DE19848665A1 - New primers and probes from the factor V gene, useful for detecting the mutation that causes activated protein C resistance - Google Patents
New primers and probes from the factor V gene, useful for detecting the mutation that causes activated protein C resistanceInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft einen automatisierbaren Gentest zum Nachweis des Thromboserisikofaktors APC (aktiviertes Protein C) geeignete Starteroligo nukleotide, Oligonukleotidsonden für diesen Gentest, sowie ein Verfahren und ein Testkit zum Nachweis der APC Resistenz-Mutation.The present invention relates to an automatable gene test for detection the thrombosis risk factor APC (activated protein C) suitable starter oligo nucleotides, oligonucleotide probes for this genetic test, and a method and a Test kit for the detection of the APC resistance mutation.
1993 publizierten Dahlbäck et al. (PNAS 90.1004.1993) einen bisher nicht bekannten Gerinnungsdefekt, der mit einer deutlich erhöhten Frequenz an venösen und möglicherweise auch arteriellen Thrombosen korreliert ist. Bei Patienten mit throm bophiler Diathese wurde nach Zugabe von aktiviertem Protein C (APV) eine geringe Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) festgestellt. Dieses Phänomen wird als APC-Resistenz bezeichnet.In 1993, Dahlbäck et al. (PNAS 90.1004.1993) a previously unknown Clotting defect, with a significantly increased frequency of venous and possibly also correlated with arterial thrombosis. In patients with throm bophilic diathesis became low upon addition of activated protein C (APV) Extension of activated partial thromboplastin time (aPTT). This phenomenon is called APC resistance.
Defekte des Gerinnungssystems betreffen in erster Linie die antikoagulatorisch wirkenden Proteine Antithrombin III (Hach-Wunderle et al., Dtsch.med.Wschr. 118,187,1993; Hirsch et al., Amer. J. Med. 87 Suppl 3B,345,1989) Protein C (Clouse, New Engl. J. Med. 314,1298,1986) und Protein S (Gladson et al., Thrombos. Haemostas 59,18,1988). Schwere angeborene Hypoplasminogenämien (Gladson et al., Blood, 66 Supppl. 1,350A,1985) und Fälle von kongenitalem Heparin-Cofaktor II Mangel (Bertina, Thrombos Haemostas, 57,196,1987) sind sehr selten. Eine gesteigerte Thromboseneigung kann auch durch eine Verminderung der fibrinolytischen Aktivität in Form einer gestören t-PA-Freisetzung (Grimaudo et al., Thrombos Haemostas, 67,397,1992) oder Erhöhung des Plaminogen-Aktivator- Inhibitors (Engesser et al., Thrombos Haemostas, 62,673,1989) erfolgen. Eine Ver erbung dieser Defekte wurde allerdings nicht beobachtet.Defects of the coagulation system primarily affect the anticoagulant acting proteins antithrombin III (Hach-Wunderle et al., Dtsch.med.Wschr. 118,187,1993; Hirsch et al., Amer. J. Med. 87 Suppl 3B, 345, 1989) Protein C (Clouse, New Engl. J. Med. 314, 1298, 1986) and Protein S (Gladson et al. Thrombus. Haemostas 59, 18, 1988). Severe congenital hypoplasminogenemias (Gladson et al., Blood, 66 Supppl., 1,350A, 1985) and cases of congenital Heparin cofactor II deficiency (Bertina, Thrombos Haemostas, 57, 1996, 1987) is very high Rare. Increased tendency to thrombosis can also be caused by a reduction in the risk of thrombosis fibrinolytic activity in the form of a disrupted t-PA release (Grimaudo et al., Thrombos Haemostas, 67, 397, 1992) or increase of the plaminogen activator Inhibitors (Engesser et al., Thrombos Haemostas, 62, 673, 1989). An Ver However, inheritance of these defects was not observed.
Der Defekt des Gerinnungsfaktors V bewirkt die Entwicklung der APC-Resistenz (Dahlbäck et al., PNAS 91,1396,1994). Faktor V hat neben der klassischen pro koagulatorischen Aufgabe, nämlich der Umwandlung von Prothrombin in Thrombin zusätzlich eine antikoagulatorische Funktion. Er ist bei der proteolytischen Inakti vierung von Faktor Va als Cofaktor von aktiviertem Protein C beteiligt. Durch Thrombinaktivierung wird die prokoagulatorische Wirkung des Faktor V verstärkt.The defect of coagulation factor V causes the development of APC resistance (Dahlbäck et al., PNAS 91,1396,1994). Factor V has in addition to the classic pro coagulative task, namely the conversion of prothrombin into thrombin additionally an anticoagulant function. He is at the proteolytic inactivity Involved Factor Va as a cofactor of activated protein C. By Thrombin activation enhances the procoagulant effect of factor V.
Bertina et al. (Nature, 369,64,1994) konnten zeigen, daß der Phänotyp einer APC- Resistenz mit einer Punktmutation in Position 1691 des Faktor V Gens korreliert ist. Guanin ist durch Adenin ersetzt, was im Faktor V Protein zu einem Glutamin/- Arginin-Austausch in Position 506 führt. Diese Mutation verändert die Cofaktor- Funktion von Faktor V, die prokoagulatorische Funktion bleibt jedoch erhalten. Der Defekt wurde von den Entdeckern als Faktor V Leiden gezeichnet.Bertina et al. (Nature, 369, 64, 1994) were able to show that the phenotype of an APC Resistance is correlated with a point mutation in position 1691 of the factor V gene. Guanine is replaced by adenine, resulting in a factor V protein glutamine / - Arginine exchange in position 506 leads. This mutation alters the cofactor Function of factor V, but the procoagulant function is retained. The Defect was drawn by the discoverers as Factor V Leiden.
Verschiedene klassische Tests wie der APC-Ratio-Test (Dahlbäck et al., PNAS, 90,1004,1993), APC-Response-Test (Moritz et al., Hamburger Hämophilie Symposium, 1994 S. 20) wurden entwickelt und werden in den Kliniken teilweise eingesetzt. Diese Tests sind jedoch sehr zeit- und arbeitsaufwendig. Auch die bislang beschriebenen molekularbiologischen Faktor V Gentests, die von einer Amplifika tion des Mutation tragenden Fragmentes ausgehen mit anschließender Spaltung des Fragmentes mit Restriktionsenzymen und der Identifizierung von unterschiedlichen Fragmentgrößen, je nach dem homozygoten, heterozygoten Vorliegen der Mutation oder dem Fehlen der Mutation (Wildtyp). (De Lucia D et al., Medlab 97 St. 236, Grenngard, Thrombosis research, 80,441,1995; Guillerm, Clinical chemistry 42,329,1996; Bertina, Nature 369,64,1994). Ein weiterer Nachteil dieser Methoden ist, daß sie nicht automatisierbar sind.Several classic tests such as the APC Ratio Test (Dahlbäck et al., PNAS, 90, 100, 1, 1993), APC response test (Moritz et al., Hamburg Hemophilia Symposium, 1994 p. 20) have been developed and are partially used in clinics used. However, these tests are very time consuming and labor intensive. Also so far described molecular biological factor V gene tests by an amplification tion of the mutation - bearing fragment with subsequent cleavage of the Fragment with restriction enzymes and the identification of different Fragment sizes, depending on the homozygous, heterozygous presence of the mutation or the absence of the mutation (wild-type). (De Lucia D et al., Medlab 97 St. 236, Grenngard, Thrombosis research, 80, 441, 1995; Guillerm, Clinical chemistry 42,329,1996; Bertina, Nature 369, 64, 1994). Another disadvantage of these methods is that they are not automatable.
