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DE2208631C3 - N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Cephalosporin C - Google Patents

N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Cephalosporin C

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Publication number
DE2208631C3
DE2208631C3 DE2208631A DE2208631A DE2208631C3 DE 2208631 C3 DE2208631 C3 DE 2208631C3 DE 2208631 A DE2208631 A DE 2208631A DE 2208631 A DE2208631 A DE 2208631A DE 2208631 C3 DE2208631 C3 DE 2208631C3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cephalosporin
parts
isobornyloxycarbonylcephalosporin
chloride
ethyl acetate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2208631A
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English (en)
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DE2208631A1 (de
DE2208631B2 (de
Inventor
Masahiko Hyogo Fujino
Satoshi Horii
Nariakira Mizokami
Michihiko Ochiai
Tetsuya Okutani
Susumu Shinagawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP46010063A external-priority patent/JPS514997B1/ja
Priority claimed from JP6241771A external-priority patent/JPS5121998B2/ja
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of DE2208631A1 publication Critical patent/DE2208631A1/de
Publication of DE2208631B2 publication Critical patent/DE2208631B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2208631C3 publication Critical patent/DE2208631C3/de
Expired legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/74—Amino or imino radicals substituted by hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D501/00—Heterocyclic compounds containing 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. cephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
    • C07D501/02—Preparation
    • C07D501/12—Separation; Purification

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie die Verwendung dieser Verbindung zur Herstellung von 2s Cephalosporin C.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß N-Isobornyloxycarbonylcephalsporin C durch Umsetzung einer wäßrigen Lösung, die Cephalosporin C enthält, mit Isobornyloxycarbonylchlorid oder einer 1-Isobornyloxybonylpyridiniumchloridverbindung gebildet wird, daß das auf diese Weise im Reaktionsgemisch gebildete N-Isobonyloxyoarbonylcepha.losporin C in hoher Ausbeute aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden kann, und daß die schützende Gruppe, d. h. die Isobornyloxycarbonylgruppe sich durch Behandlung des N-Isobornyloxycarbonylcephalosporins C mit einer Säure leicht entfernen läßt, wobei Cephalosporin C gewonnen wird.
Es wurde ferner gefunden, daß das in der oben beschriebenen Weise hergestellte N-Isobornylciiycarbonylcephalosporin C nicht nur als Zwischenprodukt für die Herstellung von Cephalosporin C und anderen Cephalosporansäurederivaten, sondern auch als antimikrobielles Mittel wertvoll ist.
Weitere Untersuchungen der Anmelderin haben ergeben, daß die N-lsobornyloxycarbonylierung von Cephalosporin C unter milderen Bedingungen und mit erhöhtem Wirkungsgrad vonstatten geht, wenn eine wäßrige Lösung, die Cephalosporin C enthält, mit einer
1 -Isobornyloxycarbonylpyridiniumchloridverbindung an Stelle von Isobornyloxycarbonylchlorid umgesetzt wird. Der Erfindung liegen die obengenannten Feststellungen zu Grunde.
Cephalosporin C kann aus einer Cephalosporin C enthaltenden Lösung, z. B. einer wäßrigen Lösung, die ss aus einem Fermentationsmeclium von Cephalosporin C bildenden Mikroorganismen hergestellt worden ist, isoliert werden. Bekannt ist beispielsweise ein Verfahren, bei dem Cephalosporin C in der wäßrigen Lösung mit Natrium-2,4,6-trinitroben:iolsulfonat umgesetzt und < >o das gebildete 2,4,6-Trinitrophenylcephaiosporin C extrahiert wird. Es ist jedoch unmöglich, die Gruppe zu entfernen, ohne daß Nebenreaktionen, z. B. die Zersetzung des ^-Cephemrings des gewünschten Produkts, stattfinden. (\s
Gegenstand der Erfindung ist die wertvolle und neue Verbindung N-Isobornyloxycnrbonyicephalosporin C.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in an sich bekannter Weise eine Cephalosporin C enthaltende wäßrige Lösung mit lsob-omyloxycarbonylchlorid oder einem Isobomyloxycarbonylpyridiniumchlorid behandelt und die erhaltene Verbindung in üblicher Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C durch Behandlung der Ausgangsverbindung mit Trifluoressigsäure oder einem Gemisch von Trifluoressigsäure und Essigsäure.
