DE19938520A1 - Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelauskleidung nativer Blutgefäße oder im Gewebelabor endothelialisierter, künstlicher oder natürlicher Blutgefäße und Blutgefäßklappen, Herzhöhlen und Herzklappen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung für chirurgische Implantationszwecke entnommener, nativer Blutgefäße oder endothelialisierter künstlicher oder natürlicher Gefäßprothesen (1), Gefäßklappen, Herzklappen oder Herzhöhlen. Zur Qualitätskontrolle werden charakteristische und selektive metabolische Aktivitäten und/oder strukturelle Merkmale der an der jeweiligen Prothesenwand (2) aufgezüchteten Endothelschicht (3) und der Zellen (4) der tieferen Prothesenwandschichten (2) als Maß für die Vollständigkeit der Endothelialisierung erfaßt und quantifiziert.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelauskleidung nativer Blutgefäße oder im Gewebe­ labor mit einem aufgezüchteten Endothel versehener ("endo­ thelialisierter") künstlicher oder natürlicher Blutgefäße oder Blutgefäßklappen, Herzhöhlen und Herzklappen für chir­ urgische Implantationszwecke nach dem Oberbegriff des Pa­ tentanspruches 1.

Einhergehend mit der steigenden Lebenserwartung und der Häufigkeit von Herz- und Gefäßerkrankungen spielt der Er­ satz funktionsuntüchtiger Arterien und Herzklappen in der Chirurgie eine immer größere Rolle. Wenn dies irgendwie möglich ist, wird versucht, patienteneigene bzw. 'autologe' Blutgefäße für solche Zwecke zu rekrutieren, deren Ver­ pflanzung zwar keine operativen und/oder immunologischen Probleme bereitet, die aber nur begrenzt verfügbar sind. Außerdem kann deren Endothel krankheitshalber bzw. präpara­ tionsbedingt auch Schäden aufweisen.

Bei vielen Patienten sind die relativ wenigen, für derarti­ ge Zwecke prinzipiell überhaupt nur in Frage kommenden Blutgefäße (z. B. die Vena saphena magna, Vena saphena parva oder Arteria mammaria interna) durch Krankheiten (z. B. Va­ rikosis oder Ateriosklerosis) allerdings oft schon so stark alteriert, daß sie nicht mehr verwendet werden können. Au­ ßerdem wächst die Zahl der Patienten, die sich nach einer Jahre zurückliegenden ersten Gefäßersatz-Operation plötz­ lich dringend einer zweiten derartigen Therapie unterziehen müssen, für die aber ein autologer Gefäßersatz dann nicht mehr zur Verfügung steht. In dieser bedrohlichen Situation können bisher nur ein vollkommen prothetischer Gefäßersatz durch flexible Kunststoffprothesen (z. B. aus PTFE) oder kryopräservierte Fremdvenen ("Spendervenen") in Betracht gezogen werden. Leider haben solche Ersatzprodukte jedoch meist wegen rascher Thrombosierung nur eine sehr unbefrie­ digende Prognose.

Aus diesem Grunde wurde versucht, die Thrombogenität von prosthetischen Ersatzprodukten zu verringern. Alle Blutge­ fäße des Kreislaufsystems sind mit einer konfluenten En­ dothelschicht ausgekleidet, die mit aktiven und auch regu­ lierbaren physiologischen Funktionen die Bildung von Blut­ gerinnseln verhindern. Dazu gehören Blutplättchen (Thrombo­ zyten) hemmende Funktionen bzw. "antiaggregatorische" Funk­ tionen ebenso wie gerinnungshemmende bzw. "antikoagulatori­ sche" Mechanismen. Ein intaktes Endothel kann durch fi­ brinauflösende bzw. "profibrinolytische" Wirkungen bereits gebildete Gerinnungsthromben (Fibrinthromben) auch noch komplett wieder auflösen. Da diese Komplexität und Anpas­ sungsfähigkeit antithrombogener Wirkfaktoren durch ein Kunststoffmaterial in gar keiner Weise auch nur annähernd erreicht werden kann, bietet es sich an, vaskuläre En­ dothelzellen auf der inneren Oberfläche der zu implantie­ renden Gefäßprothesen anzusiedeln. Nach einer mehrtägigen Kultivationsphase können diese sich teilenden und vermeh­ renden Zellen schließlich die gesamte Oberfläche abdecken.

