DE19846011A1

DE19846011A1 - Process for the purification of preparations containing granulocytes

Info

Publication number: DE19846011A1
Application number: DE19846011A
Authority: DE
Inventors: Andreas Emmendoerffer; Kerstin Puellmann; Janos Kadar
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: DRK Blutspendedienst Nordrhein Westfalen gGmbH
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2000-04-20
Anticipated expiration: 2018-10-07
Also published as: DE19846011C2

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufreinigung von Granulozyten enthaltenden Präparaten sowie auf derartig aufgereinigte Granulozyten enthaltende Präparate. Granulozyten enthaltende Präparate werden im Bereich der Transfusionsmedizin, Hämatologie, Onkologie, Pädiatrie und Blutspende beispielsweise zur Therapie von Antibiotika resistenten Infektionen sowie zur Vorbeugung von Infektionen entsprechend gefährdeter Patienten oder auch zur Behandlung von angeborenen Granulozytenfunktionsstörungen verwendet. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Vorläuferzellen der Granulozyten aus den Präparaten abgetrennt, indem das Präparat mit Annexin V oder Antikörpern, die die Vorläuferzellen erkennen, inkubiert wird und anschließend die an Annexin V bzw. an die Antikörper gebundenen Vorläuferzellen entweder aufgrund einer Markierung des Annexin V oder der Antikörper oder aufgrund einer Bindung des Annexin V oder der Antikörper an ein Trägermaterial, beispielsweise magnetische Beads, abgetrennt werden.The present invention relates to a method for the purification of preparations containing granulocytes and to preparations containing such purified granulocytes. Granulocyte-containing preparations are used in the field of transfusion medicine, hematology, oncology, pediatrics and blood donation, for example for the therapy of antibiotic-resistant infections and for the prevention of infections in patients at risk or for the treatment of congenital granulocyte dysfunction. According to the method according to the invention, the precursor cells of the granulocytes are separated from the preparations by incubating the preparation with Annexin V or antibodies which recognize the precursor cells, and then the precursor cells bound to Annexin V or to the antibodies either on the basis of labeling of Annexin V or the antibody or due to a binding of Annexin V or the antibody to a carrier material, for example magnetic beads, are separated.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver fahren zur Aufreinigung von Granulozyten enthaltenden Präparaten. Derartige Granulozyten enthaltende Präparate werden im Bereich der Transfusionsmedizin, Hämatologie, Onkologie, Blutspende, Pädiatrie, etc. erzeugt bzw. verwendet.The present invention relates to a ver drive to the purification of granulocytes Preparations. Such granulocytes containing Preparations are used in the field of transfusion medicine, Hematology, oncology, blood donation, pediatrics, etc. generated or used.

Insbesondere werden Granulozytenpräparate für die Granulozytentransfusion bei der Therapie antibiotisch schwer zu beherrschender Infektionen, bei der Prophylaxe bei Patienten mit hohem Infektionsrisiko oder auch zur Behandlung angeborener Granulozyten funktionsstörungen beispielsweise in der Pädiatrie eingesetzt.In particular, granulocyte preparations for the Granulocyte transfusion in antibiotic therapy difficult to control infections where Prophylaxis in patients at high risk of infection or also for the treatment of congenital granulocytes functional disorders, for example in pediatrics used.