Der große Vorteil der beschriebenen Erfindung dagegen ist, daß durch die Verwen dung von speziellen, im Hinblick auf Länge und Mismatchsequenzen am 3. Ende optimierte mutations- und wildtypspezifischen Primern im Gegensatz zu den bisher bekannten auf Amplifikation basierenden Methoden keine nachträgliche Spaltung des Amplikons mit einem Restriktionsenzym notwendig ist und der Nachweis von homozygotem, heterozygotem Vorliegen der Mutation oder des Wildtyps nicht durch Nachweis der Fragmente in einer Gelelektrophorese notwendig ist, sondern durch einen vollautomatisierbaren Read out durch direkte Messung der Menge des gebil deten Amplikons über einen Chemilumineszentztest oder colorimetrischen Test. Durch die Verwendung einer RNA Detector Probe in Verbindung mit einem DNA/RNA Antikörper konnte darüber hinaus die Signalstärke des Amplikons um den Faktor 10 und die Sensitivität des Tests gegenüber herkömmlichen DNA-Tests um den Faktor 10 bis 100 gesteigert werden. Dadurch konnte die Menge an erforder lichem Testmaterial stark reduziert werden und die Zuverlässigkeit der Testaussage durch die deutlich höheren Signale selbst bei geringen Mengen an Testmaterial deutlich verbessert werden. Durch die bereits entwickelte Automatisierung des Ver fahrens ist der Read out einer großen Probenzahl (< 100) innerhalb von 20 Minuten möglich.The great advantage of the described invention, however, is that by the Verwen special, with regard to length and mismatch sequences at the 3rd end optimized mutation- and wildtype-specific primers in contrast to the previous ones known amplification-based methods no subsequent cleavage of the amplicon with a restriction enzyme is necessary and the detection of homozygous, heterozygous presence of the mutation or wild-type Detection of the fragments in a gel electrophoresis is necessary, but by a fully automatable read out by direct measurement of the amount of gebil of amplicons via a chemiluminescent assay or colorimetric assay. By using an RNA Detector Probe in conjunction with a DNA / RNA antibody was also able to reverse the signal strength of the amplicon the factor 10 and the sensitivity of the test compared to conventional DNA tests increased by a factor of 10 to 100. This allowed the amount of required test material are greatly reduced and the reliability of the test statement by the much higher signals even with small amounts of test material be significantly improved. Due to the already developed automation of Ver driving is the read out of a large number of samples (<100) within 20 minutes possible.
Die vorliegende Erfindung beschreibt mutationsspezifische Primer und Oligonukleo tidsonden und ihre Verwendung zum schnellen Nachweis der APC-Resistenz auf der Basis der Mutation 1691 im Exon 10 des Faktor V Gens in klinischen Probenmaterial und biologischen Körperflüssigkeiten ohne Restriktionsenzymspaltung und gelelek trophoretische Identifizierung der Spaltprodukte. Die Amplifikation mit dem Muta tionsprimer oder dem Wildtypprimer erfolgt nur wenn die Mutation bzw. keine Mutation vorhanden ist. Die Methode ist deshalb besonders schnell und automa tisierbar, weil direkt über die Amplifikation der Mutationstyp der APC Resistenz bestimmbar ist und in dem Read out beispielsweise mit magnetischen Beads nach dem in Beispiel 5 und 6 beschriebenen Methoden eine automatische Durchführung möglich ist, z. B. Immuno I, Bayer Diagnostics, Tarrytown.The present invention describes mutation-specific primers and oligonucleotide and their use for the rapid detection of APC resistance on the Base of mutation 1691 in exon 10 of the Factor V gene in clinical specimens and biological body fluids without restriction enzyme cleavage and gelelek trophoretical identification of the cleavage products. Amplification with the Muta tion primer or the wild-type primer takes place only if the mutation or none Mutation is present. The method is therefore particularly fast and automatic Tisierbar, because directly via the amplification of the mutation type of the APC resistance is determinable and in the read out, for example, with magnetic beads after the methods described in Example 5 and 6 an automatic implementation is possible, for. Immuno I, Bayer Diagnostics, Tarrytown.
Die Erfindung betrifft Starteroligonukleotide enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 1. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Set aus dem vorstehend genannten Starteroligonukleotid und einem Starternukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 3. Dieses Set eignet sich für die Amplifikation und den spezifischen Nachweis von G/A-Punktmutationen in Position 1691 der Nukleotidsequenz des Exons X vom Faktor V Leiden Gen. The invention relates to starter oligonucleotides containing the nucleotide sequence according to Sequence protocol SEQ ID no. 1. The invention further relates to a set of the containing the aforementioned starter oligonucleotide and a starter nucleotide the nucleotide sequence according to sequence listing SEQ ID no. 3. This set is suitable for amplification and specific detection of G / A point mutations in Position 1691 of the nucleotide sequence of exon X from factor V Leiden gene.
Die Erfindung betrifft weiterhin Starteroligonukleotide enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 2 sowie ein Set enthaltend das vorstehend genannte Starteroligonukleotid sowie ein Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 3. Dieses Set eignet sich für die Amplifikation und den spezifischen Nachweis der Wildtypbase G in Position 1691 der Nukleotidsequenz des Exons X vom Faktor V Leiden Gen.The invention further relates to starter oligonucleotides containing the nucleotide sequence according to sequence protocol SEQ ID no. 2 and a set containing the containing the aforementioned starter oligonucleotide and a starter oligonucleotide the nucleotide sequence according to sequence listing SEQ ID no. 3. This set is suitable for the amplification and the specific detection of the wild-type base G in position 1691 of the nucleotide sequence of exon X from factor V Leiden gene.
Weiterhin betrifft die Erfindung Oligonukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 4; Oligo nukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 5; Oligonukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 6 sowie Oligonukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 7.Furthermore, the invention relates to oligonucleotide probes, optionally labeled, containing the nucleotide sequence according to sequence listing SEQ ID no. 4; oligo nucleotide probes, optionally labeled, containing the nucleotide sequence according to Sequence protocol SEQ ID no. 5; Oligonucleotide probes, optionally labeled, containing the nucleotide sequence according to sequence listing SEQ ID no. 6 as well Oligonucleotide probes, optionally labeled, containing the nucleotide sequence according to sequence protocol SEQ ID no. 7th
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von APC-Gen
sequenzen in einem Probenmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man
Furthermore, the invention relates to a method for the detection of APC gene sequences in a sample material, characterized in that
- a) aus der Probe die DNA isoliert,a) isolating the DNA from the sample,
- b) die Proben-DNA mit dem oben beschriebenen mutationsspezifischen Set von Starteroligonukleotiden amplifiziert,b) the sample DNA with the mutation specific set of Starter oligonucleotides amplified,
- c) die Proben-DNA in einem weiteren Ansatz mit dem oben beschriebenen Wildtyp-spezifischen Set von Starteroligonukleotiden amplifiziert undc) the sample DNA in a further approach with the one described above Wild-type specific set of starter oligonucleotides amplified and
- d) die Amplifikationssignale auswertet.d) evaluates the amplification signals.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Testkit zum Nachweis der APC-Resistenz- Mutation enthaltend eines oder mehrere der obengenannten Starteroligonukleotide sowie gegebenenfalls eine oder mehrere der obengenannten Oligonukleotidsonden. Furthermore, the invention relates to a test kit for detecting the APC resistance Mutation containing one or more of the above-mentioned starter oligonucleotides and optionally one or more of the above-mentioned oligonucleotide probes.
Die Starteroligonukleotide (Primer) wurden aus der Gensequenz des Faktor V Gens (Cripe, Biochemistry 1992, Genbank Acession Number J05368) durch chemische Synthese hergestellt.The starter oligonucleotides (primers) were from the gene sequence of the factor V gene (Cripe, Biochemistry 1992, Genbank Accession Number J05368) by chemical Synthesis produced.
Die Erfindung betrifft Primer und Probes mit einer Länge von 15 bis 50, bevorzugt 18 bis 30, besonders bevorzugt 19 bis 25 Nukleotiden aus dem Bereich der Mutation 1691. Die Primer tragen am 3'-Ende das Nukleotid der Mutation oder des Wildtyps und zusätzlich mehrere, bevorzugt zwei bis fünf, besonders bevorzugt 2 weitere Mis matchbasen zur besseren Differenzierung zwischen Wildtyp und Mutation.The invention relates to primers and probes with a length of 15 to 50, preferably 18 to 30, more preferably 19 to 25 nucleotides from the region of the mutation 1691. The primers carry at the 3 'end the nucleotide of the mutation or the wild type and additionally several, preferably two to five, particularly preferably 2 further mis matchbases for better differentiation between wild type and mutation.
Die bevozugten Primer wurden aus dem Bereich ausgewählt
The preferred primers were selected from the range
- a) der spezifisch ist für den Mutationstyp G/A (Primer 1 SEQ ID No. 1)a) which is specific for the mutation type G / A (primer 1 SEQ ID No. 1)
- b) der spezifisch ist für den Wildtyp (Primer 2 SEQ ID No. 2)b) which is specific for the wild-type (primer 2 SEQ ID No. 2)
- c) der spezifisch sit für das Wildtyp und Mutation tragende Faktor V Gen als Gegenstrang-Primer (universal Primer) (Primer 3 SEQ ID No. 3).c) the specific sit for the wild-type and mutation-bearing factor V gene as Universal primer (Primer 3 SEQ ID No. 3).
