DE19933506A1 - Cellular uptake of DNA - Google Patents
Cellular uptake of DNAInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues System zur zellulären Aufnahme von Nukleinsäuren, Stoffen, die eine Nukleinsäurekomponente enthalten, oder geneti scher Information. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, enthal tend eine Nukleotidsequenz mit mindestens einer Signalsequenz, welche die Aufnahme der Nukleinsäure in eine Zelle bewirkt, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein Verfahren zur Identifizierung derartiger Nukleotidsequenzen.The present invention relates to a new system for cellular uptake of Nucleic acids, substances that contain a nucleic acid component, or genetic information. In particular, the invention relates to a nucleic acid, including tend a nucleotide sequence with at least one signal sequence which the Incorporation of the nucleic acid into a cell causes processes for its production and a method for identifying such nucleotide sequences.
In der biomedizinischen Forschung ist ein gesamtes Fachgebiet, die Vektoren entwicklung, mit der Einschleusung rekombinanter DNA in Zellen von Interesse befaßt. Bis heute hat sich kein Vektorsystem auf breiter Basis durchgesetzt. Darüber hinaus sind die bekannten Verfahren zur Herstellung anwendbarer Vektoren vergleichsweise komplex und teuer.In biomedical research there is an entire field, the vectors development, with the introduction of recombinant DNA into cells of interest deals. To date, no broad-based vector system has prevailed. In addition, the known methods of manufacturing are more applicable Vectors are comparatively complex and expensive.
Die Anwendung viraler und nicht-viraler Vektoren zur Einschleusung rekombinan ter genetischer Information (z. B. DNA) in Zielzellen wird in der Molekularbiologie, molekularen Medizin und Gentherapie vor allem durch die Komplexität der Systeme extrem aufwendig, kostenintensiv und biologisch nur äußerst schwer kontrollierbar. Die Übertragung von Nukleinsäure-Transportfunktionen, ins besondere DNA-Transportfunktionen, auf die einzuschleusende Nukleinsäure, z. B. eine DNA, selbst würde den konzeptionell einfachsten und in methodischer Hinsicht am besten umsetzbaren Weg darstellen. Jedoch sind artifizielle DNA- Elemente (DNA-cis-Elemente), welche die zelluläre Aufnahme von DNA ver mitteln, bisher unbekannt.The use of viral and non-viral vectors for recombinant injection genetic information (e.g. DNA) in target cells is used in molecular biology, molecular medicine and gene therapy mainly due to the complexity of the Systems extremely complex, expensive and biologically very difficult controllable. The transfer of nucleic acid transport functions to special DNA transport functions on the nucleic acid to be introduced, e.g. B. a DNA, itself would be conceptually simplest and methodical Best possible way. However, artificial DNA Elements (DNA-cis elements), which ver the cellular uptake of DNA average, previously unknown.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein in biologischer und technischer Hinsicht möglichst einfach ausführbares System zur Einschleu sung genetischer Information, wie beispielsweise DNA, in Zellen bereitzustellen. The present invention is therefore based on the object of being biological and technically easy to implement system for insertion provide genetic information, such as DNA, in cells.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausfüh rungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.This object is achieved by the embodiment characterized in the claims tion forms of the present invention solved.
Die vorstehend definierte Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird insbesondere dadurch gelöst, daß Transportsignale zur Einschleusung "nackter" Nukleinsäu ren, wie beispielsweise rekombinanter DNA, in Zellen von cis-Elementen, wie beispielsweise DNA-cis-Elementen, übernommen werden, die sich auf der ein zuschleusenden Nukleinsäure selbst befinden. Daher wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure, enthaltend eine Nukleotidsequenz mit mindestens einer Signalse quenz, welche die Aufnahme der Nukleinsäure in eine Zelle bewirkt, bereit gestellt.The object of the present invention defined above becomes particularly solved in that transport signals for introducing "naked" nucleic acid ren, such as recombinant DNA, in cells of cis elements, such as For example, DNA cis elements, which are located on the one to be smuggled nucleic acid itself. Therefore, according to the invention Nucleic acid containing a nucleotide sequence with at least one signal sequence that causes the uptake of the nucleic acid into a cell posed.
Die Begriffe "Nukleinsäure" und "Nukleotidsequenz" umfassen endogen ex primierte, halbsynthetische, synthetische oder chemisch modifizierte Nukleinsäu remoleküle, die vorzugsweise im wesentlichen aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden bestehen. Die "Signalsequenz" der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist mindestens ein Teil der Nukleotidsequenz und ist somit ein cis-Element der erfindungsgemäßen Nu kleinsäure und bewirkt deren Aufnahme in eine Zelle. Beispielsweise handelt es sich bei der Signalsequenz einer erfindungsgemäßen DNA somit um ein DNA-cis- Element.The terms "nucleic acid" and "nucleotide sequence" encompass endogenously ex primed, semi-synthetic, synthetic or chemically modified nucleic acid remolecules, preferably consisting essentially of deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides and / or modified nucleotides. The "Signal sequence" of the nucleic acid according to the invention is at least part of the Nucleotide sequence and is thus a cis element of the Nu according to the invention small acid and causes it to be absorbed into a cell. For example, it is the signal sequence of a DNA according to the invention is thus a DNA cis- Element.
Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiter mindestens eine zu transportierende zweite Nukleotidsequenz und/oder eine oder mehrere mit der ersten und/oder zweiten Nukleotidsequenz kovalent verknüpfte und/oder komplexierte Komponenten, die biologisch aktiv und keine Nukleinsäuren sind.The nucleic acid according to the invention preferably further contains at least a second nucleotide sequence to be transported and / or one or more and / or linked covalently to the first and / or second nucleotide sequence complexed components that are biologically active and not nucleic acids.
Der Ausdruck "eine zu transportierende zweite Nukleotidsequenz" bedeutet eine heterologe oder homologe, rekombinante Nukleotidsequenz, die beispielsweise einen für mindestens ein Polypeptid und/oder ein RNA-Transkript von Interesse, z. B. für mindestens eine Antisense-Nukleinsäure und/oder für mindestens ein Ribozym kodierenden Bereich und/oder einen oder mehrere Kontrollbereiche und/oder eine partiell oder vollständig doppelsträngige RNA (z. B. eine RNAi beim sog. "post translational gene silencing", PTGS) umfassen kann.The expression "a second nucleotide sequence to be transported" means a heterologous or homologous, recombinant nucleotide sequence which, for example, is of interest to at least one polypeptide and / or an RNA transcript, e.g. B. for at least one antisense nucleic acid and / or for at least one ribozyme coding region and / or one or more control regions and / or a partially or completely double-stranded RNA (eg an RNA i in the so-called "post translational gene silencing" , PTGS).
Der Ausdruck "für mindestens ein Polypeptid kodierender Bereich" bedeutet, daß der entsprechende Nukleotidsequenzbereich mindestens einen offenen Leserah men (ORF) bzw. ein oder mehrere Exons, zwischen denen gegebenenfalls ein oder mehrere nicht-translatierte Bereiche (z. B. Introns) eingefügt sind, enthält, der bzw. die für die Aminosäuresequenz, d. h. die Primärstruktur, eines Polypep tids kodiert bzw. kodieren. Der mindestens für ein Polypeptid kodierende Bereich kann dabei in Bezug auf die Zelle heterolog oder homolog sein. Der Ausdruck "für mindestens eine Antisense-Nukleinsäure kodierender Bereich" bedeutet, daß der entsprechende Nukleotidsequenzbereich mindestens für eine Nukleinsäure kodiert, die zur Bindung an eine Ziel-RNA befähigt ist und so deren biologische Funktion, z. B. die Translation einer mRNA inhibiert. Der Ausdruck "für minde stens ein Ribozym kodierender Bereich" bedeutet, daß der entsprechende Nu kleotidsequenzbereich mindestens für eine Nukleinsäure, kodiert, die zur Spal tung einer Ziel-mRNA befähigt ist und so deren Translation inhibiert. Vorzugs weise handelt es sich bei einem solchen Ribozym um ein Hammerhead-Ribozym.The term "region coding for at least one polypeptide" means that the corresponding nucleotide sequence region has at least one open reading area men (ORF) or one or more exons, between which there may be a or several non-translated areas (e.g. introns) are inserted, the one or more for the amino acid sequence, d. H. the primary structure, a polypep encode or encode tids. The region coding for at least one polypeptide can be heterologous or homologous with respect to the cell. The expression "region coding for at least one antisense nucleic acid" means that the corresponding nucleotide sequence region for at least one nucleic acid encodes that is capable of binding to a target RNA and thus its biological Function, e.g. B. inhibits the translation of an mRNA. The expression "for minde least a ribozyme coding region "means that the corresponding Nu Kleotidsequenzbereich encoded at least for a nucleic acid, the Spal target mRNA is capable and thus inhibits their translation. Preferential such a ribozyme is a hammerhead ribozyme.
Der Begriff "Kontrollbereich" umfaßt sämtliche bei der Genregulation, d. h. insbesondere bei der Regulation der Expression von Genen, mitwirkende Nukleo tidsequzenzen, wie beispielsweise Promotoren, Enhancer, Operatoren, Trans kriptionsstartsignale und Polyadenylierungssignale.The term "control area" encompasses all of gene regulation, i. H. especially involved in regulating the expression of genes tide sequences, such as promoters, enhancers, operators, trans start-up signals and polyadenylation signals.
Der Begriff "Promotor" bezeichnet einen Nukleotidsequenzabschnitt, durch den der Initiationspunkt und die Initiationshäufigkeit der Transkription (mRNA-Syn these) eines Gens festgelegt werden.The term "promoter" denotes a nucleotide sequence section through which the initiation point and the initiation frequency of the transcription (mRNA syn these) of a gene.
