DE19929365A1 - New genes from Corynebacterium glutamicum, useful for modifying cells for production of primary or secondary metabolites, e.g. amino or fatty acids - Google Patents
New genes from Corynebacterium glutamicum, useful for modifying cells for production of primary or secondary metabolites, e.g. amino or fatty acidsInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit den Herstellungsverfah ren für Primär- und Sekundärmetabolite mit Hilfe eines gentech nisch veränderten Organismus. Diese Erfindung besteht in Teil sequenzen von Genen, die anabolische und katabolische Enzyme aus Corynebacterium glutamicum kodieren, und aus ihrem Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Metaboliten.The present invention is concerned with the manufacturing process ren for primary and secondary metabolites with the help of a genetic engineering nichically modified organism. This invention is in part sequences of genes made up of anabolic and catabolic enzymes Coding Corynebacterium glutamicum, and from their use for microbial production of metabolites.
Die Konzentrationen der Metabolite sind in lebenden Zellen ge wöhnlich gut ausbalanciert und überschreiten nicht eine gewisse Grenze. Unter manchen Wachstumsbedingungen oder als Folge einer gentechnischen Veränderung können sie allerdings im Überschuß gebildet und in das Kulturmedium ausgeschieden werden. Für das Zellwachstum kann man relativ billige Stoffe als Kohlenstoff quelle verwenden. Mit Hilfe des biochemischen Potentials der Zellen (in den meisten Fällen mikrobiellen Ursprungs) oder der Enzyme lassen sich diese preiswerten Stoffe in ein breites Spektrum wertvollerer Substanzen umwandeln. Zur fermentativen Herstellung von Metaboliten zu Verkaufszwecken setzt man ins besondere Mikroorganismen ein. Mikroorganismen lassen sich durch gentechnische Veränderung der Biosynthesewege in ihrer Biosynthe seleistung auf bestimmte Metabolite hin optimieren, und man erzielt dadurch höhere Syntheseleistungen. Gentechnische Verände rung meint hier, daß die Anzahl der Kopien oder die Geschwindig keit der Transkription bestimmter Gene für bestimmte Synthesewege erhöht ist. Allerdings muß man die geeigneten Zielgene für diese Verbesserung zuerst identifizieren. Wir beschreiben nun im fol genden die Zielgene und Teilsequenzen davon, die durch Klonen der DNA und anschließende Sequenzierung mit dem Ziel der Stammverbes serung identifiziert wurden.The concentrations of the metabolites are in living cells usually well balanced and don't exceed a certain one Border. Under some growing conditions or as a result of one However, they can use genetic engineering in excess formed and excreted in the culture medium. For the Cell growth can be called relatively cheap substances as carbon use source. With the help of the biochemical potential of Cells (in most cases of microbial origin) or the Enzymes can be used in a wide range of these inexpensive substances Convert spectrum of more valuable substances. For fermentative The production of metabolites for sales purposes is used special microorganisms. Microorganisms can pass through genetic modification of the biosynthetic pathways in their biosynthesis optimize performance for certain metabolites, and man thereby achieves higher synthesis performances. Genetic engineering changes here means that the number of copies or the speed ability to transcribe certain genes for certain synthetic routes is increased. However, one must have the appropriate target genes for this Identify improvement first. We now describe in fol the target genes and partial sequences thereof by cloning the DNA and subsequent sequencing with the aim of the parent verb were identified.
Ein Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 1 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 1 durch Substitution, Inser tion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Part of the invention consists of a gene fragment with a Nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 1 is described or differ from this sequence SEQ ID NO. 1 by substitution, insertion tion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 2 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 2 durch Substitution, In sertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet. Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 2 is described or from this sequence SEQ ID NO. 2 by substitution, In sertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 3 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 3 is described or from this sequence SEQ ID NO. 3 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 4 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 4 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 4 is described or from this sequence SEQ ID NO. 4 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 5 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 5 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 5 is described or from this sequence SEQ ID NO. 5 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 6 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 6 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 6 is described or from this sequence SEQ ID NO. 6 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 7 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 7 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 7 is described or from this sequence SEQ ID NO. 7 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 8 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 8 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 8 is described or from this sequence SEQ ID NO. 8 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 9 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 9 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 9 is described or from this sequence SEQ ID NO. 9 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 10 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 10 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 10 is described or from this sequence SEQ ID NO. 10 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 11 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 11 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet. Another part of the invention consists in a gene fragment a nucleotide sequence set out in SEQ ID NO. 11 is described or from this sequence SEQ ID NO. 11 by substitution, Insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht im Einsatz der Nucleotid sequenz SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 6 oder SEQ ID NR. 7 oder SEQ ID NR. 8 oder SEQ ID NR. 9 oder SEQ ID NR. 10 oder SEQ ID NR. 11 zur Konstruktion genetisch modifizierter Mikroorga nismen.Another part of the invention is the use of the nucleotide sequence SEQ ID NO. 1 or SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 8 or SEQ ID NO. 9 or SEQ ID NO. 10 or SEQ ID NO. 11 for the construction of genetically modified microorganisms nisms.
