DE19839113A1 - Use of hyaluronic acid fragments in vaccine production, especially for cancer treatment - Google Patents
Use of hyaluronic acid fragments in vaccine production, especially for cancer treatmentInfo
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Abstract
Description
Die Bereitstellung von dendritischen Zellen (DZ) erlangt bei der Therapie von verschiedenen Erkrankungen eine immer größer werdende Bedeutung. Mit Hilfe der dendritischen Zellen ist es möglich, hochaktive Immunmodulatoren bereitzustellen, die mit verschiedenen Antigenen, insbesondere Tumorantigenen, Viruspeptiden oder allergen wirkenden Verbindungen beladen werden können. Diese Zellen werden dann in der adoptiven Immuntherapie bei Patienten mit Tumoren, Viruserkrankungen oder Allergien eingesetzt. Es besteht daher in der adoptiven Immuntherapie ein erheblicher Bedarf an dendritischen Zellen, wobei diese dendritischen Zellen vorzugsweise über standardisierte, reproduzierbare und kostengünstige Verfahren bereitgestellt werden sollen. Diese Verfahren müssen unter GMP-/GLP-Bedingungen durchgeführt werden können.The provision of dendritic cells (DC) at the therapy of various diseases an ever increasing growing importance. With the help of dendritic cells it is possible to provide highly active immunomodulators that work with various antigens, especially tumor antigens, Load virus peptides or allergenic compounds can be. These cells are then adopted in the Immunotherapy in patients with tumors, viral diseases or Allergies used. It is therefore adoptive Immunotherapy a significant need for dendritic cells, these dendritic cells preferably over standardized, reproducible and inexpensive processes should be provided. These procedures must be under GMP / GLP conditions can be carried out.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Erzeugung von dendritischen Zellen aus Stammzellen bekannt.Various methods are known from the prior art Generation of dendritic cells from stem cells is known.
Aus dem Knochenmark oder dem peripheren Blut von mit Granulozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF) behandelten Chemotherapie-Patienten können hämatopoetische Stammzellen isoliert werden, die den Oberflächenmarker CD34 aufweisen. Diese Stammzellen werden unter Zugabe verschiedener Zytokine kultiviert und die dendritischen Zellen werden nach einer verhältnismäßig langen Kultivierungszeit erhalten.From the bone marrow or peripheral blood from with Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) treated Chemotherapy patients can use hematopoietic stem cells be isolated, which have the surface marker CD34. These stem cells are made with the addition of various cytokines cultivated and the dendritic cells are after a get relatively long cultivation time.
Bei einem anderen Verfahren werden Monozyten aus peripherem Blut isoliert, die mit GM-CSF und IL-4 kultiviert werden. Zur vollständigen Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen müssen am Ende der Differenzierungsphase weitere Zytokine zugesetzt werden.Another method involves peripheral monocytes Blood isolated, which are cultured with GM-CSF and IL-4. For complete maturation of the cells to dendritic cells need more cytokines at the end of the differentiation phase be added.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weisen verschiedene Nachteile auf. Die verhältnismäßig lange Kultivierungsdauer ist für den Einsatz in der Klinik nicht geeignet. Darüber hinaus können die hohen Kosten der Zytokine und die Chargenabhängigkeit der eingesetzten Zytokine nachteilig sein.The methods known from the prior art have various disadvantages. The relatively long Cultivation time is not for use in the clinic suitable. In addition, the high cost of the cytokines and the batch dependency of the cytokines used to be disadvantageous.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren
zur Anreicherung von ausgereiften dendritischen Zellen, das
folgende Schritte umfaßt:
The present invention therefore relates to a method for enriching mature dendritic cells, which comprises the following steps:
- a) aus Blut werden mononukleäre Zellen gewonnen,a) mononuclear cells are obtained from blood,
- b) Zellen, die den Oberflächenmarker CD14 aufweisen, werden angereichert,b) Cells that have the surface marker CD14 enriched,
- c) die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen werden in einem Medium kultiviert, das die Zytokine GM-CSF und IL-4 beinhaltet, undc) the cells which have the surface marker CD14 cultivated in a medium containing the cytokines GM-CSF and IL-4 includes, and
- d) die in Schritt c) erhaltenen Zellen werden mit Hyaluron säurefragmenten, die gegebenenfalls geeignet modifiziert sein können, kultiviert, um die Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen zu veranlassen.d) the cells obtained in step c) are hyaluronic acid acid fragments, which are modified as appropriate can be cultured to mature the cells to induce dendritic cells.
