DE2225275C3 - Verfahren zur quantitativen Calciumbestimmung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen oder fluoreszenzanalytischen quantitativen alkalischen Calciumbestimmung im Blutserum.

Die klassische Methode zur Calciumbestimmung im Serum ist die von Clark und Collip. »A Study of the Tisdall Method for the Determination of Blood Serum Calcium with a Suggested Modification«. J. Biol. Chem. 63. 461 464 (1925); auch ibid. 49. 487 (1921), nach der das Calcium als Oxalat gefällt wird und anschließend kolorimetrisch bestimmt wird. Oxalat wurde zur Calciumbestimmung bereits im |ahre 1871 von Pribram »Berichte über die Verhandlungen der Königlich. Sächsischen Gesellschaft der Wissenschaften zu Leipzig«. Math.phys. Classe, 1971 XXIIi, 279. wie in Kramer und Tisdall. |. Biol. Chem. 47. 475 (1921) angeführt, benutzt, jedoch war die Methode von Clark und Collip bis vor wenigen Jahren die verbreiteste. In neuester Zeit ist man aber von dieser Methode abgerückt, da sie ein Zentrifugieren erfordert und eine besonders sorgfältige Handhabung der Proben, um eine Kontaminierung mit Calcium aus dem Glas zu vermeiden. Darüber hinaus ist die Gefahr einer Fehlbestiinmung des Calciumgehaltes durch einen Verlust an Niederschlag recht groß. All diese Faktoren vermindern die Verläßlichkeii der Probe.

In jüngster Zeit hat sich zwar die Atomabsorpiionsspektroskopie als angemessene Technik erwiesen, jedoch wird zur Durchführung dieses Verfahrens eine besondere und kostspielige technische Ausrüstung erfordert, die in den meisten klinischen Laboratorien dicht zur Verfügung steht.

Insbesondere in jüngerer Zeit sind verschiedene Verfahren bekanntgeworden, die die Veränderung der Parbe von Farbstoffen durch Calcium ausnutzen (R, L Searcy, »Diagnostic Biochernistry«, McGraW-j-lill, New York, 1969, S, 135, 136). Unter diesen Verfahren sind solche, die NälnUmchloranilat, Kfesoiphihalein* Kdmplexöh, Eriöchrömblau SE, Glyoxäl-b1s<(2'hydrö* xyänilin) Und Alizarin Verwenden, Auch wUfdc Cälceifl verwendet, dessen Fluoreszenz gemessen wurde.

Von den Vorgenannten Verfahren" ist das mit Natriumchloranilat zur Zeit das verbreiteste. Im Rahmen dieser Methode muß jedoch das Calcium vor der eigentlichen Analyse gefällt (als Calciumchloranilat) und zentrifugiert werden. Da aber prinzipiell Verfahren i oder Bestimmungsmethoden, die ein Zentrifugieren oder mehrere Verfahrensstufen erfordern, im klinischen Laboratorium nicht sonderlich geeignet sind, da sie sowohl einen höheren Arbeitsaufwand als auch die Gefahr einer Kontamination mit Fremdcalcium in sich

H) bergen, besteht ein dringendes Bedürfnis nach einem Verfahren zur Calciumbestimmung, b;i dem die Bestimmung direkt im Serum vorgenommen werden kann.

Prinzipiell sind eine Reihe der kolorimeirischen und

H fluoreszenzanalytischen Calciumbestimmungen im Serum ausführbar und sind auch ausgeführt worden, haben jedoch bislang nur zu erratischen Ergebnissen geführt.

Solche Fehlbestimmungen sind im wesentlichen auf Wechselwirkungen, insbesondere auf Maskierungscf-

2" fekte oder Fällungseffekte, zurückzuführen, die durch andere im Serum vorhandene Stoffe bewirkt werden. Unter diesen Wechselwirkungen sind insbesondere die Einflüsse von Magnesium und Phosphat zu nennen. Während Magnesium mit den üblichen kolorimetri-

-'> sehen oder fluoreszenzanalytischen Reagenzien im allgemeinen ebe lfalls farbverändernd oder fluoreszierend reagiert, führt die Reaktion mit Phosphat im Serum zur Bildung von Calciumkomplexen, die eine Reaktion des Calciums mit den Indikatorreagenzien unterbindet.

