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DE2112740A1 - Enzym-Reaktoren,ihre Herstellung und Verwendung - Google Patents

Enzym-Reaktoren,ihre Herstellung und Verwendung

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Publication number
DE2112740A1
DE2112740A1 DE19712112740 DE2112740A DE2112740A1 DE 2112740 A1 DE2112740 A1 DE 2112740A1 DE 19712112740 DE19712112740 DE 19712112740 DE 2112740 A DE2112740 A DE 2112740A DE 2112740 A1 DE2112740 A1 DE 2112740A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
reactor
solution
adsorbed
crosslinked
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19712112740
Other languages
English (en)
Inventor
Reynolds John Herschel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Co
Original Assignee
Monsanto Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Co filed Critical Monsanto Co
Publication of DE2112740A1 publication Critical patent/DE2112740A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
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    • A23C19/0245—Making cheese curd using continuous procedure with immobilized enzymes or microorganisms
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Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF
PATENTANWÄLTE
MÜNCHEN 2, HILBLESTRASSE ZO
Ing. Stapf, 8 München 2, HllblestraBe 20 ·
Unser Zeichen
Anwaltsakte 20 ?80
Datum
17, Van VS1\
Monsanto· Company tit. Louis/USA
"!!inzym-Keakboren, ihre Hera teilung und Verwendung"
i»i« verschiedenen Wirkungen der Enzyme und inre" Verwen—. dangen sind allgemein bekannt und in der Literatur be- iynii· Lob on, i-iriz^rne sin-J ihror liatur nach oro bein ha It ige -.•üii.:~,t,i>tiz!;ii und ^av/öhallcti wasserlöslich., »jie unterliegen dim ivbbait diirch verüauiedene Verfahren \iie der t'roteolyae,
BAD ORIU(NAL
0 θ β A -■! / ^ 1 0 *ϊ
Autolyse und der thermischen Denaturierung, sodaß ihre Verwendung meist mit einem Verlusb oder einem "Aufbrauchen"' des Enzyms begleitet ist..
lieuerdings wurden Versuche unternommen, die Gebraucnsdauei' der Enzyme dadurch zu verlängern, daß man sie -uilöslioh und so zur Wiedergewinnung und wiederverwendung geeignet macfrc. Derartige Bemühungen führten zu mehr oder weniger Erfolg, wobei sie jedoch schwerwiegend beeinträchtigt"werden durch die hohen Kosten der organischen Materialien, die zur Kombination mit den Enzymen vorgesehen sind, um ein unlösliches Produkt zu bilden und weiterhin durch die hohen Verfahrenskosten,urn solche Produkte herzustellen.
Es wäre daher sehr erwünscht, unlösliche, lang wirkende und wiederverwendbare i'Ormen von Enzymen zur Verfügung zu haben, die nicht an dem Nachteil, hoher Kosten leiden. Weiterhin wäre es vorteilhaft, enzymatisch wirksame Materialien in I'Ormen zur Verfügung zu haben, die für einen leichten kontakt eines üubstrats wit dem unlöslich gemachten Enzym geeignet sina4 ■
Die vorliegende Erfindung stellt unbeweglich gemachte Enzyme aur Verfügung, die auf einem polymeren Material adsorbiert und zur Verwendung in eineiü makrof-origen iiern .eines ensymatisch wirkenden lieäktionsgafäßes ^eeiguat sind., üas auf der ρο1,>ΐΐ)«Γοη üborflache ;.«.!sorbiyx-te wirksame Ensyui
^%M BAfG / 1 1 G 9
ORIQfNAL
wird weiter unbeweglich gemacht durch örtliche Vernetzung in it einem Vernetzungsmittel wie Dialdehyd, monomeren] PoIyisocyanat, Bisamidoester, Disulfonylhalogenid und dergleichen. Der makroporige Reaktorkern kann aus Makromolekülen des Acryl- oder Polyamidtyps, aus Polyurethan und dergleichen gebildet sein, wodurch eine Adsorptions-fordernde Oberflache gebildet wird öder er kann aus einem inerten Material wie aus einem geschäumten, offen-zelligen Polyolefin oder dergleichen hergestellt sein, wobei dessen Ober- g flächen dann so beschichtet werden, dali auf diesem Material die gewünschte polymere Oberfläche gebildet wird.
Derartig unbeweglich gemachte Enzyme bilden, wenn sie in einen Behälter oder eine Üäule eingeschlossen sind, die mit Ein- und Auslaßöffnungen -versehen sind, durch welche die Substrate geleitet werden und die geeignete Pump-, i'ilter- und Regelvorrichtungen aufweisen, ein neuartiges üi'naymreaktorsystem, wobei die relativ hohe Porosität des Reaktorkerns hohe Fließgeschwindigkeiten durch den Reaktor % ermöglicht.
Enzymreaktoren dieser Erfindung sind besonders geeignet bei der Käseherstellung für die Milchgewinnung, bei der Glukoseherstellung aus Stärke, zum üüßen von ftohsirup, beim Kältefestmachen (chillproofing of beer) von Bier, zur bynthese von organischen Zwischenprodukten, zur Bildung von Geruchsverbesserern wie Nukleotide, in spezifischen Abfall-
BAO ORIGINAL
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• - ff -
behandlungen, für die Entfernung von unerwünschten .Polysacchariden aus sojamilch, zur Bestimmung des Blutzuckers und anderer Komponenten aus physiologischen Flüssigkeiten und dergleichen.