Die Oligonukleotidsonden aus dem Bereich 1533-1616 wurden durch chemische Synthese hergestellt (SEQ ID No. 4, 5). Dieser Bereich wird von allen Primern amplifiziert und ist spezifisch für das Faktor V Gen. Die Oligonukleotidsonden haben eine Länge von 20 bis 100, bevorzugt 20 bis 40 Nukleotide.The oligonucleotide probes from the range 1533-1616 were prepared by chemical Synthesis prepared (SEQ ID No. 4, 5). This area is used by all primers amplified and is specific for the factor V gene. The oligonucleotide probes have a length of 20 to 100, preferably 20 to 40 nucleotides.
Die genomische DNA wurde durch Nukleinsäureisolierungsverfahren aus Blut isoliert.The genomic DNA was made by blood nucleic acid isolation method isolated.
Die Amplifikation von Teilen des Exon 10 vom Faktor V Gen wurde mit den spezifischen Primern 1 oder 2 aus dem kodierenden Bereich, die am 3. Ende die Base der Resistenzmutation tragen (A statt G (Mutationsprimer) und G (Wildtypprimer)) und einen spezifischen Primer 3 aus dem nichtkodierenden Strang des Gens, der als Gegenstrang-Primer (forward primer) für alle Amplifikationen eingesetzt wird, durchgeführt.The amplification of parts of exon 10 from the factor V gene was performed with the specific primers 1 or 2 from the coding region, the 3rd end the base carry the resistance mutation (A instead of G (mutation primer) and G (wild-type primer)) and a specific primer 3 from the noncoding strand of the gene, referred to as Backbone primer (forward primer) is used for all amplifications, carried out.
Für den Nachweis der Amplicons mit den Mutationen G/A, und Wildtyp G/G wird bevorzugt eine capture und detector Probe aus dem Nukleotidbereich 1533-1568 bzw. 1581-1616 (analog 108-143 bzw. 156-191 entsprechend Exon 10) eingesetzt. Diese haben im allgemeinen eine Länge von 20 bis 100 Nukleotiden, bevorzugt von 20 bis 50 Nukleotiden.For the detection of amplicons with the mutations G / A, and wild type G / G is preferably a capture and detector probe from the nucleotide region 1533-1568 or 1581-1616 (analog 108-143 or 156-191 according to Exon 10) used. These generally have a length of 20 to 100 nucleotides, preferably from 20 to 50 nucleotides.
Die Amplifikation wurde mit Hilfe von bekannten Amplifikationstechniken, bevor zugt der PCR-DNA-Amplifikationsmethode (EP200362) durchgeführt:Amplification was performed using known amplification techniques before to the PCR-DNA amplification method (EP200362) performed:
Der Nachweis des spezifischen Amplifikationsproduktes kann nach an sich be
kannten Methoden durchgeführt werden, beispielsweise durch:
The detection of the specific amplification product can be carried out by methods known per se, for example by:
- a) direkte Elektrophorese des Amplifikationsproduktes im Agarosegel und Anfärbung durch interkalierende Agenzien wie Ethidiumbromid;a) direct electrophoresis of the amplification product in agarose gel and Staining by intercalating agents such as ethidium bromide;
- b) durch Fluoreszenzbestimmung des während der Amplifikation mit Fluores zenznukleotiden oder fluoreszenzmarkierten Primern markierten Amplifika tionsproduktes. Das Amplifikationsprodukt wird über zusätzlich eingebautes Biotin (Primer oder Nukleotid) separiert;b) by fluorescence determination of during amplification with fluores zinc nucleotides or fluorescently labeled primers labeled amplicons tion product. The amplification product is additionally built-in Biotin (primer or nucleotide) separated;
- c) bevorzugt durch Hybidisierung des während der Amplifikation markierten Amplifikationsproduktes mit den obengenannten Oligonukleotidsonden durchgeführt. Der Hybridiserungskomplex wird mit Fluorescein Antikörper gecoateten magnetischen Partikeln separiert.c) preferably by hybridization of the labeled during the amplification Amplification product with the above oligonucleotide probes carried out. The hybridization complex is labeled with fluorescein antibody separated coated magnetic particles.
Die Auswertung des gebildeten Hybridisierungskomplexes als Maß für die Menge oder das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der APC Resistenz Mutation kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen. Bevorzugt ist ein Chemilumineszenztest mit Antidigoxigenin-Antikörpern, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind (PCR) und mit dem in die Detektorsonde eingebauten Digoxigenin reagieren.The evaluation of the hybridization complex formed as a measure of the amount or the presence or absence of the APC resistance mutation can take place according to known methods. Preferred is a chemiluminescence test with anti-digoxigenin antibodies labeled with alk. Phosphatase are coupled (PCR) and react with the digoxigenin incorporated into the detector probe.
Der Test wird jeweils mit einem Ansatz mit Mutationsprimer und einem Ansatz Wildtyp-Primer durchgeführt zur Genotypdifferenzierung von wildtypspezifischen, heterozygoten oder homozygoten Vorliegen des Gendefektes. Bei normalem APC Gen erfolgt Amplifikation nur mit dem Wildtypprimer, der Mutationsprimer ergibt kein Amplicon und damit auch kein Chemilumineszenzsignal. Bei heterozygotem Gendefekt entsteht ein Amplicon sowohl mit Mutationsprimer wie Wildtypprimer und bei homozygotem Gendefekt ergibt nur er Mutationsprimer ein Amplicon und Chemilumineszenzsignal.The test is each done with a mutagenic primer approach and an approach Wild-type primer performed for genotype differentiation of wild-type specific, heterozygous or homozygous presence of the gene defect. In normal APC Gene is amplified only with the wild type primer yielding mutation primer no amplicon and thus no chemiluminescence signal. In heterozygous Gene defect produces an amplicon with both mutation primer and wild-type primer and in a homozygous genetic defect, only he mutation primer gives an amplicon and Chemiluminescence.
Der große Vorteil dieses Tests gegenüber den bislang publizierten Tests und in den Kliniken eingesetzten Tests besteht darin; daß nach der Amplifikation kein Restriktionsverdau des Amplikons durchgeführt werden muß mit anschließender Gelelektrophorese. Bei dem vorliegenden Test kann direkt über die Amplifikation entschieden werden welcher Gendefekt vorliegt, der Test ist automatisierbar und aufgrund nur eines einzigen Amplifikationsschrittes viel schneller und weniger arbeits- und kostenaufwendig als herkömmliche Tests.The big advantage of this test compared to the previously published tests and in the Clinics used tests consists in; that after the amplification no Restriktionsverdau the amplicon must be carried out with subsequent Gel electrophoresis. In the present test can directly via the amplification which genetic defect is present, the test can be automated and much faster and less due to just one amplification step laborious and expensive than conventional tests.
Die Gensonden-Diagnostik insbesondere in Verbindung mit Amplifikationstechniken ist eine schnelle, spezifische und hochempfindliche Methode, die eine Früherken nung von spezifischen Genen, Genfragmenten oder Einzelmutationen auf DNA/RNA Ebene ermöglicht. Die Technik kann direkt im Untersuchungsmaterial durchgeführt werden. Sie basiert auf der DNA/RNA Hybridisierungstechnik, d. h. der spezifischen in vitro Bindung von komplementärer Einzelstrang-Nukleinsäure unter Bildung von Watson-Crick-Basenpaaren. Die gebildeten DNA/DNA oder DNA/RNA Doppel stränge werden auch als DNA-Hybride bezeichnet. Zur Detektion der spezifischen DNA oder RNA durch die Hybridiserungsreaktion werden komplementäre sequenz spezifische Gensonden verwendet. Diese Gensonden sind kurze, chemisch synthe tisierte Oligonukleotidsonden mit einer Länge von 10 bis 200, bevorzugt 18 bis 35, Nukleotiden.Gene probe diagnostics, especially in conjunction with amplification techniques is a fast, specific, and highly sensitive method that reduces early tion of specific genes, gene fragments or single mutations on DNA / RNA Level allows. The technique can be performed directly in the examination material become. It is based on the DNA / RNA hybridization technique, i. H. the specific in vitro binding of complementary single-stranded nucleic acid to form Watson-Crick base pairs. The formed DNA / DNA or DNA / RNA double strands are also referred to as DNA hybrids. For the detection of the specific DNA or RNA by the hybridization reaction become complementary sequence used specific gene probes. These gene probes are short, chemically synthe tized oligonucleotide probes with a length of 10 to 200, preferably 18 to 35, Nucleotides.