Die Transfusion von Granulozytenpräparaten ist seit mehreren Jahrzehnten Bestandteil der Therapie an tibiotisch schwer zu beherrschender Infektionen. Für die Transfusion werden mindestens 1 bis 2 × 10¹⁰ Zel len benötigt. Diese hohe Zahl von Zellen wird von Normalspendern nur selten erreicht, so daß gewöhnlich die Granulozyten aus dem Knochenmark durch Gabe von Steroiden, wie beispielsweise Dexamethason, Prednison oder Methylprednison, mobilisiert werden. Mit Einfüh rung von G-CSF in den klinischen Bereich für die Mobilisation von Granulozyten zur Vorbereitung von Spendern für Granulozytenpräparate konnte die Ef fizienz der Mobilisierung gegenüber den Steroiden weiter gesteigert werden. Hierbei wird derzeit noch ermittelt, ob den Spendern zur Mobilisation von Granulozyten G-CSF einmal oder wiederholt gegeben werden soll. Der Stand der Technik bei dem Einsatz von Granulozytenpräparaten wird beispielsweise in Emmendoerffer, A. et al. "Kinetics of transfused neutrophils in peripheral blood and BAL fluid of a patient with x-linked chronic granulomatous disease" Eur. J. Haematol, Bd. 47, S. 246-252, 1991, beschrieben.The transfusion of granulocyte preparations has been part of the therapy for tibiotic infections that are difficult to control for several decades. At least 1 to 2 × 10 ¹⁰ cells are required for the transfusion. This high number of cells is rarely reached by normal donors, so that the granulocytes from the bone marrow are usually mobilized by administration of steroids, such as, for example, dexamethasone, prednisone or methylprednisone. With the introduction of G-CSF in the clinical area for the mobilization of granulocytes to prepare donors for granulocyte preparations, the efficiency of the mobilization compared to the steroids could be further increased. It is currently being determined whether the donors for mobilizing granulocytes should be given G-CSF once or repeatedly. The prior art for the use of granulocyte preparations is described, for example, in Emmendoerffer, A. et al. "Kinetics of transfused neutrophils in peripheral blood and BAL fluid of a patient with x-linked chronic granulomatous disease" Eur. J. Haematol, Vol. 47, pp. 246-252, 1991.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Ver fahren zur Aufreinigung von Granulozyten zur Ver fügung zu stellen, um den Reinheitsgrad und die Qualität der zur Granulozytentransfusion verwendeten Präparate zu verbessern, sowie nach diesem Verfahren hergestellte Granulozyten enthaltende Präparate und deren Verwendung zur Verfügung zu stellen.The object of the present invention is a Ver drive to the purification of granulocytes for ver to provide the degree of purity and the Quality of the granulocyte transfusion used Preparations to improve, as well as following this procedure prepared granulocyte-containing preparations and to make their use available.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1, Granulozyten enthaltende Präparate nach Anspruch 11 sowie deren Verwendung nach Anspruch 12 gelöst. This object is achieved by the method according to claim 1, preparations containing granulocytes according to claim 11 and their use according to claim 12 solved.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den abhängigen Ansprüchen gegeben.Advantageous further developments of the invention Procedures are set out in the dependent claims given.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Aufreinigung von Granulozyten enthaltenden Präparaten werden aus diesen Präparaten die nicht funktionalen, beispielsweise die chemotaktisch nicht aktiven, in der Sauerstoffradikalproduktion schwachen oder negativen Granulozyten, insbesondere die Vorläufer zellen der Granulozyten abgetrennt. Wesentlich für dieses Verfahren ist die Erkenntnis, daß Granulozyten, die z. B. durch G-CSF beschleunigt aus dem Knochenmark ausgeschüttet wurden und in das periphere Blut gelangten, sich in Abhängigkeit von ihrem Reifungs- und Differenzierungsgrad von normalen neutrophilen Granulozyten in der Expression bestimm ter Oberflächenantigene und in ihrer Funktion (Chemotaxis, Sauerstoffradikalproduktion) unterscheiden. Insbesondere bei mehrfacher Gabe von G-CSF erhöht sich hier der Anteil an jungen Granulozyten aus dem Knochenmark. Nebenwirkung der allogenen Granulozytentransfusion ist das Auftreten antigranulozytärer Antikörper im Empfänger, wobei die Wahrscheinlichkeit hierfür und der jeweilige Titer der Antikörper mit der Zahl der transfundierten Präparate korreliert. Zum anderen werden durch die intensive Mobilisation auch Vorläuferzellen von Granulozyten aus dem Knochenmark ausgeschüttet, die im Hinblick auf die Sauerstoffradikalproduktion negativ bzw. signifikant schwächer und außerdem chemotaktisch inaktiv sind. Der Anteil dieser Zellen schwankt in Abhängigkeit von der Art und Dauer der Mobilisation, in Abhängigkeit von der Art der Zel lapharese bzw. der Lagerdauer des Präparates zwischen 5% und 80% der Zellen des Präparates. Dies bedeutet