Sowohl Magp jsium als auch Phosphate sind normalerweise im Sen m in verschiedenen Mengen vorhanden.

Bei eine Reihe bekannter Bestimmungsmethoden konnten Jie Störeinflüsse des Magnesiums bereits erfolgreich eliminiert werden. Es ist bisher jedoch noch

i> nicht gelungen, den zu einer Farbminderung führenden Einfluß des Phosphats zu eliminieren. Calciumbestimmungen. die nach den bekannten Verfahren in Gegenwart von Phosphat durchgeführt werden, fuhren also immer durch ein teilweises Abfangen der

■"' Calciumionen durch die Phosphationen zu fehlerhaften Bestimmungen des Calciumspiegels im Serum.

Da sich die Störreaktionen im klassischen Clark/Collip-Verfahren nicht direkt und von selbst zeigen, sind die klinischen Chemiker diesen Problemen zumindest seit

•ί den zwanziger Jahren unseres lahrhunderts nachgegangen. Kramer stellte 1921 (Kramer B. und F. F. Tisdall. »A simple Technique for the Determination of Calcium and Magnesium in Small Amount of Serum«. J. Biol. Chem. 47, 47$ -481 [192I]) sein Verfahren, von dem das

^⁰ Clark/Collip-Verfahren eine Modifikation ist. auf hohe Phosphatspiegel ab Seit dieser Zeit fand das Problem des Serumphosphats eine zunehmend stärkere Beachtung, so betont Gradwohl 1942 (R B H. Gradwohl, »Clinical Laboratory Methods and Diagnosis«, C. V.

« Mosby Comb. St l.ouis. 194 3. Band I. S 279) im Zusammenhang mit der Serumcalcuimbestimmung. daß »die Phosphate unlösliche ('alciumsal/e bilden wurden«.

Insbesondere in Verbindung mit Verfahren, bei denen

der Einfluß der C alciumionen auf Farbstoffe ausgenutzt

^hn wird, sind viele Versuche unternommen worden, den Einfluß von Phosphat auszuschließen, 1954 gelang es Kenny (A. D₁ Kerinyufid§;U_iToverud,»Noriinterferen·' ce öf Phosphate in an Ethylehecliömihetefra'sdöläle Method for Serum Calcium«, Anal, Chem. 26, 1059

^b<> [1959]) im Rahmen eines solchen Verfahrens das Calcium unter Eliminierung des Phösphateinnusses mit Äthyiendiaminielraessigsäufe zu titrieren. Diese Me* thöde beinhaltet jedoch eine Titration, die im Rahmen

klinischer Routinebestimmungen weniger geeignet ist, als es die direkten kolorimetrisehen oder fluoreszenzanalytischen Bestimmungen sind.

Im Jahre 1955 ging Connerty (H. V. Connerty und A. R. Briggs, »Clinical Chemistry«, 11,716-728 [1965]) das Problem dadurch an, daß er die Seren eine Stunde vor der eigentlichen Bestimmung mit Säure behandelt. Dieses Verfahren ist aber keine vollwertige Lösung der Aufgabe, da sich die störenden Komplexe nicht nur in der folgenden alkalischen Stufe wieder bilden, sondern vor allem auch nicht wegen des hohen Zeitbedarfs dieser Bestimmungsmethode.

Im Jahre 1969 gelang es Burr (R. G. Burr, »Clinical Chemistry«, 15, 1191—1197) das Phosphatproblem dadurch zu reduzieren, daß er geringere Mengen Probenserum verwendete, wodurch er geringere Calciumphosphatmengen in der Lösung erreichte. Diese Methode ist die vermutlich beste der bisher bekannten Methoden zur Bestimmung von Calcium in Gegenwart von Phosphat jedoch muß sie eine verminderte Empfindlichkeit in Kauf nehmen, ohne dabei das Problem restlos zu lösen.