Der Begriff "Enhancer" bezeichnet Nukleotidsequenzabschnitte, wie sie beispiels weise im 5'- oder 3'-flankierenden Bereich von Genen, insbesondere solcher eukaryotischer und viraler Herkunft zu finden sind, welche die Effizienz der Transkription erhöhen. Die cis-aktiven Enhancer-Elemente können selbst über Distanzen von einigen Kilobasen ihre Wirkung entfalten. Sie funktionieren in beiden Orientierungen und sind positionsunabhängig, d. h., sie können z. B. im 5'- Bereich eines durch sie kontrollierten Gens liegen oder können auch z. B. im 3'- Bereich oder sogar beispielsweise in einem Intron lokalisiert sein.The term "enhancer" refers to nucleotide sequence sections as they are, for example as in the 5'- or 3'-flanking region of genes, especially those eukaryotic and viral origins are found, which affect the efficiency of the Increase transcription. The cis-active enhancer elements can self over Distances of a few kilobases are effective. They work in both orientations and are position independent, i. that is, they can e.g. B. in 5'- Range of a gene controlled by them are or can also z. B. in 3'- Area or even localized, for example, in an intron.
Der Begriff "Operator" bezeichnet in der vorliegenden Erfindung einen Nukleotid sequenzabschnitt, an dem regulatorisch wirkende Proteine (beispielsweise Repressoren oder Aktivatoren) binden, um dadurch die Aktivitäten von beispiels weise angrenzenden Strukturgenen, wie z. B. des für ein Polypeptid kodierenden Bereichs, zu blockieren (negative Regulation) oder zu aktivieren (positive Regula tion).The term "operator" in the present invention denotes a nucleotide Sequence section on which regulatory proteins (e.g. Repressors or activators) bind to thereby the activities of, for example as adjacent structural genes, such as. B. the coding for a polypeptide Range, to block (negative regulation) or to activate (positive regulation tion).
Der Begriff "Transkriptions/Translationsstartsignal" umfaßt insbesondere Kon trollbereiche im 5'-flankierenden Bereich von für Polypeptide kodierenden Nukleo tidsequenzabschnitten, wie beispielsweise TATA- und CCAT-Boxen, sowie die unmittelbar im 5'-flankierenden Bereich eines Transkriptionsstarts befindlichen sog. "Kozak"-Sequenzen (M. Kozack (1991) "An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translational control", J. Cell Biol. 115 (4), 887-903) sowie Ribosomenbindungsstellen und IRES-Elemente (engl. "internal ribosomal entry sites").The term "transcription / translation start signal" particularly includes Kon troll regions in the 5 'flanking region of nucleo coding for polypeptides tid sequence sections, such as TATA and CCAT boxes, as well as the located directly in the 5 'flanking area of a transcription start So-called "Kozak" sequences (M. Kozack (1991) "An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translational control ", J. Cell Biol. 115 (4), 887-903) and ribosome binding sites and IRES elements (internal ribosomal entry sites ").
Ein "Polyadenylierungssignal" bezeichnet Nukleotidsquenzen, die für die Addition eines Poly(A)-Schwanzes an eine mRNA und zur Prozessierung des 3'-Endes der mRNA benötigt werden. Die Polyadenylierungssignale für die Addition eines poly(A)-Schwanzes an mRNA-Moleküle von Säugern enthalten beispielsweise zwei Elemente: Die AAUAAA-Sequenz 20 bis 30 Nukleiotide vor und einen diffusen GU-reichen Abschnitt direkt nach dem 3'-Ende des für die mRNA kodierenden Nukleotidsequenzabschnitts.A "polyadenylation signal" denotes nucleotide sequences necessary for the addition a poly (A) tail to an mRNA and for processing the 3 'end of the mRNA are needed. The polyadenylation signals for the addition of a For example, contain poly (A) tails on mammalian mRNA molecules two elements: the AAUAAA sequence 20 to 30 nuclei and one diffuse GU-rich section immediately after the 3 'end of the for the mRNA coding nucleotide sequence section.
Der Begriff "biologisch aktive Komponente" umfaßt alle biologisch aktiven Strukturen, die aus einzelnen oder mehreren Molekülen sämtlicher Substanz klassen mit biologischer Funktion außer den Nukleinsäuren, beispielsweise Peptide, z. B. Polypeptide, wie Proteine, Lipide, z. B. Phospholipide, Saccharide, z. B. einzelne Zucker, Oligo- und Polysaccharide aufgebaut sind. Des weiteren können solche biologisch aktiven Komponenten selbstverständlich auch Cofakto ren, prosthetische Gruppen, Ionen usw. enthalten.The term "biologically active component" encompasses all biologically active components Structures made up of single or multiple molecules of any substance classes with biological function other than nucleic acids, for example Peptides, e.g. B. polypeptides such as proteins, lipids, e.g. B. phospholipids, saccharides, e.g. B. individual sugars, oligosaccharides and polysaccharides. Furthermore such biologically active components can of course also be cofacto , prosthetic groups, ions, etc.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist (sind) der (die) Kontrollbereich(e) zur Regulation der Expression des minde stens einen für mindestens ein Polypeptid und/oder für mindestens eine Anti sense-Nukleinsäure und/oder für mindestens ein Ribozym kodierenden Bereichs befähigt. Der Ausdruck "zur Regulation der Expression befähigt" bedeutet, daß der bzw. die Kontrollbereiche die Transkription und/oder Translation des minde stens einen für mindestens ein Polypeptid und/oder für mindestens eine Anti sense-Nukleinsäure und/oder für mindestens ein Ribozym kodierenden Bereichs in positiver und/oder negativer Weise beeinflußt bzw. beeinflussen.According to a preferred embodiment of the nucleic acid according to the invention is the control area (s) for regulating the expression of the mind at least one for at least one polypeptide and / or for at least one anti sense nucleic acid and / or for at least one ribozyme coding region capable. The expression "capable of regulating expression" means that the control area or areas control the transcription and / or translation of the minde at least one for at least one polypeptide and / or for at least one anti sense nucleic acid and / or for at least one ribozyme coding region influenced or influence in a positive and / or negative manner.
