DE2234382C3

DE2234382C3 - Verfahren zur in-vitro-Bestimmung einer physiologisch aktiven Substanz in einer Körperflüssigkeit

Info

Publication number: DE2234382C3
Application number: DE2234382A
Authority: DE
Inventors: Everett K. Vancouver B.C. Mincey (Kanada)
Original assignee: Byk Mallinckrodt Chemische Produkte GmbH
Current assignee: Byk Mallinckrodt Chemische Produkte GmbH
Priority date: 1971-07-12
Filing date: 1972-07-10
Publication date: 1979-02-15
Also published as: PL82595B1; US3799740A; JPS51128413A; AU457051B2; NL7209081A; AU4368972A; CA1015251A; GB1395253A; JPS5249757B1; SU576976A3; SE406647B; IL39739A; FR2142544A5; DE2234382A1; DE2234382B2; DD97752A5; IT1003512B; RO61156A; ES404772A1; AU8014075A

Description

3 4

stimmten Umständen, die dem katalytischen Abbau Einen Überblick über den Stand der Technik auf eines Teils des markierten T4 in der T4/TBG-Lösung diesem Gebiet mit zahlreichen Hinweisen auf Originalzuzuschreiben ist, wurde durch Brown und Veröffentlichungen geben R. L. H a yes, F. A. G os F. P. H a 11 e 11 behoben, indem sie ein Chelatisie- w i t ζ und B. E. P. M u r ρ h y in Teil 1 von »Proteinrungsmittel zur Lösung zufügten. Diese Modifikation 5 binding Studies and Radioassyas« aus »Radioisotopes des Reagens ergab keine Änderung in der fundamen- in Medicine«, CONF 6 71 111, U. S. Atomic Energy talen Theorie und Arbeitsweise des Brown-Verfahrens. Commission, 1968.

Annähernd 99,95% des zirkulierenden Thyroxins Die Schilddrüse synthetisiert zwei Hormone,

sind an die Plasmaproteine gebunden und 0,05 % 3,3',5'-Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4).
liegen im ungebundenen, freien Zustand vor. Es wird io Bestimmte Serumproteine wie Globulin (Thyroxin-

als gültig angesehen, daß der Spiegel an ungebundenem bindendes Globulin, TBG), Prealbumin (Thyroxin

oder »freiem« Thyroxin im Plasma direkt für die Regu- bindendes Prealbumin, TBPA) und Albumin (Serum-

lation des Zellmetabolismus und die Thyrocropin- albumin, SA) binden diese Schilddrüsenhormone in

(TSH)-Sekretion der Hypophyse verantwortlich ist. variierenden Graden. Der Begriff »thyroxin-bindend« Somit würde die direkte Messung des freien Thyroxins 15 beschreibt sowohl die Bindung des T3 als auch des T4

den metabolischen Status eines Individuums genauer an diese Proteine, da entweder T3 oder T4 von einer

wiedergeben als irgendein anderer Schilddrüsenfunk- gegebenen bindenden Steile aufgenommen werden

tion-Einzeltest. Bisher waren die verfügbaren Ver- kann. Die Schilddrüsenhormone stehen mit den

fahren zur Messung des freien Thyroxins die Gleich- thyroxinbindenden Proteinen in dynamischem Gleichgewichtsdialyse, Ultrafiltration oder Gelfiltration, korn- 20 gewicht.

biniert mit einer Bestimmung des Gesamtserum-Thyro- Das ungebundene T4 oder der »freie« T4-Plasma-

xins. Diese Verfahren zur Bestimmung des Freien spiegel beträgt schätzungsweise weniger als 0,1 Prozent

Thyroxins sind jedoch komplex, mühselig und nicht des gesamten Proteingebundenen T4, oder annähernd

zum klinischen Routinegebrauch angewendet worden. 2 bis 5 Millimikrogramm-Prozent.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Ver- 25 Die Sckilddrüsenhormon-Synthese und -Sekretion fahren zur in-vitro-Bestimmung einer physiologisch wird durch ein anderes Hormon, das Thyroid-stimuaktiven Substanz in einer Körperflüssigkeit zu ent- lierende Hormon (TSH), beeinflußt, das von dem vorwickeln, welches eine genauere und verläßliche direkte deren Hypopiiysenlappen abgesondert wird. Man Messung bzw. Bestimmung dieser aktiven Substanz in nimmt an, daß TSH das »Abfangen« oder die Entder Körperflüssigkeit erlauben sollte und damit ver- 30 fernung des Jods aus dem Plasma und die Synthese Jäßliche, exakte Rückschlüsse auf den metabolischen und Freisetzung der Schilddrüsenhormone reguliert. Status des zu untersuchenden Individuums ermög- Der Spiegel des zirkulierenden T3 und T4 beeinflußt Weht. das Maß der TSH-Sekretion. Wenn die Plasmaspiegel Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Verfahren dieser Hormone unter Normalkonzentrationen liegen, der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß der 35 wird die Hypophyse zur Synthese und Sekretion von Mischung eine zweite Probe der die aktive Substanz TSH stimuliert. TSH stimuliert die Schilddrüsenenthaltenden Körperflüssigkeit, welche ungesättigtes hormon-Sekretion, was wiederum über ein negatives Bindematerial für diese aktive Substanz enthält, züge- Rückkopplungssystem die TSH-Sekretion der Hyposetzt wird, und daß entweder die insgesamt an das physe herabsetzt.