N-Isobomyloxycarbonylcephalosporin C wird durch Umsetzung von Cephalosporin C mit Isobornyloxycarbonylchlorid oder einer l-lsobornyloxycarbonylpyridiniumchloridverbindung hergestellt. Der Pyridinring der letztgenannten Verbindung kann durch einen oder mehrere Substituenten, die die Reaktion nicht stören, substituiert sein. Geeignet als lsobornyloxycarbonylpyridiniumchlorid sind somit beispielsweise 1-Isobornylcarbonyl-4-dimethylaminopyridiniumchlorid und 1-Isobornylcarbonyl-4-aminopyridiniumchlorid.
Es ist vorteilhaft, wenn die Substituenten der l-Isobornyloxycarbonylpyridiniumverbindungen an der 2- oder 4-Steilung des Pyridinringes stehen und hierbei Elektronen donierende Gruppen, z. B. Aminogruppen, alkylierte Aminogruppen (z. B. Methylamino, Äthylamino und Dimethylamino) und Hydroxylgruppen sind.
Die 1 -Isobornylcarbonylpyridiniumchloridverbindung ist dem Isobornyioxycarbonylchlorid insofern überlegen, als l-Isobornyloxycarbonylpyridiniumchloridverbindungen, die wasserlöslich sind, sehr wirksam selbst ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels zum Reaktionssystem reagieren, während Isobornyloxycarbonylchlorid, das in Wasser und einem organischen Lösungsmittel, z. B. Aceton, Dioxan oder Tetrahydrofuran, als in wäßriger Lösung reagiert
Die l-lsobornyloxycarbonylpyridiniumchloridverbindung wird ourch Umsetzung von Isobornylcarbonyichlorid mit einer entsprechenden Pyridinverbindung nach an sich bekannten Verfahren zur Herstellung von quaternären Pyridiniumsalzen hergestellt.
Sowohl das Isobornyloxycarbonylchlorid als auch das l-Isobomyloxycarbonylpyridiniumchlorid kann in Form des Razemats oder in optisch aktiver Form vorliegen.
Cephalosporin C kann beispielsweise als wäßrige Lösung verwendet werden. Diese wäßrige Lösung kann ferner aus einem Fermentationsmedium von Cephalosporin C bildenden Mikroorganismen (z. B. aus dem Filtrat des Fermentationsmediums) hergestellt werden. Das Fermentationsmedium kann nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden.
Das Fermentationsmedium oder sein Filtrat kann in großen Mengen wasserlösliche Verunreinigungen sowie fettlösliche Verunreinigungen (z. B. Cephalosporin N, Cpphalosporin P, Schaumverhütungsmittel usw.) enthalten. In diesem Fall ist zu empfehlen, die wäßrige Lösung durch Reinigung des Fermentationsniediums oder seines Filtrats in üblicher Weise, z. B. durch Chromatographie und Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel (z. B. Äthylacetat und Methyläthylketon), herzustellen.
Das Isobornyloxycarbonylchlorid kann dem Reaktionssystem in Form einer Lösung in einem mii Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, das an der Reaktion nicht teilnimmt, zugesetzt werden. Geeignet als organische Lösungsmittel sind beispielsweise Aceton, Dioxan und Tetrahydrofuran.
Die 1 -Isobornyloxycarbonylpyridiniumchloridverbindung kann dem Reaktionsgemisch in Form einer wäßrigen Lösung zugesetzt werden. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Wasser, einem organischen Lösungsmittel, insbesondere einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (z. B. Aceton, Dioxan und Tetrahydrofuran) oder in einem Gemisch eines solchen Lösungsmittels mit Wasser, durchgeführt
Im allgemeinen ist es vorteilhaft, die Reaktion bei ι ο einem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 11, vorzugsweise 7 bis 10, insbesondere 8 bis 9, durchzuführen. Als Mittel zur Einstellung des pH-Wertes eignen sich anorganische Basen, z. B.
Natriumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat, >
Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd,
Lithiumhydroxyd, Bariumhydroxyd und
Magnesiumoxyd, und organische Basen, z. B.
Triäthylamin, Tributylamin,
N-Methylmorpholin und Pyridin.
Die Reaktion kann unter Kühlung, bei Raumtemperatur oder unter gewissen Bedingungen auch unter Erhitzen durchgeführt werden. Vorzugsweise wird jedoch bei einer Temperatur von —5 bis 50° C, insbesondere zwischen 0 und 35° C, gearbeitet. Unter den vorstehend genannten Bedingungen ist die Reaktion im allgemeinen in einer Zeit von 10 Minuten bis 4 Stunden beendet.
Die gewünschte Verbindung N-lsobornyloxycarbonylcephalosporin C wird aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch leichtes Ansäuern des Reaktionsgemisches mit einer anorganischen Säure (z. B. Salzsäure und Schwefelsäure) vorzugsweise auf einen pH-Wert von 2 bis 3 und anschließende Extraktion dieses angesäuerten Gemisches mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, z. B. einem Äther (z. B. Diäthyläther), einem Alkohol (z. B. n-Butanol), einem Ester (z. B. Äthylacetat), einem Keton (z. B. Methyläthylketon) oder einen» halogenierten Kohlenwasserstoff (z. B. Methylenchlorid) isoliert. Durch Abdampfen des Lösungsmittels vom Extrakt wird das Produkt gewonnen. Wenn die Konzentration von N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin 1Z verhältnismäßig hoch ist, kann es durch Ausfällung aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, indem das wäßrige Reaktionsgemisch mit der anorganischen Säure auf einen pH-Wert von vorzugsweise 1 bis 3 eingestellt und die hierbei gebildete Fällung abgetrennt wird.
Das in dieser Weise hergestellte Isobornyloxycarbonylcephalosporin C kann nach einem Verfahren, das routinemäßig für die Reinigung von fettlöslichen Antibiotika angewendet wird, weiter gereinigt werden. Vorzugsweise geschieht dies nach einem Verfahren, das zur Reinigung von sauren, fettlöslichen Antibiotika dient, z. B. durch Extraktion der aktiven Substanz aus dem schwach angesäuerten Gemisch mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, Überführung des gewünschten Produkts in eine wäßrige Phase unter alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH 8 bis 9) durch Extraktion und Rückführung in eine organische t>° Phase unter sauren Bedingungen (vorzugsweise pH 1 bis 3). Außer diesen Verfahren sind natürlich andere Verfahren, z. B. die Extraktion im Gegenstrom, Verteilungschromatcgraphie, Adsorption, Ionenaustausch und Molekularsieb-Chromatographie in geeigneten Kombi- '^ nationen geeignet, um ein gereinigtes N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C zu erhalten.
Wie bereits erwähnt, kann ein Fermentationsmedium, das Cephalosporin C enthält, als Lösung, die Cephalosporin C enthält, verwendet werden. Im allgemeinen enthalten jedoch Cephalosporin C enthaltende Fermentationsmedien außerdem Cephalosporin N. Zur Entfernung von Cephalosporin B aus einem solchen Gemisch kann der Vorteil der Erscheinung, daß Cephalosporin N in sauren Lösungen zersetzt wird, in an sich bekannter, nachstehend beschriebener Weise ausgenutzt werden.
Beispielsweise kann eine solche Lösung vor oder nach der Umsetzung mit Isobornyloxycarbonylchlorid oder der l-Isobornyloxycarbonylpyridiniumchloridverbindung 2 Stunden bei pH 3 und 37° C stehen gelassen werden, um das Cephalosporin N zu zersetzen. Als Alternative kann der Vorteil der Tatsache genutzt werden, daß Cephalosporin N allein in der nächsten Stufe, in der beispielsweise Trifluoressigsäure zur Entfernung der Isobornylgruppe verwendet wird, zersetzt wird. Außer diesen Verfahren kann natürlich das Isobornyloxycarbonylcephalosporin C von Isobornyloxycarbonylcephalosporin N nach Verfahren wie Chromatographie und Extraktion im Gegenstrom in üblicher Weise abgetrennt werden.