Aus immunulogischen Gründen müssen solche Endothelzellen aus dem Patienten selbst stammen (autologes Endothel). Die Isolierung entsprechender Zellen kann bereits ohne Schwie­ rigkeit routinemäßig und in ausreichender Menge selbst noch aus relativ kleinen, chirurgisch entnommenen Venen des Pa­ tienten erfolgen. Im Gewebelabor lassen sich die isolierten Zellen unter sterilen Bedingungen so erheblich vermehren, daß ca. 2 bis 3 Wochen später im Prinzip auch größere Ge­ fäßprothesen mit ihnen ausgekleidet werden können. Aller­ dings erhebt sich bei Gefäßprothesen aus künstlichen Mate­ rialien das besondere Problem, ausgesäte Endothelzellen an den Innenwandungen der Kunststoffrohre zuverlässig dauer­ haft zu verankern.

Kryopräservierte, von fremden Personen stammende Blutge­ fäßprothesen erhalten nach dem Auftauen zumindest noch be­ trächtliche Restmengen des Spenderendothels, das zur immu­ nologischen Abstoßung des gesamten Gefäßes führen kann. Erst kürzlich wurde im Hinblick auf die serienmäßige Ver­ wendung solcher Gefäße ein wichtiger Durchbruch erzielt, in dem es gelungen ist, das Spenderendothel selektiv und scho­ nend zu entfernen. Die luminale Oberfläche derartiger, "de­ endothelialisierter", zuvor kryopräservierter und aufgetau­ ter Gefäße eignet sich hervorragend zur dauerhaften Veran­ kerung und Auskleidung mit autologem, aus dem therapierten Patienten selbst stammenden Endothelgewebe ("autologes En­ dothel"). Eine vielversprechende erste Implantation eines solchen Gefäßes in eine Patientin wurde bereits publiziert (Lamm P., Juchem G., Weyrich P., Reichart B.: New alterna­ tive coronary bypass graft: First clinical experience with an autologous endothelialized cryopreserved allograft. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999, 117 (6), 1217-1219). Ent­ sprechende logistische Vorkehrungen vorausgesetzt, er­ scheint auf dieser Basis ein ganz neuer, hervorragend ge­ eigneter Gefäßersatz für entsprechende Problempatienten in naher Zukunft möglich zu sein.

Ein Problem besteht jedoch bis heute in der unbefriedigen­ den Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung der ausge­ wählten Ersatzprodukte. Dieses Argument gilt sowohl im Hin­ blick auf eventuell noch zur Verfügung stehendes autologes Gefäßmaterial, als auch für natürliche und artifizielle, endothelialisierte oder nicht endothelialisierte Blutgefä­ ße, Herzklappen, und Herzhöhlen unmittelbar vor ihrer Im­ plantation. Derzeit kann lediglich eine Überprüfung von endständig abgeschnittenen Segmenten bzw. Gewebeproben der zur Implantation vorgesehenen Ersatzmaterialien vorgenommen werden, wobei die Auswertung durch die übliche rasterelek­ tronenmikroskopische Inspektion erst ein bis zwei Tage spä­ ter erfolgen kann. Auf die wirkliche Intaktheit der dann bereits transplantierten Protheseteile kann also lediglich indirekt zurückgeschlossen werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung der oben bezeichneten Gefäß- oder Herzteile in ihrem gesam­ ten Ausmaß zu schaffen, durch das eine schnelle und über­ zeugende Dokumentation der Funktionalität ihrer Endothelbe­ schichtung selbst noch am Tage der chirurgischen Implanta­ tion möglich wird.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.

