DE19882655B4

DE19882655B4 - Verfahren zur Herstellung einer Sonde für die Nukleinsäurehybridisierung

Info

Publication number: DE19882655B4
Application number: DE19882655T
Authority: DE
Inventors: Mikael Kubista; Nicke Svanwik; Gunnar Westman
Original assignee: LightUp Technologies AB
Current assignee: LightUp Technologies AB
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2018-09-05
Also published as: GB2344823A; GB0006174D0; JP2001515923A; GB2344823B; SE522077C2; DE19882655T1; AU9100598A; SE9703251D0; US6461871B1; SE9703251L; WO1999013105A1

Abstract

Verfahren zum Herstellen von Sonden mit Oligodesoxyribonukleinsäuren oder Nukleinsäuresäureanalogen mit einem Sequenzerkennungsteil (SET) und einer Reportergruppe (RG), wobei die Sonden hinreichend komplementär für unterschiedliche Teile einer Zielnukleinsäure sind
gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
a) Erzielen einer Testmatrix mit einer Anzahl der Sonden,
b) Bestimmen des Hintergrundsignals der Sonden in Abwesenheit der Zielnukleinsäure,
c) Hybridisieren der Zielnukleinsäure zu den Sonden,
d) Bestimmen des Signals der Sonden in Anwesenheit der Zielnukleinsäure,
e) Auswählen der Sonden, die den größten Unterschied im Signal zwischen der Abwesenheit und der Anwesenheit der Zielnukleinsäure aufweisen.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Sonden, insbesondere die Herstellung von selektiven Sonden für die Identifizierung von Nukleinsäuren, eine Matrix, die diese Sonden umfasst und die Verwendung dieser Sonde für die Hybridisierung von Nukleinsäuren.

Hintergrund der Erfindung

Sonden für die Hybridisierung von Nukleinsäuren werden verwendet, um das Vorhandensein einer bestimmten Nukleinsäure in einer Testlösung aufzuzeigen. Herkömmliche Sonden erzeugen keine erkennbaren Unterschiede hinsichtlich nachweisbarer Merkmale im freien und hybridisierten Zustand, vielmehr wird die Nukleinsäure durch Trennen hybridisierter und nicht hybridisierter Sonden bestimmt (Gillespie & Spiegelman, J. Mol. Biol. 12,829,1956). Homogene Testverfahren verwenden allerdings Sonden, deren Signale sich bei der Hybridisierung verändern (1). Diese Sonden sind aus einem Sequenzerkennungsteil (SET) und einer Reportergruppe (RG) zusammengesetzt (2), worin der SET in der Regel eine synthetische Oligodesoxyribonukleinsäure (Barton, J. US-A-5,157,032; Yamana et al., Nucl. & Nucl. 11 (2–4),383,1992; Linn et al., EP-A-0 710 668, US-A5,597,696) oder ein Nukleinsäureanalog (Kubista, PCT/SE97/00953) ist. Die RG ist normalerweise ein Farbmittel, dessen Fluoreszenz sich bei der Bindung an eine Nukleinsäure verstärkt. Wie durch Nygren et al., Biopol., 46, 39–51 (1998) gezeigt wurde, sind die Eigenschaften dieser Farbmittel stark von der Sequenz der Nukleinsäure abhängig. Dieses führt, wie in der PCT/SE/97/0095 gezeigt ist, zu der Tatsache, dass sowohl die Hintergrundfluoreszenz der freien Sonden als auch die Fluoreszenz der hybridisierten Sonden von der Sequenz der SETs und daher von der gewählten Zielsequenz (MS), die komplementär zum SET ist, abhängen. Des Weiteren ist es wahrscheinlich, dass sogar die Sequenz, die der MS am nächsten ist, wichtig ist.

EP 0 231 495 A2 betrifft ein Verfahren zum Erkennen der Anwesenheit eines Zielpolynukleotiden oder zum Verhindern einer Transkription oder Translation eines Zielpolynukleotiden, wobei zu dem Verfahren die Hybridisierung einer Polynukleotidverbindung zu einem Zielpolynukleotiden gehört. Offenbart ist ein homogenes Testverfahren, bei dem eine Änderung der "Eigenschaft" besteht, wenn die Hybridisierung erfolgt. Offen bleibt, wie Sonden mit einem großen Unterschied im Signal zwischen dem nicht hybridisierten und dem hybridisierten Zustand auszuwählen sind.

