DE19955352A1

DE19955352A1 - Detecting antimicrobial substances, comprises using Streptococcus proteins

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Publication number: DE19955352A1
Application number: DE19955352A
Authority: DE
Inventors: Regine Hakenbeck
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-11-17
Filing date: 1999-11-17
Publication date: 2001-08-02

Abstract

The use of the gene products FibA and/or FibB of the genes fibA and/or fibB from Streptococcus pneumoniae or its mutants for detecting antimicrobial substances, is new, where the interaction of the gene product with the potential antimicrobial can be carried out in vivo or in vitro. Independent claims are also included for the following: (1) Streptococcus with mutations in their penicillin-binding proteins caused by mutated gene fibA and/or fibB, which makes the bacterium resistant to penicillin; (2) a nucleotide sequence of gene fibA* (225 nucleotide sequence given in the specification); and (3) a nucleotide sequence for gen fibB* (245 nucleotide sequence given in the specification).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren und Proteine aus Streptococcus und deren Verwendung zum Auffinden antimi krobiell wirksamer Substanzen.The present invention relates to nucleic acids and proteins from Streptococcus and their use for finding antimi krobiell effective substances.

Das Bakterium Streptococcus pneumoniae gehört zu den grampo sitiven Bakterien. Diese verfügen über eine vielschichtige Murein-Zellwand, bei der die einzelnen Schichten des Mureins miteinander verbunden sind. Die Verbindung erfolgt über Inter peptidketten, welche die Tetrapeptidseitenketten der im Murein enthaltenen Muraminsäuren miteinander verknüpfen. Bei Staphy lococcus aureus, einem weiteren Gram-positiven Bakterium, be steht die Interpepidkette aus Pentaglycin. Bei Streptococcus pneumoniae hingegen besteht die Interpeptidbrücke aus den Di peptiden L-Alanin-L-Alanin oder L-Alanin-L-Leucin. Am Mecha nismus zur Bildung der Murein-Zellwand greifen verschiedene Antibiotika wie β-Lactam- und Glycopeptidantibiotika an. Die Hemmung der Zellwandsynthese durch diese Substanzen führt in der Regel zur Induktion autolytischer Enzyme und somit zu ei ner raschen Zellyse.The bacterium Streptococcus pneumoniae belongs to the grampo sititive bacteria. These have a complex layer Murein cell wall, where the individual layers of murein connected to each other. The connection is via Inter peptide chains containing the tetrapeptide side chains in the murein linking muraminic acids together. At Staphy lococcus aureus, another Gram-positive bacterium, be the interpepid chain is pentaglycine. In Streptococcus pneumoniae, on the other hand, consists of the interpeptide bridge of the di peptides L-alanine-L-alanine or L-alanine-L-leucine. At the Mecha The mechanisms for forming the murein cell wall are different Antibiotics such as β-lactam and glycopeptide antibiotics. The Inhibition of cell wall synthesis by these substances leads to the rule for the induction of autolytic enzymes and thus to egg rapid cell lysis.

Penicillin beispielsweise bindet an Zielproteine, die soge nannten Penicillin bindenden Proteine (PBP) und inhibiert die se. Die PBPs sind diejenigen Enzyme, die an der Verlängerung der Zuckerketten des Mureins (in Transglycosilierungsreaktio nen) und auch an der Quervernetzung des Mureins (in Transpep tidierungsreaktionen) beteiligt sind. Zwei bei Staphylococcus aureus gefundene Proteine, FemA und FemB, sind beispielsweise an der Biosynthese der Penta-Glycin Interpeptidbrücke des Mu reins in der Bakterienzellwand beteiligt.For example, penicillin binds to target proteins that are soge called penicillin binding proteins (PBP) and inhibits the se. The PBPs are the enzymes involved in the extension the sugar chains of murein (in transglycosylation reaction and also on the cross-linking of murein (in Transpep tidierungsreaktionen) are involved. Two in Staphylococcus aureus-found proteins, FemA and FemB, are for example on the biosynthesis of the penta-glycine inter peptide bridge of Mu involved in the bacterial cell wall.