Die zur Befestigung der Enzyme geeignete polymere Oberfläche kann nach der vorliegenden lief in dung aus einem wasserunlöslichen Polymerisat hergestellt werden, das Nitril-(=±Q, Säμreamid- (-CONH2) oder üreid- (-KHCOtIH2)-Gruppen aufweist, die die Enzymadsorption fordern. Eür solche Polymerisate ist typisch ein Acrylharz wie die Polymerisate oder Hischpolymerisate von Acrylsäure, Methacrylsäure, Ester dieser Säuren oder von Acrylnitril, beispielsweise Polyacrylamid und Polyacrylnitril. Ebenso geeignet sind Polyamid-Makromoleküle wie ein Polylactam, das hergestellt ist durch die Polymerisation von Eactatnmonomeren der allgemeinen i'orrael
τ \
worin R1 eine Alkylengruppe mit 5 bis ungefähr 12, vorzugsweise 5 bis 12 Kohlenstoffatomen ist. Geeignete Lactammonomere sind epsilon-Gaprolactam, alpha-Pyrrolidon, Piperidon, Valerolactam, Methylcyclohexanonoxime, Capryllactam, Cyclodecanonisoxim, Lauryllactani und dergleichen. Typische Polyamidharze sind Polycaprolactam (Nylon 6), Polyhexamethjlenadipamid (Nylon 6.6) und dergleichen. Weiterhin sine
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vorgesehen .folyamide, die ihrer Beschaffenheit nach proteinnaltig siud wie Collagen, Albumine und dergleichen.
i;ine weitere Polymerisatart, die vorteilhafterweise für diesen Zweck verwendet werden kann, ist ein Polyurethanharz, das hergestellt ist durch die Reaktion von polyfunktionellen Isocyanaten mit organischen Verbindungen, die aktive Wasserstoffatome enthalten wie Alkohole (einschließlich Phenole), Garbonsäuren, Polyesteraddukte, die aus der .Kondensation von Polyolen mit irolycarbonsäuren und -anhydriden stammen und dergleichen, d.h. mit organischen Verbindungen wie Polyestern oder Polyäthern, die wenigstens zwei freie Hydroxylgruppen enthalten, wobei die Herstellung in Gegenwart verschiedener allgemein bekannter Hilfsmittel wie Katalysatoren, Emulgiermittel,. Schaumbildnern oder Blähmitteln und dergleichen erfolgt.
Polyacrylnitril, Polycaprolactam und Polyurethan sind die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugten polymeren Materialien.
Wie bereits festgestellt, kann der Kern des Reaktors geeigneterweise durch ein polymeres Material gebildet sein, wie ausgeflocktes Nylon 6, gesponnenes (spun-bonded) Polyamid, gesponnenes Polyacrylnitril oder dergleichen. Ls kann auch ein inertes Haterial mit der gewünschten Porosität wie ein poröses Polyäthylen, Polypropylen oder PoIy-
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styrol, gesinterte Keramiken, Glasfritte und dergleichen verwendet und dann mit dem polymeren waterial beschichtet ' werden. Die Porosität des Materials ist; abhängig von der vorgesehenen .Endverwendung und der üubstratvitsKosit-ät und sie wird so ausgewählt, daß der Druckabfall durch die J^orosität innerhalb dem Reaktor bei praktischen Flie^geschwindigkeiten durch diesen verringert wird. Zusätzlicn zu der Verwendung von Oberflächenbescnichtungen auf inerten porösen Materialien können Polyurethanharze in For ω von offen-zelliger Schäume verwendet werden, wobei aiese gleicn— zeitig die gewünschte poröse drei-dimensionale Struktur bilden. '
Der Reaktorkern ist makroporig und die inneren Oberflächen des Kerns v/eisen die voraus bezeichneten jidsorptions-fordernden Gruppen auf. uie Poren in der» Reaktorkern sind so ausreichend ,groß, daß sie durch die vernetzten Bnzymmoleküle nicht behindert oder verstopft werden,.aber derartigen vernetzten Enzymmolekülen 'ermöglichen, an den ±'orenoberflächen in dem Reaktorkern adsorbiert zu v/erden oder adsorbiert zu verbleiben, ohne das Fließen eines oubstrats durch den Kern wesentlich zu behindern. Elastizität dzw. rriickstellvermögen des Reaktorkerns ist nicht unzulässig und in manchen Fällen sogar erwünscht; jedoch sollte der Kern •unter normalen Arbeitsbedingungen des Reaktors nicht so zusammendrückbar sein, daß der oubstratfluß abgeschnitten
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oder wesentlich behindert wird. Darüberhinaus kenn ein expandierbarer reaktorkern mitunter verwendet werden, wobei wenigstens ein Teil der Bestandteile des üeaktorkerns durch die Einwirkung· des durch ihn geleiteten »Substrats expandiert oder verwirbelt wei'den.
D-ais aktive Enzym kann aus jeder geeigneten Quelle, d.h. es kann pflanzlichen, tierischen Ursprungs' sein oder durch hikroorganismen gebildet werden. Viele derartige Enzyme sind im Handel erhältlich. Zu ihnen gehöreii beispielsweise liibonuklease, Trypsin, Eigenprotease (ficin), oubtilisin, Cstalase, Pepsin, Papain, uarboxypeptidase, Hennin, Chymotrypsin und dergleichen. Ebenso können Enzymgeniische verwendet v/erden, όο sind typische Geraische Gemische von Proteasen, sum Beispiel von saurer und/oder neutraler und/oder rlkalischer Protease.
Viele derartige Enzyme können aus hikroOrganismen, zu denen bakterien, Hefen, Pilze und dergleichen gehören, erhalten werden unter Verwendung bekannter Fermentationsverfahren, wie sie von Kirk-Othmer, Encyclopedia· of Chemical !Technology β, 173-204 beschrieben sind, und eine große Anzahl der von i-iikroorganistnen gebildeten Enzyme sind im Handel erhältlich.