Cephalosporin C wird durch Behandlung des in dieser Weise hergestellten und isolierten N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C mit Trifluoressigsäure oder einem Gemisch aus Trifluoressigsäure und Essigsäure gewonnen. Diese Behandlung dient der Entfernung der schützenden Gruppe, d. h. der Isobornyloxycarbonylgruppe, von. N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C.
Das Reaktionsgemisch kann stark sauer sein und einen pH-Wert unter 2,5, vorzugsweise unter 2,0, insbesondere unter 1,0, haben.
Bei Verwendung von Trifluoressigsäure beträgt ihre Menge gewöhnlich 10 bis 100 Mol pro N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C.
Für die Reaktion kann ein Lösungsmittel verwendet werden, das die Reaktion nicht stört. Geeignet hierzu sind beispielsweise Essigsäure, Dichlormethan, Dichlorathan, Chloroform, Dioxan, Tetrahydrofuran, Äther, Äthylacetat und Trifluoressigsäure. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem Gemisch durchgeführt, das weniger als 30 Gew.-% Wasser enthält. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Trifluoressigsäure, die wasserfrei ist oder weniger als 10% Wasser enthält.
Die Reaktionszeit und -temperatur sowie die Säuremenge werden so gewählt, daß vollständige Spaltung unter möglichst milden Bedingungen sichergestellt ist. Wenn beispielsweise wasserfreie Trifluoressigsäure verwendet wird, sind eine Temperatur von 10 bis 25°C und eine Reaktionszeit von 10 bis 30 Minuten als optimale Bedingungen anzusehen.
Nach der Reaktion wird das gewünschte Cephalosporin C nach an sich bekannten Verfahren, z. B. durch Einengung, Extraktion im Gegenstrom und Chromatographie unter Verwendung von Molekularsieben oder Ionenaustauschharzen, vom Reaktionsgemisch abgetrennt. Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht es somit, Cephalosporin C aus rohen Lösungen in reiner Form in hohen Ausbeuten und in vorteilhafter Weise zu isolieren.
Natürlich ist es im Rahmen der Erfindung möglich, das Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C beispielsweise durch Ergänzung durch weitere an sich übliche Maßnahmen zu modifizieren.
Die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalte nen Produkte, d. h. N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C und Cephalosporin C, haben beide antimikrobielle Eigenschaften und sind nicht nur wertvoll als Medika-
mente, sondern auch als Zwischenprodukte für die Herstellung von synthetischen Cephalosporine^ 7-Aminocephalesporansäure und anderen Verbindungen. Es erübrigt sich die Feststellung, daß /-Aminocephalosporansäure, die aus N-lsobronyloxycarbonylcephalosporin C hergestellt werden kann, wertvoll als Ausgangsmaterial für die Herstellung von synthetischen Cephalosporine!) ist Die Erfindung wurde vorstehend insbesondere in Verbindung mit den Säureformen beschrieben, jedoch können diese Verbindungen auch Salze mit Metallen wie Natrium, Kalium, Calcium und Aluminium sowie mit organischen Basen wie Trimethylamin, Triäthylarnin, Tributylamin, Triamylamin und Pyridin bilden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.
Versuch 1
Herstellung von Isobornyloxycarbonylchlorid
In 200 Raumteilen trockenem Äther werden 61,6 Gew.-Teile Isoborneol gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, wird eine Lösung von 60 Gew.-Teilen Phosgen in 150 Raumteiler, Tetrahydrofuran zugetropft. Nach erfolgtem Zusatz wird das Gemisch 2 Stund en bei 50c C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der viskose ölige Rückstand der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Benzol als w Lösungsmittel unterworfen. Das erhaltene Chromatogramm zeigt, daß das als Ausgangsmaterial verwendete Isoborneol vollständig verschwunden ist und statt dessen ein neues Produkt mit einem höheren RF-Wert gebildet worden ist. Das Infrarotspektrum dieses Produkts zeigt, daß es sich um das gewünschte Chloroformiat handelt. Ausbeute 83,2 Gew.-Teile (95,6%).