Resistenzen gegen die genannten Antibiotika können zum einen durch die Bildung von Beta-Lactamasen entstehen, welche Peni cillin und ähnlich (mit einem Beta-Lactam-Ring) strukturierte Antibiotika spalten können; zum anderen können die PBPs so mutieren, daß sich ein Antibiotikum nicht mehr an sie anlagern kann.Resistance to the mentioned antibiotics can on the one hand caused by the formation of beta-lactamases, which Peni cillin and similar (with a beta-lactam ring) structured Can split antibiotics; on the other hand, the PBPs can do that mutate that an antibiotic no longer attach to them can.

Streptococcen kommen als Erreger von Lungenentzündung, Sinusi tis, Mittelohrentzündung, Meningitis, Scharlach usw. eine gro ße klinische Bedeutung zu. Da Penicillin-resistente und mul tiple Antibiotika-resistente Stämme gerade von Streptococcus pneumoniae weltweit in zunehmendem Maße auftreten, stellt das Auffinden neuer antimikrobieller Wirkstoffe gegen diese Orga nismen einen großen Bedarf dar.Streptococci come as a causative agent of pneumonia, Sinusi tis, otitis media, meningitis, scarlet fever, etc. a large clinical significance. Because penicillin-resistant and mul tiple antibiotic-resistant strains of Streptococcus pneumoniae is increasingly occurring worldwide Finding new antimicrobial agents against this organ a great need.

Um die Eignung neuer Substanzen als Antibiotika zu testen, sind aufwendige Versuche mit Bakterienkulturen notwendig, wo bei die möglicherweise geringere Sensitivität gegenüber einer prinzipiell geeigneten Substanz, aber auch eine sehr niedrige Konzentration der zur Verfügung stehenden Substanz, die Auf findung zusätzlich erschweren kann oder sogar unmöglich macht.To test the suitability of new substances as antibiotics, elaborate experiments with bacterial cultures are necessary where at the possibly lower sensitivity to one in principle suitable substance, but also a very low Concentration of the available substance, the up makes it even more difficult or even impossible.

Es wäre daher wünschenswert, wenn das Auffinden neuer antimi krobiell wirkender Substanzen einfacher möglich wäre. Der vor liegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Systeme bereitzustellen, um neue Antibiotika rasch und einfach auf finden zu können.It would therefore be desirable if finding new antimi krobiell acting substances would be easier possible. The before underlying invention is therefore the object of systems to provide new antibiotics quickly and easily to be able to find.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung des Genproduk tes FibA oder/und FibB gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 1, den Streptococcus-Stamm gemäß dem unabhängigen Patentan spruch 6, dessen Verwendung nach dem unabhängigen Patentan spruch 12, die Nukleotidsequenzen gemäß den unabhängigen Pa tentansprüchen 13 und 16, sowie die Aminosäuresequenz gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 19. Weitere vorteilhafte Aus gestaltungen, Aspekte und Details der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen, der Beschreibung und der beigefügten Zeichnung. This problem is solved by the use of the gene product FibA or / and FibB according to the independent claim 1, the Streptococcus strain according to the independent patent claim 6, its use according to the independent patent claim 12, the nucleotide sequences according to the independent Pa tentansprüchen 13 and 16, and the amino acid sequence according to the independent claim 19. Further advantageous Aus Forms, aspects and details of the invention will become apparent From the dependent claims, the description and the attached drawing.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß zwei bei Strepto coccus pneumoniae vorkommende, zu FemA und FemB und anderen zu derselben Protein-Familie gehörigen Proteinen homologe Protei ne, FibA und FibB genannt, als Modellsysteme zur Auffindung neuer, antimikrobiell wirksamer Substanzen in verschiedener Weise höchst geeignet sind. Die Sequenzen der beiden in der vorliegenden Erfindung verwendeten Gene sind bestimmt worden und zugänglich bei "The Institute for Genomic Research" unter dem URL http:/ /www.tigr.org.It was surprisingly found that two in Strepto coccus pneumoniae occurring, to FemA and FemB and others too protein proteins homologous to the same protein family ne, called FibA and FibB, as model systems for detection new, antimicrobially active substances in various Way most suitable. The sequences of the two in the Genes used have been determined and accessible at "The Institute for Genomic Research" at the URL http://www.tigr.org.