Jie genaue Aktivität des oder der als Ausgangsmaterial verwendeten Enzyme hängt von dem genauen Herstellungsverfahren
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ab und ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, vorausgesetzt daß das hieraus stammende immobilisierte Enzym die gewünschte enzymatisch^ Wirksamkeit hat. Es ster-; hen verschiedene analytische Verfahren zur Verfugung, um die Wirksamkeit des enzymatisch wirksamen Materials zu beistimmen und es kann beispielsweise die Proteaseaktivität von proteolytischen Enzymen mittels*' der bekannten Caseindigestionsverfahren bestimmt werden. Bei derartigen Untersuchungen katalysiert eine Protease die 'Hydrolyse von Gasein während einer bestimmten Zeitdauer und Temperatur und bei einem bestimmten pH-Wert; die Reaktion wird durch Zugabe von Trichloressigsäure angehalten und die Lösung filtriert und das Absorptionsvermögen bei 280 rau bestimmt. Die Amylaseaktivität wird im allgemeinen nach den bekannten Dinitrosalicylsäureverfahren von Bernfeld bestimmt. Weitere Untersuchungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und es werden einige derartiger Verfahren nachfolgend angegeben.
Die Enzyme wenden^.anfangs-.mit-oderι ,polymeren Oberfläche ,. . mittels Adsorption befestigt..
Die adsorptiv innerhalb der Makroporen desReaktorkerns . gehaltenen Enzyme können an der Verwendungsstelle so vernetzt werden, daß sie eine enzym-aktive polymere Einheit bilden, die gegenüber den adsorptiven Kräften viel fester als Folge" des sich ergebenden relativ höheren Molekularge-
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wichts gehalten wird»
? .die Zwecke dieser Erfindung sind' geeignete difunktionelle Vernetzungsmittel Dialdehyde, Bisatnido ester, Monomere Polyisocyanate, DisuironyltelogeBide und dergleichen.
Unter üialdehyden sind beispielsweise Glyoxal, Glutaralde— hyd, halonsäurealdehyd, ßerasteinsaureaidehyd und dergleichen zu verstehen, die vorzugsweise 2 bis 8 Kohlenstoff- M atome enthalten.
Monomere Polyisocyanate sind beispielsweise Xylylendiisocyanat, Toluol-2v4-diisocyanat ^ ΐοΙιιοΙ-2»6-diisocyanat t Diphenylmethan—4-»4'-diisocyanat r 3-Kethyldiphenylmethan- M: «4 *-diisoeyanat r 1 *1-Bis(4—isocyanatphenyl)-cyclohexan, m—Phenylendiisocyanat t p-Phenylendiisocyanat, Ghlorphenylen—2.4-diisoeyanat t Naphthalin-1;. 5-äüaocjanat, -Diphenyl-4.Λ'-diisoeyanat, 3»5--Dimethyldiph;enyl-4-,4-l-diisocyanat,
Diphenyläther-4.4'-diisoeyanat und dergleichen. -
Zu geeigneten I3isamid ο estern gehören solche von Dicarbonsäuren mit ungefähr 4: bis ungefähr IQ Kohlenstoffatomen wie. Bimethyladipimidat und
Bisulfonylhalogenide. sind beispielsweise uaphthaiin-1.5-disulfonyl chloride Kaphthaiin-1., 6-di sulfonyl chi or 4-ä, .Uaph
und dergieicheii.. '
Die henge des vorhandenen Vernetzungsmittels ist in erstei?· Linie abhängig von ü&r Enzyraraenge.oder der ■ J'iengo der Enzyme, die mit der polymeren Oberfläche verbunden-werdea sollen. Gewöhnlich beträgt das Gewichtsverhältnis Enzym/'/eXMietZuti.;^- "mittel ungefähr 1:5 oder .weniger; Ein Verhältnis von ungefähr 1:20 wird bevorzugt.
Sofern der Reaktorkern-ein inertes, makroporiges, drei-..--;.. dimensional es,Material ist,; wird die Ablagerung, des -roly.-- ■■ merisats dadurch·-erreicht-,/,daß-.man -eine nicht wälirige-Lo-sung des'wasserunlöslichen Polymerisats in einem, für das Polymerisat·-geeigneten· organischen Lösungsmittel herstellt, den-maleroporigen iieakt.orkern mit der nicht wässrigen Lösung imprägniert und danach das Polymerisat auf dem it.eaktorkei-n ausfällt, wozu man durch diesen ein Polymerisat-ausfallendes Mittel, wie beispielsweise V/asser, leitet. Die" Immobilisierung· eines äktiven"Enzyms in dem pLeaKtorkern wird dadurch bewirkt, daß man durch diesen eine wäßrige Losung, ''' die das gewünschte aktive Enzym enthält, durchleitet.
Sofern der Reaktorkern aus dem; polymeren Haterial selbst', beispielsweise aus Polyurethan,, gesponnenem (spun-bonded) Polyamid oder gesponnenem (spun-bonded) Polyacrylnitril gebildet ist» kann die polymere Oberfläche, wenn gewünscnt, durch waschen mit einem geeigneten Lösungsmittel aktiviert werdenJ1 bevor die wäiirige aktive ü-nzyralösung durch den Kern geleitet" wird* Auf diese Weise wird eine sehr-dünne
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Überflächenschicht des polymeren Materials weggelöst unter Bildung einer frischen, nicht verunreinigten Oberfläche zur .befestigung des aktiven Enzyms. Der Reaktorkern weist jedoch noch die erforderliche Makroporosität auf, um das substrat durch den Kern schnell durchlaufen zu lassen.
,.■ie Unbeweglichmachung des Enzyms kann taifc oder ohne ein Vernetzungsmittel in einem wäßrigen .Medium bei pH- und l'ernperaturbedingungen durchgeführt werden, die nicht dazu.neigen, das Enzym zu inaktivieren. Temperaturen über ungefähr 600O sollten im allgemeinen vermieden werden. Das vorliegende Verfahren wird leicht bei Raumtemperaturen unter Verwendung einer'wäßrigen Lösung des Enzyms und des Vernetzung» uittels durchgeführt. ■ ■ « .