Der Begriff "Zelle" umfaßt sowohl prokaryotische Zellen, wie beispiesweise Protozoen und Bakterien, z. B. E. coli, Bacillus spec. und Agrobacteriurne fa ciens, als auch eukaryotische Zellen, wie beispielsweise Pilze, wie Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, Schistosaccharomyces pombe und Pichia pastoris, Pflanzenzellen, z. B. Tomatenzellen, Kartoffelzellen und Arabidopsis spec., Nematodenzellen, z. B. C. elegans, Insektenzellen, z. B. D. melanogaster und Sf9- Zellen, sowie Säugerzellen, wie beispielsweise Kulturzellen wie Zellen von Endothel-, Leber-, Muskel- und Hirnzellinien, z. B. humane Kulturzellen (z. B. HeLa, ECV 304, MCF-7, A431) oder Kulturzellen anderer Säuger (z. B. BHK, CHO, PV-1) sowie Zellen, die einem an einer krankhaften Störung leidenden Patienten, beispielsweise einem Menschen oder einem Tier, beispielsweise zur Gentherapie, entnommen wurden.The term "cell" includes both prokaryotic cells and, for example Protozoa and bacteria, e.g. B. E. coli, Bacillus spec. and Agrobacteriurne fa ciens, as well as eukaryotic cells, such as fungi, such as yeasts, e.g. B. Saccharomyces cerevisiae, Schistosaccharomyces pombe and Pichia pastoris, Plant cells, e.g. B. tomato cells, potato cells and Arabidopsis spec., Nematode cells, e.g. B. C. elegans, insect cells, e.g. B. D. melanogaster and Sf9- Cells, as well as mammalian cells, such as, for example, culture cells such as cells from Endothelial, liver, muscle and brain cell lines, e.g. B. human culture cells (e.g. HeLa, ECV 304, MCF-7, A431) or culture cells from other mammals (e.g. BHK, CHO, PV-1) as well as cells that a patient suffering from a pathological disorder for example a human or an animal, for example for gene therapy, were removed.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der mindestens die wie vorstehend definierte Nukleinsäure enthält. Der Begriff "Vektor" bedeutet dabei ein DNA- und/oder RNA-Replikon, das zur Amplifikation und/oder Expression der Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet werden kann. Der Vektor kann jegliche wie vorstehend definierte Kontrollbereiche und/oder andere Nukeotidsequenzabschnitte im 5'- und/oder 3'- Bereich der Nukleotidsequenz, die zur Kontrolle ihrer Expression befähigt sind, enthalten. Der Vektor kann zusätzlich weitere Nukleotidsequenzen, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die zur Detektion und/oder Reinigung von Proteinen, beipielsweise eines Polypeptids, das von der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz kodiert wird, geeignet sind, im 5'- und/oder 3'-Bereich der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz enthalten. Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäße Vektor weitere Elemente, welche die stabile Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die wie vorstehend definiert beispielsweise für mindestens ein Polypeptid und/oder mindestens eine Antisense-Nukleinsäure und/oder mindestens ein Ribozym kodieren kann, in das Genom eines Wirts organismus und/oder die transiente Expression der erfindungsgemäßen Nukleo tidsequenz ermöglichen. Ferner enthält der erfindungsgemäße Vektor vorzugs weise Selektionsgene, wie beispielsweise ein oder mehrere Antibiotikaresi stenzgene, welche die einfache Selektion mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformierter Zeilen ermöglichen. Die hierfür notwendigen Arbeitsschritte sind einem Fachmann bekannt.Another object of the present invention relates to a vector which contains at least the nucleic acid as defined above. The term "Vector" means a DNA and / or RNA replicon, which is used for amplification and / or expression of the nucleotide sequence of the nucleic acid according to the invention can be used. The vector can be any as defined above Control areas and / or other nukeotide sequence sections in the 5'- and / or 3'- Region of the nucleotide sequence which is capable of controlling its expression, contain. The vector can also contain additional nucleotide sequences that are necessary for Encode amino acid sequences that are used for the detection and / or purification of Proteins, for example a polypeptide, that of the invention Nucleotide sequence is encoded, are suitable in the 5 'and / or 3' region of the contain nucleotide sequence according to the invention. Preferably, the vector according to the invention further elements which the stable integration of Nucleic acid according to the invention, as defined above, for example for at least one polypeptide and / or at least one antisense nucleic acid and / or can encode at least one ribozyme into the genome of a host organism and / or the transient expression of the nucleo according to the invention Enable tide sequence. Furthermore, the vector according to the invention preferably contains wise selection genes, such as one or more antibiotic resistance stenzgene, which is the simple selection with the vector according to the invention enable transformed lines. The steps required for this are known to a specialist.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Wirts organismus, der mindestens die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor enthält. Der Begriff "Wirtsorganismus" umfaßt sowohl Pilze, Pflanzen, Tiere und Menschen, als auch Teile dieser, insbesondere deren Zellen, wie beispielsweise die vorstehend angebenen eukaryotischen und prokaryotischen Zellen.Yet another object of the present invention relates to a host organism, the at least the nucleic acid according to the invention or the contains vector according to the invention. The term "host organism" includes both mushrooms, plants, animals and humans, as well as parts of these, in particular their cells, such as the eukaryotic and prokaryotic cells.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des erfindungsgemäßen