Die vollständigen Gene lassen sich mit Hilfe konventioneller Techniken wie Hybridisierung herstellen, wobei man von den oben offenbarten Genfragmenten ausgeht. Diese Gene lassen sich einset zen zur Konstruktion rekombinater Wirtsorganismen, die die Bio synthese wertvoller Bioprodukte, wie Aminosäuren, Fettsäuren, Kohlenhydrate, Vitamine und Kofaktoren ermöglichen. Die biologi sche Aktivität dieser Gene wird im experimentellen Teil dieser Beschreibung offenbart. Mit Hilfe dieser Gene wird es möglich, Engpässe bei der Biosynthese von Bioprodukten zu umgehen und so die Syntheseleistung mikrobieller Systeme zu steigern.The complete genes can be extracted using conventional ones Establish techniques such as hybridization using one of the above disclosed gene fragments. These genes can be used zen for the construction of recombinant host organisms that the Bio synthesis of valuable organic products, such as amino acids, fatty acids, Allow carbohydrates, vitamins and cofactors. The biologi cal activity of these genes is in the experimental part of this Description disclosed. With the help of these genes it becomes possible To avoid bottlenecks in the biosynthesis of organic products and such to increase the synthesis performance of microbial systems.
Ein weiterer Gesichtspunkt dieser Erfindung besteht in einem Expressions-Vektor mit zumindest einem der oben erwähnten Poly nucleotide. Der Expressions-Vektor verbindet funktionell eines oder mehrere dieser Polynucleotide mit regulatorischen Einheiten wie Promotoren, Terminatoren, ribosomale Bindungsstellen und der gleichen. Gewöhnlich gehören zu einem Expressions-Vektor weitere Einheiten wie Genmarker und Replikationsabschnitte.Another aspect of this invention is one Expression vector with at least one of the poly mentioned above nucleotides. The expression vector functionally combines one or more of these polynucleotides with regulatory units such as promoters, terminators, ribosomal binding sites and the same. An expression vector usually includes more Units such as gene markers and replication sections.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung besteht in der mit einem Expressions-Vektor transformierten Wirtszelle.Another aspect of the invention is that of a Expression vector transformed host cell.
Zur gentechnischen Veränderung kann man jeden beliebigen proka ryontischen Mikroorganismus verwenden, vorzugsweise Corynebacte rium- und Bacillus-Arten, aber auch jeden beliebigen eukaryonti schen Mikroorganismus, vorzugsweise Hefestämme der Gattung Ashbya, Candida, Pichia, Saccharomyces und Hansenula.Any proka can be used for genetic modification use ryontic microorganism, preferably corynebacte rium and Bacillus species, but also any eukaryonti microorganism, preferably yeast strains of the genus Ashbya, Candida, Pichia, Saccharomyces and Hansenula.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung besteht in einer Methode
zur Herstellung und Reinigung eines Polypeptids, die in folgenden
Schritten besteht:
Another aspect of the invention is a method for preparing and purifying a polypeptide, which consists of the following steps:
- a) Kultivierung der Wirtszelle aus Anspruch 3 unter Bedingungen, die für die Expression des Peptids geeignet sind; unda) culturing the host cell from claim 3 under conditions, which are suitable for the expression of the peptide; and
- b) Gewinnung des Polypeptids aus der Wirtszellkultur.b) obtaining the polypeptide from the host cell culture.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung detaillierter be schrieben. In the following examples, the invention will be described in more detail wrote.