Mononukleäre Zellen können aus Blut mit Hilfe eines Dichtegradienten gewonnen werden, wobei in bevorzugter Ausführungsform ein Leukozytenkonzentrat über einen Ficoll- Dichtegradienten aufgetrennt wird.Mononuclear cells can be extracted from blood using a Density gradients are obtained, with more preferred Embodiment a leukocyte concentrate via a Ficoll Density gradient is separated.
In dem zweiten Verfahrensschritt werden die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen angereichert, bevorzugt mit Hilfe von wenigstens einem gegen den Oberflächenmarker CD14 gerichteten Antikörper. Zum Einsatz kommen können hier die Magnet-aktivierte Zell-Sortierung (MACS) oder die Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FACS). Eine einfachere, jedoch nicht so effiziente Methode stellt die Anreicherung über Plastikadhäsion dar.In the second step, the Enriched cells with surface marker CD14, preferably with the help of at least one against the Surface marker CD14 directed antibody. For use Magnet-activated cell sorting (MACS) can come here or fluorescence-activated cell sorting (FACS). A the simpler, but not so efficient, method Enrichment via plastic adhesion.
Anschließend werden die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen in einem Medium kultiviert, das GM-CSF in einer Konzentration von 5000 bis 10000 U/ml und IL-4 in einer Konzentration von 100 bis 1000 U/ml aufweist. Gegebenenfalls können noch weitere geeignete Zytokine zugesetzt werden.Then the surface marker CD14 Cells cultivated in a medium that GM-CSF in a Concentration from 5000 to 10000 U / ml and IL-4 in one Has a concentration of 100 to 1000 U / ml. Possibly other suitable cytokines can be added.
Schließlich werden die in dem Kultivierungsschritt erhaltenen Zellen mit Hyaluronsäurefragmenten kultiviert, wobei diese Fragmente 1 bis 50 Grundbausteine der Hyaluronsäure aufweisen. Ein Grundbaustein stellt ein Aminodisaccharid aus D- Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin in β1-3-glycosidischer Bindung dar. Bevorzugt eingesetzt werden Hyaluronsäurefragmente mit jeweils 1 bis 10 Grundbausteinen.Finally, those obtained in the cultivation step Cells cultured with hyaluronic acid fragments, these Have fragments 1 to 50 basic building blocks of hyaluronic acid. A basic building block is an aminodisaccharide from D- Glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine in β1-3-glycosidic Binding. Hyaluronic acid fragments are preferably used with 1 to 10 basic modules each.
Die Kultivierung der den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen erfolgt in einem Medium, das GM-CSF und IL-4 enthält, bevorzugt für eine Dauer von wenigstens 72 h bis 7 Tagen. Hieran schließt sich die Kultivierung in Schritt d) für wenigstens 48 Stunden mit Hyaluronsäurefragmenten an. Die Hyaluronsäurefragmente liegen bevorzugt in einer Konzentration von 1 bis 50 µg/ml und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 10 bis 30 µg/ml vor. The cultivation of those having the surface marker CD14 Cells take place in a medium that contains GM-CSF and IL-4, preferably for a period of at least 72 h to 7 days. This is followed by the cultivation in step d) for at least 48 hours with hyaluronic acid fragments. The Hyaluronic acid fragments are preferably in a concentration from 1 to 50 µg / ml and particularly preferably in one Concentration of 10 to 30 µg / ml.
Die vorliegende Erfindung betrifft also die Verwendung von niedermolekularen Hyaluronsäurefragmenten für die Ausreifung von dendritischen Zellen.The present invention thus relates to the use of low molecular weight hyaluronic acid fragments for maturation of dendritic cells.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können dendritische Zellen hergestellt bzw. angereichert werden. Die dendritischen Zellen sind Antigen präsentierende Zellen, die auf die Initiation der primären Immunantwort spezialisiert sind. In den verschiedenen Stadien ihrer Entwicklung übernehmen sie unterschiedliche Funktionen. In dem unreifen Zustand sind die dendritischen Zellen sehr effektiv beim Prozessieren von nativen Protein- Antigenen für den MHC Klasse II-Weg. Reife dendritische Zellen sind dagegen weniger für die Aufnahme von neuen Proteinen für die Präsentation geeignet, stimulieren aber dafür viel besser die ruhenden CD4+ und CD8+ T-Zellen hinsichtlich des Wachstums und der Differenzierung.Dendritic cells can be produced or enriched by the method according to the invention. The dendritic cells are antigen presenting cells that specialize in the initiation of the primary immune response. They perform different functions in the various stages of their development. In the immature state, the dendritic cells are very effective in processing native protein antigens for the MHC class II route. Mature dendritic cells, on the other hand, are less suitable for the uptake of new proteins for presentation, but stimulate the resting CD4 + and CD8 + T cells much better in terms of growth and differentiation.