Vektors, umfassend die Schritte:
The present invention further relates to a method for producing the nucleic acid according to the invention or the vector according to the invention, comprising the steps:
- a) Züchten des erfindungsgemäßen Wirtsorganismus in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen unda) Culturing the host organism according to the invention in a suitable Medium under suitable conditions and
- b) Isolieren des gewünschten Produkts aus dem Medium und/oder dem Wirtsorganismus.b) isolating the desired product from the medium and / or the Host organism.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Identifizierung einer Nukleotidsequenz, die mindestens eine die Aufnahme einer
Nukleinsäure in eine Zelle bewirkende Signalsequenz enthält, umfassend die
Schritte:
The present invention further relates to a method for identifying a nucleotide sequence which contains at least one signal sequence which causes a nucleic acid to be taken up into a cell, comprising the steps:
- a) Isolieren einer Nukleinsäure, die von Zellen selektiv aus einer Vielzahl von Nukleinsäuren aufgenommen wird, wobei die Vielzahl der Nukleinsäuren Nukleotidsequenzen aufweisen, die sich mindestens teilweise voneinander unterscheiden, und a) isolating a nucleic acid that is selectively selected from a variety of cells Nucleic acids is added, the large number of nucleic acids Have nucleotide sequences that are at least partially different from each other distinguish, and
- b) Bestimmen der Nukleotidsequenz der in Schritt (a) isolierten Nukleinsäure.b) determining the nucleotide sequence of the nucleic acid isolated in step (a).
Der Begriff "Vielzahl von Nukleinsäuren" umfaßt endogen exprimierte, halbsyn thetische, synthetische oder chemische modifizierte Nukleinsäuremoleküle, die Nukleotidsequenzen aufweisen, die sich mindestens teilweise voneinander unterscheiden. Beispielsweise können die Nukleotidsequenzen der Vielzahl von Nukleinsäuren einen variablen Teil, der sich von den variablen Teilen der Nukleo tidsequenzen der anderen Nukleinsäuren unterscheidet und einen invariablen Teil, der in jeder Vielzahl von Nukleinsäuren im wesentlichen identisch ist und bei spielsweise als Bindungsstelle von PCR-Primern dienen kann, umfassen. Wie vorstehend definiert, ist die Herkunft der Nukleotidsequenzen der Vielzahl der Nukleinsäuren in keiner Weise begrenzt. Die Nukleotidsequenzen der Vielzahl von Nukleinsäuren können beispielsweise chemisch synthetisiert sein, und/oder von dem Genom jeglicher biologischer Systeme, die genetische Information enthal ten, stammen. Der Ausdruck "biologische System, die genetische Information enthalten" umfaßt dabei sowohl prokaryotische und eukaryotische Zellen als auch biologische Systeme, die sich nicht selbständig replizieren können, wie Bakteriophagen, Viren und Viroide. So kann die Vielzahl der Nukleinsäuren beispielsweise von einer representativen Bibliothek, wie beispielsweise einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek, des Genoms eines solchen biologischen Systems stammen.The term “multitude of nucleic acids” encompasses endogenously expressed, semi-syn synthetic, synthetic or chemical modified nucleic acid molecules which Have nucleotide sequences that are at least partially different from each other differentiate. For example, the nucleotide sequences of the plurality of Nucleic acids have a variable part that differs from the variable parts of the nucleo tide sequences of the other nucleic acids and an invariable part, which is essentially identical in every multitude of nucleic acids and at can serve, for example, as a binding site of PCR primers. How Defined above is the origin of the nucleotide sequences of the plurality of Nucleic acids in no way limited. The nucleotide sequences of the variety of Nucleic acids can be chemically synthesized, for example, and / or the genome of any biological system that contains genetic information ten. The expression "biological system, genetic information contain "includes both prokaryotic and eukaryotic cells as also biological systems that cannot replicate themselves, such as Bacteriophages, viruses and viroids. So can the multitude of nucleic acids for example from a representative library, such as one cDNA library or a genomic library, the genome of such biological system.