Die DNA aus dem Genom von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 läßt sich nach Standardmethoden gewinnen, die z. B. von Altenbuch ner, J. und Cullum, J. (1984, Mol. Gen. Genet. 195 : 134-138) be schrieben sind. Die Genom-Bibliothek läßt sich daraus mit jedem beliebigen Klonierungsvektor, z. B. pBluescript II KS-(Strata gene) oder ZAP ExpressTM (Stratagene), nach Standardvorschriften gewinnen (z. B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Jede beliebige Fragmentgröße kann man dabei verwenden, vorzugsweise Sau3AI-Fragmente mit einer Länge von 1 kb, die sich in Klonie rungsvektoren mit verdautem BamHI einbinden lassen.The DNA from the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 can be obtained by standard methods which, for. B. from Altenbuch ner, J. and Cullum, J. (1984, Mol. Gen. Genet. 195: 134-138) be written. The genome library can be used with any cloning vector, e.g. B. pBluescript II KS- (Strata gene) or ZAP Express ™ (Stratagene), according to standard regulations (e.g. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Any fragment size can be used, preferably Sau3AI fragments with a length of 1 kb, which can be integrated into cloning vectors with digested BamHI.
Aus der im Beispiel 1 hergestellten Genombibliothek kann man ein zelne E, coli-Klone auswählen. E. coli-Zellen werden nach Standardmethoden in geeigneten Medien kultiviert (z. B. LB ergänzt mit 100 mg/l Ampicillin), und danach läßt sich dann die Plasmid- DNA isolieren. Klont man Genomfragmente aus der DNA von Coryne bacterium glutamicum in pBluescript II KS- (siehe Beispiel 1), läßt sich die DNA mit Hilfe der Oligonucleotide 5'- AATTAAC- CCTCACTAAAGGG-3' und 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' sequenzieren.One can from the genome library produced in Example 1 select individual E, coli clones. E. coli cells are named after Standard methods cultivated in suitable media (e.g. LB supplemented with 100 mg / l ampicillin), and then the plasmid Isolate DNA. Cloning genome fragments from Coryne's DNA bacterium glutamicum in pBluescript II KS- (see example 1), can the DNA with the help of the oligonucleotides 5'- AATTAAC- Sequence CCTCACTAAAGGG-3 'and 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'.
Die Nucleotidsequenzen lassen sich z. B. mit Hilfe des BLASTX-A1- gorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-410) aneinanderfügen. Auf diesem Weg kann man neuartige Sequenzen ent decken und die Funktion dieser neuartigen Gene aufklären.The nucleotide sequences can be e.g. B. using the BLASTX-A1- algorithm (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) join together. In this way, new sequences can be created cover and elucidate the function of these novel genes.
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 1 beschrieben ist. Bei der Anwen dung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Sequenz Ähnlichkeit mit Fettsäuresynthasen aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit einem Fragment mit 519 Basenpaaren für die Fettsäuresynthase aus Corynebacterium ammo niagenes gegeben (NRDB Q04846; 68% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written, to which the one described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence as shown with SEQ ID NO. 1 is described. With the user The BLASTX algorithm (see Example 3) yielded this Sequence similarity with fatty acid synthases from different Organisms. The greatest similarity was with a fragment with 519 Base pairs for the fatty acid synthase from Corynebacterium ammo niagenes given (NRDB Q04846; 68% match at the level of amino acids).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 2 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Phytoen-Dehydrogenasen aus verschiedenen Organis men. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit der Phytoen-Dehydro genase aus Methanobacterium thermoautotrophicum (NRDB 027835; 37% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that is identified as SEQ ID NO. 2 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to phytoene dehydrogenases from different organisms men. The greatest similarity was found with the phytoene dehydro genase from Methanobacterium thermoautotrophicum (NRDB 027835; 37% Amino acid level match).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 3 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Alkohol-Dehydrogenasen aus verschiedenen Organis men. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit der Alkohol-Dehydroge nase aus Bacillus stearothermophilus (NRDB P42327; 50% überein stimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that is identified as SEQ ID NO. 3 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to alcohol dehydrogenases from different organisms men. The greatest similarity was with alcohol dehydrogen Bacillus stearothermophilus nose (NRDB P42327; 50% match mood at the level of amino acids).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 4 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Adenosylmethionin-8-Amino-7-oxononanoat-Amino transferasen aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 342 Basenpaaren bestehenden Fragment für die Adenosylmethionin-8-amino-7-oxononanoat-Aminotransferase aus Erwinia herbicola (NRDB P53656; 40% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that is identified as SEQ ID NO. 4 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to adenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate-amino transferases from different organisms. The greatest similarity resulted with a fragment consisting of 342 base pairs for the adenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate aminotransferase Erwinia herbicola (NRDB P53656; 40% match at the level of amino acids).