Die Gensonden können fotochemisch (N. Dattagupta, P. M. M. Rae, E. D. Huguenel, E. Carlson, A. Lyga, J. S. Shapiro, J. P. Albarella, Analytical Biochem. 177.85.1989) oder enzymatisch durch nick Translation (Rigby, P. W. J. et al., J. Mol.Biol. 113.237.1977) oder Random Primed Techniken (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132.6.1983) mit einer radioaktiven oder nichtradioaktiven Markierung versehen werden. Geeignet sind hierfür Markierungen mit 32PNTPs oder nicht radioaktive Markierungen mit Reporter-Molekülen wie Digoxigenind-UTP, Biotin- dUTP oder direkte Markierung mit Enzymen wie alk. Phosphatase oder Horseradish Peroxidase.The gene probes may be photochemically (N. Dattagupta, PMM Rae, ED Huguenel, E. Carlson, A. Lyga, JS Shapiro, JP Albarella, Analytical Biochem., 177.85.1989) or enzymatically by nick translation (Rigby, PWJ et al Mol. Biol., 113, 2337, 1977) or random primed techniques (Feinberg and Vogelstein, Anal. Biochem., 132.6.1983) may be provided with a radioactive or non-radioactive label. Suitable for this are labels with 32 PNTPs or non-radioactive labels with reporter molecules such as digoxigenin-UTP, biotin-dUTP or direct labeling with enzymes such as alk. Phosphatase or horseradish peroxidase.
Für die spezifische Hydribisierung zwischen der nachzuweisenden Nukleinsäure der spezifischen Gensonde werden die Nukleinsäuren zunächst durch Denaturierung (Hitze oder Alkalibehandlung) in Einzelstränge getrennt und dann unter stringenten Bedingungen, die durch Temperatur, Ionenstärke der Puffer und organische Lösungs mittel erreicht werden, ganz spezifisch miteinander hybridisiert. Bei geeigneten Hy bridisierungsbedingungen bindet die Gensonde nur an komplementäre Sequenzen der nachzuweisenden DNA oder RNA. Diese Hybridisierungsreaktion kann in ver schiedenen Testformaten z. B. als Festphasen an einen Träger wie z. B. Nitrozellulose gekoppelter Target-DNA oder Gensonde oder als Flüssighybridisierung durchgeführt werden. Die Auswertung (Read Out) erfolgt über die Markierung der Gensonde mit einem Reportermolekül wie oben aufgeführt oder wie in dem hier dargestellten Reversed Phase Hybridisierungssystem über die Target-DNA, die während der Amplifikation mit Digoxigenin-dUTP markiert wird und die Gensonde, die zur Bindung an magnetische Partikel mit Biotin markiert wird. Der Hybridisierungs komplex aus Target-DNA und markierter Gensonde wird nach Entfernen von nicht gebundener Gensonde über das verwendete Reportermolekül quantitativ bestimmt. Dieser Read Out kann direkt erfolgen bei Fluoreszenz-Markierung oder radioaktiver Markierung oder indirekt durch Enzymteste und immunologische Verfahren mit Antikörperkonjugaten, die Enzyme wie die alk. Phosphatase enthalten und dann eine Farbreaktion oder Chemilumineszenz-Reaktion ermöglichen.For specific hydration between the nucleic acid to be detected specific gene probe, the nucleic acids are first denatured (Heat or alkali treatment) separated into single strands and then under stringent Conditions caused by temperature, ionic strength of the buffer and organic solution be achieved, specifically hybridized with each other. At suitable Hy bridging conditions binds the gene probe only to complementary sequences of the DNA or RNA to be detected. This hybridization reaction can be used in ver different test formats z. B. as solid phases to a carrier such. B. nitrocellulose coupled target DNA or gene probe or as liquid hybridization become. The evaluation (Read Out) is carried out by marking the gene probe with a reporter molecule as listed above or as shown here Reversed phase hybridization system via the target DNA, which during the Amplification is labeled with digoxigenin-dUTP and the gene probe used for Binding to magnetic particles is marked with biotin. The hybridization Complex of target DNA and labeled probe will not remove after removal bound gene probe on the reporter molecule used quantitatively determined. This read out can be done directly with fluorescence labeling or radioactive Labeling or indirectly by enzyme assays and immunological methods with Antibody conjugates containing enzymes such as the alk. Contain phosphatase and then one Allow color reaction or chemiluminescent reaction.
Die Testsensitivität mit der Gensonden-Diagnostik liegt im Bereich von 105 bis 106 Kopien auf der Basis der Detektion von Einzelgenen. Eine Erhöhung der Testsensiti vität kann durch die Kombination mit DNA oder RNA-Amplifikationstechniken wie der PCR (EP 200362). LCR (EP 320308), NASBA (EP 329822), Qβ (PCT 87/06270) oder HAS-Technik (EP 427074) erreicht werden. Mit diesen Techniken kann eine bis zu 109-fache Multiplikation der nachzuweisenden DNA erzielt werden. Durch die Kombination von Amplifikation und Hybridisierung wird so die Detektion von einzelnen DNA-Molekülen möglich.The test sensitivity with the gene probe diagnostics is in the range of 10 5 to 10 6 copies based on the detection of single genes. An increase in the test sensitivity can be achieved by combining with DNA or RNA amplification techniques such as PCR (EP 200362). LCR (EP 320308), NASBA (EP 329822), Qβ (PCT 87/06270) or HAS technique (EP 427074) can be achieved. With these techniques, an up to 10 9- fold multiplication of the DNA to be detected can be achieved. The combination of amplification and hybridization makes it possible to detect individual DNA molecules.
Die Auswahl von geeigneten spezifischen Primern erfolgte anhand der Nukleotid sequenz des Exon 10 des Faktor V Leiden Gens (Cripe, Biohemistry 1992, Genbank Acession Number J05268). Auf der Basis der Mutationssequenz und der Wildtyp- Nukleotidsequenz wurden Primer ausgewählt, die am 3. Ende die Base der Punkt mutation tragen. Für den Mutationstyp G/A wurde der Primer SEQ ID No. 1 syn thetisiert. Für den Wildtyp wurde der Primer 2 SEQ ID No. 2 syntetisiert. Für die Amplifikation der Mutation tragenden Sequenz wurde als Gegenstrang-Primer der Primer 3 SEQ ID No. 3 der allen Primer-Sets gemeinsam ist (Primer 1+3, 2+3) synthetisiert. Die Primer tragen am 3'-Ende zusätzlich mehrere, bevorzugt 2 weitere Mismatchbasen, zur besseren Differenzierung zwischen Wildtyp und Mutation.The selection of suitable specific primers was based on the nucleotide sequence of exon 10 of the factor V Leiden gene (Cripe, Biohemistry 1992, Genbank Accession Number J05268). Based on the mutation sequence and the wild-type Nucleotide sequence, primers were selected, which at the 3rd end the base of the point wear mutation. For the mutation type G / A, the primer SEQ ID no. 1 syn thesized. For the wild type, the primer 2 SEQ ID no. 2 syntetisiert. For the Amplification of the mutation-bearing sequence was used as a counterstrand primer Primer 3 SEQ ID no. 3 common to all primer sets (primers 1 + 3, 2 + 3) synthesized. The primers carry at the 3 'end additionally several, preferably 2 more Mismatch bases, for better differentiation between wild type and mutation.
Die chemische Synthese der ausgewählten Primer erfolgte nach der Phosphor amiditmethode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22.1859.1981. The chemical synthesis of the selected primers was carried out after the phosphorus amidite method of S.L. Beaucage and M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22.1859.1981.
Für die Amplifikation der mutationstragenden Sequenz des Exons 10 von Faktor V Leiden wurden die obengenannten Primer jeweils als Primerset 1 (Primer 1+3), Primerset 2 (Primer 2+3) zur spezifischen Amplifikation der beiden APC-Formen (Mutante/Wildtyp) eingesetzt. Sie ergeben mit der genomischen DNA vom Wildtyp nur mit dem Wildtypprimer (Primerset II) im Agarosegel ein sichtbares Ampli fikationsprodukt. Die genomische DNA mit den Primerset I ergibt nur für das die APC Mutation tragende Exon 10 eine starke Amplifikationsbande und zeigt so die vorhandene Punktmutation an.For the amplification of the mutation-bearing sequence of exon 10 of factor V Suffering were the above-mentioned primers in each case as primer set 1 (primer 1 + 3), Primer set 2 (primers 2 + 3) for the specific amplification of the two APC forms (Mutant / wild type) used. They give with the genomic DNA of the wild type only with the wild-type primer (Primerset II) in the agarose gel a visible Ampli fikationsprodukt. The genomic DNA with the primer set I results only for the APC mutation-bearing exon 10 has a strong amplification band and thus displays the existing point mutation on.