EP 0 492 570 A1 betrifft ein Verfahren zum Erkennen der Anwesenheit eines Zielpolynukleotiden durch Benutzen einer Sonde, die ein zwischengeschaltetes Molekül umfasst. Hier wird ein Hintergrundreduktionsmittel zum chemischen Modifizieren der Sonde verwendet, um das Signal der Sonde zu reduzieren, wenn sie nicht an die Zielnukleinsäure gebunden ist. Das Problem des Hintergrundsignals von einer ungebundenen Sonde wird hier nicht durch Bauen und Auswählen von Sonden mit einem großen Unterschied im Signal zwischen dem nicht hybridisierten und dem hybridisierten Zustand gelöst, sondern durch Nutzen eines Hintergrundreduktionsmittels.

EP 0 710 668 A2 beschreibt Konjugate von Cyaninfarbstoffen und einem Oligonukleotid, wobei die Konjugate ihre Fluoreszenzeigenschaften ändern, wenn sie an ein Ziel gebunden sind. Es ist nichts darüber offenbart, wie spezifische Sonden mit dem größten Unterschied in der Fluoreszenz zwischen dem nicht hybridisierten und dem hybridisierten Zustand auszuwählen sind.

EP 0 714 986 A1 beschreibt ein homogenes Prüfungsverfahren, bei dem ein einsträngiges Oligonukleotid, das mit einem zwischengeschalteten Molekül markiert ist, zu einer Zielnukleinsäure hybridisiert wird. Wenn das einsträngige Oligonukleotid zu einer Zielnukleinsäure hybridisiert wird, werden die Eigenschaften der zwischengeschalteten Markierung geändert und eine Hybridisierung kann erkannt werden. In D4 ist nichts darüber offenbart, wie Sonden mit einem großen Unterschied im Signal zwischen dem nicht hybridisierten und dem hybridisierten Zustand auszuwählen sind. WO 92/20703 A1 offenbart PNA-Sonden, bespricht jedoch die Auswahl von Sonden mit einem großen Unterschied im Signal zwischen dem nicht hybridisierten und dem hybridisierten Zustand nicht. Die Veröffentlichung "PERRY-O'KEEFE, H. u.a." offenbart fluoreszierend markierte PNA-Sonden ohne darauf einzugehen, wie Sonden mit großem Unterschied im Signal zwischen dem nicht hybridisierten und dem hybridisierten Zustand auszuwählen sind. Schließlich offenbart die Veröffentlichung "TIMCHEVA, I.I. u.a." neue Cyaninfarbstoffe, die imstande sind, zwischen ein- und zweisträngigen Polynukleotiden zu unterscheiden, jedoch nichts über die Auswahl von Sonden, die diese Farbstoffe umfassen.

Nukleinsäuren können in der Regel selektiv bestimmt werden, indem eine große Anzahl von Sonden die sich im SET-Teil unterscheiden, verwendet wird, wobei verschiedene MSs erkannt werden, welche einmalige Segmente der Nukleinsäure bilden. Eine Nukleinsäure mit der Länge m umfasst m+n+1-Strecken der Länge n, die alle potentielle MS sind. Da die Länge der MS nicht besonders lang sein braucht, um einmalig zu sein, (eine Strecke mit 15 Basen scheint ein Durchschnitt einmal pro 415–109 Basen zu sein), kann eine große Anzahl von Sonden auf eine bestimmte Nukleinsäure gerichtet sein. Ein Genom mit 1000 Basen, das für einen Virus ziemlich charakteristisch ist, kann unter Verwendung von 981 Sonden mit der Länge von 20 Basen, 982 mit der Länge von 19, 983 mit der Länge von 18, etc. bestimmt werden. Bakteriengenome, die beträchtlich größer sind, können unter Verwendung einer noch größeren Anzahl von verschiedenen Sonden bestimmt werden. Zur Bestimmung einer bestimmten Mutation ist die Auswahl eingeschränkter, weil die Sequenz der Sonde die mutmaßliche Mutation überlappen muss, allerdings gibt es da verschiedene Alternativen.

In der PCT/SE97/00953 wählt man die Sequenz des SETs, ausgehend von der Kenntnis der bekannten Eigenschaften der RG, und für asymmetrische Cyaninfarbstoffe werden SETs endständige Basen, vorzugsweise gemischte Pyrimidine (-TT oder -CT) vorgeschlagen. Diese Strategie weist allerdings verschiedene Einschränkungen auf. Einerseits sind ausführliche Untersuchungen der Eigenschaften des Farbstoffs erforderlich, die nicht einfach auf die Eigenschaften der Sonden übertragen werden können, was auf die Unterschiede hinsichtlich experimenteller Bedingungen, etc. zurückzuführen ist, und andererseits die Sequenzerfordernisse als Regel für eine unbestimmte Anzahl von Sequenzen (1/8 aller Sequenzen, zum Beispiel die Enden mit entweder -TT oder -CT). Schließlich gibt es keine Betrachtungen hinsichtlich der Sequenz, die der MS am nächsten ist.

Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme. Im Grunde ist sie eine Methode, um zu bestimmen, welche aus einer großen Anzahl von potentiellen Sonden entspricht einer bestimmten Nukleinsäure, die das geringste Hintergrundsignal aufweist und welche davon erhält das stärkste Signal bei der Hybridisierung. Der Unterschied bei den Bestimmungen liegt im Anstieg der Signalstärke, die bei der Verwendung der verschiedenen Sonden erhalten wird.

Beschreibung der Figuren

1 Prinzip für den homogenen Test

2 Sonde für einen homogenen Test, die einen Sequenzerkennungsteil (SET) und eine Reportergruppe (RG) umfasst.

3 Prinzip zur Erläuterung, wie die geeignetste Sonde für eine Nukleinsäure im Hinblick auf die Empfindlichkeit identifiziert werden kann:

A: Beispiele von Sonden, die alle die gleiche Nukleinsäure erkennen.
B: Die Sonden, die an eine feste Matrix synthetisiert sind
C: Fluoreszenz der Sonden, die im freien und auch im hybridisierten Zustand beobachtet wurden, wobei diese, die den größten Anstieg in der Signalstärke erzeugen, die geeignetsten sind.

4 zeigt verschiedene Sonden und ihre verschiedenen Fluoreszenzintensitäten vor der Hybridisierung.

5 erläutert den Aufbau einer Sonde, die in einem Ausführungsbeispiel beschrieben ist, zusammen mit einer Sequenzmodifikation der verschiedenen Proben, deren Intensitäten in 4 gezeigt sind.

Beschreibung der Erfindung

Desoxyribonukleinsäuren und verschiedene Nukleinsäureanaloge, wie Peptidnukleinsäuren (PNA) werden im Allgemeinen unter Anwendung der Festphasensynthese, die unter anderem die Synthese einer großen Anzahl von Fragmenten mit verschiedenen Sequenzen und unterschiedlichen Längen ermöglicht, und auch an einer Matrix (Khrapko et al., FEBS Lett. 256, 118, 1989, Southern E., et al., Genomics 13, 1008, 1992; Caviani-Pease, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 91, 5022, 1994; Weiler at al, Nucl. Acids Res. 25, 2792, 1997) synthetisiert. Die Fragmente an dieser Matrix können mit einer markierten Nukleinsäure, beispielsweise mit fluoresszierenden oder radioaktiven Gruppen, hybridisiert werden, und der Grad der Hybridisierung kann aus dem Signal der Nukleinsäure bestimmt werden. Diese Technologie hat verschiedene Anwendungen und wird oftmals als DNA-Chiptechnologie bezeichnet.

In der vorliegenden Erfindung wird die DNA-Chiptechnologie angewendet, um zu bestimmen, welche aus einer großen Anzahl von Sonden, die alle genug Spezifität aufweisen, eine bestimmte Nukleinsäure, die für die Nukleinsäurehybridisierung geeignet ist, erkennt, und dann vorzugsweise in einer homogenen Lösung. Sonden, zum Beispiel Oligodesoxyribonukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloge, die mit einer RG versehen sind und komplementär und spezifisch genug für eine bestimmte Nukleinsäure sind, werden an einer Matrix synthetisiert (3). Das Signal, vorzugsweise Fluoreszenz, das sie verursachen, das heißt, das Hintergrundsignal, wird überwacht. Dann wird eine bestimmte Nukleinsäure hinzugegeben und die Fluoreszenz, dieses Mal von den hybridisierten Sonden, wird aufgezeichnet. Der Unterschied in der Signalstärke bei diesen Bestimmungen ist der Anstieg der Signalstärke, der durch die verschiedenen Sonden erhalten wird. Diejenigen, die den größten Unterschied in der Signalstärke zeigen, sind diejenigen, die im Hinblick auf die Empfindlichkeit die am meisten geeigneten sind.