Versuch 2
40
In 50 Raumteilen trockenem Methylenchlorid werden 2,44 Gew.-Teile 4-Dimethylaminopyridin gelöst. Unter Rühren wird eine Lösung von 4,65 Gew.-Teilen Isobornyloxycarbonylchlorid in trockenem Methylenchlorid zugesetzt. Nachdem weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt worden ist, wird trockener Äther dem Gemisch zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert. Nach einei Wäsche mit trockenem Äther wird die Fällung aus einem Gemisch von trockenem Methylenchlorid und trockenem Äther so erneut gefällt, wobei 6,1 Gew.-Teil (Ausbeute 90%)
l-IsobornyIoxycarbonyl-4-dimethylaminopyridiniumchlorid vom Schmelzpunkt 76 bis 770C (Zers.) erhalten werden.
Infrarotspektrum: vml„(KBr), 1780 cm->, 1645 cm-'; UV-Spektrum:Amsl(H2O), 297 ιημ(ε = 20 400).
Beispiel 1
0,4 Gew.-Teile des Natriumsalzes von Cephalosporin C werden in 0,87 Raumteilen einer wäßrigen 1 f<o n-Natriumhydroxydlösung gelöst, während mit Eis gekühlt wird. Anschließend werden 5 Raumteile Wasser und 2 Raumteile Tetrahydrofuran zugesetzt. Nach Zugabe von 0,204 Gew.-Teilen Isobornyloxycarbonylchlorid und einer wäßrigen 1 n-Natriumhydroxydlösung <>? wird das Gemisch 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und hierbei schwach alkalisch bis zu einem pH-Wert von etwa 8 gehalten. Nach beendeter Reaktion wird das Gemisch dreimal mit 30 Raumteilen Äthylacetat gewaschen. Während mit Eis gekühlt wird. wird die wäßrige Schicht mit 1 η-Salzsäure auf pH 3 eingestellt und dreimal mit je 50 Raumteilen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird abdestüliert ui.d der Rückstand erneut aus einem Gemisch von Äthylacetat und Petroläther ausgefällt Hierbei werden 0,460 Gew.-Teile (88,6%) des gewünschten Produkts als weißes Pulver vom Schmelzpunkt 118 bis 1200C erhalten. Dünnschichtchromatographie (an Kieselgel);
Äthylacetat-Methanol (2 : 3): Rf 0,42.
UV-Spektrum (Methanol): 262 ιημ (ε = 7500).
infrarotspektrum (KBr) cm -': 1790,1720.
Elementaranalyse für C27H37O10N3S:
Berechnet: C 54,55, H 6,26, N 7,06;
gefunden: C 54,45, H 6,42. N 6,64.
Beispiel 2
Ein Kulturfiltrat, das 1500y/ml Cephalosporin C (20 000 Raumteile) enthält wird mit Äthylacetat (dreimal mit je '/3 Volumen) extrahiert, um fettlösliche Verunreinigungen zu entfernen. Die wäßrige Schicht wird mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf pH 8,5 eingestellt. Unter Rühren werden 30 Gew.-Teile Isobornyloxycarbonylchlorid zugesetzt. Während des Reaktionsgemisch mit einer Natriumhydroxydlösung bei einem pH-Wert von etwa 8,5 gehalten wird, läßt man die Reaktion etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur vonstatten gehen. Nach der Reaktion wird das Reaktionsgemisch mit Salzsäure (pH 2) und dreimal mit je 5000 Raumteilen Äthylacetat extrahiert Der erhaltene Äthylacetatextrakt wird ferner mit einer 0,2mo!aren Phosphatpufferlösung (pH 8) extrahiert. Die wäßrige Schicht wird auf pH 3 eingestellt und das Isobornyloxycarbonylcephalosporin C erneut in Äthylacetat gegeben.
Die hierbei erhaltene Äthylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Abschließend wird Petroläther zum Konzentiat gegeben, wobei 56,6 Gew.-Teile rohes Isobornyloxycarbonylcephalosporin C erhalten werden.