eine hohe Variabilität in der Qualität der Präparate, was sowohl für den therapeutischen Erfolg als auch für die mit der Transfusion verbundenen Nebenwirkun gen beim Empfänger eine unnötige Belastung darstellt. Durch die Abtrennung der chemotaktisch inaktiven und bei der Sauerstoffradikalproduktion negativ bzw. sig nifikant schwächeren Vorläuferzellen oder überalter ten Granulozyten werden die reifen, funktionell ak tiven Granulozyten angereichert und der Anteil funktionell inkompetenter und somit unnötig transfun dierter Zellen reduziert. Dies führt zu einer Ver minderung der Belastung des Empfängers, da die funktionell inkompetenten Zellen von dessen Mak rophagensystem abgebaut werden und gegebenenfalls die Induktion von Alloantikörpern gegen die transfundier ten Granulozyten fördern. Es ergibt sich folglich eine bessere Qualität der Granulozyten enthaltenden Präparate und eine damit verbundene bessere Steuer barkeit der Therapie. Der erhöhte Anteil funktionell aktiver Granulozyten, die transfundiert werden und sofort für die Infektabwehr zur Verfügung stehen, führt zu einer erhöhten therapeutischen Effektivität des Granulozyten enthaltenden Präparates.According to the purification process according to the invention of granulocyte-containing preparations are made these preparations the non-functional, for example the chemotactically inactive, in of oxygen radical production weak or negative granulocytes, especially the precursors cells of the granulocytes separated. Essential for this process is the realization that Granulocytes, e.g. B. accelerated by G-CSF the bone marrow were poured out and into the peripheral blood came down depending on their degree of maturation and differentiation from normal determine neutrophil granulocytes in expression ter surface antigens and in their function (Chemotaxis, oxygen radical production) differentiate. Especially with multiple administration of G-CSF increases the proportion of young people here Bone marrow granulocytes. Side effect of allogeneic granulocyte transfusion is the occurrence antigranulocytic antibody in the recipient, the Probability for this and the respective titer the antibody with the number of transfused Preparations correlated. On the other hand, through the intensive mobilization also of progenitor cells from Granulocytes are released from the bone marrow, the in terms of oxygen radical production negative or significantly weaker and moreover are chemotactically inactive. The proportion of these cells varies depending on the type and duration of the Mobilization, depending on the type of cell lapharese or the storage period of the preparation between 5% and 80% of the cells of the preparation. this means a high variability in the quality of the preparations, what both for therapeutic success as well for the side effects associated with transfusion conditions represent an unnecessary burden on the recipient. By separating the chemotactically inactive and negative or sig in oxygen radical production significantly weaker progenitor cells or older The mature, functionally active granulocytes tive granulocytes enriched and the proportion functionally incompetent and therefore unnecessarily transfun dated cells reduced. This leads to a ver reduce the burden on the recipient as the functionally incompetent cells from its mak the oesophageal system and if necessary the Induction of alloantibodies against the transfundier Promote ten granulocytes. It follows better quality of the granulocytes containing Preparations and an associated better tax availability of therapy. The increased proportion is functional active granulocytes that are transfused and are immediately available for infection control, leads to increased therapeutic effectiveness of the preparation containing granulocytes.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren dadurch besonders einfach durchgeführt werden, daß das Granulozyten enthaltende Präparat mit Annexin V oder Antikörpern, die Verläuferzellen der Granulozyten erkennen, inkubiert wird. Dabei macht man sich die Erkenntnis zunutze, daß die aus dem Knochenmark, z. B. durch G-CSF, Steroide oder ein Kom bination aus Steroiden und G-CSF oder durch pflanzliche oder bakterielle Polysaccharide mobilisierten Granulozyten sich gemäß der nachfolgen den Tabelle 1 in einer Reihe von Oberflächenmarkern und Funktionen von den normalen Granulozyten unterscheiden.According to the present invention, the method can be carried out particularly simply in that the preparation containing granulocytes with Annexin V or antibodies, the progenitor cells of the Recognize granulocytes, is incubated. Doing so one takes advantage of the knowledge that from the Bone marrow, e.g. B. by G-CSF, steroids or a comm combination of steroids and G-CSF or through vegetable or bacterial polysaccharides mobilized granulocytes according to the follow Table 1 in a series of surface markers and functions from normal granulocytes differentiate.