Bindematerial gebundene oder die insgesamt ungebun- 40 Zur Bewertung der Schilddrüsen-Funktion stehen dene vorliegende markierte aktive Substanz gemessen dem Mediziner mehrere klinische in-vitro-Tests zur ^w'^ra· Verfugung. Seit langem benutzte Indices sind der me-Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht ver- tabolische Basiswert (i. Orig.: Basal metabolic rate besserte in-vitro-Tests zur Bestimmung von Hormonen, [BMR]) und der Protein-gebundene Jodspiegel (PBI). Antigenen, Steroiden usw. in Körperflüssigkeiten, ins- 45 Ein klinisch brauchbarer Test ist der T3-Aufnahmebesondere Tests der Schilddrüsenfunktion, welche Test. Der T3-Aufnahme-Test mißt die Kapazität begleichzeitig sowohl den Serumthyroxin-Spiegel als auch stimmter Serumproteine, vor allem des TBG, radioden Sättigungsspiegel an Thyroxin bindendem GIo- aktiv markiertes T3 durch ungesättigte oder vakante bulin berücksichtigen. thyroxin-bindende Stellen aufzunehmen oder zu Gemäß einer speziellen Ausgestaltung der Erfindung 50 binden; daher ist er hauptsächlich ein Mittel zur Bewird ein Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses Stimmung der nichtbesetzten bindenden Stellen. T3-zwischen dem freien und gebundenen Thyroxin-Gehalt Aufnahme-Tests schätzen die Verteilung von markiereiner Blutprobe vorgeschlagen, wobei die erste Probe tem T3 zwischen Serum-Komponenten und anderen Thyroxin aus der zu testenden Blutprobe enthält und Agenden mit einer Affinität für T3 ab. Andere Agenpraktisch frei von thyroxinbindendem Globulin ist und 55 tien sind zum Beispiel rote Blutkörperchen, Proteindas Reagens die Lösung eines an ein thyroxinbinden- überzogene Holzkohle und Ionenaustausch-Harze in des Globulin gebundenen markierten Schilddrüsen- Granulat-, Folien-, Schwamm- und Säulenform,
hormons, wie Thyroxin oder 3,3',5'-Trijod-thyronin, Ein genauer und vereinfachter T3-Aufnahme-Test und die zweite Probe eine Lösung ist, die ungesättigtes wird in der FR-PS 20 47 211 beschrieben. Der Schlüsthyroxinbindendes Globulin und dessen assoziierte 60 sei zu dieser Arbeitsweise besteht in der Verwendung Schilddrüsenhormone aus einer Blutprobe derselben eines Ionenaustausch-Harzes in Form einer festen Quelle enthält, und das markierte, an das thyroxinbin- Matrix, welches nicht das Spülen zur Entfernung von dende Globulin gebundene Schilddrüsenhormon oder ungebundenem T3 erfordert und leicht aus der Reakdas ungebundene markierte Schilddrüsenhormon ge- tionslösung zu entfernen ist, um die direkte Messung messen wird. 65 der Serum-Bindekapazität für T3 zu ermöglichen. Zur Erläuterung dieser speziellen Weiterbildung der Dieser T3-Aufnahme-Test mißt direkt die Binde-Erfindung ist es erforderlich, zunächst den Stand der kapazität des Serum-TBG für markiertes T3. Es ist Technik ausführlich darzulegen. bekannt, daß TBPA keine Affinität für T3 besitzt. Die

Affinität von TBG für T3 ist viel größer als die Affinität von Albumin für dieses Hormon, und die Verdünnung des Serums im Puffer während der Arbeitsweise reduziert weiter die Bindung von T3 durch Albumin.

Wenn Serum zu einer Pufferlösung des markierten T3 zugegeben wird, binden die nichtbesetzten TBG-Bindestellen markiertes T3. Das Überschüssige oder nichtgebundene markierte T3 wird dann an ein sekundäres Bindematerial — in diesem Test der Ionenaustausch-^Trfarz-Streifen — gebunden. Nach Entfernung des Streifens aus der Pufferlösung wird die Menge des T3-markierten TBG direkt gemessen, und die Ergebnisse werden als Thyroxin-Bindekapazitätsindex (TBC Index) ausgedrückt, bezogen auf den Normal-T3-Wert von 1,00.

Wenn die Konzentration von TBG (primäres Bindematerial) in dem Serum normal ist, ist, die Zahl der zur Bindung von markiertem T3 verfügbaren oder nichtbesetzten Bindestellen umgekehrt proportional der Zahl der Bindestellen, die durch T4 und bis zu einem geringeren Grad durch T3 besetzt sind. Wenn die Verfügbarkeit von1 T4 für TBG-Bindung erhöht wird, wie bei einer Überfunktion der Schilddrüse, werden diese Bindestellen nahezu vollständig durch T4 besetzt; desahlb stehen weniger Bindestellen zur Bindung von markiertem T3 zur Verfugung. Somit ist die an das TBG gebundene Aktivität geringer als in dem normalen T3-Kontrollserum, was den herabgesetzten TBC-Index bedingt. Wenn die Verfügbarkeit von T4 für die TBG-Bindung herabgesetzt ist, wie bei der Unterfunktion der Schilddrüse, sind weniger Bindestellen durch T4 besetzt, was mehr Stellen als normal verfügbar zur Bindung von markiertem T3 freiläßt. Das Ergebnis ist eine Zunahme der Menge der an das TBG gebundenen Aktivität und eine Zunahme des TBC-Index.

Es sollte vermerkt werden, daß, obgleich markiertes T3 traditionsgemäß zur Messung des TBC-Index verwendet wird, die Verwendung von markiertem T4 gleichwertig ist.

Auf der Grundlage der TBC-Index-Messungen kann eine Indikation des klinischen Thyroid-Status an Hand der Bereiche in Tabelle 1 vorgenommen werden.

Diese Bereiche gehen auf eine repräsentative Probenahme bei Patienten innerhalb eines weiten geographischen Gebietes zurück.