£±e ausgewählte Temperatur hängt jedoch hauptsächlich von dem jeweils verwendeten Enzym oder Enzymgemisehs ab. Gewöhn— lich kann die Temperatur im Bereich von ungefähr -5 C bis ungefähr 50° ^ liegen, wobei ein Temperaturbereich von ungefähr 10σΰ bis ungefähr 25°C bevorzugt wird. Die Enzymkonzentration in der Lösung ist nicht kritisch und kann von ungefähr G,005 bis ungefähr 5 Gew..% variieren, wobei ungefähr 0,1 bis ungefähr 2 Gew.% bevorzugt werden.
üarüberhinaus wurde festgestellt, dais überschüssiges aktives Enzym auf der polymeren Oberfläche dadurch abgewaschen werden kann, daß man den Reaktorkern nach Durchleiten der
-12-
BAD ORIGINAL
Jv .■■■·■ 2-1127 AO"
aktives En zym-ent halt enden Lösung mit einer wäßrigen. Lösung eines wasser-raisehbaren organischen Lösungsmittels behandelt, wobei dieses ein Niedrigalkanol mit bis zu-M-Kohlenstof fat omen, d.h. Methanol-, Äthanol, Isopropanol·,. n-Butanol, usw., oder ein Niedrigalkylketon mit bis zu 4- Kohlenstoffatomen in den Alkylteilen, d.h. Aceton, Methylethylketon, Methylpropylketon, Methylbutylketon, usw. sein kann. Vorzugsweise ist das wasser-mischbare organische Lösungsmittel in einer Menge im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 15 Vol.$ vorhanden, -",. . . . .
Zur Beschichtung des makroporigen Heaktionskerns mit der polymeren Beschichtung wird das polymere Material in einem geeigneten inerten.organischen Lösungsmittel gelöst, wie beispielsweise Ameisensäure, Trifluoräthanol, Dimethylformamid, H.n-Dimethylpyrolidinon, Dimethylacetamid, Dimethyl sulf oxid oder dergleichen, Je nach der Beschaffenheit des Materials. Das makröporige Enzym-Trägermaterial W wird dann mit der erhaltenen Lösung versetzt und danach wird .das polymere Material aus der Lösung auf das poröse Material dadurch ausgefällt, daß man durch das-?-'eingeweichte oder imprägnierte Material ein geeignetes' i-O'iym'erisatausfällmittel, beispielsweise V/asser, wie vorausgehend ausgeführt, durchleitet. Das organische Lösungsmittel' wird gleichzeitig ausgewaschen. ' -
Die vorliegende Erfindung wird weiter durclr die nachfolgen- '' -13-
1 0 Ili-3 /JA 0 9 BAD ORIGINAL,
den Beispiels
Pölyäthyieiiäöheiije fifit eiiieiii Büröteies-äer von $ö ffita Una einer- iitärke vdä 5f1 ftiiö (1/0 inöii) würde van eiii@i Platte pörööötii Fölyätilylött äbgesöiiöitteii ttrid mit eiiiei* QöWi^igeti Lösxitlg von Folyööryiöitßii in N-fleth^ipy^öü dei 5O°ö duröHsetgti Maöfedem die to.ersöhüssigs Fölyraerisat iösüög aus deii ätißö^eö Obörfiäohöö del* SöMeibe etltfertit Würde j wurde die Sötaexbe itt eiiier göii-göeteO Haitertltig
Dana würde destilliertes Waöse^ dür"öii die Böfaeifee üffi das Pölyaöryliiitrii art din iööer'eEi ^ööei äüszüfälleii üiid das W-Methyipyrdl-idi-Möö· zu eätfertieni
Eine wäßrige mzyml'amrigi die älMöliscäBi PI*öteäse (oübtilisin 0arlöKel*g) (0#"1 Gew#?^ üiid
iid-elt und eineö pH-Wef-'t -¥dn & atif-Wiös» Wü^de tierg-estellt tiöd Wiederholt durch di§ ödheibe uögefShr drei Stünden ge püöipt* Danach würde die SöBeifeö toit l'risChydroxymethyl)-araiüoraethan-Piifferiööüng (p'H &fÖ) geWäSöheöf v/obei dieser Lösung Kaliumchlorid (Im) zugegeben wurde? üiiö das nicht gebundene EnzytH
Das Versuchsverfahren bestand darin* ü?1$iges denaturiertes
10 i i it $ 111 ö i BAD
iügügeben und die erhaltene Lösung durch die Sc-heibe wit eiöei* öesöhw'indigkdit von BjQ mi pro Minute zu pumpen* ϊ? Älisti-'öm Wüiäe iß Keagenzgiasefo gösainmelt f die wäßrige ge TtfiöiiiöreSßigÖaüWelÖöiifig eötbieltenj zur Ent-' irgendeiriel* lusfallüiig'f öi§ Voihanaen sein könnte * und d-aö ÄfraörptioöSveftnögen öös Filtrats in einem
toei einer tfeilenlänge von 280 mü gemessen *
Die Estefäsea&tivität deö üttfetiliöinreaMtörs wurde_unter-Yerwendüfig vött Lpstiogett äeö Beiizoylaigininatii^lesters bestimmt t 'Eä wurde ein enzyfiiätiäöb wirMssBier Keaistorkern
8ΐί b t i 1 i sinr eäfetg^, ■ . . -
Es wurde eine läng wirkende P^öteäs'eöktivxtät eines tilisinreSMtors j der wie in Beispiel d ßef'gestelit gegäfiüber* öäöein geprüft* iSine 0^1 Gev7i/>ige Lösung von öäaein viur'de drei w'ocben lang duroii den Heaktor geleitet* Haöh! Ablauf dieser Zeit hätte er" niiir Λ0% seiner Änföngsaktivität verlören« i^linl-ieiie Ergebnisse vrarden mit Benir als Substrat erhalten*
BAD ORIGiMAt
100643/11Ö3
Ühymotr.ypsin-.rie3ktor
Eine jr'olyäthylenscheibe mit einem Durchmesser von 140 mm und einer ütürke von 5,1 nun (1/8 inch) wurde von einer Platte von porösem Polyäthylen abgeschnitten und mit einer 1ü Gew./«igen Lösung von Polyacrylnitril in N-Methylpyrolidinon bei 500C durchsetzt. Danach wurde überschüssige Polymerisatlösung aus den äußeren Oberflächen der Scheibe ent-
fernt und die Scheibe in einer Hembranhalterung befestigt. «
Destilliertes Wasser wurde dann durch die Scheibe zur Ausfällung des Polyacrylnitrile auf den bcheibenoberflächen und zur Entfernung des H-hethylpyrolidinons gepumpt.