In vivo läuft die Reifung der dendritischen Zellen dann ab, wenn die unreifen dendritischen Zellen von den Stellen der Antigenaufnahme zu den T-Zell-Bereichen der lymphoiden Organe wandern. In vitro kann die Reifung in Kulturen von frisch isolierten dendritischen Zellen beobachtet werden. Die Reifung der dendritischen Zellen schlägt sich auch in Änderungen der Morphologie und des Phänotyps nieder. Die Charakterisierung und Differenzierung der dendritischen Zellen erfolgt üblicherweise über den Nachweis verschiedener Oberflächenmarker.The maturation of the dendritic cells then takes place in vivo, when the immature dendritic cells from the sites of the Antigen uptake to the T cell areas of the lymphoid organs hike. In vitro, the ripening in cultures of fresh isolated dendritic cells can be observed. The maturation The dendritic cells also translate into changes in the Morphology and phenotype. The characterization and Differentiation of the dendritic cells is usually done on the detection of various surface markers.
Aufgrund der natürlichen Funktionen sind die dendritischen Zellen besonders geeignet, als natürliches Adjuvans bei der Impfung und Immuntherapie, insbesondere bei der Tumortherapie, eingesetzt zu werden. Dabei ist es für den angestrebten therapeutischen Einsatz entscheidend, ausgereifte DZ's zu verwenden, die sich nach Reinfusion in den Patienten nicht wieder zu Makrophagen-ähnlichen Vorstadien zurückdifferenzieren können. Because of their natural functions, they are dendritic Cells particularly suitable as a natural adjuvant in the Vaccination and immunotherapy, especially in tumor therapy, to be used. It is aimed at therapeutic use crucial, mature double rooms too do not use that after reinfusion in the patient differentiate back to macrophage-like preliminary stages can.
Man geht nach derzeitigem Wissensstand davon aus, daß die dendritischen Zellen im unreifen Zustand das Antigen (beispielsweise ein Tumorantigen) aufnehmen und anschließend das Antigen prozessieren. Dabei reifen die dendritischen Zellen und wandern zu den T-Zell-reichen Bereichen der sekundären lymphoiden Organe. Reife dendritische Zellen exprimieren in hohem Maße MHC, co-stimulierende Moleküle und Adhäsionsmoleküle auf ihrer Oberfläche, wodurch eine Interaktion zwischen den dendritischen Zellen und den T-Zellen ermöglicht wird (T-cell clustering). Co-stimulatorische Signale werden über B7-CD28 und CD40-CD40-Liganden-Interaktionen übertragen und durch die Produktion von Zytokinen, wie IFN-α, IFN-γ und IL-12, die bekannterweise die zellulär vermittelte Immunität fördern, verstärkt.According to the current state of knowledge, it is assumed that the dendritic cells in the immature state the antigen (for example, a tumor antigen) and then process the antigen. The dendritic cells mature and migrate to the T cell-rich areas of the secondary lymphoid organs. Mature dendritic cells express in high levels of MHC, co-stimulating molecules and adhesion molecules on their surface, creating an interaction between the dendritic cells and the T cells (T-cell clustering). Co-stimulatory signals are transmitted via B7-CD28 and CD40-CD40 ligand interactions transmitted and through the Production of cytokines such as IFN-α, IFN-γ and IL-12 which known to promote cellular mediated immunity, reinforced.
