DE19937241A1 - Nachweis des Toxin-Operons nhe aus Bacillus cereus durch PCR - Google Patents
Nachweis des Toxin-Operons nhe aus Bacillus cereus durch PCRInfo
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Abstract
Bacillus cereus ist ein ubiquitär verbreitetes Bakterium, welches aufgrund seiner Sporenbildung auch Pasteurisierungsprozesse überlebt und deshalb in vielen Lebensmitteln verbreitet ist. Manche Bacillus cereus Stämmen bilden Toxine, was zu Lebensmittelintoxikationen und Lebensmittelinfektionen führt. DOLLAR A Das NHE Enterotoxin kann bisher auf immunologischer Basis durch einen kommerziellen Nachweis detektiert werden. Nachteil ist der Zeitaufwand sowie die relativ schlechte Nachweisgrenze. Der Nachweis des nhe Operons ist bisher nicht möglich, weil die zugehörige Nukleinsäuresequenz unbekannt war. Die Nukleinsäuresequenz des für die Synthese des nicht-hemolytischen Enterotoxins NHE verantwortlichen Operons wird in dieser Erfindung offenbart. Aufgrund dieser Sequenz wurden PCR Primer entwickelt, durch welche die Präsenz des nhe Operons nachgewiesen werden kann. Auf diese Weise kann zwischen potentiell NHE-toxischen und nicht-toxischen Bacillus cereus Isolaten sehr schnell unterschieden werden. DOLLAR A Im Ausführungsbeispiel wird die Amplifikation des nhe Operons gezeigt sowie der Test von 19 Bacillus cereus Isolaten aus Lebensmittelvergiftungen auf nhe demonstriert. Davon waren 18 Stämme nhe-positiv. Die parallele Untersuchung dieser 19 Stämme durch einen immunologischen Test ergab volle Übereinstimmung mit dem hier beschriebenen PCR Test.
Description
Eine Aufgabe der Lebensmittelmikrobiologie ist der Nachweis der hygienischen
Unbedenklichkeit von Mikroorganismen in Lebensmitteln. Der Hersteller von
Lebensmitteln ist verpflichtet, nur gesundheitlich unbedenkliche Lebensmittel
in Verkehr zu bringen. Zu diesem Zweck muß ausgeschlossen werden, daß Toxin
bildner im Lebensmittel vorhanden sind. Der Nachweis von Toxinbildnern ist
unter anderem dadurch möglich, daß die für die Toxine codierenden Gene durch
PCR amplifiziert und detektiert werden. Voraussetzung dafür ist die Kenntnis
der Nukleinsäuresequenz der Toxingene. In dieser Erfindung werden spezifische
Primer für den Nachweis des nhe Toxinoperons von Bacillus cereus
vorgestellt.
Bacillus cereus ist ein wichtiges Lebensmittelpathogen und verursacht zwei
unterschiedliche lebensmittelbedingte Erkrankungen durch ein emetisches Toxin
sowie durch Enterotoxine (Granum PE, Lund T, 1997, FEMS Microbiology Letters
157, 223-228). Enterotoxine verursachen Durchfallerkrankungen. Für die Präsenz
von Enterotoxinen in Bacillus cereus sind Nachweismethoden auf immunolog
ischer Basis verfügbar (Beecher D J, Wong A C L, 1994, Appl. Environ.
Microbiol. 60, 4614-4616; Granum, PE and Lund, T, 1997, FEMS Microbiol.
Letters 157, 223-228). Zwei Enterotoxine wurden auf DNS-Ebene
charakterisiert: Das bceT Gen (Agata et al. 1995, Microbiology 141, 983-988)
sowie das hemolytische hbl Gen (Heinrichs et al. 1993, Journal of
Bacteriology 175, 6760-6766; Ryan PA et al. Journal of Bacteriology 179,
2551-2556). Ein PCR Nachweis für hblA ist publiziert (Mäntynen V, Lindström K,
1998, Applied and Environmental Microbiology 64: 1643-1639), ebenso für bceT
(Granum PE et al. 1996, FEMS Microbiology Letters 141, 145-149). Das dritte
von Bacillus cereus gebildete Enterotoxin ist das nicht-hämolytische NHE
(Lund T, Granum PE, 1997, Microbiology 143, 3329-3336), dessen codierende DNS-
Sequenz zur Publikation eingereicht ist (Granum PE et al. 1999, FEMS
Microbiol.Lett., zur Publikation eingereicht am 7.6.99). Diese Sequenz bildet
die Grundlage für den hier beschriebenen PCR-Nachweis.
Der Stamm Bacillus cereus 1230-88 wurde aus einem durch Lebensmittel verur
sachten Ausbruch in Norwegen isoliert (Granum et al. 1993, International
Journal of Food Microbiology 117, 269-297). Drei von diesem Stamm gebildete
Enterotoxinproteine mit der Größe von 45 kDa, 39 kDa und 105 kDa wurden
isoliert und durch Edman-Abbau die N-terminalen Aminosäuresequenzen bestimmt.
Diese dienten der Synthese von degenerierten Primern, durch welche zwei 1.3 bp
und 4 bp lange DNA-Fragmente amplifiziert werden konnte. Die Sequenzierung
dieser Fragmente ergab insgesamt die im Anhang wiedergegebene Nukleotid
sequenz des nhe Operons. Das Operon codiert drei Proteine: NheA (41 kDa),
NheB (39 kDa) und NheC (36 kDa) und ist flankiert von einem möglichen
Promoter und einem möglichen Terminator (Abb. 1).