Tabelle 2
Gesamtserum-Thyroxin-Bereiche

Hypothyroid

(Unterfunktion
der Schilddrüse)

Euthyroid

Hyperthyroid

(Überfunktion
der Schilddrüse)

Tabelle 1 TBC-Index-Bereiche	Euthyroide Funktion	Unterfunktion der Schilddrüse
Überfunktion der Schilddrüse	0,87 bis 1,13	größer als 1,13
weniger als 0,87

Die Indikation des klinischen Thyroid-Status, wie er sich in dem Serum-Thyroxin-Spiegel widerspiegelt, kann unter Bezug auf die vorgeschlagenen, in Tabelle 2 gezeigten Bereiche erfolgen. Diese Bereiche basieren auf einer repräsentativen Probennahme an Patienten innerhalb eines weiten geographischen Gebietes.

weniger
als 5,0 ^

5,0 bis
13,7 μ_Β

größer
als 13,

Grundlegend wird der freie Thyroxin-Spiegel durch die Konzentration an zirkulierendem Thyroxin (gebunden) und durch den Spiegel des TBG bestimmt. Jedoch ist die Wechselwirkung dieser beiden Faktoren zur Aufrechterhaltung normaler Spiegel an freiem .Schilddrüsenhormon beträchtlich komplexer, als durch diese einfache Feststellung nahegelegt wird.

Unter euthyroiden Bedingungen erfolgt die Aufrechterhaltung eines normalen Spiegels an freiem Thyroxin mittels Regulationsmechanismen, welche Änderungen im Gesamtthyroxin-Spiegel stimulieren, um Änderungen im TBG-Spiegel zu kompensieren.

Eine Zunahme im Östrogen-Spiegel beeinflußt das Schilddrüsen-Regulationssystem, was zu einer Situation führt, die verzerrte Ergebnisse bei dem T3-Aufnahmetest und Serum-T4-Test hervorbringt. Solche erhöhten Östrogen-Spiegel treten gewöhnlich auf während der Schwangerschaft oder während einer Östrogen-Verabreichung, zum Beispiel während der Medikation mit einer antiovulatorischen Präparation, welche östrogen enthält.

Die folgende Sequenz von Ergebnissen nimmt in der Zunahme des Östrogen-Spiegels ihren Ausgang.

1. Erhöhte Östrogen-Spiegel rufen erhöhte TBG-Bildung hervor.

2. Die resultierende erhöhte Zahl ungesättigter Thyroxin-Bindestellen (TBG) bindet freies Thyroxin, was eine Erniedrigung des freien Thyroxin-Spiegels verursacht.

3. Die Hypophyse wird durch den herabgesetzten freien Thyroxin-Spiegel stimuliert, um Thyrotrophormon (TSH) auszuscheiden.

4. Die Schilddrüse wiederum wird durch das TSH zur Sekretion von Thyroxin stimuliert.

5. Thyroxin bindet mit TBG zu einem kompensierten Spiegel, was das freie Thyroxin auf eine normale Konzentration zurückbringen läßt.

so Wenn eine Erhöhung des Östrogen-Spiegels vorliegt, die während der Schwangerschaft oder Östrogen-Verabreichung, wird die klinische Bewertung der Schilddrüsen-Aktivität, die aus T3-Aufnahmetest-Bestimmungen erhalten wird, eine Erhöhung an ungesättigten TBG-Bindestellen anzeigen und daher eine Unterfunktion der Schilddrüse. Umgekehrt werden T4-Bestimmungen eine Überfunktion der Schilddrüse anzeigen. Der wirkliche klinische Status unter diesen Bedingungen, der Euthyroidismus, kommt in dem normalen Spiegel an freiem Thyroxin zum Ausdruck. Somit ist in diesem Fall weder das T3-Aufnahmetestnoch das Serum-T4-Testergebnis allein adequat für eine korrekte klinische Bestimmung, dies obwohl jedes Testergebnis ganz genau den Wert der gemessenen Variablen widerspiegelt.

1965 führten F. C1 a r k und D. B. H ο r η (J. CHn. Endocrinol. 25; 39 bis 45) ein Verfahren zur Abschätzung eines Index ein, welcher proportional der Kon-

zentration an freiem T4 ist. Er basiert auf der Bestimmung des PBI und der TS-Aufnahme-Messung.

PBI X Harz-T3-Aufnahmeverhältnis = »Free thyroxine Index«

Es besteht eine direkte Beziehung zwischen dem PBI-Spiegel, wie er von Clark und Horn verwendet wird, und dem Serum-T4-Spiegel, wenn er gemäß dem oben zitierten Brown-Verfahren bestimmt wird.

Andererseits ist der TBC-Index, wenn er gemäß dem Vorschlag der FR-PS 20 47 211 berechnet wird, umgekehrt proportional dem T3-Auf nahmeverhältnis von Clark und Horn.

Als Folge dieser Beziehungen ist es möglich, einen »Free-74-Index« aus dem TBC-Index und den Daten, die aus dem Brown-Test erhalten werden gemäß der folgenden Formel zu berechnen:

Free T4 Index =

Serum-T4-Spiegel fcg %)
TBC-Index

Obwohl dieser »Free-T4-Index« numerisch verschieden von dem »Free thyroxine Index« von Clark und Horn ist, besteht Gleichwertigkeit.

Die Indikation des klinischen Thyroid-Status, wie ihn der Free-T4-Index widerspiegelt, kann unter Bezug auf die in Tabelle 3 gegebenen Bereiche vorgenommen werden, welche auf einer repräsentativen Probennahme an Patienten innerhalb eines weiten geographischen Gebietes basieren.