Bei der PCR-Amplifikation kann neben den 4 dNTPs (Desoxyadenosintriphophat, Desoxyguanosintriphosphat, Desoxycytidintriphosphat und Thymidintriphosphat) zusätzlich z. B. Digoxigenin-dUTP in das Amplifikationsprodukt eingebaut werden. Dadurch kann das Amplifikationsprodukt mit einem Antidigoxigenin-Antikörper, der z. B. alk. Phosphatase gekoppelt enthält, über einen Chemilumineszenztest mit AMPPD als Substrat oder einem Farbstoffiest mit pNPP ausgewertet werden.In PCR amplification, in addition to the 4 dNTPs (deoxyadenosine triphosphate, Deoxyguanosine triphosphate, deoxycytidine triphosphate and thymidine triphosphate) additionally z. For example, digoxigenin-dUTP can be incorporated into the amplification product. Thereby, the amplification product with an anti-digoxigenin antibody, the z. B. alk. Coupled with phosphatase via a chemiluminescent assay AMPPD can be evaluated as a substrate or a dye with pNPP.
Alternativ besteht die Möglichkeit fluoreszenzmarkierte Nukleosidtriphosphate wie z. B. Fluoreszein-dUTP oder Cumann-dUTPs in das Amplifikationsprodukt einzu bauen und das Amplifikationsprodukt mit viel höherer Sensitivität als mit Ethidium bromidanfärbung zu identifizieren. Bei der Verwendung von biotinylierten Primern besteht so die Möglichkeit das fluoreszenzmarkierte, biotinylierte Amplifikations produkt über Streptavidin gecoatete magnetische Partikel abzutrennen und im Fluoreszenzfotometer quantitativ zu bestimmen. Alternativ und bevorzugt in dieser Erfindung werden eine DNA capture Probe und eine unmarkierte RNA Probe als Detektorprobe eingesetzt und der Read out über einen DNA/RNA Antikörper durch geführt. Es kann auch nur eine Probe in Form einer fluoresceinmarkierten RNA- Probe eingesetzt werden, die als Capture- und Detector-Probe dient. Mit diesem neuen Gentest unter Verwendung des DNA/RNA Antikörpers werden deutlich bessere Sensitivitäten als mit den bisher üblichen Gentesten für andere Targets erreicht und damit sehr wenig Ausgangsmaterial für die Durchführung des Tests benötigt.Alternatively, the possibility exists of fluorescently labeled nucleoside triphosphates such as z. As fluorescein dUTP or coumarin dUTPs in the amplification product build and the amplification product with much higher sensitivity than with ethidium to identify bromide staining. When using biotinylated primers so there is the possibility of the fluorescently labeled, biotinylated amplification product via streptavidin coated magnetic particles and in the Quantify fluorescence photometer. Alternatively and preferred in this The invention will be a DNA capture probe and an unlabelled RNA probe as Detector sample inserted and read out via a DNA / RNA antibody guided. It may also be just a sample in the form of a fluorescein-labeled RNA Sample can be used, which serves as a capture and Detector sample. With this new genetic tests using the DNA / RNA antibody become clear better sensitivities than with the usual genetic tests for other targets achieved and thus very little starting material for the performance of the test needed.
Die Auswahl der für die Amplifikationsprodukte der Primersets spezifischen Oligo nukleotidsonden erfolgte aus dem Bereich 8167-8486 für das das mutationsspezi fische und wildtypspezifische Amplifikationsprodukt gemeinsam ist. Es wurde 30-36 Primere mit der Sequenz SEQ ID No. 4 und 5 synthetisiert, die spezifisch für die beiden Amplifikationsprodukte sind. Alternativ für SEQ ID No. 4 kann SEQ ID No. 6 oder No. 7 verwendet werden.The selection of oligo specific for the amplification products of the primer sets nucleotide probes were from the range 8167-8486 for the mutation spec fish and wild type-specific amplification product is common. It was 30-36 Primers with the sequence SEQ ID no. 4 and 5 synthesized specifically for the both amplification products are. Alternatively for SEQ ID no. 4, SEQ ID NO. 6 or no. 7 are used.
Die chemische Synthese erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S. L. Beaucae und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981.The chemical synthesis was carried out according to the phosphoramidite method of S. L. Beaucae and M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981.
Mit den Oligonukleotidsonden besteht die Möglichkeit die mutationspezifischen und wildtypspezifischen Amplifikationsprodukte spezifisch zu hybridisieren. Das Verfah ren, bei dem zunächst mit den mutationsspezifische Primern Teile des Exons 10 vom Faktor V Leiden Gen amplifiziert werden und dann anschließend das Amplifikations produkt spezifisch mit den beiden Oligonukleotidsonden hybridisiert wird, hat ge genüber der reinen Amplifikationsdiagnostik über das Gel den Vorteil, daß die Test sensitivität um den Faktor 100-1000 höher ist und das Zeit- und arbeitsaufwendige Verfahren darüber hinaus nicht automatisierbar ist:With the oligonucleotide probes there is the possibility of the mutation-specific and specifically to hybridize wild type-specific amplification products. The procedure First, with the mutation - specific primers parts of the exon 10 from Factor V Leiden gene are amplified and then amplification product is specifically hybridized with the two oligonucleotide probes has Ge Compared with pure amplification diagnosis via the gel has the advantage that the test sensitivity is higher by a factor of 100-1000 and this is time- and labor-intensive In addition, the method can not be automated:
Die APC Mutation kann direkt nach Amplikation eines Teils des Exon 10 Gens von Factor V Leiden durch die in der Erfindung beschriebenen Primersets mit beliebigen Analyseverfahren bestimmt werden. The APC mutation may occur immediately after amplification of part of the exon 10 gene Factor V Leiden by the primer sets described in the invention with any Analytical methods are determined.
Eine mögliche Read Out Methode ist die Anfärbung des durch Agarosegelektro phorese separierten Amplifikationsproduktes mit interkalierenden Agenzien wie Ethidiumbromid.A possible read out method is the staining of the agarose gel electro phorese separated amplification product with intercalating agents such as Ethidium bromide.
Eine andere Möglichkeit ist der Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleosidtri phosphaten in das Amplifikationsprodukt. Hierdurch wird eine deutliche Verbes serung der Testsensitivität erreicht.Another possibility is the incorporation of fluorescently labeled nucleoside tri phosphates in the amplification product. This will be a distinct verb achieved the test sensitivity.
Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern für die Amplifikation oder die Kombination von biotinylierten Primern mit Fluoreszenz nukleotiden, so daß ein endständig biotinyliertes, fluoreszenzmarkiertes Amplifika tionsprodukt entsteht, das an Streptavidin gekoppelte magnetische Partikel gebunden und separiert werden kann und die Fluoreszenz semiquantitativ bestimmt werden kann.Another possibility is the use of fluorescently labeled primers for the amplification or combination of biotinylated primers with fluorescence nucleotides such that a terminal biotinylated, fluorescently labeled amplicon tion product is formed, which bound to streptavidin coupled magnetic particles and can be separated and the fluorescence can be determined semiquantitatively can.
