanz B in Suspension in AIF gebildet "wurden.'Die Wirkungen der-Substanz B werden-mit den in Vergleichstieren erzielten Wirkun gen verglichen, denen entweder AIF oder ACF verabreicht -wurde. -

Tabelle XIV

Injizierte Produkte	Quantitative Präzipitation
Vergleich AIF Vergleich ACF ' AIF + Substanz B: 200 pg	650 4030 8200
Vergleich AIF Vergleich ACF kIF + Substanz B erneut gereinigt lurch eine weitere Filtration durch Sephadex G 50: 50 ng -	750 3530 4990

E. Biologische Ergebnisse mit Substanz E1 und Substanz E2.

1. Nachweis der Adjuvans-Eigenschaften von Substanz E1 und Substanz E2-.

Die Imrnun-Adjuvans-Wirkung der angegebenen Substanzen wurde aufgezeigt, indem sie Mäusen intraperitoneal mit als Antigen verwendetem Rinderserumalbumin (BSA) verabreicht-"wurden. In dem nachfolgenden Versuch erhielten alle Mäuse 0,5 mg BSA, ausgenommen eine Vergleichsgruppe. Die anderen Gruppen erhielten gleichzeitig mit BSA 50 ^g eine der folgenden Substanzen: Substanz A, Substanz C, Substanz E1 bzw.-Substanz E2.

309821/1164

In allen Fällen wurde das Adjuvans dem Antigen in einer isotonischen Lösung zugemischt.

Zehn Tage später erhielten diese Tiere durch intraperitoneale Verabreichung 5 jug radioaktives BSA (merkiert mit J). Am nächsten Tag v/urden jeder Maus 50 μΐ Blut entnommen und die Radioaktivität in einem Szintillationszähler gemessen. Die restliche Radioaktivität wird nach folgender Formel berechnet:

aufgefundene Radioaktivität χ K _1rjn injizierte Radioaktivität *

in der K eine Konstante darstellt, die in Abhängigkeit von der Rasse und dem Gewicht der verwendeten Maus festgelegt wird,

Aus Tabelle XV ist ersichtlich, daß 24 Stunden nach der Verabreichung des radioaktiven Antigens die Vergleichstiere, die nur mit BSA immunisiert waren, eine restliche Radioaktivität sehr nahe der der nichtimmunisierten Vergleichstiere hatten. Im Gegensatz dazu, zeigten die Tiere, die zusammen mit dem Antigen 50 jug der verschiedenen wasserlöslichen Adjuvans-Präparate erhalten hatten, eine wesentlich raschere Ausscheidung des Antigens. Die Tabelle weist die äußerst wirksame Adjuvans-Wirkung aller der erfindungsgemässen wasserlöslichen Adjuvantien nach. Alle Mäuse, die diese Adjuvantien gleichzeitig mit dem Antigen erhielten, zeigen Gehalte an zirkulierenden Antikörpern (Opsoninen), die höher sind, als bei den ohne Adjuvans immunisierten Vergleichstieren, da das radioaktive Antigen rascher eliminiert wird.

Tabelle XV

Behandlung '	Restliche Radioaktivität . im Blut {%) i
Vergleichsproben	31,1+ ±6,9
BSA BSA + 50 \xg Substanz A BSA + 50 ,SUg Substanz C BSA' + 50 pg" Substanz E1 BSA +50 pg Substanz E2	28,7 + 12,9 16,3 + 15,9 0,1 ρ 0,05 ++ 14,7 +11,6 P 0,05 12,1 +13,1 P 0,05 11,7 + 10,9 P 0,05

⁺ Mittelwert der Prozentzahlen, erhalten bei 8 Mäusen pro Gruppe mit der Standardabweichung

Signifikanzwert nach der Studentverteilung

2. Nachweis des Fehlens einer Sensibilisierung des Tiers durch Substanz E1 und Substanz E2 gegenüber. Tuberkulin»

Substanz El und Substanz E2 verursachen in vitro keine Blastentransformation der Lyinphozyten von Tuberkulin-empfindlichen menschlichen Spendern und sie sind insbesondere nicht befähigt, wie Tuberkulin, einen verstärkten Einbau von tritiiertem Thymidin durch Lymphozyten in vitro zu verursachen.