Nach derzeitigem Wissensstand scheint es wesentlich zu sein, daß für die Induktion von primärer T-Zellantwort spezialisierte Antigen präsentierende Zellen vorhanden sind, da die Präsentation von Antigenen an T-Zellen in Abwesenheit eines zweiten Signals (Co-Stimulation) entweder das Absterben der T- Zellen oder eine Antigen-spezifische Toleranz bewirken kann.Based on current knowledge, it seems to be essential that specialized in the induction of primary T cell response Antigen presenting cells are present as the Presentation of antigens on T cells in the absence of a second signal (co-stimulation) either the death of the T- Cells or an antigen-specific tolerance can cause.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher insbesondere darin zu sehen, daß die dendritischen Zellen relativ einfach bereitgestellt werden können. Außerdem müssen nur verhältnismäßig geringe Konzentrationen an kostspieligen Zytokinen eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Bereitstellung einer Zellpopulation, die ganz überwiegend aus dendritischen Zellen besteht und, die sich in einem verhältnismäßig einheitlichen (synchronen) Reifungszustand befinden. Wenn die dendritischen Zellen für die Präsentation von Antigenen eingesetzt werden sollen, können die geeigneten Antigene zu einem geeigneten Zeitpunkt zu den dendritischen Zellen zugegeben werden und die Antigene können dann von den dendritischen Zellen im Laufe des Reifungsprozesses prozessiert werden. Die Antigene können entweder als Proteine, in Form von abgetöteten Zellen oder Zellpräparationen oder auch in Form von gentechnologisch modifizierten Zellen zugegeben werden. Wenn sich die dendritischen Zellen in dem gewünschten Zustand befinden, können sie für die Therapie verwendet werden.The advantages of the method according to the invention are therefore especially seen in the fact that the dendritic cells can be provided relatively easily. You also have to only relatively low concentrations of expensive Cytokines are used. The method according to the invention enables the deployment of a cell population that is quite consists predominantly of dendritic cells and which are located in a relatively uniform (synchronous) Ripening state. If the dendritic cells for the Presentation of antigens can be used appropriate antigens at the appropriate time dendritic cells are added and the antigens can then from the dendritic cells over the course of the Ripening process. The antigens can either as proteins, in the form of killed cells or Cell preparations or in the form of genetic engineering modified cells are added. If the dendritic cells are in the desired state, can be used for therapy.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Bereitstellung von autologen dendritischen Zellen geeignet. Der Begriff "autolog" bedeutet, daß die Ausgangszellen einem Spender (Patienten) entnommen werden. Diese Zellen werden dann in vitro erfindungsgemäß behandelt, um dendritische Zellen zu gewinnen. Die angereicherten dendritischen Zellen werden dann gegebenenfalls nach Kontakt mit dem Antigen demselben Spender, von dem sie ursprünglich herstammen, zurückgegeben.The method according to the invention is for the provision of autologous dendritic cells. The term "autolog" means that the output cells of a donor (patient) be removed. These cells are then grown in vitro treated according to the invention in order to obtain dendritic cells. The enriched dendritic cells are then if necessary after contact with the antigen from the same donor, from which they originally came from.
Alternativ hierzu kann das Verfahren auch für die Bereitstellung von "allogenen" dendritischen Zellen verwendet werden. Hierbei werden die Zellen von einem Spender oder auch aus Blutkonserven, die von Blutspendediensten erhalten werden können, hergestellt und dann an andere Empfänger zurückgegeben. Hierdurch können standardisierte dendritische Zellen bereitgestellt werden, die beispielsweise optimal mit einem Tumorantigen beladen sind. Insbesondere bei viralen Infektionen (HIV) kann so die zelluläre Immunität effektiv gesteigert werden.As an alternative to this, the method can also be used for Provision of "allogeneic" dendritic cells used become. Here, the cells from a donor or from preserved blood obtained from blood donation services can, manufactured and then returned to other recipients. This enables standardized dendritic cells are provided, for example, optimally with a Tumor antigen are loaded. Especially with viral infections (HIV) can effectively increase cellular immunity become.