Die sensitivste und bevorzugte Methode ist die beschriebene Methode der Hybri disierung der Amplifikationsprodukte mit der beschriebenen Oligonukleotidsonde. Beim Einbau von z. B. Digoxigenin-dUTP während der Amplifikation und Ver wendung einer biotinylierten oder fluoreszinierten Oligonukleotidsonde, läßt sich der Hybridisierungskomplex an Streptavidin/Fluorescein-Antikörper gecoateten magneti schen Partikeln separieren und bei Verwendung von Antigigoxigenin-Antikörpern, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind, mit AMPPD oder CSPD als Subsrat über Chemilumineszenz semiquantitativ auswerten. Die bevorzugte Methode ist die Amplifikation ohne irgendeinen Einbau von Markermolekülen und der Nachweis des Amplikons durch Hybridisierung mit einer fluoreseinmarkierten Capture Probe und einer zusätzlichen RNA Probe als Detektorprobe. Die Detektion des hybridisierten Amplicons erfolgt dabei mit einem DNA/RNA Antikörper. Dieser Read out ergibt die höchste Sensitivität von allen bisher getesteten Testverfahren und wurde speziell für automatisierte Verfahren beispielsweise im Immunol Automaten und Nachfolge geräten entwickelt. The most sensitive and preferred method is the described method of Hybri Disierung the amplification products with the described oligonucleotide probe. When installing z. B. digoxigenin-dUTP during amplification and Ver The use of a biotinylated or fluorescated oligonucleotide probe, the Hybridization complex to streptavidin / fluorescein antibody coated magneti separating particles and using antigigoxigenin antibodies, the with alk. Phosphatase are coupled with AMPPD or CSPD as a subset over Evaluate chemiluminescence semiquantitatively. The preferred method is the Amplification without any incorporation of marker molecules and detection of the marker Amplikons by hybridization with a fluorescently labeled capture probe and an additional RNA sample as detector sample. The detection of the hybridized Amplicons are carried out with a DNA / RNA antibody. This read out yields the highest sensitivity of all previously tested tests and became special for automated procedures for example in the Immunol automaton and successor developed devices.
Die chemische Synthese der ausgewählten Starteroligonukleotide (Primer) erfolgte
nach der Phosphoramiditmethode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron
Letters, 22.1859.1981. Folgende Nukleotidsequenzen wurden synthetisiert:
PCR-Primer 1 spezifisch f Mutation APC: SEQ ID No. 1
PCR-Primer 2 spezifisch f. Wildtyp APC: SEQ ID No. 2
PCR-Primer 3 universal Gegenstrangprimer: SEQ ID No. 3The chemical synthesis of the selected starter oligonucleotides (primers) was carried out according to the phosphoramidite method of SL Beaucage and M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22.1859.1981. The following nucleotide sequences were synthesized:
PCR primer 1 specific f mutation APC: SEQ ID no. 1
PCR primer 2 specific f. Wild-type APC: SEQ ID no. 2
PCR primer 3 universal counterstrand primer: SEQ ID no. 3
Die Oligonukleotidsonden (capture und detector probe) wurde aus dem Nukleotid bereich 8167-8486 des exons 10 des Faktor V Leiden Gens ausgewählt, der die mutationsrelevante Region enthält. Die chemische Synthese der ausgewählten Oligo nukleotidsonden erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22.1859.1981. Folgende Nukleotidsequenzen wurden synthetisiert:The oligonucleotide probes (capture and detector probe) were removed from the nucleotide range 8167-8486 of exon 10 of the Factor V Leiden gene selected to be the contains mutation-relevant region. The chemical synthesis of the selected oligo nucleotide probes were made by the phosphoramidite method of S.L. Beaucage and M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22.1859.1981. Following nucleotide sequences were synthesized:
Detector Probe: SEQ ID No. 4
TACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACC
Capture Probe: SEQ ID No. 5
TGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGT Detector Probe: SEQ ID no. 4
TACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACC
Capture Probe: SEQ ID no. 5
TGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGT
Detector Probes: SEQ ID No. 6
5'UACUUAUAAGUGGAACAUCUUAGAGUUUGAUGAACC
SEQ ID No. 7
5'UACUUAUAAGUGGAACAUCUUAGAGUUUGADetector probes: SEQ ID no. 6
5'UACUUAUAAGUGGAACAUCUUAGAGUUUGAUGAACC
SEQ ID no. 7
5'UACUUAUAAGUGGAACAUCUUAGAGUUUGA
Die Detector Probe wurde nach der Methode von Bollum, The enzymes, Bayer ed, Vol. 10, p 145 Academic Press New York, am 3. Ende markiert. Die Endgruppen markierung wurde nicht radioaktiv mit Fluorescein-dUTP vorgenommen (Chang, L. M. S., Bollum T. J., J. Biol. Chem. 246.909.1971). In einem 50 ml Ansatz mit 10 ml Reaktonspuffer (Kaliumkakodylat 1 mol/l; Tris/HCl 125 mmol/l; Rinderserum albumin 125 mg/ml; pH 6,6; 25°C) 1 bis 2 mg Oligonukleotid, 25 Einheiten Terminale Transferase CoCl2 2,5 mmol/l und 1 ml Gluorescein-dUTP (1 mmol/l) werden nach 60 Minuten bei 37°C ca. 50% 3. Endmarkierung erreicht. Die Detector Probe wurde analog mit Digoxigenin-dUTP markiert oder es wurde eine nicht markierte RNA Probe eingesetzt.The Detector probe was labeled by the method of Bollum, The enzymes, Bayer ed, Vol. 10, p145 Academic Press New York, at the 3rd end. End-group labeling was not radioactive with fluorescein-dUTP (Chang, LMS, Bollum TJ, J. Biol. Chem. 246.909.1971). In a 50 ml batch with 10 ml of reaction buffer (potassium cacodylate 1 mol / l, Tris / HCl 125 mmol / l, bovine serum albumin 125 mg / ml, pH 6.6, 25 ° C) 1 to 2 mg oligonucleotide, 25 units of terminal transferase CoCl 2 2.5 mmol / l and 1 ml gluorescein-dUTP (1 mmol / l) are after 60 minutes at 37 ° C about 50% 3rd Endmarkierung achieved. The detector sample was labeled analogously with digoxigenin-dUTP or an unlabeled RNA sample was used.
Die Amplifikation der Target-DNA wurde nach der Polymerase Chain Reaktion (EP 200362; 201184) durchgeführt. Zur PCR-Reaktion wurden eingesetzt 100 pg genomische DNA von Blutzellen (Leucozyten), 0,17 µmol Primer 1-5 SEQ ID No. 1-5, 2,5 Units Taq-Polymerase von Cetus/Perkin-Elmer sowie jeweils 200 µmol/l dNTPS in insgesamt 100 µl PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris/HCl pH 8,3, 2 mM MgCl2, und 0,01% Gelatine. Die Amplifikation wurde in einem PCR- Prozessor der Firma CetuslPerkin-Elmer durchgefürht. Es wurden insgesamt 2 PCR- Ansätze mit Primerset 1 (Primer 1+3) und Primerset 2 (Primer 2+3 für den Nachweis von homozygoter, heterozygoter oder Wildtyp APC-Gen angesetzt. Eine Amplifika tionssignal mit Wildtyp + Mutationsprimer zeigt das heterozygote Vorliegen der Mutation, ein Signal mit Wildtyp, aber nicht mit Mutationsprimern zeigt den Wildtyp und ein Signal mit dem Mutationsprimerset, aber nicht mit dem Wildtypprimern zeigt das homozygote Vorliegen der Mutation.The amplification of the target DNA was carried out after the polymerase chain reaction (EP 200362; 201184). For PCR reaction were used 100 pg genomic DNA of blood cells (leucocytes), 0.17 μmol primer 1-5 SEQ ID NO. 1-5, 2.5 units Taq polymerase from Cetus / Perkin-Elmer and in each case 200 .mu.mol / l dNTPS in a total of 100 .mu.l PCR buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris / HCl pH 8.3, 2 mM MgCl 2 and 0.01% gelatin The amplification was carried out in a PCR processor from Cetusl-Perkin-Elmer and a total of 2 PCR mixtures with primer set 1 (primer 1 + 3) and primer set 2 (primer 2 + 3 for detection A wild type + mutation primer amplification signal indicates the heterozygous presence of the mutation, a wild-type but not mutation-primed signal indicates the wild type and a signal with the mutation primer set, but not wild-type priming the homozygous presence of the mutation.
Für den Chemilumineszenztest nach Beispiel 6 wurde in der PCR zusätzlich 0,15 mmol) Digoxigenin-dUTP zur Markierung des PCR-Produktes eingesetzt. Bei Verwendung einer RNA Probe als Detector Probe in Verbindung mit einem DNA/RNA Antikörper (Beispiel 7) wird die PCR ohne Markierungszusätze durchgeführt.For the chemiluminescence test according to Example 6 was in the PCR in addition 0.15 mmol) digoxigenin-dUTP was used to label the PCR product. at Use of an RNA sample as a Detector Probe in conjunction with a DNA / RNA antibody (Example 7) is the PCR without labeling additives carried out.