Die Erfindung kann hierbei in zwei Teilbereiche gegliedert werden. Zum einen können die Proteine FibA und FibB direkt verwendet werden, um eine Interaktion mit einer potentiell antimikrobiellen Substanz nachzuweisen. Diese Interaktion kann intracellulär oder extracellulär verfolgt werden. Zum Anderen kann ein mutiertes fibA* oder fibB* Gen in Bakterienzellen durch Ersetzen des Wilddtyp-Gens konstruiert werden, wo es eine Hypersensitivität gegenüber Beta-Lactamantibiotika ver mitteln kann.The invention can be divided into two subregions become. For one, the proteins FibA and FibB can be direct used to interact with a potential prove antimicrobial substance. This interaction can be followed intracellularly or extracellularly. On the other hand can be a mutated fibA * or fibB * gene in bacterial cells be constructed by replacing the wild-type gene where it hypersensitivity to beta-lactam antibiotics ver can mediate.

Bezüglich des ersten Aspekts ist die Erfindung daher zuerst gerichtet auf die Verwendung des Genproduktes FibA oder/und FibB der Gene fibA oder/und fibB aus Streptococcus pneumoniae oder Mutanten davon zum Auffinden antimikrobiell wirkender Substanzen, wobei eine Interaktion des Genproduktes mit einer potentiell antimikrobiell wirkenden Substanz in vivo oder in vitro festgestellt wird.With regard to the first aspect, the invention is therefore first directed to the use of the gene product FibA or / and FibB of the genes fibA or / and fibB from Streptococcus pneumoniae or mutants thereof for finding antimicrobial Substances, wherein an interaction of the gene product with a potentially antimicrobial substance in vivo or in is determined in vitro.

Eine Anwendung in vivo, also in Bakterienzellen, basiert dabei auf dem Nachweis der Interaktion von FibA oder/und FibB mit einer Substanz intracellulär oder extracellulär; und vorzugs weise mit FibA oder/und FibB, welches in den Bakterienzellen synthetisiert worden ist. Bei einer Anwendung in vivo wird vorzugsweise mit gereinigten Proteinen gearbeitet.An application in vivo, ie in bacterial cells, is thereby based on the evidence of the interaction of FibA or / and FibB with a substance intracellular or extracellular; and preferential with FibA or / and FibB present in the bacterial cells has been synthesized. When used in vivo will preferably worked with purified proteins.

Expressionssysteme, mit denen die Proteine in hinreichender Menge produziert werden können, sind dem Fachmann ebenso be kannt wie geeignete Reinigungsverfahren. Hierbei kann bei spielsweise die cDNA der Gene auf einem Expressionsvektor vor liegen, der in geeignete Zellen eingeschleust wird. Es ist möglich, die Proteine, beispielsweise durch Einführen geeigne ter DNA-Sequenzen, als sekertierte Proteine herzustellen, so daß sie in das Medium abgegeben werden und ohne Zellaufschluß dargestellt werden können.Expression systems with which the proteins in sufficient Amount can be produced, the expert are equally be knows how suitable cleaning methods. This can be at for example, the cDNA of the genes on an expression vector lie, which is introduced into suitable cells. It is possible, the proteins, for example by insertion geeigne ter DNA sequences to produce as sekertierte proteins, so that they are released into the medium and without cell disruption can be represented.

Dem Fachmann stehen verschiedenste Methoden zur Beobachtung von Interaktionen zur Verfügung.A person skilled in the art has various methods of observation of interactions available.

Es wird beispielsweise bevorzugt, daß die Interaktion eine Anlagerung des Genproduktes an die potentiell antimikrobiell wirkende Substanz ist. Die Interaktion kann auch in einer da durch erfolgenden Modifikation von FibA oder/und FibB beste hen.For example, it is preferred that the interaction be one Attachment of the gene product to the potentially antimicrobial acting substance is. The interaction can also be in one there by successful modification of FibA or / and FibB best hen.

Besonders bevorzugt werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in denen das Genprodukt aus einer Nukleotidsequenz translatiert ist, die in SEQ Nr. 1 für fibA oder fibB, in SEQ Nr. 2 für fibA* oder in SEQ Nr. 3 für fibB* wiedergegeben ist.Embodiments of the present invention are particularly preferred Invention in which the gene product from a nucleotide sequence in SEQ. ID. 1 for fibA or fibB, in SEQ No. 2 for fibA * or in SEQ No. 3 for fibB *.