Erfindungsgemäß werden zur Ausreifung der dendritischen Zellen Fragmente von Hyaluronsäure (HA), die gegebenenfalls geeignet modifiziert sein können, eingesetzt. Die Hyaluronsäure ist ein makromolekulares Polysaccharid, das als körpereigene Substanz vor allem in der Dermis zur Wasserspeicherung dient. Hyaluronsäure wird vor allem von Keratinozyten in den basalen Schichten der Oberhaut (Epidermis) sowie von Fibroblasten des Unterhaut-Bindegewebes produziert. Hyaluronsäure findet sich auch im Glaskörper von Augen, der Synovialflüssigkeit der Gelenke und ist ein Bestandteil des Bindegewebes. Bei niedrigen Konzentrationen bildet Hyaluronsäure eine hochviskose wäßrige Lösung. Die Hyaluronsäure ist eine hochmolekulare Verbindung mit einem Molekulargewicht zwischen 50000 Dalton und mehreren Millionen Dalton. Der Grundbaustein der Hyaluronsäure ist ein Aminodisaccharid, das aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D- Glucosamin in β1-3-glycosidischer Bindung besteht. Dieser Grundbaustein ist mit der nächsten Einheit β1-4-glycosidisch verbunden. Diese unverzweigte Kette der Hyaluronsäure besteht aus etwa 2000 bis 10000 derartiger Grundeinheiten. Durch Hyaluronidasen werden β-glucosidische Bindungen hydrolisiert und die Hyaluronsäure wird so zu kleineren Bruchstücken abgebaut. Erfindungsgemäß werden bevorzugt die Hyaluronidase aus Bullenhoden oder die aus Streptococcus hyaluronicus isolierte Hyaluronidase verwendet. Die erfindungsgemäß eingesetzten Hyaluronsäurefragmente werden bevorzugt zunächst mechanisch durch Scherkraft und/oder Ultraschall zerkleinert und anschließend erfolgt ein weiterer Abbau des Polysaccharids mit Hilfe einer geeigneten Hyaluronidase. Die gewünschten Fragmente mit bevorzugt 1 bis 50 Grundeinheiten werden anschließend durch geeignete Trennverfahren isoliert.According to the invention, the dendritic cells are matured Fragments of hyaluronic acid (HA), if appropriate can be modified, used. The hyaluronic acid is a Macromolecular polysaccharide that acts as the body's own substance primarily for water storage in the dermis. Hyaluronic acid is mainly from keratinocytes in the basal Layers of the epidermis and fibroblasts of the Subcutaneous connective tissue is produced. Hyaluronic acid is found also in the vitreous of eyes, the synovial fluid of the Joints and is part of the connective tissue. At low Concentrations, hyaluronic acid forms a highly viscous aqueous Solution. Hyaluronic acid is a high molecular compound with a molecular weight between 50,000 daltons and several Million daltons. The basic building block of hyaluronic acid is a Aminodisaccharide consisting of D-glucuronic acid and N-acetyl-D- Glucosamine exists in a β1-3 glycosidic bond. This The basic building block is β1-4-glycosidic with the next unit connected. This unbranched chain of hyaluronic acid exists from about 2000 to 10,000 such basic units. By Hyaluronidases are hydrolyzed β-glucosidic bonds and the hyaluronic acid becomes smaller fragments reduced. According to the invention, hyaluronidase is preferred from bull testicles or from Streptococcus hyaluronicus isolated hyaluronidase used. The invention Hyaluronic acid fragments used are preferred initially mechanically crushed by shear force and / or ultrasound and then the polysaccharide is further degraded with the help of a suitable hyaluronidase. The desired Fragments with preferably 1 to 50 basic units are then isolated by suitable separation processes.