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 5 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Phosphoglycerat-Mutasen 2 aus verschiedenen Orga nismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 204 Ba senpaaren bestehenden Fragment für die Phosphoglycerat-Mutase 2 aus Mycobacterium tuberculosis (NRDB P71724; 54% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that is identified as SEQ ID NO. 5 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to phosphoglycerate mutases 2 from different organizations nisms. The greatest similarity arose out of 204 Ba Pair of existing fragments for phosphoglycerate mutase 2 from Mycobacterium tuberculosis (NRDB P71724; 54% agreement at the amino acid level).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 6 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Xylulose-Kinasen aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 633 Basenpaaren bestehenden Fragment für die Xylulose-Kinase aus Streptomyces rubiginosus (NRDB P27156; 48% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that is identified as SEQ ID NO. 6 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to xylulose kinases from different organisms. The greatest similarity was with one of 633 base pairs existing fragment for the xylulose kinase from Streptomyces rubiginosus (NRDB P27156; 48% match at the level of Amino acids).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 7 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Fettsäure-CoA-Ligasen für langkettige Fettsäuren aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 369 Basenpaaren bestehenden Fragment für die Fett säure-CoA-Ligase für langkettige Fettsäuren aus Archaeoglobus fulgidus (NRDB 030302; 48% Übereinstimmung auf der Stufe der Ami nosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that is identified as SEQ ID NO. 7 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to fatty acid CoA ligases for long chain fatty acids from different organisms. The greatest similarity emerged with a 369 base pair fragment for the fat Acid-CoA ligase for long-chain fatty acids from Archaeoglobus fulgidus (NRDB 030302; 48% agreement at Ami level nonacids).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 8 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Guanosinpentaphophat-Synthetasen aus verschiede nen Organismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 606 Basenpaaren bestehenden Fragment für die Guanosinpentapho phate-Synthetase aus Streptomyces coelicolor (NRDB 086656; 70% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that is identified as SEQ ID NO. 8 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to guanosine pentaphophate synthetases from various organisms. The greatest similarity came from one 606 base pair fragment for the guanosine pentapho phate synthetase from Streptomyces coelicolor (NRDB 086656; 70% Amino acid level match).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 9 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit NTRB-Homologen aus verschiedenen Organismen. NTRB ist ein Regulatorgen für die Tanskription, das an der Regulierung der Stickstoffassimilation beteiligt ist. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 645 Basenpaaren bestehenden Fragment für NTRB aus Mycobacterium leprae (NRDB Q50049; 61% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren). When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that appears as SEQ ID NO. 9 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to NTRB homologues from different organisms. NTRB is a regulatory gene for transcription that is involved in regulation involved in nitrogen assimilation. The greatest similarity resulted with a fragment consisting of 645 base pairs for NTRB from Mycobacterium leprae (NRDB Q50049; 61% agreement at the amino acid level).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 10 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit nifS aus verschiedenen Organismen. NifS ist an der Stickstoffixierung beteiligt. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 594 Basenpaaren bestehenden Fragment für nifs aus Mycobacterium leprae (NRDB Q49690; 62% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that appears as SEQ ID NO. 10 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to nifS from different organisms. NifS is on involved in nitrogen fixation. The greatest similarity was found with a 594 base pair fragment for nifs from Mycobacterium leprae (NRDB Q49690; 62% agreement the level of amino acids).
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 11 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit nifU aus verschiedenen Organismen. NifU ist an der Stickstoffixierung beteiligt. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 339 Basenpaaren bestehenden Fragment für nifU aus Mycobacterium leprae (NRDB Q49683; 61% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).When analyzing the E. coli clones as described in Example 2 was written and to which the described in Example 3 An analysis of the sequences obtained was followed by one Sequence that is identified as SEQ ID NO. 11 is described. When using of the BLASTX algorithm (see Example 3) showed this sequence Similarity to nifU from different organisms. NifU is on involved in nitrogen fixation. The greatest similarity was found with a 339 base pair fragment for nifU from Mycobacterium leprae (NRDB Q49683; 61% agreement the level of amino acids).
Claims (4)
- a) Kultivierung der Wirtszelle aus Anspruch 3 unter Bedin gungen, die für die Expression des Peptids geeignet sind; und
- b) Gewinnung des Polypeptids aus der Wirtszellkultur.
- a) cultivation of the host cell from claim 3 under conditions that are suitable for the expression of the peptide; and
- b) obtaining the polypeptide from the host cell culture.
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