.bine wäßrige jSnsyulösüng, die a-ühymotrypsin (0,1 Gew.;&) und Glutaraldehyä (5 Gew./y) enthielt und einen pH-Wert von 6,5 hatte, wurde hergestellt und wiederholt durch die bcheibe ungefähr 1 Stunde gepumpt. Danach wurde die ocheibe vait Tris(hydroxymethyl)-aminoraethan-Puffer-(pii 8,0)-lösung gewaschen, wobei man zu der Lösung Kaliumchlorid (1H) zugegeben hatte, um nicht gebundenes Enzym auszuwaschen. Danach wurde die facheibe geprüft.
j^ie Esteraseaktivität wurde mit Acetyltyrosinäthylester und Bensoyltyrosinäthylester nachgewiesen. Die Amidaseaktivität wurde mit Carbobenzoxy-tyrosin-p-nitroanilid nachgewiesen. I-iilchgerinnungsaktivität wurde beobachtet, wenn eine
-16-109843/1109 bad original
Eine PöiyätftylenilsetaäiöB «it ©in&ni D\i£©iiraBsser vötl J8 »-ta■,,- und ei&ei» S-öärke von 5^ ϊπϊίί Ci/B iöök) wüM-e Wo. ®lJn&p ..;
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6AD ORIGINAL
äthylester und Tosylargininraethylester und die Araidaseaktivität gegen Benzoylarginin-p-nitroanilid geprüft. Die Prcteaseaktivität wurde mit Casein beobachtet.
.Beispiel 3
Alkalischer Phosphatase-Reaktor ' Eine Polyäthylenscheibe mit einem Durchmesser von 38 ^m und 3>1 ram (1/8 inch) Stärke wurde von einer Platte von porösem Polyäthylen abgeschnitten und in eine 10 Gew.^ige Lösung von Polyacrylnitril in N-Methylpyrolidinon bei 50°G eingetaucht". Danach wurde die überschüssige Polymerisatlösung von den äußeren Oberflächen der Scheibe entfernt und diese in einer Membranhalterung befestigt.
Destilliertes Wasser wurde dann durch die Scheibe' gepumpt, um das Polyacrylnitril auf den Scheibenoberflächen auszufällen und N-Methylpyrolidinon zu entfernen.
Eine wäßrige'iifazymlosung, die alkalisches Phosphatase (Kükenintestin) (0,1 Gew.i^) enthielt, wurde wiederholt durch die Scheibe ungefähr eine halbe Stunde lang gepumpt. Das Enzym wurde dann mit Glutaräldehyd, wie im Beispiel 4 beschrieben, vernetzt. Danach wurde die Scheibe mit Glyzin-Pufferlösung gewa'schen, wobei man der Lösung Kaliumchlorid (1M) zugab, um das nicht verbundene Enzym auszuwaschen. Die Scheibe wurde dann geprüft.
BAD OFtIGlNAL
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Der alkalische Phosphatasereaktor wurde mit o^-Carboxy-.. ; phenylphosphät geprüft und hatte eine wesentliche Enzymaktivität. ·
-Beispiel 6 . '
Ribonuclease-Reaktor
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 5 wurde eine ticneibe hergestellt, in der Rinder-Pancreas-Kibohuclease adsorbiert und dann an der Verwendungsstelle vernetzt wurde, uxe wies Aktivität gegenüber Cytidin-21.3'-cyclisches Phosphat und
Hefe-Rihonucleinsäure auf. ' .
Beispiel 7
geigenprotease-Reaktor ..-...,.
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 5 vmrde eine Scheibe hergestellt, auf der man Feigenprotease adsorbierte und dann an der Verwendungsstelle vernetzte, üie wies Aktivität gegenüber Casein und Benzoylargininäthylester auf.
Beispiel 8 Pepsin-'Reaktor
In ähnlicher ^eise v;ie in Beispiel 5 wurde eine Scheibe hergestellt, suf Vielehe man Bchweine-Pepsin adsorbierte und dann an der Verwendungsstelle vernetzte. Kr v/ies Aktivität gegenüber Haemoglobin auf.
BADORIGtNAt; -19-",.
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in ähnlicher Weise wie la Beispiel· 5 würde eine Scheibe tiergestellt, die mit Invertase adsorbiert und danti an der Verwendungsstelle vernetzt Wurde* sie wies Aktivität gegenüber Sucrose auf*
Bei spiel .10 .
Pep s in-iieaktor
In ähnlicher aeise wie in Beispiel 5 wurde eine scheibe . . ~ hergestellt, die mit Ivüken-Pepsiii adsorbiert und dann an der Verweudungsstelle vernetzt würde» Sie wies -Aktivität gegen Haemoglobin aui\ . .