Verschiedene Matrixmaterialien können verwendet werden, wie Cellulosesubstrate, Metallsubstrate und Polymersubstrate. Bei der Verwendung von Metallsubstraten ist das Metall oftmals mit einer Beschichtung aus einer Aminosäure versehen, um die Haftung zu erleichtern. Bei der Verwendung von Cellulosesubstraten wird ein erstes Nukleotid an das Substrat gebunden, wonach weitere Nukleotide an das erste, das gebunden wurde, synthetisiert werden, bis man eine geeignete Nukleotidsequenz erhalten hat.

Die vorliegenden Proben können für die Analyse einer Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuren in Form von mRNA, DNA, PNA, PNA-PNA-Komplexe oder DNA-PNA-Komplexe verwendet werden.

Der Unterschied in der Signalstärke bei der Hybridisierung kann entweder durch die Sonden, die ihre Eigenschaften ändern, den Signalunterschied im nicht hybridisierten Zustand gegenüber dem hybridisierten Zustand erhalten werden, oder man hybridisiert an eine markierte Nukleinsäure unter Verwendung einer anderen Reportergruppe RG', wobei der Unterschied in der Signalstärke erhalten wird, wenn sich die RG-Gruppe der Sonde und die RG'-Gruppe der Ziel-DNA aneinander nähern. Die RG und RG' können gleich oder unterschiedlich sein. In einem System, das Pyren enthält, verändern die Fluoreszenzeigenschaften beträchtlich, wenn zwei Pyrene miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei eine Eximer-Fluoreszenz erhalten wird. Beispiele für zwei verschiedene RG und RG sind Energieübertragungspaa re, wie Fluorescein/Tetramethylrhodamin oder ein Fluorophorm/Quencherpaar.

Die Erfindung wird nun nachfolgend mit Bezug auf ein Beispiel beschrieben, das die Erfindung erläutern soll, ohne diese allerdings darauf einzuschränken.