Tabelle 1 Table 1

Veränderung Oberflächenmarker auf G-CSF induzierten Granulozyten im Vergleich zu normalen Granulozyten Change in surface markers on G-CSF induced granulocytes compared to normal granulocytes

Die Erfindung macht sich dabei den Umstand zunutze, daß diese Zellen sich in der Durchflußzytometrie neben dem Scatterprofil (Größe und Granularität) deutlich in der Expression von Phosphatidylserin von normalen Granulozyten unterscheiden. Sie zeichnen sich durch eine äußerst hohe Expression von Phosphatidylserin aus. Diese Expression kann im Durchflußzytometer mittels einer Bindung von beispielsweise FITC-markiertem Annexin V nachgewiesen werden. Diese Erkenntnis, daß die Vorläuferzellen der Granulozyten Annexin V binden und folglich mit An nexin V markiert werden können, kann nun vorteilhaft zur Abtrennung dieser Vorläuferzellen verwendet wer den. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, daß Annexin V an Trägermaterial gebunden wird und anschließend in der Gegenwart von Kalziumionen das Granulozyten enthaltende Präparat mit dem Träger material in Kontakt gebracht wird. Das Trägermaterial kann dabei auch aus magnetischen Beads bestehen. Geraten die Vorläuferzellen der Granulozyten in Kon takt mit dem Annexin V, so binden sie an dieses und sind folglich auch an das Trägermaterial gebunden. Sie können daher einfach durch Entfernung des Träger materials, beispielsweise über ein Magnetfeld zur Entfernung der magnetischen Beads, entfernt werden. Dasselbe Verfahren läßt sich statt mit Annexin V auch mit Antikörpern durchführen, die die Vorläuferzellen der Granulozyten erkennen. Derartige Antikörper sind beispielsweise die Antikörper CD13, CD33, CD117.The invention takes advantage of the fact that these cells are in flow cytometry in addition to the scatter profile (size and granularity) clearly in the expression of phosphatidylserine from distinguish normal granulocytes. they draw by an extremely high expression of Phosphatidylserine. This expression can be found in Flow cytometer by means of a binding of for example, FITC-labeled Annexin V detected become. This realization that the progenitor cells of the Granulocytes bind Annexin V and consequently with An nexin V can now be marked who used to separate these precursor cells the. This can happen, for example, in that Annexin V is bound to carrier material and then in the presence of calcium ions Granulocyte-containing preparation with the carrier material is brought into contact. The carrier material can also consist of magnetic beads. If the precursor cells of the granulocytes get into con clock with Annexin V, they bind to this and are consequently also bound to the carrier material. You can therefore simply by removing the carrier materials, for example via a magnetic field Removal of the magnetic beads. The same procedure can be used instead of Annexin V. perform with antibodies that the progenitor cells of granulocytes. Such antibodies are for example the antibodies CD13, CD33, CD117.

Als Alternative hierzu können markiertes Annexin V oder entsprechende markierte Antikörper eingesetzt werden, indem diese mit dem Granulozyten enthaltenden Präparat vermischt werden. Die Vorläuferzellen der Granulozyten binden anschließend an das markierte Annexin V bzw. an die markierten Antikörper und kön nen anschließend aufgrund der Markierung abgetrennt werden. Besonders geeignet ist dabei eine fluorochrome Markierung des Annexin V oder der Anti körper. Diese können anschließend zusammen mit den Vorläuferzellen der Granulozyten beispielsweise durch Chromatographie oder in einem Sorter, aus dem Präparat abgetrennt werden.As an alternative, labeled Annexin V or appropriate labeled antibodies are used by using these containing the granulocytes Preparation to be mixed. The progenitor cells of the Granulocytes then bind to the labeled one Annexin V or to the labeled antibodies and can then separated based on the marking become. One is particularly suitable fluorochrome labeling of Annexin V or Anti body. These can then be used together with the Precursor cells of the granulocytes, for example Chromatography or in a sorter from which Preparation are separated.

Die durch dieses erfindungsgemäße Verfahren auf gereinigten Granulozyten enthaltenden Präparate wer den in der Transfusionsmedizin, Hämatologie, Onkologie, Blutspende, Pädiatrie, insbesondere zur Behandlung von antibiotisch schwer zu beherrschenden Infektionen oder zur Prophylaxe von Patienten mit hohem Infektionsrisiko eingesetzt.The method of this invention preparations containing purified granulocytes those in transfusion medicine, hematology, Oncology, blood donation, pediatrics, especially for Treatment of antibiotic difficult to control Infections or for prophylaxis of patients with high risk of infection.

