DE2022280A1 - Verfahren zur Bestimmung von Xylit - Google Patents

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann,

Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fingke

Dipl.-Ch em, B. Huber

8~MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 482921/22

Böehringer Mannheim GmbH, 68 Mannheim 31« SandhoferS.tr. 112

Verfahren zur Bestimmung von Xylit

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung von Xylit, soxtfie eine Reagentien-Zusainmenstellung zur Durchführung dieses Verfahrens,

Xylit spielt neben Sorbit und Fructose eine immer größer werdende Rolle als Austauschmittel für Glucose und Saccharose bei Diabetes, Daher wird eine einfache und zuverläßige Bestimmungsmethode für Xylit benötigt.

Es ist bekannt, Xylit durch Oxidation mit Perjodsäure unter Bildung von Formaldehyd, der wieder mit Chroinotropeäure zu einem Farbstoff umgesetzt wird, colorimetrisch zu bestimmen. Dieses Verfahren hat den Hachteil, sehr unspezifisch zu sein und für jede Versuchsreihe die Aufstellung einer Eichkurve erforderlich zu machen. In Biochem. Z. 32§> ?$ (1962)

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wird ein Verfahren von K. H. Bässler und Mitarbeitern "beschrieben, bei dem Xylit durch enzymatische Dehydrierung mit Sorbit-Dehydrogenase und NAD als Dehydrierungsmittel zu D-Xylulose + NADH umgesetzt und letzteres in üblicher Weise bestimmt wird. Diese .Methode hat den Nachteil, daß sie keine EndwertbeStimmung zuläßt, da das Gleichgewicht zu ungünstig liegt. Es muß daher die Geschwindigkeit der Reaktion in Abhängigkeit von der Xylitmenge gemessen v/erden. Die Methode ist schwer reproduzierbar, ergibt eine Standardabweichung von 8 bis 10 $> und erfordert ebenfalls jeweils die Aufstellung einer neuen Eichkurve.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer spezifischen Bestimmungsmethode verbesserter Empfindlichkeit und Genauigkeit, bei der keine Eichkurve benötigt v/ird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Xylit durch enzymatische Hydrierung mit Sorbit-Dehydrogenase und einem Dehydrierungsmittel zeichnet sich dadurch aus, daß als Dehydrierungsmittel 3-Acetylpyridin-adenin-dinucleotid (APAD) verwendet wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig bei einem pH-Wert zwischen 8,7 und 10, vorzugsweise zwischen 9 und 9,5 durchgeführt. Zur Einstellung des pH-Wertes eignen sich Puffer mit einer Konzentration zwischen 0,o2 und 0,3 M, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 M. Die geeigneten Puffer lassen sich durch einfache Vorversuche leicht ermitteln, v/obei solche Puffer als geeignet anzusehen sind, welche die Sorbit-Dehydrogenase nicht oder nur geringfügig hemmen. Eine geringfügige Hemmung kann in Kauf genommen werden, da das erfindungsgemäße Verfahren eine Endwertbestimmung zuläßt, Beispiele für gut geeignete Puffer sind Diäthanolamin-Puffer, Natriumpyrophosphat-Puffer, Veronal- und Amediolpuffer, weniger geeignet sind z.B. Tris-Puffer, Glycin-Puffer und Piperazin-Puffer. Besonders bevorzugt v/ird Diäthanolamin-Puf f er. 109847/157Λ

w a ο H Ii \ ο / k BAD ORIGINAL

Bei Verwendung eines Puffers im bevorzugten Konzentrationsbereich können XyIit-BeStimmungen in Serumproben durchgeführt v/erden,' die vorher in üblicher V/eise, z.B. durch Perchlorsäure, enteiweißt wurden, ohne daß eine Neutralisation nach Zugabe der zur Enteiweißung verwendeten Säure erforderlich ist.

Die Xyüit-Konzentration sollte zweckmäßig etwa 0,3 bis 3,0/ι Mol pro ml der zu. bestimmenden Lösung betragen, um optimale Ergebnisse zu ermöglichen. Dies entspricht etwa 2 - 20/U g = 0,015 - 0,15/U Mol Xylit pro Testansatz, wie er im Beispiel beschrieben ist.