Die Hyaluronsäurefragmente können vor oder nach der Isolierung geeignet chemisch modifiziert werden. Eine Modifizierung nach der Isolierung ist bevorzugt. Als Modifikationen können beispielsweise Veresterung, Salzbildung, Amidierung, Reduktion einer Säuregruppe zum Aldehyden oder Alkohol oder Abspaltung einer Säuregruppe genannt werden. Bevorzugt sind Salze und Ester der Hyaluronsäurefragmente, beispielsweise Alkali- und Erdalkalisalze und C1-C10-, bevorzugt C1-C4-Alkylester. Auch andere chemische Modifikationen sind möglich und von einem Fachmann aufgrund seines Fachwissens ohne weiteres durchführbar.The hyaluronic acid fragments can be chemically modified appropriately before or after isolation. Modification after isolation is preferred. Examples of modifications which can be mentioned are esterification, salt formation, amidation, reduction of an acid group to aldehydes or alcohol or elimination of an acid group. Salts and esters of hyaluronic acid fragments, for example alkali and alkaline earth metal salts and C 1 -C 10 -, preferably C 1 -C 4 -alkyl esters are preferred. Other chemical modifications are also possible and can easily be carried out by a person skilled in the art on the basis of his specialist knowledge.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgend beschriebenen Beispiele weiter erläutert. Bei der Durchführung der Beispiele wurde besonders auf Verunreinigungen der Reagenzien mit Lipopolysacchariden (LPS) geachtet. Lipopolysaccharide sind Bestandteile aus der Zellwand Gramm negativer Bakterien. Schon kleinste Verunreinigungen mit Lipopolysacchariden reichen aus, um Monozyten bzw. CD14+- Stammzellen des peripheren Blutes irreversibel zu aktivieren. Daher wurde bei den erfindungsgemäß durchgeführten Versuchen darauf geachtet, einen Schwellenwert von 0,01 ng/ml Lipopolysaccharid zu unterschreiten, der erfahrungsgemäß keinen Einfluß auf Monozyten, CD14+-Stammzellen oder dendritische Zellen hat.The present invention is further illustrated by the examples described below. When carrying out the examples, particular attention was paid to contamination of the reagents with lipopolysaccharides (LPS). Lipopolysaccharides are components from the cell wall of grams of negative bacteria. Even the smallest contaminations with lipopolysaccharides are sufficient to irreversibly activate monocytes or CD14 + stem cells from peripheral blood. Therefore, in the experiments carried out according to the invention, care was taken to fall below a threshold value of 0.01 ng / ml lipopolysaccharide, which experience has shown to have no effect on monocytes, CD14 + stem cells or dendritic cells.
Ein Leukozytenkonzentrat (Buffy coat) von einem gesunden, humanen Spender wurde über einem Dichtegradienten mit Ficoll- Hyperpaque plus (Pharmacia, Uppsala, Schweden) durch Zentrifugation aufgetrennt. Die mononukleären Zellen (PBMC) lagern sich dabei in der Interphase des Gradienten ab, rote Blutkörperchen (Erythrozyten) sowie neutrophile Granulozyten befinden sich unter dem Gradienten und wurden verworfen. Ficoll-Hyperpaque plus ist ein Gemisch von makromolaren Zuckern zellulärer Herkunft, ist aber vom Hersteller auf den LPS-Gehalt getestet (Endotoxin-Gehalt <0,001 ng/ml). Dieser Wert konnte in eigenen Tests bestätigt werden.A buffy coat from a healthy, human donor was over a density gradient with Ficoll Hyperpaque plus (Pharmacia, Uppsala, Sweden) by Centrifugation separated. The mononuclear cells (PBMC) are deposited in the interphase of the gradient, red Blood cells (erythrocytes) as well as neutrophil granulocytes are below the gradient and have been discarded. Ficoll-Hyperpaque plus is a mixture of macromolar sugars cellular origin, but is from the manufacturer on the LPS content tested (endotoxin content <0.001 ng / ml). This value could be in own tests are confirmed.
Zur weiteren Aufreinigung der Monozyten wurden die PBMC für 45 min. mit anti-CD 14-mAK inkubiert. Daraufhin wurde mit PBS gewaschen und das Zellpellet in 2 ml MACS-Puffer resuspendiert. MACS® (Miltenyi, Biotech, Bergisch Gladbach) = Magnetic activated Cell sorting; Eine Methode zur Aufreinigung von Zellen über an Metallkügelchen gebundene Antikörper; Markierte Zellen bleiben in der magnetischen Säulenmatrix hängen. [PBS w/o Ca2+/Mg2+ (Gibco) mit 5 mM Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) und Rinder-Serumalbumin (BSA); pH 7,2 durch Zugabe von HCl eingestellt]. Durch Zugabe von EDTA wird das Klumpen der Zellen verhindert, was wichtig für die Aufreinigung in der Säule ist. Nun wurden die Zellen mit 50 µl Ziege-anti-Maus-IgG Microbeads unter den gleichen Bedingungen inkubiert, anschließend mit MACS-Puffer gewaschen, zentrifugiert und in 5 ml MACS-Puffer resuspendiert.To further purify the monocytes, the PBMC were kept for 45 min. incubated with anti-CD 14 mAb. The mixture was then washed with PBS and the cell pellet was resuspended in 2 ml of MACS buffer. MACS® (Miltenyi, Biotech, Bergisch Gladbach) = Magnetic activated Cell sorting; A method for purifying cells using antibodies bound to metal beads; Marked cells get stuck in the magnetic column matrix. [PBS w / o Ca 2+ / Mg 2+ (Gibco) with 5 mM ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) and bovine serum albumin (BSA); pH 7.2 adjusted by adding HCl]. The addition of EDTA prevents the cells from clumping, which is important for the purification in the column. The cells were then incubated with 50 μl of goat anti-mouse IgG microbeads under the same conditions, then washed with MACS buffer, centrifuged and resuspended in 5 ml of MACS buffer.