Beispiel 3
In 50 Raumteilen Wasser werden 9,4 Gew.-Teile eines rohen Präparats, das 45% (Gew./Vol.) Cephalosporin C enthält, gelöst. Die Lösung wird, während sie mit Eis gekühlt wird, mit 1 n-Natriumhydroxyd auf pH 8 bis 9 eingestellt. Dieser Lösung wird eine Lösung von 4,0 Gew.-Teilen Isobornyloxycarbonylchiorid in Tetrahydrofuran zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden unter Rühren der Reaktion bei Raumtemperatur überlassen, wobei das Reaktionsgemisch mit 1 n-Natriumhydroxyd bei pH 8 bis 9 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird mit Äthyläther gewaschen und die wäßrige Schicht mit 1 η-Salzsäure angesäuert. Die erhaltene Fällung wird mit Äthylacetat extrahiert Auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise wird eine Extraktion mit einem 0,2molaren Phosphatpuffer vorgenommen. Der erhaltene Äthylacetatextrakt wird eingeengt und dann mit Petroläther versetzt. Hierbei werden 4,8 Gew.-Teile rohes Isobornyloxycarbonylcephalosporin C erhalten.
Die Dünnschichtchromatographie dieses Produkts [an Kieselgel unter Verwendung von Äthylacetat-Methanol (2 : 3) als Lösungsmittel] ergibt einen Flecken für
Isobornyloxycarbonylcephalosporin bei einem Rf-Wert von 0,42 und einen schwachen Flecken bei einem Rf-WertvonO,18.
Um Isobornyloxycarbonylcephalosporin C in reiner Form zu erhalten, wird das vorstehend genannte Produkt durch Chromatographie an Kieselgel weiter gereinigt (Lösungsmittel: Methanol-Äthylacetat-Gemisch 3 :2), wobei das gleiche Produkt wie in Beispiel 1 erhalten wird. Die Ermittlung der antibakteriellen Wirkung des Produkts (hemmende Mindestkonzentra- ι ο tion;Testorganismus Bacillus subtilis) ergibt 12,5 y/ml.
Beispiel 4
In 50 Raumteiler. Anisol werden 10 Gew.-Teile des gemäß Beispiel 3 hergestellten N-lsobornyloxycarbonylcephalosporins C gelöst Unter Ausschluß von Feuchtigkeit werden 100 Raumteile Trifluoressigsäure bei — 200C zugesetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei — 200C und 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird es mit Triäthylamin auf pH 6 eingestellt und dann mit Wasser versetzt Die erhaltene wäßrige Lösung wird durch Chromatographie an einem quaternären stark basischen Anionenaustauscherharz (Styrol), Waschen mit Wasser, Elution mit 0,2molarem Ammoniumacetatpuffer von pH 5,8 und abschließende Chromatographie an Aktivkohle gereinigt. Die Fraktion, die Cephalosporin C enthalten, werden aufgefangen und mit 1 n-NaOH auf pH 6,5 eingestellt, worauf Methanol zugesetzt wird. Hierbei werden 4,7 Gew.-Teile kristallines Natriumsalz von Cephalosporin C erhalten.
Beispiel 5
In 2 Raumteilen Anisol werden 1,1 Gew.-Teile N-lsobornyloxycarbonylcephalosporin C gelöst. Bei -20° C werden 7 Raumteile Trifluoressigsäure der Lösung zugesetzt. Unter Ausschluß von Feuchtigkeit wird das Gemisch bei dieser Temperatur 5 Minuten und bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt worauf wasserfreier Äthyiäther zugesetzt wird. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit trockenem Äthyläther gut gewaschen und über Nacht unter vermindertem Druck in einem Exsiccator, der Kaliumhydroxyd und Phosphorsäureanhydrid enthält stehen gelassen. Das erhaltene Pulver wird in Wasser gelöst und die Lösung mit 1 n-Natriumhydroxyd auf pH 6,5 eingestellt, worauf Äthanol zugesetzt wird. Hierbei werden 0,5 Gew.-Teile (60%) des Natriumsalzes von Cephalosporin C in Kristallform erhalten.