Fünfzehn 10-Basenpaare lange PNA-Thiazolorange-Sonden, die zu verschiedenen Segmenten der Sequenz GTCAGATGAGGAAGAGGCTATTGT komplementär sind und eine Sonde, die in paralleler Orientierung zu der zentralen Polypurinregion ist, wurden auf eine Perspektiv-PP-NH₂-Membran (die aus der Membran mit einem PEG-500-Glu-Lys-Capronsäure-Linker abgetrennt wurde), mit einem automatisierten SPOT-Roboter AMIMED ASP 222 (Weiler, J. et al., Nuclein Acids Res. 25,2792 (1997) 1) synthetisiert. Die PNA-Momomere wurden nach der Beschreibung von Weiler et al. supra gebunden. Im letzten Schritt wurde der Thiazolorange-Farbstoff, der mit einem Carbonsäurealkyllinker substituiert war, aktiviert und dann in der gleichen Weise wie die Fmoc-PNA-Monomere umgesetzt. Nach der Synthese wurden die Seitenkettenschutzgruppen von den PNA-Oligomeren durch Behandlung mit 90 % TFA/5 % Wasser/5 % Triethylsilan für 1 Stunde (TFA = Trifluoressigsäure) entfernt.
Die Membran wurde dann in einem 10 mmol/l Boratbuffer bei einem pH von 8,5, der 100 mmol/l NaCl enthielt, für zwei Stunden befeuchtet, und sie wurde mit einer Standard-UV-Lampe mit λ_max = 312 nm belichtet und mit einer CCD-Kamera fotografiert (4). Die Hintergrundfluoreszenz der Sonden wurde mit Bezug auf die Probe 16 (CCTCTTCCTCTO) ausgedrückt, die die schwächste Intensität vor der Hybridisierung zeigte und von daher zu erwarten ist, dass sie den größten Unterschied in der Signalstärke nach der Hybridisierung zeigt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zum Herstellen von Sonden mit Oligodesoxyribonukleinsäuren oder Nukleinsäuresäureanalogen mit einem Sequenzerkennungsteil (SET) und einer Reportergruppe (RG), wobei die Sonden hinreichend komplementär für unterschiedliche Teile einer Zielnukleinsäure sind gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Erzielen einer Testmatrix mit einer Anzahl der Sonden, b) Bestimmen des Hintergrundsignals der Sonden in Abwesenheit der Zielnukleinsäure, c) Hybridisieren der Zielnukleinsäure zu den Sonden, d) Bestimmen des Signals der Sonden in Anwesenheit der Zielnukleinsäure, e) Auswählen der Sonden, die den größten Unterschied im Signal zwischen der Abwesenheit und der Anwesenheit der Zielnukleinsäure aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der SET eine Peptidnukleinsäure (PNA) oder ein Peptidnukleinsäure(PNA)-Derivat ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde mit dem SET und der RG so beschaffen ist, um mit einer markierten Zielsequenz zu hybridisieren, wobei die Zielsequenz eine Reportergruppe RG' gleich der RG der Sonde oder davon unterschiedlich aufweist, wobei sich ein Signal-Unterschied ausbildet, wenn sich die RG an die RG' bei der Hybridisierung annähert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix aus einem Cellulosesubstrat einem Metallsubstrat oder einem Polymersubstrat oder einem Substratgemisch daraus besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden an die feste Matrix mittels Adsorption gebunden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das durch die RG erzeugte Signal ein Fluoreszenzsignal ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass SET eine Desoxyribonukleinsäure, ein Desoxyribonukleinsäurederivat oder eine Desoxyribonukleinsäureanaloge ist.
Matrix zum Auswerten einer Sonde für Nukleinsäurehybridisierung, wobei die Matrix Sonden umfasst, die Oligodesoxyribonukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloge umfassen, welche einen Sequenzerkennungsteil (SET) und eine Reportergruppe (RG) aufweisen, wobei die Oligodesoxyribonukleinsäuren oder Nukleinsäureanalogen fest an die Matrix gebunden und hinreichend komplementär sind, um unterschiedlichen Teilen einer Zielnukleinsäure eine Hybridisierung zu ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, dass die RG-Abschnitte bei Abwesenheit von Zielnukleinsäure zum Erzeugen eines Signals ausgewählt sind, das sich von dem erzeugten Signal unterscheidet, wenn die Sonden zu Zielnukleinsäure hybridisiert sind.
Matrix nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix aus einem Cellulosesubstrat, einem Metallsubstrat oder einem Polymersubstrat oder einem Substratgemisch daraus besteht.
Verwendung einer Matrix nach Anspruch 8 oder 9 zum Auswerten einer Sonde zur Nukleinsäure-Hybridisierung, dadurch gekennzeichnet, dass die RG-Abschnitte zum Erzeugen eines Signals in Abwesenheit von Zielnukleinsäure so ausgewählt sind, dass es sich von dem erzeugte Signal unterscheidet, wenn die Sonden zu Zielnukleinsäure hybridisiert sind.
Verwendung von Sonden bestehend aus SET und RG zum Nachweis einer Nukleinsäure durch Hybridisierung, bei der sich die Signale der Sonden durch die Hybridisierung an eine Nucleinsäure ändern, wobei die Sequenz des SET gewählt wird, indem das Signal der Sonden in freiem und in hybridisiertem Zustand von zumindest 10 Sonden, die an unterschiedliche Teile einer bestimmten Nukleinsäure hybridisieren, verglichen wird, wobei die Sonden an eine feste Matrix synthetisiert sind, und wobei ihre Signale in Abwesenheit einer Zielnukleinsäure bestimmt werden und/oder ihre Signale in Anwesenheit einer Zielnukleinsäure bestimmt werden und die Sonden so ausgewählt sind, dass sie den größten Signal-Unterschied zwischen Abwesenheit und Anwesenheit der Zielnukleinsäure aufweisen.
Verwendung von Sonden bestehend aus SET und RG zum Nachweis einer Nukleinsäure durch Hybridisierung, bei der sich die Signale der Sonden durch die Hybridisierung an eine Nucleinsäure ändern, wobei die Sequenz des SET gewählt wird, indem das Signal der Sonden in freiem und in hybridisirertem Zustand von zumindest 100 und weiter vorzugsweise zumindest 1000 Sonden, die an unterschiedliche Teile einer bestimmten Nukleinsäure hybridisieren, verglichen wird, wobei die Sonden an eine feste Matrix synthetisiert sind, und wobei ihre Signale in Abwesenheit einer Zielnukleinsäure bestimmt werden und/oder ihre Signale in Anwesenheit einer Zielnukleinsäure bestimmt werden und die Sonden so ausgewählt sind, dass sie den größten Signal-Unterschied zwischen Abwesenheit und Anwesenheit der Zielnukleinsäure aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung in einer homogenen Lösung stattfindet.
Verwendung nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde mit SET und RG so ausgebildet ist, dass sie an eine markierte Zielsequenz mit einer Reportergruppe RG' hybridisiert, die gleich der RG der Sonde ist oder davon unter schiedlich, wobei ein Unterschied im Signal auftritt, wenn sich RG und RG' bei der Hybridisierung aneinander annähern.