Eine Interaktion in vitro kann beispielsweise durch Mischen des Genproduktes FibA oder/und FibB mit einer potentiell anti mikrobiell wirkenden Substanz herbeigeführt werden. Gerade bei Untersuchungen in vitro, d. h. in einer gut definierten Umge bung wie einem Reaktionsgefäß oder auf einer geeigneten Chip- Oberfläche, kann eine Interaktion der erfindungsgemäß verwen deten Genprodukte besonders einfach gemessen werden.For example, an interaction in vitro can be achieved by mixing of the gene product FibA or / and FibB with a potentially anti microbially acting substance are brought about. Especially at In vitro studies, d. H. in a well defined environment such as a reaction vessel or on a suitable chip Surface, can use an interaction of the invention gene products are particularly easy to measure.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Mutanten der Gene fibA bzw. fibB, beispielsweise die in den SEQ-Nr. 2 und 3 angegebenen Mutanten fibA* und fibB*, welche zu verkürzten Genprodukten führen, in penicillinresistente Stämme von Strep tococcus pneumoniae eingebracht, welche veränderte Peniccil lin-bindende Proteine besitzen. Die Mutationen an fibA und fibB werden durch Deletionen, Insertionen, Inversionen, Punkt- oder frame-shift-Mutationen oder bevorzugt Insertions-Duplika tionen erreicht, die zu einer vorzeitigen Termination der Tra nslation und damit verkürzten Genprodukten führten. Unerwarte terweise wurde dabei gefunden, daß die solcherart erzeugten Bakterien nicht mehr resistent gegenüber Penicillin waren, sondern im Gegenteil eine erhöhte Sensibilität für Penicillin aufwiesen. Damit steht ein System zur Verfügung, mit dem über die Beobachtung von Wachstumshemmung schon bei niedrigen Kon zentrationen an einer zu testenden Substanz deren Potential als antimikrobiell wirksame Substanz bestimmt werden kann.The inventors of the present invention have mutants of Gene fibA or fibB, for example, those shown in SEQ. 2 and 3 indicated mutants fibA * and fibB *, which were to be shortened Gene products into penicillin-resistant strains of Strep tococcus pneumoniae introduced which altered peniccil possess lin-binding proteins. The mutations on fibA and fibB are identified by deletions, insertions, inversions, or frame-shift mutations or preferably insertion duplicons achieves premature termination of the tra nslation and shortened gene products. Unerwarte It was found that it was produced in such a way Bacteria were no longer resistant to penicillin, but on the contrary an increased sensitivity to penicillin exhibited. Thus a system is available with which over the observation of growth inhibition even at low Kon concentrations on a substance to be tested its potential can be determined as antimicrobially active substance.

Die Erfindung ist daher ebenfalls gerichtet auf einen Strepto coccus mit einer Mutation in einem Penicillin bindenden Pro tein, die eine Penicillin-Resistenz vermittelt, der gekenn zeichnet ist durch ein Gen fibA und/oder Gen fibB, welche je weils gegenüber dem Wildtyp mutiert sind.The invention is therefore also directed to a Strepto coccus with a mutation in a penicillin-binding pro which mediates penicillin resistance, which is is characterized by a gene fibA and / or gene fibB, which ever because mutated to the wild type.

Die Mutation kann eine Trunkation des verwendeten Gens sein, bei der das Gen als solches verkürzt ist. Die Mutation kann allerdings auch eine Mutation sein, die zu einem verkürzten Polypeptid führt, indem durch die Einführung von Punktmutatio nen vorzeitige Stopcodons eingeführt werden.The mutation may be a truncation of the gene used, in which the gene is shortened as such. The mutation can but also a mutation that leads to a shortened Polypeptide performs by adding point mutation premature stop codons are introduced.