so Beispiel 6
Ein Fermentationsmedium, das Cephalosporin C enthält, wird auf pH 5,5 eingestellt, worauf das Mycel abfiltriert wird. 2000 Raumteile des erhaltenen Kulturfiltrats werden auf pH 7,5 eingestellt und dann durch eine Säule geleitet, die mit 200 Raumteilen eines carboxylgruppenhaltigen Kationenaustauscherharzes (Acrylharz) gefüllt ist, wodurch basische Verunreinigungen entfernt werden. Der Ablauf wird auf pH 3 eingestellt und 2 Stunden bei 37° C stehen gelassen und dann mit <>o einer Natriumhydroxydlösung auf pH SJ5 eingestellt Zu dieser Lösung werden 50 Gew.-Teile 1-Isobomyloxycarbonyl-4-dimethylamino-pyridiniumchlorid gegeben. Bei Raumtemperatur läßt man die Reaktion etwa 1,5 Stunden vonstatten gehen, wobei der pH-Wert der Lösung bei 8,0 bis 8,5 gehalten wird.
Nach beendeter Reaktion wird das Gemisch mit Salzsäure auf pH 2 eingestellt und dann dreimal mit je 500 Raumteilen Äthylacetat extrahiert Die erhaltene Äthylacetatlösung wird mit einer O^molaren Phosphatpufferlösung (pH 8) extrahiert. Die wäßrige Schicht wird erneut auf pH 2 eingestellt und das N-lsobornyloxycarbonylcephalosporin C in das Äthylacetat gegeben. Die hierbei erhaltene Äthylacetatlösung wird mit einer wäßrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Durch Zusatz von Petroläther zum Rückstand werden 11,4 Gew.-Teile rohes N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C erhalten. Dieses Produkt hat eine Reinheit von etwa 66%, ermittelt durch Biotest mit Bacillus subtilis als Testmikroorganismus.
Das in der beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt wird an säurebehandeltem Kieselgel unter Verwendung von Chloroform und Äthylacetat (1 :1) als Lösungsmittelsystem chromatographiert, wobei 3,4 Gew.-Teile reines N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C erhalten werden. Die biologischen und physikalischen und chemischen Eigenschaften dieses Produkts stimmen vollkommen mit den Eigenschaften des N-lsobornyloxycarbonylcephalosporin C überein, das auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise hergestellt worden ist.
Beispiel 7
In 25 Raumteilen Wasser werden 4,73 Gew.-Teile kristallines Natriumsalz von Cephalosporin C gelöst. Zur Lösung werden 10 Raumteile 1 n-Natriumhydrogencarbonat und dann 4.0 Gew.-Teile 1-Isobornyloxycarbonyl-4-dimethylaminopyridiniumchlorid gegeben. Das Gemisch wird 1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren der Reaktion überlassen. Nach beendeter Reaktion wird das Gemisch mit 2 η-Salzsäure auf pH 2 eingestellt und dann mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt
Zum Konzentrat wird Petroläther gegeben, wobei 5,1 Gew.-Teile der gewünschten Verbindung N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C erhalten werden (Ausbeute 85,6%). Die Untersuchung durch Dünnschichtchromatographie, UV-Spektrum und Infrarotanalyse ergibt, daß das Produkt mit dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Produkt identisch ist.
Die antibakterielle Wirksamkeit (hemmende Mindestkonzentration) des Produkts beträgt 12,5 y/ml gegen Bacillus subtilis.
Beispiel 8
Ein Fermentationsmeaium (2000 Raumteile), das Cephalosporin C enthält, wird durch eine Säule eines carboxylgruppenhaltigen Kationenaustauscherharz (Acrylharz) geleitet Zum Ablauf werden 35 Gew.-Teile 1 -IsobomyloxycarbonyM-aminopyridiniumchlorid gegeben. Das Gemisch wird 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei sein pH-Wert im Bereich von 8,0 bis 8,5 gehalten wird. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit 2 η-Salzsäure auf pH 2 eingestellt und dann mit Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und mit einer 0,2molaren Phosphatpufferlösung (pH 8,0) extrahiert Die wäßrige Schicht wird erneut auf pH 2 gebracht und mit Athylacetat extrahiert Die Äthylacetatschicht wird mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und Ober wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, worauf das Äthylacetat abdestilliert wird. Durch Zusatz
von Petroläther zum Rückstand werden 6,9 Gew.-Teile rohes N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C erhalten.