Tabelle 4

Tabelle 3
Free-TJ-Tndex-Bereiche

Hypothyrodid

(Unterfunktion
der Schilddrüse)

Euthyrodid

Hyperthyroid

(Überfunktion
der Schilddrüse)

weniger
als 4,4

4,4 bis 15,7

mehr als 15,7

Wie bei der eigentlichen Messung des freien T4 ist der »Free-T4-Index« gegenüber der Verabreichung von östrogenen, Androgenen, Salicylaten, Diphenyl-hydantoin, den Bedingungen der Schwangerschaft oder Naphrosis und anderen Faktoren, die infolge Variationen im Spiegel des TBG oder Störung dessen normaler Bindung anomale Ergebnisse hervorrufen, unempfindlich.
Die Messisng einer einzigen Variablen war bisher gewöhnlich nicht ausreichend, um eine genaue Diagnose des Thyroid-Status zu liefern.

Vor der vorliegenden Erfindung kamen der experimentell bestimmte freie T4-Wert oder der berechnete »Free T4 Index« einer verläßlichsten Information mit der geringsten Zahl von Tests zur Bestimmung der Schilddrüsen-Funktion am nächsten.

Die Wirkungen verschiedener physiologischer Bedingungen und Drogen auf die T4- und T3-Tests und den »Free T4-Index« können wie folgt zusammengefaßt werden:

T4

T3 FT 4-Index

Normalwert

T3-TBC-Index
Τ4μ_δ%
Free T4-Index

Schwangerschaft/ erhöht

Östrogen-Medikation

Hypo-Schwangerschaft

Hyper-Schwangerschaft

Nephrosis

Androgen-Medikation

Diphenyl-hydantoin

Hypothyroidismus-behandelt
adequate T3-Medikation

adequate trockene

Schilddrüse

adequates L-Thyroxin
Hyperthyroidismus-behandelt
mit adequater Kontrolle

Acromegalie erniedrigt

erhöht

erniedrigt	erhöht
erhöht	erniedrigt
erniedrigt	erniedrigt
erniedrigt	erniedrigt
erniedrigt	erniedrigt
kein Effekt	kein Effekt
normal	erhöht
hoch-normal	erhöht
normal	normal

erniedrigt normal

erniedrigt

erhöht

normal

kein Effekt

hoch-normal

hoch-normal
normal

normal

0,87 bis 1,13
5,0 bis 13,7
4,4 bis 15,7

Die spezielle Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur direkten Bestimmung des Verhältnisses zwischen dem freien und gebundenen Thyroxin-Gehalt einer Blutprobe ermittelt einen Index für freies Thyroxin und gestattet die genaue Bestimmung des Status der Schilddrüsenfunktion mit einem einzigen einfachen Test in Gegenwart störender Einflüsse, wie erhöhter Östrogen-Spiegel.

Bei der speziellen Ausgestaltung der Erfindung wird das wirksame Thyroxin-Verhältnis des Blutes durch eine Modifizierung des obenerwähnten Brown-Verfahrens für Serumthyroxin ermittelt, wobei z. B. zwei Lösungen, die von dem zu testenden Blut stammen, zu dem markierten T4. TBG-Reagens zugegeben werden. Die erste Lösung derselben ist, wie von Brown beschrieben (französische Patentschrift 20 47 211), eine

ίο

etwa 80% des T4 aus einer Serumprobe enthaltende Lösung, die frei von Blutproteinen ist.

Die zweite Lösung enthält erfindungsgemäß eine vorbestimmte Menge des zu testenden Serums. Gemäß der bisherigen Technik wird die T4-Bindung durch Albumin stark durch Verdünnung reduziert, und die Bindung durch Prealbumin wird durch Barbital-Puffer inhibiert, wodurch eine Lösung erhalten wird, in welcher das einzige wirksame T4-bindende Protein ungesättigtes TBG aus dem zu testenden Serum ist.

Es darf in Erinnerung gerufen werden, daß bei dem

Tabelle 6

T3-Aufnahmetest die Thyroxin-bindenden Proteinstellen, die nicht von T3 oder T4 besetzt sind, markiertes T3 aufnahmen. Bei dem Serum-T4-Verfahren wird das gesamte Serum-T4 extrahiert und ersetzt markiertes T4 aus dem markierten T4.TBG. Das ersetzte markierte T4 wird entfernt und das verbleibende markierte T4.TBG ausgezählt. Tabelle 6 gibt in relativen Werten den Status der — entsprechenden Serum-Komponenten und die T3-Aufnahmetest- und Serum-T4-Testergebnisse in verschiedenen klinischen Situationen wieder.

1	2	3	4	5	6	7 I
Klinische Situation	Spiegel der T4-bindenden Proteine	Spiegel des gebundenen T4	Spiegel des freien T4	T3-Aufnahme test (cpm.)	Serum-T4-Test (cpm.)	Free T4 Index jj (cpm.) }. (5 + 6) I
euthyroid	normal	normal	normal	mittel (10 000)	mittel (10 000)	I 20 000 I
hypothyroid	normal	niedrig	niedrig	hoch (15 000)	hoch (15 000)	30 000 1
hyperthyroid	normal	hoch	hoch	niedrig (5000)	niedrig (5000)	10 000 1
erhöhter Östro- gen-Spiegel	hoch	hoch	normal	hoch (15 000)	niedrig (5000)	20 000 1 I

cpm. = Zählungen pro Minute.

Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß beim Vorliegen einer unkomplizierten Schilddrüsenerkrankung die Zählrate sowohl bei dem T3-Aufnahme- als auch dem Serum-T4-Test von der normalen in gleicher Richtung abweicht, d. h. hypothyroides Serum ergibt hohe Zählungen in beiden Tests, und hyperthyroides Serum gibt niedrige Zählungen in beiden Fällen. Somit unterstreichen die kombinierten Zählungen in den beiden Tests das Vorliegen einer abnormalen Situation hinsichtlich der Schilddrüsen-Funktion.