Beispiel·.11
In ähnlicMer weise \«ie in Beispiel 5 wurde eiile &öii?@i hergestellt, auf der ein Gemisch von B* neutraler -Protease* alkalischer Protease und Affiylaie adsorbiert und dann an der Verwehäütigsstell-e Yeraet-zt wurde* J^s zeigte sich Aktivität gegenüber Casein* ßenzöylarginin« ät hy lest er und. !•
ia ei spiel. 12' ■
Catala se-^eaktor
In ähnlicher V/eise wie in Beispiel $ vmrde eine ocheibe
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hergestellt, auf der Catalase adsorbiert und dann an der Verwendungsstelle vernetzt wurde, oie wies Aktivität gegen Wasserstoffperoxid auf.
Beispiel 13
Polyp ti en ol-Oxida s e-Reaktor . ■
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 5 wurde eine Scheibe hergestellt, auf der Polyphenoloxidase adsorbiert und dann an der Verwendungsstelle vernetzt wurde, oie wies Aktivität gegen Dihydroxyphenylalanin auf. ■
Beispiel 14- .
Carlsberg Reaktor · : ...
in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden drei Scheiben hergestellt, auf denen Bubtilisin-Carlsberg adsorbiert und dann an der Verwendungsstelle vernetzt wurde. Jede Scheibe' wandelte eine 10 Ivi-Lösung von Benzoylarginiriäthylester zu Benzoylarginin um.."-Der Grad der Umwandlung zu diesem Produkt war -bei jeder Scheibe, wenn sie einem Keaktbrsystena einverleibt wurde-, 60/i. Wenn jede dieser drei-Scheiben in Tandemanordnung in dem Reaktor syst era verwendetoviurdö, war der G-esamtunrwandlungsgrad zu dem Produkt 9!?^. :^><\
Beispiel 13 :,.. .. - . : ..-.= -s ·ιυ*.;:·>.-;> ua Ämyloglucosidase-Reaktor ,:·λ^ .;--;>üüv;,....- -yUJ-'
In ähnlicher V/eis,e...wie. in Beispiel 5 wurde eine scheibe
-21-
10 9 8 4 3/1109 W PB'GWA«
tiergestellt, auf der 4rrtylQgluQ0sida.se adsorbiert und dann an der Vepwenaungsstelle vernetzt wurde» Diese war gegen ötärkelösungenund bildet Qlukose»
■üeispiel 16 '
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 5 wurde eine ö hergestellt, auf der- a^üalaatasidase adSQrbieyt und an der ¥erwendungsstelle vernetzt wurde, öle ist. wirksam m gegen pWihlid
.Beispiel
■tjeaktppen in 'l'andenianOrdnung . .. ■ Ii$ ähnlicher Weise wie iii Beispiel 5 wurden zwei hergestelltr wobei eine van diesen öeheiben. mit
adsorbiert
kinase (^K)/und dann an der ¥erwendungsstellg v§rn,etgt und die andere tjjit LactatdehydrQgenase (LPH) adsorbiert und dann an der Verwendungsstelle Yernetzt wurde, Diese beiden Dcsheifeen wurden in !'anderaanerdnung eineffl Heaktorsystem eingefügt,: Wobei die P& an erster unddie LDH an zweiter ip-telle war. Eine Lösung von ^hosphoenolpyruyat wurde duroh den Heaictor, der die beiden acheiben· enthielt» gepuiript«. Das produkt der enzymatischen iieaktion in der ersten öoheibe aildet Pyruvat, das nachher in der zweiten Scheibe unter .Bildung von säure umgesetzt wird,
BAD ORtGWAL „22-
- 22 er . ' .
oeispiel. 16
In ähnlicher. Weise wie in Beispiel 5 wurde eine Jcneibe hergestellt», auf der Kermin adsoppiert und en eier'Very/en dunggsteile Y§rü§tzt wurde» 'iim'iU Jie wcnei&e in ein Sy. stern eingefügt wurde,, bpaghte sie. HiIyα zu® fie
spiel· 19 - .
Zwanzig grglipcDrige Polyäthylensoneiben (Porengräije fähr 0,79. ffl5) CV32. inoh)) wurägn mit 5^iger (Gow»/VbX)s L:J-gung YQii Polyakrylnitril in iiiiiietajlsulfoxid Bei 5Q0O durcn-* tränkt· DeB uoersohuii d@r rolyrnerigatlÖsung wurde aann von den durQöträiiktep öQhe.db.en durgn Abv/asQb,§n mii; einea desuil-=·. lierten Waggergtron] entfernt, wobei gleichzeitig Polyaorylrjitril auf den Ooerflachen de-r 8sneib§n ausgefüllt v/urde, Xiie. gewas@h§neri pq helfe en wurden, dann in eineft $d χ 101 mm (1 r5 χ ^f iiioh.) grpiien Hphrstutzen aiig rpstfreiern ötahl tiberfühpt und rieduzierendstüc/ke,, die rnit Ä tungspagetügken. ve.rs'enen sind., wurden mit den beiden des Rohrstutζens verbunden t pegtilliertes V/asser (ungefähr Z X) wurden durch den so. zusararaengesteilten Reaktgr ge= pumpt und der Reaktor vrorde dann in ein bei 34°0. gehaltenes Wasserbad getaucht.