Standardbedingungen:Standard conditions:
Vor der PCR muß die Plasmid-DNA 1 : 105 verdünnt werden. Von dieser Verdünnung wird dann 1 µl eingesetzt und 99 µl PCR-Mix. Das entspricht einer Konzentration von 100 ng klinischer Probe. Die klinische Probe wird in einer Konzentration von 100 ng eingesetzt, ebenfalls 1 µ1 DNA und 99 µl Mix. Prior to PCR, the plasmid DNA must be diluted 1: 10 5 . From this dilution then 1 .mu.l is used and 99 .mu.l PCR mix. This corresponds to a concentration of 100 ng of clinical sample. The clinical sample is used at a concentration of 100 ng, also 1 μ1 DNA and 99 μl mix.
Zur direkten Auswertung des DNA-Amplifikationsproduktes wurden nach der Amplifikation interkalierende Agenzien wie z. B. Ethidiumbromid eingesetzt oder während der Amplifikation Fluoreszenz-Nukleotidtriphosphate wie z. B. Fluoreszein dUTP/ oder Cumann dUTP eingebaut. Es können auch Biotin-dUTP oder Digoxigenin-dUTP eingesetzt werden und mit Antikörper gekoppelter alk. Phosphatase ein Farbstoff-Read out durchgeführt werden. Auch können bei ge ringerer Sensitivität entsprechend fluoreszenzmarkierte Primer verwendet werden.For direct evaluation of the DNA amplification product were after the Amplification intercalating agents such. B. Ethidiumbromid used or during the amplification fluorescence nucleotide triphosphates such. B. fluorescein DUTP / or Cumann dUTP installed. It can also be biotin-dUTP or Digoxigenin-dUTP and antibody-coupled alk. Phosphatase can be done a dye read out. Also can ge Ringerer sensitivity according to fluorescently labeled primer can be used.
Die bevorzugte Methode war der Einbau von Cumann-UTP, weil dabei die beste Testsensitivität erreicht wurde. Das Amplifikationsprodukt wurde auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen und 30 Minuten bei 100 mA elektrophoretisiert. Die Fluor eszenz-Signale wurden unter einem UV-Transilluminator direkt ausgewertet. The preferred method was the incorporation of coumarin UTP, because the best Test sensitivity was achieved. The amplification product was reduced to 0.8% Agarose gel and electrophoresed for 30 minutes at 100 mA. The fluorine Cells were directly evaluated under a UV transilluminator.
Durch die Kombination von geeigneten Target-Amplifikationsmethoden wie der Polymerase Chain Reaction (PCR) (EP200362), LCR (EP320308) und der Genson dentechnik wird eine signifikante Sensitivitätssteigerung gegenüber den herkömm lichen Gensonden-Read out Methoden erzielt.By combining suitable target amplification methods such as Polymerase Chain Reaction (PCR) (EP200362), LCR (EP320308) and the Genson dentechnik will provide a significant increase in sensitivity over the conventional achieved gene-read-out methods.
Die Flüssighybridisierungstests wurden mit 100 ng 3-biotinylierten oder digoxi genierter Detectorsonde und fluoreszinierter Capturesonde und amplifizierter DNA nach Beispiel 3 in einem Volumen von 50 µl durchgeführt.The liquid hybridization assays were performed with 100 ng of 3-biotinylated or digoxi genated detector probe and fluorescence capture probe and amplified DNA carried out according to Example 3 in a volume of 50 ul.
Nach 5-minütigem Erhitzen auf 100°C wurden 50 µl 2x Hybridisierungsmix (50 ml 20XSSC, 1 g Blocking Reagenz (Boehringer), 2 ml 10%iges Lauroylsarcosin, 200 ml 20%iges SDS ad 100 ml bidest H2O) zugegeben und 5 bis 10 Minuten bei 37°C hyridisiert (Oligonukleotidsonde). Die magnetischen Beads (20 µl) werden zu 100 µl 1× Hybridisiermix zugegeben und 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur unter schwacher Bewegung inkubiert. Der gekoppelte Hybridisierungskomplex wurde mit den Beads separiert, die Restflüssigkeit abpipettiert und einmal mit Puffer B (0,1 SSC; 0,1% SDS) 1× gewaschen.After heating for 5 minutes at 100 ° C., 50 μl of 2x hybridization mix (50 ml 20XSSC, 1 g blocking reagent (Boehringer), 2 ml 10% lauroyl sarcosine, 200 ml 20% SDS ad 100 ml bidist H 2 O) were added and Hyridized at 37 ° C for 5 to 10 minutes (oligonucleotide probe). The magnetic beads (20 μl) are added to 100 μl 1 × hybridization mix and incubated for 5 to 10 minutes at room temperature with gentle agitation. The coupled hybridization complex was separated with the beads, the residual liquid was pipetted off and washed once with buffer B (0.1 SSC, 0.1% SDS) 1 ×.
Anschließend wurde die Blocking Reaktion und Antikörper-Reaktion zum Nachweis der Hybridisierung über Chemilumineszenz durchgeführt. Die mit DNA beladenen Beads wurden 1× mit 500 µl Blocking Puffer (0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl pH 7,5; 1% Blocking Reagenz (Boehringer)) zugegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde separiert, abpipettiert und 250 µl Antikörperkonjugat-Lösung (AK 1 : 2500 in Blocking Puffer) zugeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann separiert, abpipettiert und mit 500 µl Waschpuffer (Blocking Puffer + 0,3% Twenn 20) behandelt 4× 30 Sekunden, 1× 2 Minuten bei schwacher Bewe gung. Es wurde dann mit 100 µl Detektionslösung 0,8 µl CDP von Promega in Lumineszensmix (100 µl) 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert, dann die Chemilu mineszenz im Lumineszenz-Fotometer bei 477 nm (Lumacounter von Lumac) 10 sec. gemessen.Subsequently, the blocking reaction and antibody reaction for detection hybridization via chemiluminescence. Those loaded with DNA Beads were washed 1 × with 500 μl blocking buffer (0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl pH 7.5; 1% blocking reagent (Boehringer)). After 5 minutes incubation at Room temperature was separated, pipetted and 250 μl of antibody conjugate solution (AK 1: 2500 in blocking buffer) and 10 minutes at room temperature incubated, then separated, pipetted and washed with 500 .mu.l wash buffer (blocking buffer + 0.3% Twenn 20) treated 4 × 30 seconds, 1 × 2 minutes at low load supply. It was then with 100 .mu.l detection solution 0.8 .mu.l CDP from Promega in Luminescent mixture (100 .mu.l) for 5 min. At room temperature, then the Chemilu minescence in the luminescence photometer at 477 nm (Lumacounter from Lumac) 10 sec. Measured.
mit HCl konz. auf pH 10 stellen
ad 200 ml bidestwith HCl conc. to pH 10
ad 200 ml redist
Im Chemilumineszenztest mit Dig-Detector-Probe werden 40 µl des jeweiligen Amplicons eingesetzt, sowie 5 µl (50 ng) der fluoreszinierten capture Probe (APC-2) und 4 µl (1 : 10 verdünnt) (4 ng) der digoxigenierten Detection-Probe (APC-1).In the chemiluminescence test with Dig-Detector sample, 40 μl of the respective Amplicons and 5 μl (50 ng) of the fluorescence capture probe (APC-2) and 4 μl (1:10 diluted) (4 ng) of the digoxigenized detection probe (APC-1).
Durch die Kombination von geeigneten Target-Amplifikationsmethoden wie der Polymerase Chain Reaction (PCR) (EP200362), LCR (EP320308) und der Gen sonentechnik wird eine signifikante Sensitivitätssteigerung gegenüber den herkömm lichen Gensonden-Read out Methoden erzielt.By combining suitable target amplification methods such as Polymerase Chain Reaction (PCR) (EP200362), LCR (EP320308) and the gene sonic technology will provide a significant increase in sensitivity over the conventional achieved gene-read-out methods.
Die Flüssighybridierungstests wurden mit 100 ng 3'-unmarkierer RNA Detectorsond und fluoreszinierter Captur sonde und amplifizierter DNA nach Beispiel 3 in einem Volumen von 50 µl durchgeführt. Liquid hybridization assays were performed with 100 ng of 3 'unlabeled RNA Detector probe and fluorescence Captur probe and amplified DNA according to Example 3 in one Volume of 50 ul performed.