Andererseits läßt der verzerrende Einfluß erhöhter Östrogen-Spiegel die Zählraten in beiden Tests von der normalen in entgegengesetzten Richtungen abweichen. Ihre Abweichungen von Normalwerten tendieren zur gegenseitigen Kompensation; ihre Summe zeigt daher eine normale Situation hinsichtlich der Schilddrüsenfunktion an.

Der berechnete Free Thyroxine Index von Clark und Horn und Varianten desselben basieren auf dem gleichen Konzept. Nur das arithmetische Mittel differiert.

Die vorliegende Erfindung gestattet, das wirksame Thyroxin-Verhältnis als Index des relativen freien Thyroxin-Spiegels einer Probe aus Blutserum (oder Plasma) in einem einzigen in vitn.-Test zu bestimmen, der in einer einfachen nichtunterteilten Phiole durchgeführt wird. Dies wird noch klarer aus der folgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels.

In der ersten Stufe des Verfahrens wird das T4 (annähernd 80%) aus einer Serumprobe extrahiert und ein aliquoter Teil des Extraktes zu einer markierten T4.TBG-Reagenslösung zugefügt. Das T4 in dem Extrakt ersetzt teilweise markiertes T4 aus dem markierten T4 · TBG-Reagens, wobei das Ausmaß dieses Ersatzes proportional dem T4-Spiegel der Serumprobe ist.

In dem zweiten Schritt wird ein aliquoter Teil des gleichen Serums zur gleichen Phiole gegeben. Das ersetzte markierte T4 aus Schritt 1 wird nun teilweise von dem ungesättigten TBG aufgenommen, das in dem aliquoten Serumteil, der in Schritt 2 zugegeben wird, vorliegt; das Ausmaß der Aufnahme an markiertem T4 ist von zwei Faktoren abhängig:

(1) der Menge an verfügbarem markiertem T4 (aus Schritt 1);

(2) der Menge an ungesättigtem TBG, das in dem zugegebenen aliquoten Serumteil zugegen ist

(Schritt 2).

Es ist verständlich, daß die Reihenfolge oder Sequenz dieser Schritte nicht entscheidend ist und die Erfindung durchgeführt werden kann, wenn man die Schritte oder die Reihenfolge der Zugabe des T4-Extraktes und des Patientenserums, das die ungesättigte TBG enthält, umkehrt. Auch kann das verwendete markierte Reagens eine Barbital-gepufferte Lösung von markiertem T3 an Stelle von markiertem T4 sein.

Es ist bereits herausgestellt worden, daß markiertes T3 traditionsgemäß bei der Bestimmung der ungesättigten Bindekapazität von Serumproteinen für Schilddrüsenhormone verwendet worden ist, daß es jedoch durch markiertes T4 gleichwertig ersetzt werden kann. Im vorliegenden Verfahren erfolgt dieser Ersatz, wobei das markierte T4 durch Freisetzung aus markiertem T4. TBG in Schritt 1 geliefert wird.

Es ist offensichtlich, daß die relativen Mengen an Serum-T4 und ungesättigten Serumproteinen, die in den beiden Schritten des erfindungsgemäßen Testverfahrens erhalten werden, von den relativen Volumina Serum, die durch die beiden verwendeten aliquoten Teile dargestellt werden, abhängig sind. Gute Ergebnisse sind erhältlich, wenn man von einem vorbestimmten Verhältnis des Volumens der ersten Blutserumprobe zum Volumen der zweiten Blutserumprobe ausgeht. Es ist experimentell gefunden worden, daß die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn dieses

Verhältnis etwa 21:1 beträgt. Wie gesagt, dieses Verhältnis kann aber auch z. B. im Bereich zwischen etwa 10 :1 und 30:1 variieren.

Unter den Begriffen »markiertes T4« und »markiertes T3«, wie sie hier verwendet werden, soll eines dieser Hormone in einer Form verstanden werden, in welcher es identifizierbar gemacht worden ist durch Assoziierung mit oder Inkorporierung von einer Menge an unterscheidbaren Atomen. Die unterscheidbaren Atome können z. B. Atome eines Radionuklide, das durch seine Radioaktivität identifizierbar und meßbar ist, oder Atome eines stabilen Nuklids mit unterscheidbarem Atomgewicht sein, das wie, z. B. C-13, normalerweise nicht zugegen und durch Massenspektroskopie identifizierbar ist. Es können aber auch Atome eines anderen Elementes, das einem normalerweise in dem Hormon vorhandenen Element chemisch ähnlich ist, sein.

Durch die spezielle Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird es nun möglich, eine direkte Bestimmung des wirksamen Thyroxin-Verhältnisses. eine genaue Bestimmung des Schilddrüsen-Funktionsstatus, in Gegenwart eines verzerrenden Einflusses, wie erhöhter Östrogen-Spiegel, vorzunehmen. In dieser Hinsicht bietet das Testverfahren nach der Erfindung genaue und verläßliche Ergebnisse, wenn es mit Blutproben von sehr kranken Patienten und Patienten eh- TBG in deren Blut durchgeführt wird, in weichen hallen die Standard-T3- und T4-Tests zu Γα'· sehen Ergebnissen führen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch angewendet zur Bestimmung anderer Liganden oder physiologisch aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten, wie Steroiden, Antigenen, Antikörpern und Eisen, welche in gebundenen und nicht gebundenen Formen existieren können. Das Bindematerial in solchen Systemen ist eine Substanz, normalerweise ein Protein, welche eine Affinität zu mindestens einem solchen Liganden oder einer solchen physiologisch aktiven Substanz hat und daher zur Bildung eines Ligand-Bindematerial-Komplexes führt. Zum Beispiel kann das vorliegende Testverfahren zur Bestimmung von Steroiden, wie Plasmacortisol, oder zur Bestimmung von Plasmaeisen angewendet werden. So ist das corticosteroide Cortisol, eines der wichtigsten Steroidhormone, die von der Nebennierenrinde abgeschieden werden, an einen Protein-Träger, das Corticosteroid-bindende Globulin (CBG) oder Transcortin, gebunden. In ähnlicher Weise wird Plasmaeisen durch Transferrin (eisenbindendes Globulin) transportiert, welches sich wie ein /J-Globulin verhält. Während der Schwangerschaft, z. B. können die Spiegel an Corticosteroid-bindendem Globulin und Transferrin ansteigen.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung noch weiter erläutert:

Markiertes T4. TBG-Reagens

Dieses Reagens ist eine gepufferte Verdünnung von gesammeltem Normalserum, das Barbital und mit J-125 markiertes Thyroxin enthält. Es wird in bekannter Weise wie folgt erhalten:

Zu 78 ml Serum werden 1850 ml einer pH 8,6-Barbital-Pufferlösung, die 2,39% Natriumbarbital und 0,7% Natriumazid (mikrobiologisches Schutzmittel) enthält, gegeben, deren pH-Wert mit HCl eingestellt war. Eine kleine Menge an radioaktivem T4 (etwa 0,13 mc) wird ebenfalls zugegeben, um als Isotopenindikator zur Bestimmung der Wirksamkeit der Extraktion zu dienen.

»Eine Extraktionssäule wird vorbereitet, in dem eine genügende Menge eines Ionenaustauscher-Harzes in eine geeignete Glassäule gegeben wird, um ein Bettvolumen von 1000 ml und eine Fließgeschwindigkeit von annähernd 10 ml je Minute zu haben. Für diesen Zweck ist z. B. ein stark basisches Harz der quaternären Ammonium-Type geeignet.

ίο Das Harz wird in die Säule als Wasseraufschlämmung gegeben, und es wird stets eine Wasserschicht über dem Harz gehalten. Die Säule wird mit einem Vorratsgefäß verbunden, das die zu extrahierende Serumlösung enthält, und der Fluß des Serums durch die Säle begonnen. In Zeita'nständen wird eine 1-ml-Probe des Eiuais entfernt und deren Radioaktivität gezählt, um die Wirksamkeit der Extraktion zu messen. Die Radioaktivität des Eluats sollte 10% oder weniger derjenigen der Ausgangslösung betragen.

Zu etwa 8 ml des obigen Barbital-Puffers gebe man ausreichend Dinatrium-EDTA (0,215 g EDTA-Na₂), um eine Konzentration von 0,1 mg Dinatrium-EDTA je m¹ Säuleneluat (extrahierte Serumlösung) zu erhalten. Die Lösung des EDTA wird mit Hilfe geringen Erwärmens bewirkt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird diese Lösung zum Säulenelual lexttuhierte Serumlösung) gegeben. D^n wird stärker radioaktives Thyroxin (annähernd 0,27 mc) zum Eluat gegeben. Die extrahierte Serumlösu.._b wird dann vorzugsweise durch ein 0,22-Filter geschickt.

An diesem Punkt wird ein Volumen (11 580 ml) der Barbital-Pufferlösung, die 0,1 mg Dinatrium-EDTA je ml enthält und gleich dem 6fachen Volumen des Eluats entspricht, ausgemessen. Diese Lösung wird dann zu dem Eluat gegeben und liefert eine 6fache Verdünnung des Eluats. Das erhaltene Reagens hat einen pH-Wert von etwa 8,6 und eine Dinatrium-EDTA-Konzentration von 0,1 mg/ml.

Serum-T4-Lösung

Etwa 10 ml des zu testenden Blutes werden abgezogen und koagulieren gelassen. Das Serum wird entfernt und ein 1,0-ml-Teil des Serums tropfenweise zu 2 ml 95 %igem Äthanol in einem Zentrifugenrohr gegeben. Der Inhalt wird gut gemischt auf einem hochtourigen Mischer, um die Serumproteine zu denaturieren. Dieses alkoholische Gemisch wird dann zentrifugiert, bis das gefällte Protein am Boden des Rohrs sitzt (2000 bis 2500 Upm für 4 bis 5 Minuten). Die erhaltene proteinfreie überstehende alkoholische Lösung enthält annähernd 80% des gesamten Thyroxin-Gehalts der Probe.

Serum-TBG-Lösung

Ein Teil des zu testenden Serums (0,20 ml) wird zu 4,0 ml des pH 8,6-Barbital-Puffers (hergestellt wie unter »markiertes T4-TBG-Reagens« beschrieben) gegeben. Diese Lösung liefert ungesättigtes TBG aus dem zu testenden Serum. Eine unverdünnte Wasserlösung kann an Stelle einer gepufferten Lösung und kleinere Mengen Serum, wie 5 oder 10 μΐ, können verwendet werden.

Test

Anmerkung: Für jeden Ansatz der Testserien wird ein Kontrollserum in genau derselben Weise wie die Testseren, eingeschlossen die Präparation der (Kontroll) Serum-T4- und TBG-Lösungen, behandelt. Das

Kontrollserum ist im Handel erhältliches normales Sammelserum, das normale T4- und TBG-Spiegel enthält.

Ein aliquoter Teil der Scrum-T4-Lösung (0,30 ml) wird zu 4,0 ml des markierten T4.-TBG-Reagens in einer Phiole gegeben. Die Phiole wird zugestöpselt und die Lösungen gut gemischt. Dann wird ein aliquoter Teil (0,10 ml) der Serum-TBG-Lösung zum Reagens/ T4-Lösungs-Gemisch gegeben.

Ein Streifen einer im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharz-Membran wird in die Phinle gegeben, die das Gemisch der drei Lösungen enthält.