Die erforderliche APADmenge hängt prinzipiell von der zu bestimmenden XyI^-^ tmenge ab. Um unter allen Bedingungen eine sichere Endwertbestimmung zu ermöglichen, wird jedoch zweck-"mäßig ein erheblicher Überschuß angewandt. In der Praxis bedeutet dies, daß pro Test zweckmäßig etwa 1 - 2 mg APAD eingesetzt werden.

Das erfinduiigsgemäße Verfahren weist mehrere wesentliche Vorteile auf. Diese bestehen vor allem in der verbesserten Spezifität gegenüber den bekannten enzymatisehen Verfahren, dem sttjchicmetrischen Verlauf der erfindungs gemäß en Umsetzung, der das Aufstellen einer Eichkurve, die bei den beiden bisher bekannten Methoden erforderlich ist, überflüssig macht. Die Bestimmung ist zudem als direkter optischer Test mit EndwertbeStimmung besonders leicht durch- ■ führbar. Alle erforderlichen Lösungen werden direkt in die Meßküvette einpipettiert und dann der Endwert direkt abgelesen. Der Endwert wird normalerweise nach etwa,,30 - 60 Minuten.erreicht, und zwar je nach der verwendeten Pufferlösving« So v/ird der Endwert bei Verwendung von 0,1 M Natrium-pyrophosphat-Puffer, pH 9,5 in etwa 30 Minuten,

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bei Verwendung des gleichen Puffers mit 0,2 M in etwa 60 Minuten erreicht.

■Ein weiterer wichtiger Vorteil ist darin zu sehen, daß bei Verwendung von APAD als Coenzym die Messung bei 366 nm .durchgeführt werden kann und dadurch wesentlich empfindlicher ist, da der Extinktionskoeffizient für APADH 9,0 cm²/ /u Mol beträgt (der entsprechende Wert für NADH: £ = 3,3 cm /u Mol). Schließlich ist das Verfahren auch gut reproduzierbar und die Standardabweichung beträgt bei Messungen in Serum nur 2 $ gegenüber 8—10 9^ beim bekannten erizymatischen Verfahren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Reagentien-Zusammenstellung zur Durchführung des erfindungsgeraäßen Verfahrens. Diese Keagentien-Zusammenstellung besteht aus

a) 0,1 - 0,2 M Paffer, pH 9 - 9,5

b) APAD und

c) Sorbit-Dehydrοgenäse, nebeneinander in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.

Vorzugsweise besteht der Puffer der Reagentien-Zusammenstellung aus 0,2 M Diäthanolamin-Puffer, pH 9,5.

Nach einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Reagentien-Zusammenstellung liegen Puffer und APAD bereits in vorgemischtem Zustand vor, und zwar zweckmäßig als vor Gebrauch mit Wasser aufzulösende Pestsubstanz. Es ist aber auch möglich, Puffer und APAD in Form einer wässrigen Lösung vorzusehen, die in diesem Fall ein Konservierungs- bzw» Stabilisierungsmittel wie z.B. Azid enthalten muß. Ein Zusatz von Azid oder einem anderen Konservierungsmittel kann aber auch bei getrennter Zurverfügungstellung von Puffer und APAD oder bei Anwendung einer trockenen Mischung dieser beiden Substanzen vorgesehen werden.

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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung Vielter;

Beispiel 1

Durchführung des Verfahrens '

Verwendete Reagentien:

a) Diäthanolamin-Puffer, 0,2 M; pH = 9,5 (Lösung "bei +4⁰C 6 Monate haltbar)

b) Acetylpyridin-adenin-dinucleotid, 15 mM . (lösung bei +4⁰G 4 Wochen haltbar)

c) Sorbit-Dehydrogenase (5 mg/ml), als Lyophilisat (Handelspräparat 12 Monate haltbar) (lösung bei +4⁰C 2 Wochen haltbar)

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d) Zusätzlich bei biologischem Untersuchungsmaterial 1 N Perchlorsäure«

1 ml Serum wird mit 1 ml 1 N Perchlorsäure enteiweißt, der ITiederschlag 10 Min. ab25entrifugiert und der Überstand zur XyIit-BeStimmung verwendet.