Im folgenden werden einige vorteilhafte Ausfüh rungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Granulozyten enthaltenden Präparate beschrieben. Es zeigenThe following are some advantageous implementations tion examples of the method according to the invention and of the granulocytes according to the invention Preparations described. Show it

Fig. 1a den Anteil an Annexin-V-positiven Zellen 24 Stunden nach Gabe von G-CSF (Fall 1) im FSC/SSC-Dot plot; FIG. 1a plot the percentage of annexin V-positive cells 24 hours after administration of G-CSF (case 1) in the FSC / SSC dot;

Fig. 1b denselben Anteil im FL1-Histogramm mit Annexin V-FITC zum Anfärben der Zellen; FIG. 1b shows the same portion in the FL1 histogram with Annexin V-FITC staining of the cells;

Fig. 2a den Anteil Annexin-V-positiver Zellen 48 Stunden nach der Gabe von G-CSF im Blut von Fall 1 im FSC/SSC-Dotplot; FIG. 2a shows the proportion annexin V-positive cells 48 hours after the administration of G-CSF in the blood of the case 1 in the FSC / SSC dot plot;

Fig. 2b das zu Fig. 2a zugehörige FL1-Histogramm mit Annexin V-FITC zum Anfärben der Zellen; FIG. 2b shows the Figure 2a corresponding FL1 histogram with Annexin V-FITC staining of the cells.

Fig. 3 den Anteil an Annexin-V-positiven Zellen 48 Stunden nach der Gabe von G-CSF im Blut von Fall 2 im FSC/SSC-Dotplot; FIG. 3 shows the percentage of annexin V-positive cells 48 hours after the administration of G-CSF in the blood of the case 2 in the FSC / SSC dot plot;

Fig. 4 den Anteil an Annexin-V-positiven Zellen nach Reduktion in der Magnetseparation im Fall 2; FIG. 4 shows the percentage of annexin V-positive cells after reduction in the magnetic separation in the case 2;

Fig. 5 die Anreicherung an Annexin-V-positiven Zellen nach Magnetseparation im Fall 2; FIG. 5 shows the accumulation of Annexin V-positive cells by magnetic separation in the case 2;

Fig. 6 den Phänotyp der Annexin-V-positiven Zellen nach Pappenheim-Färbung. Fig. 6 shows the phenotype of annexin V-positive cells after Pappenheim staining.

Die Fig. 1 bis 6 zeigen Ergebnisse zweier Proban denfälle, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wurde. Figs. 1 to 6 show results of two denfälle Proban in which the inventive method has been applied.

In beiden Fällen wurden 300 ml heparinisiertes venöses Vollblut eines gesunden Spenders, der 48 bzw. 24 Stunden zuvor einmalig mit 300 µg rhu G-CSF sub cutan behandelt wurde, mit Hydroxyethylstärke (6%) in einem Verhältnis von 1 : 2 gemischt. Das Vollblut wurde dabei durch einfache Blutabnahme gewonnen. Die Erythrozyten wurden durch Sedimentation für 30 Minuten bei Raumtemperatur aus dem Vollblut abgetren nt. Der leukozytenhaltige Überstand wurde abgenommen und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Mag nesium und Kalzium (PBS-MC) in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt. Die Leukozyten wurden daraufhin in Granulozyten und mononukleäre Zellen über einen Ficoll-Dichtegradienten (20 Minuten, 750 × g) auf getrennt. Der Überstand dieses Dichtegradienten wurde entfernt und das granulozytenhaltige Sediment gesam melt. Anschließend wurde das granulozytenhaltige Sediment durch hypotone Lyse von kontaminierenden Erythrozyten gereinigt. Eine Probengewinnung durch Apharese wäre ebenfalls möglich. Die Zellen wurden gezählt und in einen kalziumhaltigen Puffer über führt. Der die Granulozyten enthaltende kalziumhal tige Puffer wurde zu Annexin V-beladenen magnetischen Beads gegeben und diese Mischung anschließend inkubiert. Während dieser Inkubation banden diese Vorläuferzeller der Granulozyten an das Annexin V und wurden so mit den magnetischen Beads gekoppelt. Die Annexin V-positive Zellen wurden anschließend über eine Säule magnetisch mit den Beads entfernt. Die Annexin V-negative Zellen enthaltende Lösung wurde anschließend mittels durchflußzytometrischer Analyse an einem FACScan (Becton Dickinson) gemessen und mit den Zellen der unseparierten Fraktion verglichen.In both cases, 300 ml was heparinized Whole venous blood from a healthy donor who is 48 or 24 hours beforehand with 300 µg rhu G-CSF sub cutan was treated with hydroxyethyl starch (6%) mixed in a ratio of 1: 2. The whole blood was obtained by simply taking blood. The Erythrocytes were sedimented for 30 Minutes from whole blood at room temperature nt. The supernatant containing leukocytes was removed and with phosphate-buffered saline without mag nesium and calcium (PBS-MC) in a ratio of Mixed 1: 1. The leukocytes were then in Granulocytes and mononuclear cells over one Ficoll density gradients (20 minutes, 750 × g) Cut. The supernatant of this density gradient was removed and the granulocyte-containing sediment total melt. Then the granulocyte-containing Sediment contaminated by hypotonic lysis Erythrocytes cleaned. Sampling through Apharesis would also be possible. The cells were counted and transferred to a calcium-containing buffer leads. The calcium hal containing the granulocytes buffer became annexin V-loaded magnetic Given beads and then this mixture incubated. During this incubation, these bound Precursor cell of the granulocytes to Annexin V and were coupled with the magnetic beads. The Annexin V positive cells were then over a column magnetically removed with the beads. The Solution containing Annexin V negative cells then by means of flow cytometric analysis on a FACScan (Becton Dickinson) measured and with the cells of the unseparated fraction compared.