Der klinisch besonders bestechende Vorteil des erfindungs­ gemäßen Verfahrens besteht darin, daß ein spezifischer Nachweis der morphologischen und funktionellen Intaktheit der Endotheloberfläche der jeweils vorbereiteten Prothesen (s. oben!) schon kurz vor der Implantation in einen Patien­ ten getroffen werden kann. Dadurch werden möglicherweise schwerwiegende Komplikationen für den Patienten vermieden, die darin bestehen könnten, daß vorgesehene Ersatzprodukte mit einem unvollständigen Endothel transplantiert werden. Im Bedarfsfall muß die Kultivationsphase noch länger ausge­ dehnt werden, bis die relevante Oberfläche der Prothesen vollständig mit dem Patientenendothel bedeckt ist. So er­ gibt sich in jedem Fall die Möglichkeit, kryopräservierte Spendergefäße optimal zu nutzen. Auch im Hinblick auf durch Krankheit, Alter oder iatrogene Intervention vorgeschädigte autologe Gefäße sind ähnliche Überlegungen wichtig. Durch Einbringung solcher Gefäße in eine geeignete Endotheliali­ sierungsapparatur (DE-PS 199 18 558.1 A1) kann die Endothe­ lauskleidung noch vervollständigt und dann auf der Grundla­ ge der hiermit zum Patent angemeldeten Methodik qualitäts­ mäßig auch überprüft werden.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.

Im folgenden werden die Erfindungen und deren Ausgestaltun­ gen im Zusammenhang mit der Figur näher erläutert. Die Fi­ gur zeigt als exemplarisches Beispiel eine Gefäßprothese, die nur teilweise mit patienteneigenen Endothelzellen be­ schichtet wurde.

Im Gewebelabor werden aus einer kleinen, chirurgisch ent­ nommenen Vene des Patienten stammende Endothelzellen iso­ liert und so erheblich vermehrt, daß mit ihnen auch größere Gefäßprothesen 1 ausgekleidet werden können. Eine speziell entwickelte Beschichtungseinrichtung zur Auskleidung von Gefäßprothesen mit Endothelzellen ist in der Patentanmel­ dung DP 199 18 558.1 erläutert. Nach dem Aussäen der En­ dothelzellen und dem Anhaften derselben auf der Innenwan­ dung 2 der Gefäßprothese 1 vermehren sich die anhaftenden Endothelzellen 3 in einem geeigneten Kulturmedium derart, daß sie schließlich eine konfluente Endothelzellenschicht an der Innenwandung 2 der Gefäßprothese 1 bilden. Dabei wird Kulturmedium in der in DE-PS 199 18 558.1 A1 erläuter­ ten Weise über dicht mit den Enden der Gefäßprothese 1 ver­ bundene Kanülen (nicht dargestellt) durch das Gefäßlumen perfundiert.

Der Zielsetzung einer zuverlässigen und aussagekräftigen Qualitätskontrolle zur kompletten und funktionell aktiven Endothelialisierung von Gefäßprpthesen folgend, führten die folgenden Überlegungen zur Erfindung.

Endothelzellen 3 zeichnen sich physiologischerweise durch diverse antithrombotische Aktivitäten aus, durch die im in­ takten Blutkreislauf auch die Bildung von Fibrinthromben äußerst wirksam verhindert wird. Beispielsweise besteht ei­ ne besonders hervortretende, für die Zwecke der vorliegen­ den Erfindung bevorzugt einsetzbare Spezialität des En­ dothels bzw. der Endothelzellen 3 in allen Blutgefäßen des Körpers in der Aktivierung von Protein C, das ständig durch die Leber in das Blutplasma eingespeist wird. Die Zellen tieferer Schichten der Blutgefäßwand (z. B. Gefäßmuskelzel­ len und Perizyten) können Protein C nicht aktivieren. Ande­ rerseits zeichnen sich diese Zellen aber durch bestimmte prothrombogene Eigenschaften, z. B. eine besonders hohe Kon­ zentration an Gewebefaktor aus, dem heute eine entscheiden­ de Auslöserrolle bei der Entstehung intravasaler Fibrin­ thromben zugemessen wird. Diese prothrombogene Aktivität läßt sich an hochgereinigten gesunden arteriellen oder ve­ nösen Endothelzellen tierischen und menschlichen Ursprungs nicht nachweisen.