Die Anreicherung erfolgte bei 4°C. Die VS+®Säule wurde in den MACS-Magneten (beides Miltenyi) eingesetzt und zunächst mit 5 ml MACS-Puffer gewaschen. Zur Gewinnung einer Einzelzellsuspension wurden die Zellen durch ein Zellsieb (30 µm Maschenweite; Miltenyi) passiert und auf die Säule aufgetragen. Die Negativfraktion aus unmarkierten Zellen, die magnetisch nicht in der Säulenmatrix festgehalten wurden, liefen durch und wurden verworfen. Die Säule wurde noch zweimal mit jeweils 5 ml MACS-Puffer gewaschen, um eine möglichst reine Positivfraktion zu erhalten. Anschließend wurde die Säule aus den Magneten genommen und die spezifisch über Microbeads in der Matrix festgehaltenen Zellen unter Druck mit 5 ml Puffer in ein steriles Röhrchen gespült. Die erhaltenen Zellen wurden in der Neubauerkammer ausgezählt. In der Regel konnten durch diese Methode aus einem Buffy-coat 3-5 × 107 CD14-positive Zellen (Monozyten) gewonnen werden, mit einer Reinheit <90%. Diese Zellen lassen sich vollständig durch Zytokinzugabe in DZ umwandeln.Enrichment took place at 4 ° C. The VS + ® column was inserted into the MACS magnet (both Miltenyi) and first washed with 5 ml MACS buffer. To obtain a single cell suspension, the cells were passed through a cell sieve (30 μm mesh size; Miltenyi) and applied to the column. The negative fraction from unlabeled cells that were not magnetically retained in the column matrix passed through and were discarded. The column was washed twice with 5 ml of MACS buffer in order to obtain the purest possible positive fraction. The column was then removed from the magnets and the cells, which were specifically retained in the matrix by means of microbeads, were rinsed under pressure with 5 ml of buffer into a sterile tube. The cells obtained were counted in the Neubau Chamber. In general, 3-5 × 10 7 CD14-positive cells (monocytes) could be obtained from a buffy-coat using this method, with a purity of <90%. These cells can be completely converted into DC by adding cytokine.
Die isolierten CD14-positiven Zellen wurden in 12 ml c-RPMI [(cRPMI: "RPMI 1640" (Gibco, Paisley, Schottland) mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalen Kälberserum, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin), alle Bestandteile enthalten weniger als 0,025 internationale Endotoxineinheiten/ml (Richtwert für Aqua ad injectabilia)] aufgenommen. Um sie zu dendritischen Zellen (DCs) ausreifen zu lassen, wurde ihnen humanes GM-CSF für die klinische Anwendung (Leukomax 400®, Sandoz AG, Nürnberg) in einer Konzentration von 8000 Einheiten/ml Medium und IL-4 (Genzyme, Rüsselsheim, Charge auf LPS-Gehalt getestet: <0,001 ng/ml) in einer Konzentration von 500 Einheiten/ml Medium zugegeben. Dann wurde die Zellsuspension in einer Six-Well-Platte zu jeweils 2 ml auspipettiert und im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Am vierten Tag wurden nochmals 2 ml/well c-RPMI mit GM-CSF und IL-4 dazugegeben.The isolated CD14 positive cells were in 12 ml c-RPMI [(cRPMI: "RPMI 1640" (Gibco, Paisley, Scotland) with 10% heat-inactivated fetal calf serum, 1% L-glutamine and 1% penicillin-streptomycin), all components contain less than 0.025 international endotoxin units / ml (recommended value for aqua ad injectabilia)]. In order to mature them into dendritic cells (DCs), they were given human GM-CSF for clinical use (Leukomax 400®, Sandoz AG, Nuremberg) in a concentration of 8000 units / ml medium and IL-4 (Genzyme, Rüsselsheim, Batch tested for LPS content: <0.001 ng / ml) added in a concentration of 500 units / ml medium. Then the cell suspension was pipetted out in a six-well plate to 2 ml each and cultivated in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 . On the fourth day, 2 ml / well c-RPMI with GM-CSF and IL-4 were added.