Die durchflußzytometrische Analyse der angereicherten Granulozytenfraktion des Probandenfalls 1, der ein malig mit G-CSF 300 µg s.c. behandelt worden war, zeigt gemäß Fig. 1a den Anteil an Annexin V positiven Zellen nach 24 Stunden. Fig. 1a ist dabei ein FSC/SSC-Dotplot (Forward Scatter/Side Scatter- Dotpot), wobei mit R1 der Meßbereich angegeben ist, dessen Meßwerte dem Anteil Annexin V positiver Zellen entspricht. Der Bereich R2 entspricht dabei funktionell aktiven neutrophilen Granulozyten. Fig. 1b zeigt im FL 1-Histogramm die Anteile der einzelnen Fraktionen an Vorläuferzellen der Granulozyten und intakten Granulozyten in den einzelnen Bereichen R1 bzw. R2. Dabei entspricht die mit G1 bezeichnete Kurve den Messungen, die bei der Beschränkung der Messung auf ein Fenster gemäß dem Bereich R1 in Fig. 1a bestimmt wurden. Die Kurve G2 wurde mit einem Fenster gemäß dem Bereich R2 in Fig. 1a aufgezeich net. Fig. 2a und Fig. 2b zeigen dieselben Messungen 48 Stunden nach Gabe des G-CSF wobei die Bezeichnun gen R1, R2 und G1 und G2 wie in Fig. 1a und 1b ver wendet werden. Wie unmittelbar in den Fig. 1a, 1b, 2a und 2b zu erkennen ist, zeigt sich die Anwesenheit von Annexin V positiven Zellen im peripheren Blut. The flow cytometric analysis of the enriched granulocyte fraction of subject 1, who had been treated once with G-CSF 300 µg sc, shows the proportion of annexin V positive cells after 24 hours according to FIG. 1a. FIG. 1a is a FSC / SSC dot plot (Forward scatter / side scatter Dotpot), the range indicated by R1, the measured values corresponding to the proportion of Annexin V positive cells. The area R2 corresponds to functionally active neutrophil granulocytes. Fig. 1b-1 histogram shows the FL, the proportions of the individual fractions of precursor cells of granulocytes and intact granulocytes in the individual areas R1 and R2. The curve labeled G1 corresponds to the measurements which were determined when the measurement was restricted to a window in accordance with the region R1 in FIG. 1a. The curve G2 was recorded with a window according to the area R2 in FIG. 1a. Fig. 2a and Fig. 2b show the same measurements 48 hours after administration of G-CSF with the designations by R1, R2 and G1 and G2 as shown in Fig. 1a and 1b are ver turns. As can be seen directly in FIGS. 1a, 1b, 2a and 2b, the presence of Annexin V positive cells in the peripheral blood is evident.