Trotz aller Versuche blieb also bislang, wie gezeigt, die Aufgabe noch immer ungelöst, ein schnelles und genaues Verfahren zur Bestimmung des Calciumspiegels im Blutserum zu finden, das insbesondere die Störeffekte des Phosphats ausscnaltet und mit Standardgerät durchgeführt werden kann, das in praktisch jedem klinischen Laboratorium bereitsteht.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur kolorimetrischen oder fluoreszenzanalytischen quantitativen alkalischen Calciumbestimmung im Blutserum vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Serum vor Je>- Zugabe des Färb- bzw. Fluoreszenzindikators und der Lau ;e in saurer Lösung mit Molybdat versetzt wird.

Durch eine solche Vorstufe, in der das Phosphat in laurer Lösung mit Molybdat, vorzugsweise in Gegenwart von Polyvinylpyrrolidon, vor der Zugabe der alkalischen Farbstofflösung umgesetzt wird, wird der Störeinfluß des Phosphats bei der Calciumbestimmung lußerst wirkungsvoll ausgeschaltet. Darüber hinaus wird die Unterbindung des Störeinflusses des Phosphats in einer Weise erreicht, die die Bestimmung selbst nicht wesentlich komplizierter gestaltet. Außerdem entfällt die Notwendigkeit einer Beschränkung auf kleine und kleinste Serumprobenmengen. Durch die Zugabe des Polyvinylpyrrolidons wird die Bildung des Molybdatophosphats beschleunigt.

Angesichts der jahrzehntelangen vergeblichen Versuche, ein zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung des Calciumspiegels im Blutserum zu finden, mag es verwunderlich erscheinen, daß die vorliegende Erfindung nicht bereits früher gemacht wurde, und zwar selbst dann, wenn sie weitab von dem Bereich der Bemühungen liegt, von dem die Verfahren nach dem Stand der Technik ausgingen. Schließlich ist die Reaktion von Molybdat mit Phosphat in saurer Lösung dem analytischen Chemiker zumindest seit 1887 (M. F. Osmond. Bull Soc. C'him.. Paris, 47, 745 [1887], /inert in R, J. Henry »Clinical Chemistry«, Harper & Röw, 1964, S. 414) bekannt; Auch stammt die Phosphatbestjmmüng von Fiske und StibbaroW (C* H, Fiske und Slübbarow, BM Chern, 66, 375 [1925]), die von der Molybdatreaktion Gebrauch macht, bereits aus dem Jahre 1952 Und ist seither verbreitet angewendet worden.

Noch erstaunlicher Werden die Bemühungen nach derri Stand der Technik Um eine störunanfällige

Caleiiimbestimmung, wenn man sich vor Augen hält, daß es im klinischen Laboratorium durchaus gebräuchlich ist, die Calciumbestimmung und die Phosphatbestimmung nacheinander und getrennt voneinander mit derselben Probe durchzuführen, da beide Bestimmungen insbesondere für die Knochenphysiologie und für die Pathologie von höchster Bedeutung sind. Seibst wenn jedoch diese beiden Bestimmungen mit derselben Blutprobe und nicht seltsn sogar vom selben Chemiker oder Assistenten durchgeführt werden, so ist das merkwürdige Phänomen, daß die vorliegende Erfindung über Jahrzehnte offensichtlich nicht naheliegend war, wahrscheinlich darin zu sehen, daß sowohl die Calciumbestimmung als auch die Phosphatbestimmung nach getrennten Vorschriften und in getrennten Arbeitsgängen nacheinander und getrennt voneinander durchgeführt wurden.

Ein weiterer Aspekt, der ein Vorurteil der Fachwelt gegen die vorliegende Erfindung begründet haben mag, obwohl die analytischen Chemiker sich um eine Umgehung des Phosphatstöreinflusses bei der Calciumbestimmung bemüht hatten und obwohi seit Jahrzehnten das Bedürfnis nach genauen Calciumbestimmungen bestand und obwohi auch die Reaktion des Molybdats

-'■> mit dem Phosphat bekannt war, mag darin zu suchen sein, daß das bei der Umsetzung gebildete Molybdatophosphat gelb gefärbte Lösungen bildet, deren Störeinnüsse auf die Farbreaktion des Calciums man offensichtlich fürchtete. Auf Grund der gelb gefärbten Molybdato-

J" phosphatlösungen hat die Fachwelt zufolge des Standes der Technik offensichtlich die Gegenwart von Phosphationen für das kleinere Übel im Vergleich zur Gegenwart von Molybdatophosphationen bei der Calciumbestimmung gehalten.