Die von Tuberkulin-empfindlichen Spendern entnommenen Lymphozyten v/erden in Röhrchen nach der Technik von C. Bona, C. Heuclin und L. Chedid (Enhancement of Mixed Human Lymphocyte Cultures by a Water-Soluble Adjuvant. Golloque CNRS, 1972) inkubiert. Jedes Röhrchen enthält 10 Lymphozyten. Dazu wer-. den in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Röhrchen, 10 lig Tuberkulin, 50 ug Substanz E1 oder Substanz E2 gegeben. Am vierten Tag wird zu jedem Röhrchen 1 . .U Ci mit H^ markiertes Thymidin gegeben. Am fünften Tag werden die Lymphozyten entnommen und nach der vorstehend angegebenen Methode behandelt. Wie im Zusammenhang mit Tabelle XVI fest-

30982-1/116/*

gestellt wird, ist der Einbau Von Thymidin in άέη Tüberkulin enthaltenden Röhrchen beträchtlich höher ale lh de« Vergleicheröhrchen (Index 5*57). Im Gegensatz dazu ist in den Röhrchen» die Substanz E1 oder Substanz E2 enthalten» der Mhbau von Thymidin nicht verstärkt. Diese Ergebnisse zeigen, döß die erfindungsgemäßen Mittel kein Tuberkulin enthalteni

Tabelle XVl

Inkubation	Mittlere Radio aktivität (5 Röhrchen) (C/mln)	Transformationsindex (Radioaktivität der behandelten Lymphozy- ten/Radiöftktivität der VergißIchslyfflpho* zyten)
Vergleich Tuberkulin Substanz E1 Substanz E2	8.791 48.969 7.221 7.828	am 5,97 0,82 0,89

Es werden daher Adjuvantien erhalten» die eine beträchtliche Aktivität besitzen und gleichzeitig frei von störenden Neben* Wirkungen sind. Sie können verwendet werden, um die Wirksamkeit von bakteriellen oder virellen Vakzinen zu verstärken, insbesondere dann, wenn es sich um schwache Immunogene handelt. Sie können insbesondere dazu verwendet werden, die Immunisierung eines WirtsOrganismus (menschlicher oder tierischer Patienten) gegenüber bakteriellen oder virellen Infektionen, Tumorantigenen, Protozoenantigenen und dergleichen zu begünstigen. Die erfindungsgemäßen Mittel sind außerdem in wirksamer V/eise zur Herstellung von Seren verwendbar. Sie können in pharmazeutisch geeigneten, sterilen Wasser-Öl-Emulsionen zusammen mit dem Antigen oder den vorstehend genannten Vakzinen verabreicht werden.

3Ο9821Ί164

So können beispielsweise die erfindungsgemäßen Substanzen \ in unvollständigem Freund'sehen Adjuvans oder lh einem Vehikel suspendiert· werden, das aus 8,5 Teilen Hexadekan, 1,5 Teilen Arlacel oder Glycerinmonooleat, und 10 Teilen isotonischer Lösung'besteht.'

Von besonderem Wert ist darüberhinaus die Tatsache, daß die erfindungsgemaQen Substanzen unter geeigneten Anwendungsbedingungen ihre Ad juvans-·· Aktivität selbst dann entfalten, wenn sie dem Antigen in Salzlösung zugesetzt werden.

Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen kann in Form von typischen Vakzinen durch intramuskuläre, intrakutane oder subkutane Injektion oder auch durch Skarifikation erfolgen.

.30982171.164-

Claims (1)

1. Patentansprüche

   ] Wasserlösliches immunologisches Adjuvans, bestehend aus

   L
   einem Oligomeren, das die gleichen Monomereinheiten umfaßt wie die polymeren Substanzen der Zellwände von Mycobakterien, .Nocardia-Zellen und verwandten Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Bestandteile enthält:

   a) Neutrale Zucker, insbesondere Galactose und Arabinose,

   b) Aminozucker, insbesondere D-Glucosamin und D-Muraminsäure,

   c) Aminosäuren, insbesondere L- und D-Alanin, D-Glutamin*- säure und Meso-<*>- £-diaminopimelinsäure, sowie gegebenenfalls

   d) Lipoide in Anteilen von höchstens

   2. Immunologisches Adjuvans nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 12 bis 155& Aminozuckern, die im wesentlichen aus D-Glucosamin und D-Muraminsäure in äquimolaren Anteilen bestehen, 12 bis 15$ Aminosäuren, bestehend im wesentlichen aus L-AIanin, D-Alanin, D-Glutaminsäure und Meso-Ct- ^-diaminopimelinsäure im Verhältnis 1,3:1:1,