Ein Beispiel einer Vielzahl von Nukleinsäuren umfaßt einen DNA-Pool mit DNA- Spezies, die beispielsweise eine Länge von 15 bis mehreren tausend Basenpaa ren aufweisen, wobei der randomisierte Anteil, d. h. der variable Teil der Nukleo tidsequenzen der DNA-Spezies, beispielsweise 5 bis 150 Basenpaare umfaßt und beidseitig terminale Primersequenzen, beispielsweise von 5 bis 40 Basenpaare Länge, angefügt sind.An example of a variety of nucleic acids includes a DNA pool with DNA Species, for example, a length of 15 to several thousand base pairs ren, the randomized portion, i.e. H. the variable part of the nucleo tidsequenzen the DNA species, for example 5 to 150 base pairs and primer sequences on both sides, for example from 5 to 40 base pairs Length, are attached.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Zellen können, wie vorstehend definiert, sämtliche eukaryotische und prokaryotische Zellen sein. Bevorzugte Zellen sind Säugerzellinien, wie beispielsweise BHK, Hela und ECV 304. The cells used for the method according to the invention can, such as As defined above, all of the eukaryotic and prokaryotic cells. Preferred cells are mammalian cell lines such as BHK, Hela and ECV 304.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des vorstehend definierten Verfah
rens umfaßt das Isolieren der Nukleinsäure
According to a preferred embodiment of the method defined above, isolating the nucleic acid comprises
- a) das Inkontaktbringen der Zellen für einen geeigneten Zeitraum, beispiels weise von 1 min bis 48 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, mit der Vielzahl von Nukleinsäuren, beispielsweise einem DNA-Pool mit einer ausreichenden Komplexität und in einer ausreichenden Menge, beispiels weise 1 ng bis 10 µg pro 107 Zellen, wobei die Zellen selektiv Nukleinsäu ren aus der Vielzahl von Nukleinsäuren aufnehmen,a) contacting the cells for a suitable period of time, for example from 1 min to 48 hours, preferably 24 hours, with the large number of nucleic acids, for example a DNA pool with sufficient complexity and in a sufficient amount, for example 1 ng to 10 µg per 10 7 cells, the cells selectively absorbing nucleic acids from the large number of nucleic acids,
- b) das Isolieren der Nukleinsäure-haltigen Bestandteile der Zellen, (iii) das Detektieren der von den Zellen selektiv aus der Vielzahl der Nuklein säuren aufgenommenen Nukleinsäuren in den Nukleinsäure-haltigen Be standteilen der Zellen von (ii), undb) isolating the nucleic acid-containing components of the cells, (iii) detecting cells selectively from the plurality of nucleuses acids in nucleic acids in the nucleic acid-containing Be components of the cells of (ii), and
- c) das Isolieren der im Schritt (iii) detektierten, selektiv von den Zellen aufge nommenen Nukleinsäuren.c) isolating those detected in step (iii) selectively from the cells taken nucleic acids.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das vorstehend definierte
Verfahren weiter
According to a preferred embodiment, the method defined above further comprises
- a) das Wiederholen der Schritte (i) bis (iv), bis sich der Anteil der aus der Vielzahl von Nukleinsäuren selektiv aufgenommenen Nukleinsäuren an den Nukleinsäure-haltigen Bestandteilen der Zellen nicht mehr ändert, wobei jeweils im Schritt (i) die im Schritt (iv) isolierten Nukleinsäuren mit den Zellen in Kontakt gebracht werden.a) repeating steps (i) to (iv) until the proportion of the Variety of nucleic acids selectively added to the Nucleic acid-containing components of the cells no longer change, whereby in step (i), the nucleic acids isolated in step (iv) with the Cells are brought into contact.
Vorzugsweise umfaßt das Detektieren der von den Zellen selektiv aufgenomme nen Nukleinsäuren im Schritt (iii) gleichzeitig die Amplifikation dieser Nukleinsäu ren, beispielsweise mittels Amplifikation in lebenden Zellen, z. B. E. coli, oder mittels einer PCR, vorzugsweise einer präparativen PCR. Dabei werden bei der PCR Primer eingesetzt, die beispielsweise an die terminalen Primersequenzen der wie vorstehend definierten DNA-Spezies im DNA-Pool binden. Ferner umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform weiter ein oder mehrere Waschschritte, beispielsweise nach dem Schritt des Inkontakt bringens der Zellen mit der Vielzahl von Nukleinsäuren im Schritt (i). Preferably, the detection comprises that which is selectively taken up by the cells NEN nucleic acids in step (iii) simultaneously amplify this nucleic acid ren, for example by means of amplification in living cells, e.g. B. E. coli, or by means of a PCR, preferably a preparative PCR. At the PCR primers used, for example, to the terminal primer sequences of the bind DNA species as defined above in the DNA pool. This also includes Method according to the invention in a preferred embodiment or several washing steps, for example after the contact step bringing the cells with the plurality of nucleic acids in step (i).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Ein schleusung von Nukleinsäuren in Zellen, umfassend die wie vorstehend definierte Nukleinsäure und/oder den wie vorstehend definierten Vektor und/oder den wie vorstehend definierten Wirtsorganismus.Another object of the present invention relates to a kit for one smuggling of nucleic acids into cells, comprising the one as defined above Nucleic acid and / or the vector as defined above and / or the how host organism as defined above.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Arzneimittel, enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Hilfsstoff und/oder ein Verdünnungsmittel.The present invention further relates to a medicament, containing the nucleic acid according to the invention or the invention Vector and optionally a pharmaceutically acceptable carrier and / or Excipient and / or a diluent.