In der Figur symbolisieren durchgehende Pfeile, wie die En­ dothelzellen 3 Protein C aktivieren. Die punktierten Pfei­ le deuten dagegen an, daß die Zellen 4 der tieferen Blutge­ fäßwand Gewebefaktor entfalten. Je größer also diejenige Fläche der Innenwandung 2 der Gefäßprothese 1 ist, die nicht von Endothelzellen 3 bewachsen ist, desto größer ist die Menge des Gewebefaktors, der im Kontakt mit einer in die Gefäßprothese 1 gefüllten Inkubationslösung 5 steht.

Die Erfindung zielt nun darauf, daß anti- bzw. prothrombo­ gene Aktivitäten der in der Gefäßprothese 1 aufgezüchteten Zellen 3 der Endothelschicht bzw. der Zellen 4 der Ge­ fäßwand hochspezifisch zu erfassen und zu quantifizieren. Beispielsweise aus Protein C in Gegenwart von Thrombin an der Endotheloberfläche in einer entsprechend zusammenge­ setzten Inkubationslösung gebildetes aktives Protein C (PCA) kann nach der Entnahme der Inkubationslösung aus dem Lumen der Gefäßprothese 1 mit einem spezifischen, für pho­ tometrische Tests kommerziell erhältlichen Substrat inku­ biert werden. Die dabei proportional zur PCA-Menge gebilde­ te Produktmenge wird standardmäßig mit Hilfe optischer Meß­ geräte registriert. Im Prinzip analog verläuft der gegebe­ nenfalls zusätzlich vorzunehmende Nachweis von Gewebefaktor an der Innenwandund 2. In diesem Fall wird die Gefäßprothe­ se 1 mit einer die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X enthaltenden physiologischen Salzlösung inkubiert (z. B. das kommerziell erhältliche Präparat Fa. "Beriplex" der Cen­ teon, Marburg). Im Kontakt mit eventuell noch nicht vom ge­ züchteten Endothel abgedeckten Wandbereichen und dem dort befindlichen Gewebefaktor würde Faktor X zu Faktor Xa umge­ wandelt. Nach der Entnahme dieser Salzlösung und Zusatz der Gerinnungsfaktoren Va bzw. II kann dann in vitro unter re­ produzierbaren Inkubationsbedingungen Thrombin gebildet werden, das ein gleichzeitig vorhandenes spezifisches Sub­ strat hydrolisieren kann. Das dabei gebildete Produkt kann wieder online mit einem optischen Meßverfahren registriert werden.

Bei allen im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Kontakt mit der Innenwandung 2 der Gefäßprothese 1 zu bringenden Gerinnungsfaktoren bzw. deren Lösungen handelt es sich um klinisch geprüfte Präparate, die sämtliche Auflagen des Arzneimittelrechts erfüllen.

Ein weiterer Vorteil des beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es sich auch mehrfach im Ver­ lauf der Endotheliasierungsprozedur anwenden läßt. Zwi­ schenzeitlich kann die Gefäßprothese wieder mit frischem Nährmedium gefüllt und die Kultivation des Endothels fort­ gesetzt werden. Auf diese Weise läßt sich der Endothelia­ sierungsprozeß im zeitlichen Verlauf genau verfolgen.

Erfindungsgemäß lassen sich alle notwendigen Testlösungen und Inkubationsprozesse problemlos unter vollkommen steri­ len Bedingungen durchführen. Darüber hinaus liegt ein be­ sonderer Vorteil auch in der Schnelligkeit des hier be­ schriebenen Qualitätskontrollverfahrens.