   60 bis 70% neutralen Zuckern, bestehend im wesentlichen aus D-Arabinose und D-Galactose im Verhältnis 2:1, weniger als 5% Lipoide sowie durch
   eine optische Drehung^x]₀ in Wasser von 11,3° £ 0,5°,

   309821/1164

   eine tJltraviolett-Endabsorption von weniger als 230 hm, Infrarot-Absorptioxisbanden bei 1650 und 1520 ein sowie bei 1000 bis 1100 cm""¹, ·

   sowie dadurch ge kennzeichne t i daß es in lyophilisierter Form als weißer flockiger Feststoff vorliegt und in Wasser leicht löslich unter Bildung einer leicht opaleszierenden Lösung sowie unlöslich in -Äther, Chloroform* Aceton und Äthanol-Chloroform-Gem.ischen ist.

   3i Immunologisches Adjuvans nach Anspruch 1 öder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines makromolekularen homogenen leicht polydispersen Systems vorliegt und in einem 0,1 η Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 bei 20⁰C und bei einer Konzentration c = 4,8 mg/ml einen Sedimentationskoeffizienten von 2,05 aufweist.

   4. Immunologisches Adjuvans nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an folgenden Bestandteilen: · ' -

   Neutrale Zucker,, bestehend aus Arabinose

   und Galactose 45 %

   Aminozucker, bestehend aus Glucosamin und.

   Muraminsäure nach Hydrolyse 16 % Aminosäuren, bestehend zu 17% aus Alanin,, Glutaminsäure und Meso-oediaminopimelinsäure . 29%

   Phosphor 0,9 %

   Lipoide weniger als 5 %

   ^0 9871 η 16A

   5. Immunologisches Adjuvans nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an folgenden Bestandteilen:

   Neutrale Zucker, bestehend aus Arabinose und

   Galactose 75 %

   Aminozucker, bestehend aus Glucosamin und Mu-

   raminsäure nach Hydrolyse 10-12 % Aminosäuren, bestehend zu 12% aus Alanin, Glutaminsäure und Meso-CC -^-diaminopimelinsäure 15% Lipoide weniger als 5 %, sowie durch einen Sedimentationskoeffizienten in einem 0,1 η Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 bei 20⁰C und einer Konzentration c = 4,8 mg/ml von etwa Sp₀ = 1,95·

   6. Immunologisches Adjuvans nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an folgenden Bestandteilen:

   Neutrale Zucker, die Glucose, Galactose,

   Arabinose und Mannose umfassen 20 - 28 % Aminozucker, bestehend aus Glucosamin und

   Muraminsäure nach der Hydrolyse 8,8 % Aminosäuren, die zu 15 % aus Alanin, Glutaminsäure und Keso-OC- £-diaminopime<linsäure bestehen ' 40 - 44 % Lipoide 5-7 %

   Phosphor etwa 5 %.

   309821/1164

   7. Immunologisches Adjuvans nach Anspruch 1, g e k e η η ζ-e i c h η e t durch einen.Gehalt an folgenden Bestandteilen: ' ■ ";■■". . ■- ■

   Neutrale Zucker, die Glucose, Galactose, Ara-

   binose und Mannose umfassen . * 16 %

   Aminozucker, bestehend aus Glucosamin und Mura-.

   minsäure nach der Hydrolyse - - -18-19 %

   Aminosäuren, die zu 2O?o aus Alanin, Glutaminsäure und Meso-CX -^-diaminopimelinsäure bestehen 39 %

   Lipoide etwa 5 %

   Phosphor etwa. Z .%

   8,- Immunologisches. Adjuvans nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an folgenden Bestandteilen: _■-.,"-.-.".