Nach Zufügen der Harzstreifen werden die die Gemische und Kontrollieren enthaltenden Phiolen ver-

kappt und exakt eine Stunde bei Raumtemperatur rotieren gelassen. Es kann ein zu diesem Zweck bestimmter käuflicher Rotator bequemerweise verwendet werden. Da die Harzaufnahme des radioaktiven Thyroxins eine Funktion der Rotationsdauer ist, ist es wesentlich, daß die Rotationszeiten für die Test- und Kontrollproben gleich sind. Zu Ende der einstündigen Rotationsdauer wird der Harzslreifen mit Pinzetten entfernt und verworfen.

Lo Die Konzentration an markiertem Thyroxin wird dann mittels eines Zählers bestimmt. Ein Minimum von 10 000 Zählungen wird dann für jede Phiole gesammelt. Dann wird ein Index, der als Effective Thyroxine Ratio« bezeichnet wird, wie folgt berechnet:

Zählungen/min für Kontroiiserum — Nülleffekt Zählungen/min Für Testserum — Nulleffekt = Effektive Thyroxine Ratio

Ergebnisse

Der Schilddn^enhormon-Status der Serumproben von 209 Patienten wurde mittels cU^ früher beschriebenen T3-Aufnahmetests von B e 11 i η g e r et al. und des Serum-T4-Tests von Brown wie auch des oben beschriebenen Effective Thyroxine ratio-Verfahrens bewertet. Ein Free-Ί-»-Index wurde ebenfalls aus den Ergebnissen der herkömmlichen Bestimmungen berechnet. Außerdem wurde der Schilddrüsenfunktions-Status jedes Patienten klinisch bewertet.

Die Gesamtheit der Patienten dieser Studie wurde in fünf Untergruppen auf Grund der Geschichte, klinischen Beobachtung und Testergebnisse eingeteilt:

1. Unkomplizierte Euthyroide (128),

2. Unkomplizierte Hypothyroide (9),

3. Unkomplizierte Hyperthyroide (14),

4. Schwangere Euthyroide (37),

5. Euthyroide, die Östrogen-Medikation erhalten (21), insgesamt 209.

Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: In der Gruppe der 128 unkomplizierten euthyroiden Patienten zeigten alle Tests und der Free-T4-Index, daß die Patienten euthyroid waren, mit der Ausnähme, daß vier Patienten nach dem Serum-T4-Test hypothyroid und 2 nach dem Free-T4-Index hypothyroid waren.

In der Gruppe der 9 unkomplizierten hypothyroiden Patienten zeigten alle Tests und der Free-T4-Index, daß die Patienten hypothyroid waren, mit der Ausnahme, daß ein Patient nach dem T3-Aufnahmetest euthyroid war.

In der Gruppe der 14 unkomplizierten hyperthyroiden Patienten zeigten alle Tests und der Free-T4-Index, daß die Patienten hyperthyroid waren, mit der Ausnahme, daß ein Patient nach dem T3-Aufnahmetest euthyroid, zwei Patienten nach dem T4-Test euthyroid und zwei Patienten nach dem Free-T4-Index euth>ruid waren.

In der Gruppe der 37 schwangeren euthyroiden Patienten war nur ein Patient nach dem T3-Aufnahmetest euthyroid, während alle anderen Patienten nach diesem Test hypothyroid waren. Vier der 37 Patienten waren nach dem T4-Test hyperthyroid, während die Serum-T4-Spiegel der restlichen 33 Patienten in den meisten Fällen erhöht waren, jedoch innerhalb des euthyroiden Bereichs für den Test lagen. Alle 37 Patienten waren nach dem Free-T4-Index und dem Effective Thyroxine Ratio der Erfindung euthyroid.

In der Gruppe der 21 euthyroiden Patienten, die Östrogen-Medikation erhielten, waren nur drei nach dem T3-Aufnahmetest euthyroid, während die restlichen 18 alle nach diesem Test hypothyroid waren. Drei der 21 Patienten waren nach dem T4-Test hyperthyroid, während die Serum-T4-Spiegel der restlichen 18 Patienten in den meisten Fällen erhöht waren, jedoch innerhalb des euthyroiden Bereichs für den Test lagen. Alle 21 Patienten waren nach dem Free-T4-Index und dem Effective Thyroxine Ratio dieser Erfindung euthyroid.

Gemäß der Erfindung kann die Indikation des klinischen Thyroid-Status, wie er durch den Effective Thyroxine Ratio widergespiegelt wird, unter Bezug auf die in Tabelle 7 gegebenen Bereiche vorgenommen werden.

Tabelle 7

Effective Thyroxine Ratio-Bereiche

Hypothyroid

Euthyroid

Hyperthyroid

weniger
als 0,85

0,85 bis 1,15 mehr als 1.15

Claims

1 2 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gePatentansprüche: kennzeichnet, daß dieses Verhältnis etwa 21:1 beträgt.