Eine wäßrigt 1$ige (Gew./VoI1) Chymotrypsinlösung (150 rnl,
BAD 2^
21127A0
pu .,ρ) vvux'üe dann durch das Keaktionsgef als ^O hinuten im r».rulöl3uf gerührt, jjie auf den scheiben abgelagerte Uhymotrypsinmeuge wurde durcn Vergleich der itbsorptionsdifferenz aer .Ghymotrypsinlöoung vor und nach dem Kreislauf errechnet uivä betrug '10L' rag. Glui;araldehyd (1,-j (vol./Vol.)) wurde dann der Ohyniotrjpsinlösunj zugegeben und der pH-V/ert auf 6,5 durch Zugabe von wäßriger 'Vd Lösung von Natriumhydroxid eingestellt und axe erhaltene Lösung durcn den Beaktor ungefähr eine Stunde im Kreislauf gefünrt. jJanach wurde die Lösung aus den: KeaKtor abgezogen und der Reaktorkern wurde durch I*utnpen von destilliertem V/asser (ungefänr 2 1) gewaschen.
Per so hergestellte Reaktor wurde mit aenzoyltyrosin-pnitroanilidsubstrat in einer IO^ieen (^Vol./Vol.) Lösung von Aceton in Wasser, das 0,05 i'1 ir is (hydroxy methyl) -arairioinethan-I:"uffer (.pH d,0) enthielt, geprüft. Die Utnv/aadlung des bubstrats su läensoyltyrosin und' p-^itroanilin wurde ' kontinuierlich bei pbOu unter Verwendung eines bpeictro- " ■ photometers festgestellt, wobei dieser mit einer iluozelle ausgestattet war. üie iienge des in dem neektor vorhandenen wirksamen Gnyaotrycsin wurde auf 65 tng bestitaint.
Beispiel 20
^u1Dt ilisin-P'eaKtor
Kin Zylinder von Polyui'ethanschaura wurde in einen 38 χ
-!".-- QADORtGINAL
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50$8 mm (1*5 x 2 inch) Rohrstutzen aus rostfreiem· btahl.'.......
eingebröcht-} der· dann mit Reduzierungsendett mit Absperre, einrichtungen -versehen wurde« J^ine lO^ige (VoI4/YoI»·)> Ace=-; tön/V/as-s er lösung wurde dann durch den i-ieaktor so- gepumpt * daß der 'Polyurethan schäum -grütidlidh .gewaschen und benabzt wurde» L»anäch wurde eine Wäßrige üs1^ (Ge-W*/Vo-I*) Lösung^ von üubtilisin Garlsberg 3ö Minuten durch den keaktor ifrj Kreislauf geführt« . -.. ■
Die henge an oubtilisin Carlsbeifg} aie an dem Polyujfethanschaütn befestigt vmrde^ wurde als 20 mg festgestellt* i/as Enzym wurde dann wie im Beispiel 4- vernetzt* Der. Reaktor. .. wurde dann mit v/äßriger 0*1 M liäliümculoridlösurlg (50Q.ini) gewaschen und geprüft s Der Reaktor war aktiv gegen iienzöyl^ argininäthyl§ster in ein ein O|üp M l'risCiiydroxymethyl^-arninöäthanpuffer (pH ö^O)^ der D^i w Kaliumchlorid enthielt*
Beispiel.. 21 .... -.
GluGOsepjxidsge=R,ea.,ktor
In äanlicher Weise Wie in Beispiel 19 wurde Glukoseoxidase in einem .Reaktor durch Vernetzen des adsorbierten ii an der Verwendungssteile immobilisiert* Der Reaktor wände!«
te eine 10 H^Lösüng von Glukose in Glükonsäüre in 80?öiger Ausbeute bei einer FließgäöChwindigkeit von 2 ml pro Minute um»
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ii/i-jS
Beispiel 22 : " -
In Zucker verwandelnder Am.ylase-Reaktor
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 19 wurde ein in Zucker verwandelnder Atnyla se-Reaktor hergestellt. Der Reaktor war aktiv und bildete Glukose aus einer löslichen Stürkesubstratlü'sung bei pH 6.
Beispiel 23
-Reaktor zur Bestimmung von Glukose In ähnlicher Weise wie in Beispiel 19 wurde ein Reaktor mit einer Vielzahl von Polyäthylenscheiben gebildet. Die untere hälfe der bcheibenanordnung enthielt Scheiben mit adsorbierter Glukoseoxidase und die obere iiälfte. der Scheibenanordnung enthielt Scheiben mit adsorbierter Peroxidase. Beide Enzyme wurden an der Verwendungsstelle vernetzt. Eine Lösung von Glukose Ia wäßrigem O»01 w Phosphatpuffer CpH 7,0) mit einem Gehalt von o-JJianisidin (8,2 χ .10" H) wird dann durch den Reaktor (im Aufwärtsfluß) geleitet und der Abstrom wurde kontinuierlich mittels einem dpektrophotometer bei 425/U überprüft, um eine quantitative Ausbeute an Glukose zu erhalten.
Beispiel'
Glukoseisomerase" ;
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 19 wurde ein ReaKtor konstruiert, der poröse Polyäthylenscheiben enthielt, auf ' ' -26-
109843/Π 09 eAD
denen ü-lukoseisotüerase, vernetzt au der Verw.euuuiu.v adsorbiert wurde. Der itear:tor war gegenüber ^in.er vrii Lösung, die Glukose entnieit, aktiv unu oilaeie eine Lösung, die ii'ractose una -Glukose enthielt.
Beispiel· 25
Pectinase-üeaktor ■ »
In ähnlicher '.»eise wie in Beispiel 19 wurde ein Reaktor - unter"Verwendung von Poljäthjlenscheiben gebildet, wobei diese adsoroierte r'ectinase (jrectinraeöti^iesuerasej unci r^ectiridepolymerase, vernetzt an der Verwenann^sscc-lxe, ent-, hielten. Der rtearctor war v/irKsam gegenücer recöin, wooei er die Trübung bei Apfel- und Grapefruiüsaft verringerte.