Schließlich handelt es sich bei allen in Rahmen des be­ schriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens benötigten Fakto­ ren bzw. Substanzen um klinisch bereits verfügbare in ande­ ren Zusammenhängen schon eingesetzte Produkte, die relativ kostengünstig zu beziehen sind.

Zusammenfassend werden durch die vorliegende Erfindung die folgenden Vorteile erreicht.

• 1. Der Qualitätsnachweis bezieht sich bei der vorliegenden Erfindung auf möglichst wenige, aus Objektivitätsgründen heraus aber hochselektive Merkmale entweder der vollkom­ menen Endothel-denudierten oder der vollkommen mit vita­ len Endothelzellen überzogenen Prothesenwand.
• 2. Die gesamte Endothelwand der zu implantierenden Prothese wird einbezogen.
• 3. Das erfindungsgemäße Verfahren erfaßt weniger passive (z. B. rein anatomische) Merkmale als vielmehr funktio­ nelle Merkmale. Diese belegen den Grad der erreichten Antithrombogenität der Endothelfläche der zu implantie­ renden Gefäßprothese.
• 4. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf wissenschaft­ lich akzeptierten und zweifelsfrei dokumentierten Meßme­ thoden.
• 5. Bei dem vorliegenden Verfahren werden vorteilhafterweise nur Chemikalien verwendet, gegen die keine arzneimittel­ rechtlichen Bedenken bestehen.
• 6. Die Qualitätskontrolle läßt sich nach dem erfindungsge­ mäßen Verfahren schon an der noch nicht implantierten Prothese vollziehen und gibt Aufschluß über den erreich­ ten Konfluenzzustand der noch wachsenden Endothelzellen.
• 7. Das erfindungsgemäße Verfahren ist wiederholt und stets unter strikt sterilen Bedingungen durchführbar.
• 8. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht schnelle Er­ gebnisse und gibt einen direkten Aufschluß über die Qua­ lität der anschließend sofort transplantierten Gefäßpro­ these.
• 9. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr kostengünstig.
• 10. Neben endothelialisierten Gefäßprothesen läßt sich das beschriebene Verfahren auch zur Qualitätsüberprüfung der Endothelialisierung von Herzklappen und Herzhöhlen ein­ setzen.
• 11. Schließlich eignet sich das hier beschriebene Verfahren auch zur Selektierung von für den autologen Gefäßersatz vor.

Beispiel Messung von Gewebefaktor im Lumen intakter Ohrve­ nen von Kaninchen

Nach Abschluß der Protein C-Aktivierungsstudien wurde die­ selben Venensegmente mit Albumin/PBS-Lösung gründlich gewa­ schen und dann mit 37°C warmer Beriplex-Lösung gefüllt (eine Stammlösung von Beriplex P/N 500 [Centeon, Marburg] in 13 ml Aqua ad iniectabilia, davon ein 500 µl Aliquot 1 : 25 mit SL verdünnt, ausreichend für 5 Standard-Venensegmente), und bei 37°C inkubiert. Nach definierten Zeitintervallen wurden 100 µl-Aliquots abgenommen und in Mikrotiterplatten sofort mit 37°C warmer Stop-Lösung (wässrige Lösung von 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 120 mM NaCl, 2,7 mM KCl, eingestellt auf pH 10,0) vermischt. Nach Zugabe von Substrat für akti­ vierten Faktor Xa ("S-2222", Chromogenix) bis zur Endkon­ zentration 1,5 mM, wurde die photometrische Messreihe bei 37°C begonnen. Dazu wurde alle 30 sec die Extinktionszunah­ me bei 405 nm über einen Zeitraum von 15 min gemessen. Als Referenz diente verdünnte Beriplexlösung, die zuvor im selben Verhältnis mit reiner Deoxycholatlösung (0,025%ig in SL) und Stop-Lösung vermischt worden war.