1. Verfahren zur in vitro-Bestimmung einer physiologisch aktiven Substanz in einer Körperflüssig- 5
keit, welche in dieser s jwohl an ein Bindematerial
gebunden als auch ungebunden vorliegen kann, bei
dem eine erste Probe der die aktive Substanz enthaltenden Körperflüssigkeit, aus weicher ein be- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in-vitrokannter Ilauptanteil des Bindematerials für die io Bestimmung einer physiologisch aktiven Substanz in aktive Substanz entfernt worden ist, nach dem einer Körperflüssigkeit, welche in dieser sowohl an ein bekannten Prinzip der konkurrierenden Protein- Bindematerial gebunden als auch ungebunden vorbindungsanalyse mit einem eine an ein Bindemate- liegen kann, bei dem eine erste Probe der die aktive rial gebundene markierte Form dieser aktiven Substanz enthaltenden Körperflüssigkeit, aus welcher Substanz enthaltenden Reagenz gemischt und dann 15 ein bekannter Hauptanteil des Bindematerials für die entweder die an das Bindematerial gebundene oder aktive Substanz entfernt worden ist, nach dem bekann-

die ungebundene markierte aktive Substanz ge- ten Prinzip der konkurrierenden Proteinbindungsana- | messen wird, dadurchgekennzeichnet, lyse mit einem eine an ein Bindematerial gebundene daß der Mischung eine zweite Probe der die aktive markierte Form dieser aktiven Substanz enthaltenden Substanz enthaltenden Körperflüssigkeit, welche 20 Reagens gemischt und dann entweder die an das ungesättigtes Bindematerial für diese aktive Sub- Bindematerial gebundene oder die ungebundene marstanz enthält, zugesetzt wird, und daß entweder kierte aktive Substanz gemessen wird,
die insgesamt an das Bindematerial gebundene, In einer speziellen Ausgestaltung betrifft die Erfin- 'i oder die insgesamt ungebunden vorliegende mar- dung ein Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses i kierte aktive Substanz gemessen wird. 25 zwischen dem freien und gebundenen Thyroxin-Gehalt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- einer Blutprobe.

zeichnet, daß das Bindematerial ein natürlich vor- Das Prinzip der konkurrierenden Proteinbindungs-

kommendes endogenes Bindematerial für die phy- analyse geht auf B. E. P. Murphy und C. J. Pattee

siologisch aktive Substanz ist. (J. CHn. Endocrinol. 24, 187 (1964); US-PS 34 14 383)

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Be- 30 zurück, welche Methode von J. L. ßrown weiter- | Stimmung des Verhältnisses zwischen dem freien entwickelt wurde (FR-PS 20 47 211).

und gebundenen Thyroxin-Gehalt einer Blutprobe, Der Brown-T4-Tesl basiert auf der Tatsache, daß

dadurch gekennzeichnet, daß die erste Probe Thy- Serum-TBG eine verhältnismäßig hohe spezifische

roxin aus der zu testenden Blutprobe enthält und Affinität zur Bindung von T4 hat. Gibt man markiertes

praktisch frei von thyroxinbindendem Globulin ist 35 T4 zu einer TBG enthaltenden Lösung (z. B. verdünnte

und das Reagens die Lösung eines an ein thyroxin- Blutsammelscrcn) wird praktisch alles T4 an das TBG

bindendes Globulin gebundenen markierten Schild- gebunden. Wenn man dann stabiles T4 (z. B. Pa-

drüsenhormons, wie Thyroxin oder 3,3',5'-Trijod- tienten-T4) zu dieser Lösung aus markiertem T4/TBG

thyronin, und die zweite Probe eine Lösung ist, die gibt, wird markiertes T4 aus dem TBG im Verhältnis

ungesättigtes thyroxinbindendes Globulin und 40 zur Menge an zugegebenem stabilem T4 ersetzt. Wenn

dessen assoziierte Schilddrüsenhormone aus einer ein anderes T4-Bindemittel wie ein Anionenaustau-

Blutprobe derselben Quelle enthält; und das mar- scher-Harz zu diesem System gegeben wird, bindet es

kierte, an das thyroxinbindende Globulin gebun- das markierte T4, welches aus dem TBG ersetzt worden

dene Schilddrüsenhormon oder das ungebundene war. Die Menge an ersetztem markiertem T4 aus dem

markierte Schilddrüsenhormon gemessen wird. 45 TBG kann dann durch einen Vergleich der Radio-

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- aktivität, die im Überstehenden zurückbleibt, mit der zeichnet, daß das Reagenz eine gepufferte Lösung vor Zugabe des Harzes gemessenen Radioaktivität beaus radioaktivem Thyroxin und Blutserum enthält, stimmt werden.

aus welchem das meiste des natürlich vorkommen- Wenn zunehmende Mengen an stabilem T4 zu den

den Thyroxins extrahiert worden ist. 5° Lösungen aus markiertem T4/TBG gegeben und wie

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 und 4, oben behandelt werden, zeigt sich, daß die im Überdadurch gekennzeichnet, daß das Schilddrüsen- stehenden verbleibende Aktivität mit jeder nachfolgenhormon in diesem markierten Reagenz radioaktives den Erhöhung des zugegebenen stabilen T4 herabge-Jod, ausgewählt aus der Gruppe: Jod-125 und setzt wird. Somit können unbekannte Mengen an sta-Jod-131, enthält. 55 bilem T4 durch Vergleich der Aktivität des Überste-

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, henden in der unbekannten Lösung mit derjenigen in dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus dem einer ähnlichen bekannten überstehenden Flüssigkeit Reagenz und der ersten und zweiten Probe mit bestimmt werden.

einem Ionenaustausch-Harz eine vorbestimmte Um diese Methode zur Serum-T4-Bestimmung anZeitdauer vor dem besagten Meßschritt in Kontakt 60 wenden zu können, muß T4 von den bindenden Progehalten wird. feinen des Patientenserums abgetrennt werden. Dies

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, erreicht man durch Denaturierung und Fällung der dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des Proteine mit Alkohol. Die denaturierten Proteine Volumens der ersten Blutserumprobe zum Volumen setzen das meiste (annähernd 80%) ihres gebundenen der zweiten Blutserumprobe vorbestimmt ist. 65 T4 frei, welches nach Zentrifugieren des Gemisches in

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn- der alkoholischen überstehenden Lösung entfernt zeichnet, daß dieses Verhältnis zwischen etwa 10:1 werden kann.

und 30:1 liegt. Eine Tendenz zu fehlerhaften Ergebnissen unter be-