Die Sequenz des nhe Operons wurde mit den bekannten Sequenzen anderer
Enterotoxinoperons verglichen. Es zeigte sich, daß Sequenzähnlichkeiten
auftauchen, welche sich besonders auf bestimmte Motive konzentrieren. Aus dem
Vergleich konnten spezifische Sequenzen für das nhe operon bestimmt und
zugehörige Primer abgeleitet werden. Mit diesen Primern ist der Nachweis des
nhe Operons möglich. Aus den Sequenzvergleichen können verschiedene Primer
abgeleitet werden. Vier mögliche Primer sind:
45-3F: 5'acgttacaaacgttgaagtac
39-2F: 5'ccaatggtacacaatgggatc
39'-2R: 5'cgacttctgcttgtgctcctg
39-2R: 5'aagcctttcgtaagagttgc
45-3F: 5'acgttacaaacgttgaagtac
39-2F: 5'ccaatggtacacaatgggatc
39'-2R: 5'cgacttctgcttgtgctcctg
39-2R: 5'aagcctttcgtaagagttgc
Die Bindungsstellen dieser Primer sind in Abb. 2 wiedergegeben. Der Gebrauch
dieser Primer ist in Abschnitt 5, Ausführungsbeispiel beschrieben.
Mit den unter Abschnitt 4 beschriebenen Primern wurden Amplifikations
experimente durchgeführt. Dabei wurden zwei Primerpaare eingesetzt. Das
Primerpaar 45-3F/39-2R ergibt ein Amplicon von 550 bp, das Primerpaar 39-2F
/39'-2R ein Amplicon der Größe 1125 bp. Das Ergebnis eines Experimentes mit
Bacillus cereus 0075-95 ist in Abb. 3 dargestellt. Die PCR-Bedingungen für
beide Primer-Paare sind wie folgt: 95°C 1 min, (95°C 1 min, 45°C 1 min, 72°C,
1 min) × 30 cycles, 72°C 7 min, dann 4°C.
Insgesamt wurden 19 Bacillus cereus Stämme aus Lebensmittelvergiftungen
untersucht. Von 19 untersuchten Stämmen waren 18 positiv für nhe mit beiden
Primersystemem. Die Untersuchung mit dem immunologischen Test der Fa. Tecra
ergab Übereinstimmung in allen Fällen.
Claims (5)
1. Verwendung der Primer 45-3F/39-2R und 2F/39'-2R zum Nachweis des
Toxinoperons nhe oder einzelner Gene davon in Bacillus cereus.
2. Verwendung aller anderen, auf der in dieser Erfindung offenbarten
Sequenz des nhe Operons beruhenden Primerkombinationen zum
Nachweis des Toxinoperons nhe, oder einzelner Gene hiervon, in
Bacillus cereus.
3. Verwendung von allen PCR-Primern, die auf der in dieser Erfindung
offenbarten nhe Sequenz beruhen, zum Nachweis des Toxinoperons nhe
oder einzelner Gene hiervon, in allen Arten der Bacillus cereus
Gruppe, darunter Bacillus cereus, Bacillus weihenstephanensis,
Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis und Bacillus anthracis.
4. Verwendung der unter Patentanspruch 1-3 genannten Primer in irgend
einem kombinierten Nachweissystem, welches parallel auch andere
Bacillustoxine erfasst.
5. Verwendung der in dieser Erfindung offenbarten Nukleinsäuresequenz
für den Nachweis jeglicher Art des nhe Operons, oder einzelner Gene
hieraus, z. B. auch durch DNA/DNA oder DNA/RNA Hybridisierungsgestützte
Nachweissysteme.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19937241A DE19937241A1 (de) | 1999-08-06 | 1999-08-06 | Nachweis des Toxin-Operons nhe aus Bacillus cereus durch PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DE19937241A DE19937241A1 (de) | 1999-08-06 | 1999-08-06 | Nachweis des Toxin-Operons nhe aus Bacillus cereus durch PCR |
Publications (1)
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|---|---|
| DE19937241A1 true DE19937241A1 (de) | 2001-02-15 |
Family
ID=7917504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| DE19937241A Ceased DE19937241A1 (de) | 1999-08-06 | 1999-08-06 | Nachweis des Toxin-Operons nhe aus Bacillus cereus durch PCR |
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|---|---|
| DE (1) | DE19937241A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1508622A1 (de) * | 2003-08-22 | 2005-02-23 | Siegfried Prof. Dr. Scherer | Nachweis des Peptidsynthase verantwortlich für die emetische Toxinproduktion in Bacillus cereus |
| EP1512740A1 (de) * | 2002-05-17 | 2005-03-09 | Bio Control Institute Limited | Von bacillus cereus produzierte cereulid-synthase, diese codierendes gen und verfahren zum nachweis von cereulid |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5763226A (en) * | 1995-02-17 | 1998-06-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Bacillus cereus enterotoxin and method of use |
-
1999
- 1999-08-06 DE DE19937241A patent/DE19937241A1/de not_active Ceased
Patent Citations (1)
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| EP1512740A4 (de) * | 2002-05-17 | 2005-09-21 | Bio Control Inst Ltd | Von bacillus cereus produzierte cereulid-synthase, diese codierendes gen und verfahren zum nachweis von cereulid |
| US7264959B2 (en) | 2002-05-17 | 2007-09-04 | Bio Control Institute Limited | Synthase of cereulide produced by Bacillus cereus, gene encoding the same and method of detecting cereulide |
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