Die vorliegende Erfindung beschreibt somit ein neuartiges System zur Einschleu sung von Nukleinsäuren, beispielsweise rekombinanter DNA oder einzelsträngiger Nukleinsäuren, in Zellen, wie beispielsweise menschliche Zellen, über neuartige cis-Elemente, beispielsweise DNA-cis-Elemente, welche die Transportfunktion von bisher benutzten viralen Komponenten oder nicht-viralen Vektoren ersetzen können. Solche DNA-cis-Elemente können beispielsweise "nackte", doppel strängige oder partiell oder vollständig einzelsträngige DNA in Säugerzellen einschleusen und stellen daher konzeptionell den einfachsten denkbaren Nu kleinsäure- bzw. DNA-Transfer in Zellen dar. Damit kann die aufwendige Kom plexierung rekombinanter DNA über virale oder nicht-virale Vektorkomponenten in der Biomedizin substantiell unterstützt oder ersetzt werden. Es ist ebenfalls möglich, daß rekombinante Gene von Interesse in der molekularen Medizin, wie beispielsweise solcher in der Gentherapie, mit zusätzlichen erfindungsgemäßen DNA-Transportelementen versehen werden und so direkt einsetzbar sind, was eine drastische Vereinfachung von Protokollen in der somatischen Gentherapie zur Folgen hat.The present invention thus describes a novel system for insertion solution of nucleic acids, for example recombinant DNA or single-stranded Nucleic acids, in cells, such as human cells, via novel ones cis elements, for example DNA cis elements, which have the transport function replace previously used viral components or non-viral vectors can. Such DNA-cis elements can be, for example, "naked", double stranded or partially or completely single-stranded DNA in mammalian cells infiltrate and therefore conceptually represent the simplest conceivable nu small acid or DNA transfer in cells. This means that the complex com plexing of recombinant DNA over viral or non-viral vector components are substantially supported or replaced in biomedicine. It is also possible that recombinant genes of interest in molecular medicine, such as for example those in gene therapy with additional inventive DNA transport elements are provided and so can be used directly, what a drastic simplification of protocols in somatic gene therapy has consequences.
Daher betrifft eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des erfindungsgemäßen Vektors oder des erfindungsgemäßen Wirtsorganismus zur Herstellung eines gentherapeutischen Arzneimittels. Zum Beispiel kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder der erfindungsgemäße Vektor oder der erfindungsgemäße Wirtsorganismus zur gentherapeutischen Behandlung von Patienten, die an Krankheiten bzw. krankhaften Störungen leiden, die mit Hilfe der Gentherapie behandelt werden können, verwendet werden.Therefore, another embodiment of the present invention relates to Use of the nucleic acid according to the invention or of the invention Vector or the host organism according to the invention for producing a gene therapeutic drug. For example, the invention Nucleic acid or the vector or the invention Host organism for gene therapy treatment of patients suffering from Diseases or pathological disorders suffer with the help of gene therapy can be treated, used.
Die zelluläre Aufnahme rekombinanter Nukleinsäuren über die erfindungsgemä ßen Nukleotidsequenzen, die Teil der einzuschleusenden Nukleinsäuren selbst sind, bedeutet sowohl in technischer als auch in biologischer Sicht eine massive Vereinfachung gegenüber gegenwärtigen Verfahren. Auch in der biomedizi nischen und molekularbiologischen Forschung bedeutet daher die zelluläre Aufnahmer "nackter" Plasmid-DNA eine deutliche und nachhaltige Verbesserung des gegenwärtigen Standes der Technik.The cellular uptake of recombinant nucleic acids via the ß nucleotide sequences that are part of the nucleic acids themselves to be introduced are massive, both from a technical and biological point of view Simplification compared to current procedures. Also in the biomedizi African and molecular biological research therefore means cellular Recording "naked" plasmid DNA a significant and sustainable improvement the current state of the art.
Die Figuren zeigen:The figures show:
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Selek tionsprotokolls zur Identifizierung von zellulären DNA-Importsigna len. Fig. 1 is a schematic representation of a selection protocol according to the invention for the identification of cellular DNA Importsigna len.
Das folgende Beispiel erläutert die vorliegende Erfindung näher, ohne sie ein zuschränken.The following example explains the present invention in more detail without it to restrict.