Gewebefaktor in der Endothel-denudierten Ohrvene des Kanin­ chens

In der Zwischenzeit der Gewebefaktor-Photometrie (s. o.) wurden die nun schon mehrfach untersuchten Ohrvenen mit Al­ bumin/PBS-Lösung gespült und dann dem in der Literatur be­ schriebenen Verfahren von E. Jaffe folgend durch 30 minüti­ ge Kollagenase-Inkubation bei 37°C von Endothel befreit. Danach wurden die Gefäße kräftig mit PBS durchspült, wobei immer wieder auch Luftblasen in den Perfusionsstrom inkor­ poriert wurden.

In den so de-endothelialisierten Gefäße wurden anschließend alle oben beschriebenen Inkubationsreihen zum Nachweis von aktivem Protein C bzw. freigelegtem Gewebefaktor unter sonst völlig analogen Bedingungen durchgeführt.

Claims (10)

1. Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung für chirurgische Implantationszwecke entnommener, nativer Blutgefäße oder endothelialisierter künstlicher oder na­ türlicher Gefäßprothesen (1), Gefäßklappen, Herzklappen oder Herzhöhlen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Quali­ tätskontrolle charakteristische und selektive metaboli­ sche Aktivitäten und/oder strukturellen Merkmale der an der jeweiligen Prothesenwand (2) aufgezüchteten Endothel­ schicht (3) und der Zellen (4) der tieferen Prothesen­ wandschichten (2) als Maß für die Vollständigkeit der En­ dothelialisierung erfaßt und quantifiziert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antithrombogenen Aktivitäten der an der Prothesenwand (2) aufgezüchteten Endothelschicht (3) und die prothrom­ bogenen Aktivitäten der Zellen (4) der tieferen Prothe­ senwandschichten (2) erfaßt werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich bei den verwendeten Gefäßprothesen um durch "Tissue engeneering" hergestellte, künstliche Gefäße handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Prothesen (1) kryopräservierte Blutgefäße, Herz­ klappen oder Herzhöhlen verwendet werden, deren ursprüng­ liche Endothelbeschichtung entfernt wurde und an deren relevanter Oberfläche(2) eine patienteneigene Endothel­ schicht (4) aufgezüchtet wurde.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß aus Protein C in Gegenwart von Thrombin und besonderen Oberflächenstrukturen der Endothelschicht (3) der jeweiligen Prothese (1) im Verlauf einer Inkuba­ tionsphase gebildetes, lösliches aktives Protein C (PCA) nach der Entnahme von Aliquots einer geeigneten Inkubati­ onslösung (5) mit einem spezifischen Substrat inkubiert wird und die dabei proportional zur PCA-Menge gebildete Produktmenge registriert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktmenge mit der Hilfe optischer Meßgeräte regi­ striert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß mit den oben genannten Gefäß- bzw. Herzersatzteilen (1) eine Geringungsfaktoren enthaltende Inkubationslösung in Kontakt gebracht wird, wobei die Zellen (4) der tieferen Prothesenwandschichten (2), die nicht mit Endothelzellen abgedeckt sind aufgrund des dort exponierten "Gewebefaktors" Gerinnungsfaktoren der Inku­ bationslösung (5) aktivieren, deren Menge erfaßt und quantifiziert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mit den bezeichneten Prothesen (1) eine physiologische Salzlösung als Inkubationslösung zusammen mit Gerinnungs­ faktoren II, VII, VIII und X kontaktiert wird, wobei durch den Gewebefaktor der Gerinnungsfaktor VII zum Fak­ tor VIIa umgewandelt wird und dieser den Faktor X zum Faktor Xa umwandelt, und daß zu bestimmten Zeitpunkten Salzlösung aus dem Inkubationsgemisch (5) entnommen und mit einem spezifischen Faktor-Xa-Substrat inkubiert wird und daß das dabei entstehende farbige Produkt mit einem optischen Meßverfahren quantifiziert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine als Inkubationslösung dienende physiologische Salzlösung die notwendigen, oben genannten Gerinnungsfak­ toren zur Wirkung bringt, die z. B. ein als "Beriplex" be­ zeichnetes Präparat der Firma Centeon, Marburg enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Inkubationslösung fortlaufend zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und photometrisch un­ tersucht wird.