Dieses Produkt hat eine Reinheit von etwa 54%, gemessen mit Hilfe des Biotests unter Verwendung von Bacillus subtilis als Testmikroorganismus.
Die nachfolgenden Vergleichsversuche zeigen den überraschenden technischen Fortschritt des Anmeldungsgegenstandes:
Versuch I zeigt, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das Cephalosporin C annähernd quantitativ in das an der Aminogruppe entsprechend geschützte Produkt umgewandelt wird, während die Ausbeute nach dem Stand der Technik (GB-PS 10 14 883) vergleichsweise gering ist
Versuch II zeigt die überraschenderweise wesentlich leichtere Extrahierbarkeit des erfindungsgemäß erhal-
tenen N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C mit organischen Lösungsmitteln gegenüber N-t-Butoxycarbonylcephalosporin C.
Vergleichsversuche
Versuch I
Vergleich zwischen dem Verfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung von Isobornyloxycarbonylchlorid und dem Verfahren nach Beispiel 1 der GB-PS 10 14 883 unter Verwendung von t-Butyloxycarbonylazid.
Die in der nachfolgenden Tabelle beschriebener Versuche wurden einmal nach Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung und zum anderen nach Beispiel 1 dt' GB-PS 10 14 883 durchgeführt. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle gegenübergestellt.
Gruppe
t-Butoxycarbonyl
Isobornyloxycarbonyl
Geschütztes Produkt
Schmelzpunkt des Produkts
Elementaranalyse des Produkts
Dünnschichtchromatogramm
des Produkts
Ausbeute
N-t-Butoxycarbonylcephalosporin C
96 bis 980C
Berechnet: C 48,93, H 5,63, N 8,16; gefunden: C 48,97, H 5,72, N 8,03
ein Fleck
26,1%
N -1 sobornyloxycarbonylcephalosporin C
118 bis 1200C
Berechnet: C 54,44, H 6,26, N 7,06; gefunden: C 54,45, H 6,42, N 6,64
ein Fleck
88,6%
Versuch II
Vergleich der Extrahierbarkeit von N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C mit N-t-Butoxycarbonylcephalosporin C. 4"
Verfahren:
40 g N-Isobornyloxycarbomylcephalosporin C bzw. N-t-Butoxycarbonylcephalosporin C werden in 20 ml Wasser gelöst, worauf die Lösung auf pH 2 bzw. 3 eingestellt wird. Die wäßrige Lösung wird dann mit 20 ml Äthylacetat extrahiert Die wäßrige Schicht wird abgetrennt, auf pH mit einem Phosphatpuffer eingestellt und dann quantitativ analysiert durch Bestimmung der Absorption bei 262 mu, um die Menge des zurückbleibenden N-Isobornyloxycarbonylcephalosporins bzw N-t-Butoxycarbonylcephalosporins in der wäßriger Lösung zu bestimmen. Das Ergebnis ist in der folgender Tabelle dargestellt, wobei das Mengenverhältnis des ir der wäßrigen Lösung zurückgebliebenen Produkts bezogen auf die Gesamtmenge des Produkts, in 0A ausgedrückt ist
N-t-Butoxycarbonylcephalosporin C
N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C
pH 2,0 pH 3,0 1,17
19,27
0,97
6,67

Claims (3)

Patentansprüche:
1. N-lsobornyloxycarbcr.yicephalosporin C.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine Cephalosporin C enthaltende wäßrige Lösung mit Isobornyloxycarbonylchlorid oder einem IsobornyloxycarbonylpyridiniumchloriJ behandelt und die erhaltene Verbin- ι ο dung in üblicher Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert
3. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung von Cephalosporin C, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung nach Anspruch 1 mit Trifluoressigsäure oder einem Gemisch von Trifluoressigsäure und Essigsäure behandelt
DE2208631A 1971-02-26 1972-02-24 N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Cephalosporin C Expired DE2208631C3 (de)

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