Auch andere Arten von Mutationen, die zu dem gewünschten Ef fekt einer Hypersensitivität führen, sind von der Erfindung miterfasst, wie z. B. Mutationen in den Genen caiH/CiaR in Kom bination mit Mutationen in Penicillin-Target-Genen, ähnlich wie in Fall der oben beschriebenen fib-Derivate. Generell ist davon auszugehen, daß Mutationen in Penicillin-Target-Genen (PBP), die zu Penicillin-Resistenz beitragen, auf eine ganze Reihe von anderen Genprodukten angewiesen sind, um mögliche Defekte, die durch solche veränderten PBP verursacht werden, auszugleichen. Solche Genprodukte stellen z. B. FibA, FibB, CiaR und CiaH dar.Other types of mutations leading to the desired Ef cause hypersensitivity are of the invention included, such. B. Mutations in the genes caiH / CiaR in Kom similar to mutations in penicillin target genes as in the case of the fib derivatives described above. Generally is assume that mutations in penicillin target genes (PBP), which contribute to penicillin resistance, to a whole Range of other gene products are dependent on possible Defects caused by such altered PBP compensate. Such gene products provide z. FibA, FibB, CiaR and CiaH

Vorzugsweise entspricht das mutierte fibA Gen in seiner Se quenz der Sequenz der SEQ Nr. 2 oder weicht davon in einer Anzahl von Nukleotiden ab, wobei die Anzahl zumindest 1 Nu kleotid und höchstens soviele Nukleotide beträgt, daß die Fun ktion des bei Translation resultierenden Polypetids gegenüber dem aus der SEQ Nr. 2 resultierenden Polypeptid nicht maßgeb lich verändert sind. Wird als Gen ein mutiertes fibB verwen det, so entspricht dieses vorzugsweise in seiner Sequenz der Sequenz der SEQ Nr. 3 oder weicht davon in einer Anzahl von Nukleotiden ab, wobei die Anzahl zumindest 1 Nukleotid und höchstens soviele Nukleotide beträgt, daß die Funktion des bei Translation resultierenden Polypetids gegenüber dem aus der SEQ Nr. 3 resultierenden Polypeptid nicht maßgeblich verändert sind. Maßgeblich für die Tauglichkeit eines erfindungsgemäßen Streptococcus-Stamms ist, daß durch die in zumindest einem der beiden Gene fibA und/oder fibB eingeführte Mutation(en) eine Hypersensitivität für Penicillin erzielt werden kann, um ein geeignetes Testsystem zu erreichen. Abweichungen von den ange gebenen Sequenzen sind dabei durchaus möglich, sofern die Ei genschafts-Bedingung erfüllt bleibt. Eigenschaften in diesem Sinne können beispielsweise die Ladungsbedingungen des Gen produkts oder seine dreidimensionale Struktur und evtl. Quer vernetzungen sein. Es ist daher nicht nur möglich, andere Mu tationen von fibA bzw. fibB zu verwenden, sondern auch homolo ge Gene aus anderen Bakterien-Species, sofern sich diese für den Erfindungszweck als geeignet erweisen.Preferably, the mutated fibA gene corresponds to its Se sequence of SEQ ID NO: 2 or deviates from it in one Number of nucleotides, the number being at least 1 nu and at most as many nucleotides that the Fun tion of the translation-resultant polypeptide the polypeptide resulting from the SEQ No. 2 not relevant changed. Will use a mutated fibB as gene det, it preferably corresponds in its sequence to the Sequence of SEQ No. 3 or deviates from it in a number of Nucleotides, the number being at least 1 nucleotide and at most as many nucleotides that the function of the Translation resulting polypetide compared to that from the SEQ ID 3 resulting polypeptide not significantly changed are. Relevant for the suitability of an inventive Streptococcus strain is characterized by that in at least one of Both genes fibA and / or fibB introduced mutation (s) Hypersensitivity to penicillin can be achieved to achieve a suitable test system. Deviations from the ange given sequences are quite possible, provided the egg conditionality remains fulfilled. Properties in this For example, the charge conditions of the gene product or its three-dimensional structure and possibly cross be networking. It is therefore not only possible to other Mu tions of fibA or fibB, but also homolo Genes from other bacterial species, if they are for prove the purpose of the invention to be suitable.