   Neutrale Zucker, die Glucose, Galactose, Ribose,

   und 14annose umfassen " 12 % Aminozucker, enthaltend Glucosamin und Muramin-

   säure nach Hydrolyse· 14 %

   Aminosäuren, die zu 11% aus Alanin, Glutaminsäure und Mesa-OC- ίΓ-diaminopimelinsäure bestehen 19 % Lipoide ■ ■ . weniger als 5 % Phosphor weniger als 5 %

   9. Immunologisches'Adjuvans nach Anspruch 1, da d ur c h gekennzeichnet ,■ daß es aus einem von neutralem

   3 09821/1164

   Zucker freien Oligomeren oder einem Oligomeren mit geringem Gehalt an neutralen Zuckern besteht, dessen Monomereinheiten die Aminozucker und Aminosäuren der Polymeren umfassen, welche die Zellwände von Mycobakterien, Nocardia-Zellen und von verwandten Mikroorganismen bilden, daß sie jedoch die Lipoideinheiten dieser Monomeren nicht oder nur zu einem geringen Teil umfassen.

   10. Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Adjuvans nach Anspruch 1 durch Züchten eines Stammes von Macobakterien, Nocardia-Zellen oder verwandter Mikroorganismen und Gewinnen der Zellen aus der Kultur, dadurch gekennzeichnet, daß man die gewonnenen Zelle» oder die durch Desintegration der Zellen erhaltenen Zellwände einer Behandlung zum Entfernen der Lipoide unterwirft, das erhaltene, von Lipoiden befreite Material im wässerigen Medium mit einem murolytischen Enzym behandelt, die erhaltene feste Fraktion entfernt und das lösliche immunologische Adjuvans in Form einer wässerigen Fraktion gewinnt.

   11. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , daß man als murolytisches Enzym eine Murainidase, insbesondere Lysozym, verwendet.

   12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet , daß man aus den durch Desintegration erhaltenen Zellwänden vor der Behandlung mit dem murolytischen En^yra die. Proteine durch Behandlung "mit pro-

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   teolyt'ischen Enzymen entfernt.

   13. Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 12, dadurch ge k e n η ζ e. i c h η e t , daß man zur Gewinnung der Zellwände die durch' Züchtung erhaltenen Zellen in einem flüssigen Medium suspendiert, die Suspension einer Desintegrie- > rungsbehandlung unterwirft, durch eine erste Zentrifugation mit ausreichend niederer Geschwindigkeit die nicht desintegrierten Zellen abtrennt und durch eine zweite Zentrifugation der in der ersten Zentrifugation obenstehenden Flüssigkeit mit höherer Geschwindigkeit das Material der desintegrierten Zellwände abtrennt. ". .

   14. Verfahren»nach Ansprüchen 10 bis 13> dadurch

   g e k e η η ze ic h. η e t , daß man die Desintegration der Zellen in wässeriger Suspension in einer gekühlten French-Presse unter einem Druck von 421 kg/cm durchführt.

   15. Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 14, d a d u' r c h gekennzeichnet, daß die Abtrennung und Entfernung der Wachse und freien Fette mit Hilfe neutraler Lösungsmittel, insbesondere Aceton, Alkohol, Chloroform oder Gemischen dieser Lösungsmittel, erfolgt.

   16. Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 15, dadurch

   g e kennz e ichn e t, daß die Entfernung der Proteine mit proteolytischen Enzymen, insbesondere Trypsin oder Chymotrypsin erfolgt. ,

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   17. Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 16, d a d u r c Ii gekennzeichnet, daß man die Nucleinsäuren mit Hilfe von DUase entfernt.

   18. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzei chnet, daß man die Behandlung mit dem murolytischen Enzym an einer Suspension der Zellwände in einer Pufferlösung, insbesondere einer Lösung von Ainmoniumacetat, durchführt, und anschließend durch gegebenenfalls mehrmaliges Lyophilisieren und Wiederaufnehmen der Lösung

   in Wasser das Adjuvans von der Pufferlösung abtrennt.

   19· Verfahren nach Ansjjruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet , daß man das Entfernen der Lipoide aus den ganzen Zellen durch aufeinanderfolgende Behandlungen mit Aceton, Äthylalkohol, Chloroform und einem Chloroform-Methanol-Gemisch oder absolutem Alkohol, Chloroform, einem Chloroform-Methanol-Gemisch und Petroläther durchführt.

   20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß man die von Lipoiden befreiten Zellen vor der Behandlung mit dem murolytischen Enzym mit Vasser und dann mit "einer 0,1 m Ammoniumacetat-Pufferlösung des pH-V/erts 6,2 wäscht.