■beispiei 26
Aiainoacylase—xteak'öor . ■ . ■
In ähnlicher .'/eise v;ie in Beispiel 19 v/urde ein Reaktor hergestellt, wobei man tOl^äthylenscr-eioen verwendete, die adsorbierte Äminoacylase, vernetzt an der Verwehdungsstelle, enthielten. Der Heaktor war aktiv gegen DL-Jicetyiraethionin." - " " ■
Beispiel 2? ■■■*...._
Chymopapain-rieaktor ■
In ähnlicher '»'/eise wie im Beispiel 19 v/uräe ein iieaktor unter Verwendung" von i^olyäthylenscheiben nergestellt, wobei
-27-
BAD ORIQfNAL . 1098 43/1109 ;
..iieao adsorbiertem Onjüiopapain enthielten* das vernetzt; wurde* ^er reaktor wie« --i.irküai.ikeit gegenüber ^enzoyl- -ai',j.inin:lthj !ester ^aI* . ■ - . .
2o
Versponnener ir-olyacdd-Keaktor
Ein ivohr au^ ro;.;tei'reiera ötanl wurde mit. gesponnenen ^ üondea) ±o±\ornidfasern Λ3ϋ .\"/n;) gepackt, v/obe-i r>.eduzierungsenden an des Rohr befestigt, wurdet: und püG ml- einer .65>jigen ('Jtnvs/Vol») Lösung von Ameisensäure Und danach ο 1 destilliertes Wasser durch^eleitet wurden* uaxioch wurde Ghymotr^ptsin auf den) versponnenen Wylon adsorbiert und dsnn in ähnlicher Weise wie in Beispiel. 19 vernetzt*"Der so gebildete ^eciictor wie^s x.sr-eräse-* Ainid&öe- um. rrotesseaktivität auf.
Beispiel, ,29 ■ .
Ausceflockeer .,,)loa b-Ke,aktor ·
PolycapiOlaot-aii ^1C g) wurden in b^.ciger (Gev.;*/Voi.s )Lösung von Auieisensiure oei 2p ö gelöst und die erhaltene Lösung in destilliertes V/assef C5 1) gegossen» r-in ausgeflocktes polymeres ha-cerial wurde hergestellt, aii; destilliertem V/asser jcewoscheii und dann Wurde es in eine ca» 10 cm (A- inch) öäule aus rostfreiem »Stahl gepackt. Line Lji^ige (Gevi./Vol) Lösung von x'rypsin (200 ml) wurde durch die Kolonne im kreislauf geführt, bis _12ü mg von- trypsin, in der Kolonne
-28-
10 9 8 k 37 11 -W'-' , .
BAD ORlGiNAL
zurückgehalten wurden. Danach wurde eine wäßrige Lösung, die 1,5/'J (Gew./Vol.) Glutaraldehyd enthielt, zu der im Kreislauf geführten Lösung zur Vernetzung des Enzyms zugegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7»O durch Zugabe einer wäßrigen 0,1 N Natriumhydroxidlösung gehalten.
Die Keaktorkolonne wurde dann mit einer wäßrigen Lösung, die 0,3hT Kaliumchlorid enthielt, gewaschen und mit 10 M I'osylargininmethylester unter Verwendung einer 0,025 H TrisChydrdxymethy^-aminomethan-Pufferlösung (pH 8,0) und 0,1 N Kaliumchlorid geprüft. Bei einer i'ließgeschwindigkeit von 28 ml pro Minute wandelte der Beaktor Tosylargininmethylester zu Tosylarginin in
uie Erfindung beinhaltet alle Abweichungen und .änderungen von den Beispielen, die lediglich zum Zwecke der JLrläuterung gegeben wurden, soweit die Abweichungen von dem allgemeinen Erfindungsgedanken Gebrauch machen.
• ■■■■ : ■
BAD ORIGINAL
-29-
0 9

Claims (5)

- 29 Patentansprüche :
1.Enzymreaktor des Durchflussystems rait einem makroporigen Reaktorkern gekennzeichnet durch eine polymere Oberfläche, die acisorptionsfordernde Nitril-, Säureamid· -, Ureidgruppen aufweisen und auf dessen Oberfläche ein aktives Enzym adsorbiert und an der Verwendungsstelle vernetzt ist.
2. Enzymreaktor gemäß Anspruch. 1 dadurch gekennzeichnet, daß der .Reaktorkern Polyäthylen, Polycaprolactara, Polyurethan oder versponnenes Polyamid ist und die polymere überfläche Polyacrylnitril, Polycaprolactam, Polyurethan oder versponnenes Polyamid ist."
3. Enzymreaktor gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Kibonuclease, Feigenprotease, öubtilisin, alkalische Phosphatase, Polyphenoloxidase, Catalase, Trypsin, Alkalische Protease, Chymotrypsin, Invertase, ßennin, Glukoseoxidase, Zucker-bildende Amylase, Glukoseisomerase, ein Gemisch von Pectinase und Pectindepolymerase, Aminoacylase oder Chymopapain ist.
LV. Enzymreaktor gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit einem Dialdehyd vernetzt ist.
5. Verfahren zur Immobilisierung eines aktiven Enzyms, in
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BAD ORIGiNAL 109843/1109
einem Enzymreaktor dadurch gekennzeichnet, daü mau eine polymere Oberfläche auf einem niakroporigen .Reaktorkern oildet, der Adsorptions-fordernde !.itril-, üäureamid - und Ureidgruppen aufweist, die polymere überfläche mit; einer wäßrigen Lösung, die ein aktives Enzyia enthält und mit einem Vernetzungsmittel in Kontakt bringt und gegebenenfalls die polymere Oberfläche mit einer, wäßrigen Lösung eines Niedrigalkanols oder eines Hiedrigalkylketons, wobei jedes bis zu 4 Kohlenstoffatome in den Alkylanteilen enthält, in Kontakt bringt.
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