κ Auch ist bereits Polyvinylpyrrolidon bei der Umsetzung von Molybdat mit Phosphat verwendet worden (J. W. Denney und L. W. Denney, US-Patent 35 47 586, erteilt am 15. Dezember 1970). Die nach diesem Stand der Technik in Verbindung mit dem Polyvinylpyrrolidon

•ίο verwendeten Molybdatkonzentrationen sind jedoch so hoch, daß sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu unbrauchbaren Ergebnissen führen würden; ein Störeinfluß auf die Bildung der gefärbten oder fluoreszierenden Calciumindikator-Komplexe wäre dann nicht mehr zu

••ϊ unterbinden.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens ist die zu erwartende Molybdatophosphaifarbe jedoch kein Problem. Die gewünschte Beseitigung des Störeinflusses von Phosphat wird ohne Inkaufnah-

'·'■ me neuer Störeinflüsse oder Maskierungseffekte erreicht.

Im folgenden ist die Erfindung anhand von zwei Ausführungsbeispielen näher beschrieben.

_Vl Beispiel!

a) Reagenzien

Molybdänsäurereagenz

45 mg Natriummolybdatünd
Mi 3 g Polyvinylpyrrolidon gelöst in

100 ml 0,2 η H₂SO₄

Färbreagenz

50 mg ulyöxal-bis-(2'hydroxyaniliri) und Di-(2-_6!j hydroxyphenylimino)-Äthan gelöst in

100 ml Methanol p.a.

Natriumhydroxid
0,2 η

b) VerfahrensschriUe

Es werden Blindversuche und Testversuche durchgeführt. In die Test-Reagenzgläser und in das Reagenzglas des Blindversuches werden je 1 ml Molybdänsäurereagenz gegeben. Den Reagenzgläsern werden 0,05 ml 5 Serum oder Standard zugesetzt. Es wird gut geschüttelt und 1 min stehengelassen. Anschließend werden 2 ml des Farbreagenz und 2 ml Natriumhydroxid dazugegeben und vermischt. Die Absorption der Testreagenzgläser gegen das Blindreagenzglas wurde bei 550 ιτιμ κι gemessen. Die Absorption des unbekannten Serums ist dsr Absorption des Standards proportional. Der Calciumwert des Serums wird durch einen Vergleich der gemessenen optischen Dichte mit einer Eichkurve erhalten, die aus wäßrigen Lösungen mit bekannten r> Calciumgehalten nachdem gleichen Verfahren erhalten wurde.

Beispiel 2
a) Reagenzien
Molybdatreagenz

18 mg Natriummolybdat und
3 g Polyvinylpyrrolidon gelöst in
100 ml 0.2 η H₂SO₄

Wasser

Ein ausreichend gut deionisiertes oder destilliertes Wasser.

KOH, 0.9 η ^!"

44,4 g KOH reinst (unter der Annahme chemisch reiner KOH) werden gelöst und mit deionisiertem Wasser auf 1 I verdünnt. Die Lösung wird Polyäthylen aufbewahrt.

Reagenzstammlösung

Es wird eine Stammlösung aus 1,00 mg/ml Calcein oder FIuoreszein-Komplexon in 0,9 η KOH hergestellt. Die Lösung wird in Polyäthylen aufbewahrt unH ist mindestens einen Monat lang bei 4° C im '" Dunkeln stabil.

Arbeitsreagenzlösung

7,0 ml der Stammreagenzlösung werden mit 0.9 η KOH auf 1 1 verdünnt. Die in Polyäthylen v, aufbewahrte Lösung ist bei Zimmertemperatur eine Woche lang stabil.