Uicht biologische Proben, z.B. Lebensmittel oder Infusionslösungen brauchen nicht enteiweißt werden,' Feste Proben werden mit Wasser extrahiert und flüssige Proben eventuell verdünnt. Die zum Testansatz"verwendete Probelösung darf bei den unten angegebenen Reagentien-Konzentrationen nicht mehr als 0,2 g Xylit/l enthalten.

Pur jede Testreihe wird ein Leerwert mit bidest.,Wasser. statt Probelösung mitgeführt. Die Messung erfolgt im Photometer bei Wellenlänge 366 nra und Zimmertemperatur (20 25°C).

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In Küvetten werden pipettiert:

Diäthanolamin-Puffer (a) APAD (b)
bidest. Wasser
xylithaltige Lösung

dann wird gemischt und die Extinktion

wird

SDH-Lösung (c) 0,05 ml 0,05 ml

zugesetzt, gemischt und nach 60 Min. die Extinktion E₂ abgelesen. In 5 min-Abständen wird der Stillstand der Reaktion überprüft und gegebenenfalls die Extinktion E₂ auf die Zeit der Enzym-Zugabe extrapoliert.
Δ E = (E₂ - E₁)P₂₁₀₁₃₆ - (E₂ - E₁

Leerwert	Probe
2,0 ml	2,0 ml
0,1 ml	0,1 ml
0,1 ml	-
-	0,1 ml
E1 abgelesen.	Dann

Da der Extinktionskoeffizient von APAD bei 366 mn 9,0 cm //Vl Mol, das Molekulargewicht von Xylit 152 beträgt, gilt unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors 2 durch die Enteiweißung:

Δ E . 2.25 . 1S2 . 2 . 100 _{= mg Xylit} / _{100 ml}

9 . 1 .0.1 . 1000

Beispiel 2

P_Leagentien- Zusammenstellung

Flasche -1: 100 ml 0,2 M Diäthanolamin-Puffer, pH = 9,5, konserviert mit 10 mg ITa-Azid /100 ml.

Inhalt der Flasche 1 ist unverdünnt zu verwenden (bei +4⁰C ein Jahr haltbar).

Flasche 2: 40 mg Acetylpyridin-adenin-dinucleotid. Inhalt der Flasche 2 ist mit 4 ml bidest. V/asser zu lesen (bei +4 C vier v/ochen haltbar).

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Flasche 3i 5 mg Sorfcit-Iiehydrogenase Inhalt der Flasche 3 ist mit 1 ml "bidest. Wasser zu lösen (bei +4⁰C zwei Wochen halfbar).

Ausreichend für ca. 20 Bestimmungen entsprechend Beispiel 1.

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Claims (7)

Patentansurüche

1. Verfahren zur Bestimmung von Xylit durch enzymatische Dehydrierung mit Sorbit-Dehydrogenäse und einem Dehydrierungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß als Dehydrierungsmittel 3-Acetylpyridin-adenin-dinucleotid verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß "bei W einem pII-Ytert zwischen 8,7 und 10, "besonders zwischen 9 und 9,5 gearbeitet wird.

5· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß 0,02 - 0,3 M, besonders 0,1 - 0,2 M Natrium-pyrophosphat-, Diäthanolamin- oder Veronal-Puffer verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung durch Kessung der Extinktionsdifferenz im Ultravioletten, besonders bei 366 nm durchgeführt wird.

5. Reagentien-Zusammenstellung zur Durchführung des Verfahrens α nach Anspruch 1 bis 4, bestehend aus

a) 0,1 - 0,2 M Puffer pH 9 - 9,5,

b) APAD, ·

c) Sorbit-Dehydrogenase nebeneinander in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.

6. Reagentien-Zusammenstellung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus 0,2 M Diäthanolamin-Puffer pH 9,5 besteht.

7. Reagentien-Zusammenstellung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil a) und/oder b) zusätzlich As id enthält.

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