Nach 5-minütigem Erhitzen auf 100°C wurden 50 µl 2x Hybridisierungsmix (50 ml 20XSSC, 1 g Blocking Reagenz (Boehringer), 2 ml 10%iges Lauroylsarcosin, 200 ml 20%iges SDS ad 100 ml Bidest H2O) zugegeben und 5 bis 10 Minuten bei 37°C hybridisiert (Oligonukleotidsonde). Die magnetischen Beads (20 µl) werden zu Hybridisierungsansatz und 100 µl 1× Hybridsiermix zugegeben und 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur unter schwacher Bewegung inkubiert. Der gekoppelte Hybri disierungskomplex wurde mit den Beads separiert, die Restflüssigkeit abpipettiert und einmal mit Puffer B (0,1 SSC; 0,1% SDS) 1× gewaschen.After heating for 5 minutes at 100 ° C., 50 μl of 2x hybridization mix (50 ml 20XSSC, 1 g blocking reagent (Boehringer), 2 ml 10% lauroyl sarcosine, 200 ml 20% SDS ad 100 ml bidest H 2 O) were added and Hybridized for 5 to 10 minutes at 37 ° C (oligonucleotide probe). The magnetic beads (20 μl) are added to the hybridization mixture and 100 μl of 1 × Hybrid Mix and incubated for 5 to 10 minutes at room temperature with gentle agitation. The coupled hybridization complex was separated with the beads, the residual liquid was pipetted off and washed once with buffer B (0.1 SSC, 0.1% SDS) 1 ×.
Anschließend wurde die Blocking Reaktion und Antikörper-Reaktion zum Nachweis der Hybridisierung über Chemilumineszenz durchgeführt. Die mit dem DNA RNH Hybrid beladenen Beads wurden 1× mit 500 µl Blocking Puffer (0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl pH 7,5; 1% Blocking Reagenz (Boehringer)) zugegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde separiert, abpipettiert und 250 µl Antikörperkonjugat-Lösung (AK 1 : 2500 in Blocking Puffer) zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann separiert, abpipettiert und mit 500 µl Waschpuffer (Blocking Puffer + 0,3% Tween 20) behandelt 2× 30 Sekunden, 1× 2 Minuten bei schwacher Bewegung. Es wurde dann mit 100 µl Detektionslösung (0,8 µl CDP von Promega in Lumineszenzmix (100 µl) siehe Beispiel 5) 5 Minuten bei Raumtemperatur mit AMPPD 1 : 100 in Puffer 3 inkubiert, dann die Chemilumineszenz 10 sec. im Lumineszenz-Fotometer bei 477 nm (Lumacounter von Lumac) gemessen. Das Verfahren ist automatisiert auf dem Immunol oder Nach folgegeräten durchführbar.Subsequently, the blocking reaction and antibody reaction for detection hybridization via chemiluminescence. The DNA RNH Hybrid-loaded beads were washed 1 × with 500 μl blocking buffer (0.1 M maleic acid; 0.15 M NaCl pH 7.5; 1% blocking reagent (Boehringer)). After 5 Minutes incubation at room temperature was separated, pipetted and 250 ul Antibody conjugate solution (AK 1: 2500 in blocking buffer) was added and 10 Incubated for a few minutes at room temperature, then separated, pipetted and with 500 ul Wash Buffer (blocking buffer + 0.3% Tween 20) treated 2 × 30 seconds, 1 × 2 Minutes with a slight movement. It was then filled with 100 μl of detection solution (0.8 μl Promega CDP in luminescence mix (100 μl) see example 5) 5 minutes incubated at room temperature with AMPPD 1: 100 in buffer 3, then the Chemiluminescence 10 sec. In the luminescence photometer at 477 nm (Lumacounter from Lumac). The procedure is automated on the Immunol or Nach followers feasible.
Im Chemilumineszenztest mit den RNA-Probes wird nur 4 µl Amplikon eingesetzt, sowie 5 µl Fluorescein-capture-Probe (50 ng) und 1 µl RNA-Probe (3 µl Oligo + 17 µl Wasser verd.) (150 ng). In the chemiluminescence test with the RNA probes, only 4 μl amplicon is used, and 5 μl fluorescein capture probe (50 ng) and 1 μl RNA probe (3 μl oligo + Dilute 17 μl of water) (150 ng).
0,1 bis 1 ml Blut mit 1 Volumen 0,1 bis 1 ml Puffer Cl und 3 Volumen eiskaltem H2O vermischt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Das lysierte Blut wird bei 4°C und 1300 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Nach Zugabe von 250 µl eiskalten Puffer C1 und 750 µl H2O wird gemixt und nochmals 5 Minuten bei 1300 g zentrifugiert. Dann werden 1 ml Puffer G2 zugegeben und durch Vortexen 10 bis 30 Sekunden gemischt.0.1 to 1 ml of blood mixed with 1 volume of 0.1 to 1 ml of buffer Cl and 3 volumes of ice-cold H 2 O and incubated on ice for 10 minutes. The lysed blood is centrifuged at 4 ° C and 1300 g and the supernatant discarded. After addition of 250 .mu.l ice cold buffer C1 and 750 .mu.l H 2 O is mixed and centrifuged again for 5 minutes at 1300 g. Then, 1 ml of Buffer G2 is added and mixed by vortexing for 10 to 30 seconds.
Nach Zugabe von 25 µl Protease Stammlösung wird 30 Minuten bei 50°C inkubiert und auf die Qiagensäule mit 1 ml Puffer QBT aufgetragen und eluiert. Die Qiagen säule wird mit 3× 1 ml Puffer QC gewaschen und dann die genomische DNA mit 2× 1 ml Puffer QF eluiert. Nach Zugabe von 0,7 ml Isopropanol wird bei 4°C 15 Minuten bei <5000 g zentrifugiert und abdekantiert, dann das Präzipitat mit 1 ml Ethanol gewaschen, 10 Minuten luftgetrocknet und dann in 0,1 bis 0,2 ml H2O aufgenommen und für die Tests eingesetzt. Die Zusammensetzung der Puffer ist im Qiagen-DNA-Handbook 1995 beschrieben. Das Kit ist unter der Katalognummer 13323 erhältlich.After addition of 25 .mu.l protease stock solution is incubated for 30 minutes at 50 ° C and applied to the Qiagensäule with 1 ml of buffer QBT and eluted. The Qiagen column is washed with 3 x 1 ml buffer QC and then the genomic DNA is eluted with 2 x 1 ml buffer QF. After addition of 0.7 ml of isopropanol is centrifuged at 4 ° C for 15 minutes at <5000 g and decanted, then the precipitate washed with 1 ml of ethanol, air dried for 10 minutes and then taken up in 0.1 to 0.2 ml H 2 O. and used for the tests. The composition of the buffers is described in the Qiagen DNA Handbook 1995. The kit is available under catalog number 13323.
Die Leucozyten DNA wurde aus dem klinischen Probenmaterial (Blut) nach der in Beispiel 7 beschriebenen Methode isoliert. Das DNA-Lysat wurde dann mit Hilfe geeigneter Amplifikationsmethoden wie im Beispiel 5 beschrieben mit spezifischen Oligonukleotid-Primern amplifiziert. Die amplifizierte Nukleinsäure wurde dann mit den Oligonukleotidsonden SEQ ID No. 4+5 hybridisiert und der unter stringenten Bedingungen sich ausbildende spezifische Hybridisierungskomplex wurde mit mag netischen Partikeln von Bayer Diagnostics separiert und wie im Beispiel 6 oder be vorzugt 7, durch Chemilumineszenz-Read out quantitativ bestimmt. The leucocyte DNA was isolated from the clinical specimen (blood) after in Example 7 isolated method. The DNA lysate was then using suitable amplification methods as described in Example 5 with specific Amplified oligonucleotide primers. The amplified nucleic acid was then with the oligonucleotide probes SEQ ID NO. 4 + 5 hybridizes and the one under stringent The conditions forming specific hybridization complex was with mag netic particles separated from Bayer Diagnostics and as in Example 6 or be preferably 7, quantified by chemiluminescence read-out.
Claims (13)
- a) aus der Probe die DNA isoliert,
- b) die Proben-DNA mit dem mutationsspezifischen Set von Starteroligo nukleotiden gemäß Anspruch 8, amplifiziert,
- c) die Proben-DNA in einem weiteren Ansatz mit dem Wildtyp-spezifi schen Set von Starteroligonukleotiden gemäß Anspruch 9 amplifiziert und
- d) die Amplifikationssignale auswertet.
- a) isolating the DNA from the sample,
- b) amplifying the sample DNA with the mutation-specific set of starter oligo nucleotides according to claim 8,
- c) amplified the sample DNA in a further approach with the wild-specific set of starter oligonucleotides according to claim 9 and
- d) evaluates the amplification signals.
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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8139 | Disposal/non-payment of the annual fee | ||
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: BAYER HEALTHCARE AG, 51373 LEVERKUSEN, DE |