Cuvbiten: 12x75 mm klar, Kunststoff (Polystyrol), handelsübliche verfügbare Kulturröhrchen mit Kappenverschluß. Es werden einzeln verpackte Röhrchen bevorzugt

b) Ausrüstung

Ein Fluorometermodell 110 oder Modell 111 von Turner, folgendermaßen ausgestattet:

Lampe: Nr. 110-850 (Standard) oder Nr. 110-851

(fernes UV)
Filter: Primärfilter Nr. 110-816 (2A)

+ Nr. 110-813(47B)

Sekundärfilter Nr. 110-818 (2A-12)

+ neutrale Filter zur Empfindlichkeitsein-

stellung

c) Probe

Serum oder heparinisiertes Plasma,
d) Verfahren

1. 1 ml Molybdatreagenz wird in jedes Reagenzglas pipettiert. Es werden 0,02 ml Serum in jedes Glas dazugegeben und 1 min lang stehengelassen.

Z 4,00 m! Arbeitsreagenz werden in eine 12 χ 75 mm Kunststoffcu vette gegeben.

3. Die Cuvette wird verschlossen und ihr Inhalt durch zehnmaliges Umkehren durchmischt.

4. Die angesetzten Proben werden 10 min lang im Wasserbad bei einer auf ±1°C konstant gehaltenen Temperatur zwischen 20 und 30⁰C gereift.

5. i>ie Proben werden im Fluorometer gemessen und die abgelesenen Werte v,_c.den zur Bestimmung anhand von Eichkurven vt.wendet, die mn Fluoreszenzeinheiten von Standardwerten mn bekanntem Calciumgehali nach dem vo-stehenden Verfahren erhalten wurden.

Die vorstehend beschriebenen Vorschriften sind Beispiele für die Ausführung der Erfindung und können mit anderen Indikatorreagenzien in gleicher Weise durchgeführt werden. Auch können andere Molybdate, insbesondere solche einwertiger Kaiionen, wie bei spielsweise Ammonium, verwendet werden, deren molare Molybdatkonzentration im sauren Reagenz im wesentlichen derjenigen der beschriebenen Ausfuhrungsbeispiele entspricht. Die Menge Natriumhydroxid muß dabei so gewählt werden, daß sie die in der ersten Stufe verwendete Säuremenge genau i'tnert und einen End-pH liefert, der den speziellen Anforderungen des Indikators, d. h. der gefärbten oder der fluoreszierenden Substanz, entspricht.

Das Molybdat oder das Molybdat und das Polyvinylpyrrolidon können im Reagenzglas zuvor getrocknet werden, wodurch eine größere Stabilität des Molybdän Säurereagenzes erreicht wird. Bei der Ausführung des Versuches mit einem derart vorbehardelten Ansatz wird 1 ml 2 π H₂SO₄ dazu gefügt.

Eine auf die Weise durchgeführte quantitative Calciumbestimmung wird durch Phosphalionen nicht gestört, also auch nicht durch jene Phosphationen, die normalerweise in unterschiedlichen Mengen im Blutserum und im Urin vorhanden sind. Bei allen anderen klinischen nach dem Stand der Technik bekannten kolorimetrischen oder fluoreszenzanalytischen f'alciumbestimmungen führt die Gegenwart von Phosphat-'of-εη dagegen zu unbrauchbaren Ergebnissen.

Dagegen bietet das Verfahren gemäß der Erfindung ein neues und klinisch vielseitig anwendbares kolorimetrisches oder fluoreszenzanalytisches Verfahren zur Bestimmung von Serumcalcium; die zur Durchführung dieses Verfahrens erforderlichen Reagenzien sind beschrieben worden.

Claims (5)

OO OR 07R Patentansprüche:

1. Verfahren zur kolorinietrischen oder fluoreszenzanalytischen quantitativen alkalischen Calciumbesümmung im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum vor der Zugabe des Färb- bzw. Fluoreszenzindikators und der Lauge in saurer Lösung mit Molybdat versetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum vor der Zugabe des Indikators und der Lauge zusätzlich zum Molybdat mit Polyvinylpyrrolidon versetzt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum mit einer sauren Molybdatlösung versetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum mit einer schwefelsauren Lösung von Molybdat und Polyvinylpyrrolidon versetzt wird.

5 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4. dadurch gekennzeichnet, daß ein Molybdat eines einwertigen Kations benutzt wird.