Der zum Einsatz kommende Stamm von Streptococcus kann aus ver schiedenen Streptococcus-Species erhalten werden. Die Bestim mung der Sequenzen der beiden Gene fibA und fibB hat ergeben, daß diese eine große Homologie zu anderen, verwandten Protei nen aufweisen und daher als Modellsystem geeignet sind. Dies prädestiniert sie einerseits dafür, auch in andere Streptococ cus-Species als den Ausgangsstamm, in das Genom integriert zu werden, andererseits kann die Erfindung auch erfolgreich mit den sehr ähnlichen Genen von anderen Species durchgeführt wer den. Vorzugsweise wird allerdings ein Streptococcus pneumoniae verwendet werden, da dieser die größte klinische Bedeutung hat. The strain of Streptococcus used can be ver different Streptococcus species are obtained. The Bestim tion of the sequences of the two genes fibA and fibB has revealed that this is a great homology to other, related Protei NEN and therefore are suitable as a model system. This on the one hand predestined her for it, also in other Streptococ cus species as the parent strain, integrated into the genome too On the other hand, the invention can also be successful with the very similar genes of other species the. Preferably, however, is a Streptococcus pneumoniae be used because of this the greatest clinical significance Has.

Die eingeschleuste genetische Substanz, beispielsweise Muta tionen von fibA oder fibB aufweisende Sequenz, kann auf einem extrachromosomalen DNA-Stück wie einem Plasmid liegen, kann jedoch auch in das Bakterienchromosom integriert vorliegen.The introduced genetic substance, for example Muta tions of fibA or fibB containing sequence, can be on one extrachromosomal pieces of DNA such as a plasmid can lie but also integrated into the bacterial chromosome.

Die Erfindung ist ebenfalls gerichtet auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Streptococcus zum Auffinden antimikrobiell wirkender Substanzen, wobei nach Zugabe einer potentiell anti biotisch wirkender Substanz eine Wachstumshemmung des Bakteri ums festgestellt wird.The invention is also directed to the use of Streptococcus according to the invention for finding antimicrobial acting substances, wherein after adding a potentially anti biotic substance inhibits growth of the bacterium is determined.

Während bei Untersuchungen von Interaktionen direkt am Protein sowohl ein Wildtyp-Gen (fibA oder fibB) als auch Mutanten (z. B. fibA* oder fibB*) in Frage kommen, sind für die Verwen dung zur Herstellung der Streptococcus-Varianten Mutationen der Gene notwendig.While in studies of interactions directly on the protein both a wild type gene (fibA or fibB) and mutants (eg fibA * or fibB *) are suitable for use for the production of Streptococcus mutations genes necessary.

Die Erfindung ist daher auch gerichtet auf eine Nukleotidse quenz des Gens fibA* oder fibB* gemäß der SEQ Nr. 2 bzw. SEQ Nr. 3 oder davon in einem oder mehreren Nukleotiden abwei chend.The invention is therefore also directed to a nucleotide sequence of the gene fibA * or fibB * according to SEQ ID NO: 2 or SEQ No. 3 or thereof in one or more nucleotides accordingly.

Die Abweichung kann auch oder zusätzlich in einer Verlängerung oder Verkürzung der exprimierbaren Nukleotidsequenz bestehen. Hierbei kann eine Insertions- bzw. Deletionsmutation die Länge des Genes als solches verlängern. Es kann jedoch ebenso durch das Entfernen oder Einfügen von Stopcodons der Kettenabbruch in beide Richtungen verschoben werden.The deviation may also or in addition to an extension or shortening of the expressible nucleotide sequence. In this case, an insertion or deletion mutation can be the length of the gene as such extend. It can, however, also through removing or inserting stop codons of the chain termination be moved in both directions.

Die Erfindung ist schließlich auch gerichtet auf eine Amino säuresequenz, welche sich durch Translation des Leserasters der SEQ Nr. 2 oder SEQ Nr. 3 oder einer davon in einer Anzahl Nukleotiden abweichenden Sequenz ergibt, wobei die Anzahl zu mindest 1 Nukleotid und höchstens soviele Nukleotide beträgt, daß Eigenschaften des bei Translation resultierenden Polype tids gegenüber dem aus der SEQ Nr. 2 oder SEQ Nr. 3 resultie renden Polypeptid nicht maßgeblich verändert sind. Zur Ab schätzung der Eigenschaften wird auf das oben Gesagte verwie sen und inhaltlich Bezug genommen.Finally, the invention is also directed to an amino acid sequence resulting from translation of the reading frame SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or one of them in a number Nucleotides differing sequence, where the number to is at least 1 nucleotide and at most as many nucleotides, that properties of the polypeptide resulting from translation tids over that resulting from SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 renden polypeptide are not significantly changed. To the Ab Estimation of the properties is referred to the above and content.

Bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell kulturen), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig wurden am 28. Ok tober 1999 gemäß Budapester Vertrag die Mutantenstämme hinter legt:
Streptococcus pneumoniae R6_TB6-CCCB-fibA DSM 13125
Streptococcus pneumoniae R6_TB6-CCCB-fibB DSM 13126At the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, the mutant strains were deposited on October 28, 1999, according to the Budapest Treaty:
Streptococcus pneumoniae R6 _TB6- CCCB-fibA DSM 13125
Streptococcus pneumoniae R6 _TB6- CCCB-fibB DSM 13126

Die Erfindung wird weiter mit Bezug auf die Figuren beschrie ben.The invention will be further described with reference to the figures ben.

Fig. 1: Übersicht über den genomischen Bereich, in dem die beiden für die Erfindung verwendeten Gene fibA und fibB liegen. Beide Wildtypformen weisen eine Länge des Leserasters von ca. 1200 Nukleotiden auf. Die Nukleotid-Sequenzen der beiden Wildtypgene sind in der SEQ Nr. 1 wiedergegeben. Durch Mutation wurden die beiden beispielhaften Mutanten fibA* und fibB* erhalten, die eine Verkürzung des Leserasters auf weisen. So führt bei fibA eine Inser tions-Duplikation zu einer Termination des FibA Pro teins nach Aminosäure Lys205. FIG. 1: Overview of the genomic region in which the two genes fibA and fibB used for the invention are located. Both wildtype forms have a reading frame length of about 1200 nucleotides. The nucleotide sequences of the two wild-type genes are shown in SEQ No. 1. By mutation, the two exemplary mutants fibA * and fibB * were obtained, which show a shortening of the reading frame. In fibA, an insertion duplication leads to a termination of the FibA protein after the amino acid Lys205.

Fig. 2A: DNA-Sequenz und abgeleitete Peptidsequenz von fibA/fibB [SEQ Nr. 1] FIG. 2A: DNA sequence and deduced peptide sequence of fibA / fibB [SEQ No. 1]

Fig. 2B: Mutantenderivate von FibA (FibA*) [SEQ Nr. 2] und FibB (FibB*) [SEQ Nr. 3] FIG. 2B, mutant derivatives of fiba (fiba *). [SEQ No. 2] and Fibb (Fibb *) [SEQ # 3.]

Die Erfindung wird weiter anhand des Beispiels beschrieben.The invention will be further described by way of example.

example

Verschiedene β-Lactamantibiotika resistente Stämme von Streptococcus wurden als Vergleich mit dem Antibiotikum Oxa cillin behandelt. Diese Stämme sind in Hakenbeck et al., J. Bacteriol. 180, S. 1831-1840 (1998) beschrieben. Weiterhin wurden Streptococcus-Stämme, in die ein mutiertes fibA*- oder fibB*-Gen eingebracht worden war, als erfindungsgemäße Bei spiele verwendet. Es wurde jeweils festgestellt, ab welchen Konzentrationen an Oxacillin Wachstumshemmungen auftreten (mi nimale Hemmkonzentration, MHK). Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 1 dargestellt:
Various β-lactam antibiotic resistant strains of Streptococcus were treated as a comparison with the antibiotic Oxa cillin. These strains are described in Hakenbeck et al., J. Bacteriol. 180, pp. 1831-1840 (1998). Furthermore, Streptococcus strains into which a mutated fibA * or fibB * gene had been introduced were used as inventive examples. In each case it was determined from which concentrations of oxacillin growth inhibition occurs (minimum inhibitory concentration, MIC). The results of this experiment are shown in Table 1:

Stammtribe MHK (Mikrogramm/Milliliter an Oxacillin)MIC (micrograms / milliliter of oxacillin) R6R6 0,1250,125 R6/fibA*R6 / FIBA * 0,090.09 R6-TCCPR6-TCPP 88th R6-TCCP/fibA*R6-TCPP / FIBA * 0,38-0,50.38 to 0.5 R6-TCCBR6-TCCB 32-4832-48 R6-TCCB/fibB*R6-TCCB / Fibb * 0,5-0,750.5-0.75

Es zeigt sich, daß die erfindungsgemäß veränderten Streptococ cus-Stämme eine erheblich gesteigerte Sensitivität gegenüber dem verwendeten Antibiotikum aufweisen.It turns out that the invention changed Streptococ cus strains are significantly more sensitive to have the antibiotic used.