Auch Fig. 3, die Messungen am Probandenfall 2 beschreibt, zeigt einen Anteil von Annexin V positiven Zellen 48 Stunden nach der Gabe von G-CSF. Wie im Vergleich zu Fig. 2a gesehen werden kann, ist auch hier ein Anteil myeloischer, FITC-markierter Vorläuferzellen zu erkennen. Fig. 4 zeigt weiterhin die Ergebnisse eines FSC/SSC-Dot-Plot nach Reduktion des Anteils an Annexin V positiven Zellen in der in Fig. 3 dargestellten Probe über Magnetseparation. Diese Ergebnisse lassen sich bei mehrfacher Wieder holung des Separations/Aufreinigungsschrittes weiter verbessern. Demgegenüber zeigt Fig. 5 eine Fraktion, bei der der Anteil von Annexin V positiven Zellen angereichert wurde. Ausgangspunkt war wiederum das bei Fig. 3 beschriebene Material des Probandenfalles 2. Es ist unmittelbar zu erkennen, daß die im Bereich R1 angesiedelten Annexin V-positiven myeloischen Vor läuferzellen gegenüber den in dem Bereich R2 an gesiedelten neutrophilen, intakten Granulozyten stark angereichert sind. Fig. 6 zeigt den Phänotyp der Annexin V-positiven Zellen nach Pappenheim-Färbung aus dem Präparat des Probandenfalles 2. Dabei wurden Zellen ausgewählt, die sich in dem Bereich R1 gemäß Fig. 3 befinden. Die hier dargestellten myeloischen Vorläuferzellen entsprechen einem Anteil von ca. 20 bis 50%. Sie bestehen aus unreifen Zellen mit mononukleärem Charakter. Weiterhin sind normale Granulozyten zu erkennen, die durch segmentierte Kerne auffallen. FIG. 3, which describes measurements on test subject case 2, also shows a proportion of Annexin V positive cells 48 hours after the administration of G-CSF. As can be seen in comparison to FIG. 2a, a portion of myeloid, FITC-labeled progenitor cells can also be seen here. FIG. 4 further shows the results of an FSC / SSC dot plot after reduction of the proportion of Annexin V positive cells in the sample shown in FIG. 3 by magnetic separation. These results can be further improved by repeating the separation / purification step several times. 5 In contrast, Fig., A fraction in which the fraction of Annexin V positive cells was enriched. The starting point was again the material of the test subject case 2 described in FIG. 3. It can be seen immediately that the Annexin V-positive myeloid progenitor cells located in area R1 are strongly enriched compared to the neutrophilic, intact granulocytes that settled in area R2. FIG. 6 shows the phenotype of the Annexin V-positive cells after Pappenheim staining from the preparation of the test subject case 2. In this case, cells were selected which are in the area R1 according to FIG. 3. The myeloid progenitor cells shown here correspond to a share of approx. 20 to 50%. They consist of immature cells with a mononuclear character. Furthermore, normal granulocytes can be seen, which stand out due to segmented nuclei.

Claims

1. A process for the purification of granulocyte-containing preparations, characterized in that the non-functional granulocytes, in particular precursor cells, are separated from granulocytes from the preparation.

2. The method according to the preceding claim, characterized in that the cells of the Preparations with Annexin V or antibodies that Recognize progenitor cells, is incubated.

3. The method according to the preceding claim, characterized in that the incubation in Granulocytes with bound to carrier material Annexin V takes place in the presence of calcium ions.

4. Proceed according to at least one of the preceding the claims, characterized in that the Preparation incubated with a carrier material on the surface of which Annexin V or An antibodies, the precursor cells of the granulocytes recognize, are coupled.

5. Proceed according to at least one of the preceding the claims, characterized in that the Carrier material contains magnetic beads.

6. Proceed according to at least one of the preceding the claims, characterized in that the mixture of magnetic beads and preparation a magnetic field is applied and the magnetic Beads and the preparation are separated.

7. The method according to at least one of claims 3 to 6, characterized in that the separation of the carrier material and the preparation Panning steps or magnetic separation takes place.

8. Proceed according to at least one of the preceding the claims, characterized in that the Product with marked Annexin V or with labeled antibodies and incubated then the labeled granulocytes to be read.

9. The method according to the preceding claim, characterized in that the preparation with fluorochrome coupled Annexin V or incubated fluorochrome-coupled antibodies and then the fluorescent labeled Granulocytes are separated from the preparation.

10. Proceed according to at least one of the two arising claims, characterized in that the separation of the labeled granulocytes by chromatography, in particular Column chromatography, or in a sorter he follows.

11. Granulocyte-containing preparation according to a procedure according to at least one of the above related claims was treated.

12. Use of granulocytes containing Preparations according to the preceding claim in transfusion medicine, hematology, oncology, Blood donation, pediatrics, especially for Treatment of antibiotic difficult to master infections and prophylaxis Patients at high risk of infection.