   21. Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganis-

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   iiius der Spezies Kycobacteriurn tuberculosis, var. hominis oder bovis, Mycobacteriurn kansasii. oder Mypobacterium smegmat is verwendet. " . ■■.-.-" "■"-■·-

   22. Verfahren nach Anspruch 21, d a d u r c h ge k e η η zeichnet, daß: /man als Mikroorganismus Mycobacterium smegmatis. Stamm ATCC 21732 verwendet. -"

   23. Verfahren nach Anspruch 21, d a d u r c h ge k e η η zeichnet , daß man als Milcro Organismus Bacillus CaI-mette Guerin, Stamm Pasteur- verwendet. .

   24. Verfahren- nach Anspruch 21, dad u r c h g e k e η η zeichnet , daß man als Mikroorganismus Mycobacterium kansasii, Staroui, P 21 Runyon verv/endet.

   25· Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 20, da du r c h gekennzeichnet ,' daß man als Mikroorganismus einen Stamm der Spezies " Nocardia opaca verwendet".

   26, Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 25, dad u r c h gekennzeichnet , daß man die das Adjuvans enthaltende wässerige Fraktion durch Filtration über ein Molekularsieb reinigt.

   27. Verfahren nach Anspruch 26, d a d u r c h '. g; e k e η η zeichnet , daß man ein Polydextran, insbesondere Sephadex G 50; oder Sephadex G 7^. verv/endet und mit 0,1 η Essigsäure aquilibriert. . ^fe

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   20. Verfahren nach Ansprüchen 21 "bis 24 und 27, dadurch g G k e η η ζ e i c h h e t , daß man nach der Reinigung die dorn ersten oder zv/eiton Elutionspeak entsprechend ο Fraktion gewinnt.

   29. Verfahren nach Ansprüchen 25 und 27, dadurch gekennzeichnet , daß man bei der Reinigung die dem zweiten oder dritten Elutionspeak entsprechende Fraktion gewinnt.

   30. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 biß 29, dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene Adjuvans zusätzlich in Gegenwart eines proteolytischen Enzyms im wässerigen Medium bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,5 und etwa 8,2 inkubiert und die wässerige Fraktion gewinnt.

   31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekenn zeichnet , daß man das Inkubieren in einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 7,8 in Gegenwart von Trypsin durchführt und die erhaltene wässerige Fraktion mit einem Molekularsieb behandelt.

   32. Verv/endung eines immunologischen-Adjuvans gemäß Ansprüchen 1 bis 9 oder eines gemäß Ansprüchen 10 bis 31 hergestellten Adjuvans zur Herstellung von Arzneimitteln, insbesondere von Vakzinen zur Immunisierung eines V/irtsorganismus gegen Antigene.

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   33. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch g e k e η η ·- ζ e i c h η e t j -daß man eine wässerige Lösung des Adjuvans mit einem pharmazeutisch geeigneten Öl in eine injizierbare oder durch Skarifikation verabreichbare Emulsion; überführt..

   34. Verv/endung nach Anspruch 33 > dadurch gekennzeichnet, daß man als pharmazeutisch geeignetes Öl

   ein Paraffin, insbesondere Hexadecan, verwendet.

   35· Verv/endung nach Anspruch 32, d a d u r c h g e k e η η zeichnet , daß man das Adjuvans in einer wässerigen, von Öl freien Salzlösung anwendet, die das immunologische Adjuvans neben dem Antigen der Vakzine enthält.

   36. Verwendung nach Anspruch 35» dadurch gekennzeichnet , daß man der Salzlösung außerdem Zusatzstoffe, insbesondere Aluminiumhydroxyd oder Calciumphosphat,. zusetzt.

   37. Durch Injektion oder Skarifikation verabreichbare Vakzine, dadurch ge kenn ze lehnet , daß sie außer einem iinmunogenen Mittel eine wirksame Dosis eines "·. immunologischen Adjuvans gemäß Ansprüchen 1 bis 9, das gemäß Ansprüchen 10 bis 31 erhalten vairde, mit einem pharmazeutisch geeigneten sterilen Träger enthält. -

   38. Vakzine nach Anspruch 37> dadurch g e k e η η zeichnet , daß, sie als pharmazeutisch geeigneten Träger eine ¥asser-Öl-EmUlsion enthält.

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   39. Vakzine nach Anspruch 37, dadurch g e k e η η zeichnet , daß sie als sterilen Träger eine pharmazeutisch geeignete Salzlösung enthält.

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