In der Fig. 1 ist das Selektionsprotokoll zur Identifizierung von DNA-Signalse quenzen, welche die Aufnahme von DNA in Kulturzellen bewirken, gezeigt. Es wurden 10 µg eines DNA-Pools mit Zellen der Säugerzellinie BHK in Kontakt gebracht. Die Länge der DNA-Spezies betrug 146 Basenpaare, umfassend einen randomisierten Anteil mit 100 Basenpaaren und terminale Primersequenzen mit je 23 Basenpaaren. Die Komplexität des DNA-Pools betrug 1013 unterschiedliche DNA-Moleküle bzw. Spezies. Die BHK-Zellen (ca. 107 Zellen) wurden mit dem DNA-Pool für 24 Stunden inkubiert. Nach dem ausgiebigen Waschen folgte die Isolierung der Nukleinsäure-haltigen Bestandteile der Zellen (intrazelluläre Frak tion). Dieses Isolat diente sodann als Matrize für eine präparative PCR mit Hilfe von Primern, die an die terminalen Primersequenzen der eingesetzen DNA-Spe zies bindeten. Im nächsten Selektionsschritt wurden die mit Hilfe der präparati ven PCR erhaltenen und danach isolierten Amplifikate wieder mit BHK-Zellen inkubiert. Nach fünf solcher Selektionstypen mit den BHK-Zellen wurde die Aufnahme von DNA-Spezies aus dem DNA-Pool bereits um einen Faktor von 10 bis 100 gesteigert. Wird nach diesem Selektionsschema der Punkt erreicht, an dem auch nach weiteren Selektionsrunden keine weitere Verbesserung der zellulären DNA-Aufnahme erfolgt, werden die selektierten DNA-Spezies kloniert und strukturell sowie funktionell charakterisiert.In Fig. 1, the selection protocol for the identification of DNA signal sequences that cause the uptake of DNA in culture cells is shown. 10 μg of a DNA pool were brought into contact with cells from the BHK mammalian cell line. The length of the DNA species was 146 base pairs, comprising a randomized portion with 100 base pairs and terminal primer sequences with 23 base pairs each. The complexity of the DNA pool was 10 13 different DNA molecules or species. The BHK cells (approx. 10 7 cells) were incubated with the DNA pool for 24 hours. After extensive washing, the nucleic acid-containing components of the cells were isolated (intracellular fraction). This isolate then served as a template for a preparative PCR using primers that bound to the terminal primer sequences of the DNA species used. In the next selection step, the amplicons obtained using the preparative PCR and then isolated were incubated again with BHK cells. After five such types of selection with the BHK cells, the uptake of DNA species from the DNA pool had already been increased by a factor of 10 to 100. If, according to this selection scheme, the point is reached at which there is no further improvement in cellular DNA uptake after further selection rounds, the selected DNA species are cloned and structurally and functionally characterized.
Claims (18)
- a) Züchten des Wirtsorganismus nach Anspruch 8 in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen und
- b) Isolieren des gewünschten Produkts aus dem Medium und/oder dem Wirtsorganismus.
- a) culturing the host organism according to claim 8 in a suitable medium under suitable conditions and
- b) isolating the desired product from the medium and / or the host organism.
- a) Isolieren einer Nukleinsäure, die von Zellen selektiv aus einer Vielzahl von Nukleinsäuren aufgenommen wird, wobei die Vielzahl der Nu kleinsäuren Nukleotidsequenzen aufweisen, die sich mindestens teilweise voneinander unterscheiden, und
- b) Bestimmen der Nukleotidsequenz der in Schritt (a) isolierten Nu kleinsäure.
- a) isolating a nucleic acid which is selectively taken up by cells from a large number of nucleic acids, the large number of nucleic acids having nucleotide sequences which are at least partially different from one another, and
- b) determining the nucleotide sequence of the nucleic acid isolated in step (a).
- a) das Inkontaktbringen der Zellen für einen geeigneten Zeitraum mit der Vielzahl von Nukleinsäuren, wobei die Zellen selektiv Nukleinsäu ren aus der Vielzahl von Nukleinsäuren aufnehmen,
- b) das Isolieren der Nukleinsäure-haltigen Bestandteile der Zellen,
- c) das Detektieren der von den Zellen selektiv aus der Vielzahl der Nukleinsäuren aufgenommenen Nukleinsäuren in den Nukleinsäure haltigen Bestandteilen der Zellen von (ii), und
- d) das Isolieren der im Schritt (iii) detektierten, selektiv von den Zellen aufgenommenen Nukleinsäuren umfaßt.
- a) contacting the cells for a suitable period of time with the large number of nucleic acids, the cells selectively taking up nucleic acids from the large number of nucleic acids,
- b) isolating the nucleic acid-containing components of the cells,
- c) the detection of the nucleic acids selectively taken up from the plurality of nucleic acids by the cells in the nucleic acid-containing components of the cells of (ii), and
- d) isolating the nucleic acids detected in step (iii) and selectively taken up by the cells.
- a) das Wiederholen der Schritte (i) bis (iv), bis sich der Anteil der aus der Vielzahl von Nukleinsäuren selektiv aufgenommenen Nukleinsäu ren an den Nukleinsäure-haltigen Bestandteilen der Zellen nicht mehr ändert, wobei jeweils im Schritt (i) die im Schritt (iv) isolierten Nu kleinsäuren mit den Zellen in Kontakt gebracht werden, umfaßt.
- a) repeating steps (i) to (iv) until the proportion of the nucleic acids selectively taken up from the large number of nucleic acids in the nucleic acid-containing constituents of the cells no longer changes, in each case in step (i) the step (iv) isolated nucleic acids are contacted with the cells.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1999133506 DE19933506A1 (en) | 1999-07-16 | 1999-07-16 | Cellular uptake of DNA |
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