Für die Messung wurden als Vergleich jeweils resistente Stämme benützt, da der Unterschied der MHK, und damit die Emp findlichkeit, mit der Stamm auf ein Antibiotikum reagiert, wesentlich deutlicher ist als würde mit dem sensitiven Stamm verglichen, und somit ein Detektieren von potentiellen Anti biotika wesentlich einfacher ist.For comparison, resistant strains were used as a comparison used, since the difference of the MIC, and thus the Emp sensitivity with which strain responds to an antibiotic, is much clearer than would be with the sensitive strain compared, and thus detecting potential anti biotika is much easier.

Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene Ansätze zur Ver fügung, wie mit Hilfe von fibA und fibB bzw. Mutanten dieser Gene, neue antimikrobiell wirksame Substanzen gefunden werden können. Damit werden neue Wege zur Antibiotika-Entwicklung eröffnet.The present invention provides various approaches to Ver as with the help of fibA and fibB or mutants of these Genes, new antimicrobial substances can be found can. This will open new avenues for antibiotic development opened.

Claims

1. Use of the gene product FibA or / and FibB of the genes fibA or / and fibB from Streptococcus pneumoniae or Mu tantentates thereof for finding antimicrobial acting Substances, wherein an interaction of the gene product with a potentially antimicrobial substance in vivo or in vitro.

2. Use according to claim 1, characterized in that the interaction an attachment of the gene product to the is potentially antimicrobial substance.

3. Use according to claim 1 or 2, characterized net, that the interaction is a modification of FibA or / and FibB causes.

4. Use according to one of claims 1 to 3, characterized ge indicates that the gene product consists of a nucleotide SEQ ID NO. 1 for FibA or FibB, SEQ ID NO: 2 for mutated FibA (FibA *) or SEQ No. 3 for mutated FibB (FibB *), or from a nucleotide sequence derived from one of these Se differs in one or more nucleotides.

5. Use according to one of claims 1 to 4, characterized ge indicates that the interaction in vitro by mixing of the gene product FibA or / and FibB with a potential antimicrobial substance is brought about.

6. Streptococcus with a mutation in a penicillin binding protein that verifies penicillin resistance means characterized by at least one gene fibA and / or Gen fibB, which in each case opposite the wild type mu animals are.

7. Streptococcus according to claim 6, characterized that the mutation is a truncation of the gene.

8. Streptococcus according to claim 6, characterized that the mutation is a mutation that leads to a shortening th polypeptide leads.

9. Streptococcus according to any one of claims 6 to 9, characterized characterized in that the mutated fibA gene is the sequence of the SEQ ID. 2 or in number of nucleons tiden, wherein the number is at least 1 nucleotide and at most as many nucleotides that property against the polypetide resulting from translation above that from SEQ. 2 resulting polypeptide are not significantly changed.

10. Streptococcus according to any one of claims 6 to 10, characterized characterized in that the mutated fibB gene is the sequence of the SEQ ID NO: 3 or in a number of nucleotides which number is at least 1 nucleotide and höc at least as many nucleotides that properties of the upon translation, the resulting polypetide over the SEQ ID NO. 3 resulting polypeptide not measured are changed.

11. Streptococcus according to any one of claims 6 to 11, characterized characterized in that it is a Streptococcus pneumoniae.

12. Use of the streptococcus according to one of claims 6 to 11 for finding antimicrobial substances, wherein after adding a potentially antibiotic acting Substance a growth inhibition of bacteria is provided.

13. nucleotide sequence of the gene fibA * according to SEQ No. 2 or thereof deviating in one or more nucleotides.

14. Nucleotide sequence according to claim 13, characterized records that the deviation is in an extension or Shortening of the expressible nucleotide sequence is.

15. Nucleotide sequence of the gene fibB * according to SEQ No. 3 or thereof deviating in one or more nucleotides.

16. Nucleotide sequence according to claim 15, characterized records that the deviation is in an extension or Shortening of the expressible nucleotide sequence is.

17. Amino acid sequence, which is expressed by translation of Le serasters of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or one of them in a number of nucleotides different sequence where the number is at least 1 nucleotide and max at least as many nucleotides that properties of the upon translation, the resulting polypetide over the Polypep resulting from SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 are not significantly changed.