Aufgereinigte Hyaluronsäure (HA) aus Hahnenkämmen (Healon®; Pharmacia, für den klinischen Einsatz bestimmt, Endotoxin- Gehalt <0,001 ng/mg) wurde zunächst mit einem Ultraschallgerät (Branson Sonifier) für 2 min. in größere Bruchstücke gespalten. Um diese Bruchstücke weiter zu zerkleinern, wurde ihnen Hyaluronidase (Typ I aus Rinderhoden; Sigma) zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde mit Natriumacetat auf pH 5 eingestellt, bei 37°C für 12 Std. inkubiert und anschließend durch Erhitzen auf 90°C inaktiviert. Die erhaltenen Fragmente wurden nun nach ihrer Größe aufgetrennt. Dazu wurden sie in einer 1,5 m langen Glassäule auf ein Polyacrylamidgel (Bio-Gel P-10, Bio-Rad, München) geschichtet. Als Spülflüssigkeit diente Aqua bidestillata, unter der Säule nahm ein Fraktionssammler (Pharmacia) alle 20 min. die Fraktionen auf. Die Röhrchen wurden verschlossen, kühl und lichtgeschützt gelagert. Purified hyaluronic acid (HA) from cockscombs (Healon®; Pharmacia, intended for clinical use, endotoxin Content <0.001 ng / mg) was first with an ultrasound device (Branson Sonifier) for 2 min. split into larger fragments. In order to further crush these fragments, they were Hyaluronidase (type I from bovine testicles; Sigma) added. The Reaction solution was adjusted to pH 5 with sodium acetate, Incubated at 37 ° C for 12 hours and then by heating inactivated to 90 ° C. The fragments obtained were now used separated by their size. For this they were in a 1.5 m long Glass column on a polyacrylamide gel (Bio-Gel P-10, Bio-Rad, Munich) layered. Aqua served as the rinsing liquid bidestillata, under the column took a fraction collector (Pharmacia) every 20 min. the factions on. The tubes were closed, stored cool and protected from light.
Sonifizierte HA wurde in einem 5%igen Agarosegel mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Polysaccharidbanden wurden im Gel durch Färbung mit Stains-all (3,3'-Diethyl-9-methyl- 4,5,4',5'-dibenzothiacarbo-cyanin; Sigma) sichtbar gemacht. Die so erhaltenen Fragmente haben eine Größe von 10.000 bis 50.000 kDa.Sonified HA was measured in a 5% agarose gel Gel electrophoresis separated. The polysaccharide bands were in the gel by staining with stains-all (3,3'-diethyl-9-methyl- 4,5,4 ', 5'-dibenzothiacarbocyanine; Sigma) made visible. The fragments thus obtained have a size of 10,000 to 50,000 kDa.
Zunächst mußten die einzelnen Proben mit dem Fluorophor ANTS markiert werden [ANTS-Lösung: 0,15 M 8-Aminonaphtalen-1,3,6- Trisulfonsäure Dinatriumsalz in Essigsäure/Wasser (3/17, v/v), durch langsames Erhitzen auf 60°C gelöst]. ANTS markiert jedes Zuckermolekül am Kettenende. Die kleinen Fragmente wurden ebenfalls mittels Gelelektrophorese unter Verwendung eines 30% Acrylamidgels aufgetrennt. Das Gel konnte nun unter UV-Licht (ANTS-Farbstoff) sichtbar gemacht und photographisch dokumentiert werden.First, the individual samples with the fluorophore ANTS be marked [ANTS solution: 0.15 M 8-amino-naphthalene-1,3,6- Trisulfonic acid disodium salt in acetic acid / water (3/17, v / v), dissolved by slowly heating to 60 ° C]. ANTS marks each Sugar molecule at the chain end. The little fragments were made also by gel electrophoresis using a 30% Acrylamide gel separated. The gel could now be exposed to UV light (ANTS dye) made visible and photographic be documented.
Es wurden von jeder Probe 0,1 ml abgenommen und im Eisbad mit 0,6 ml Färbelösung (5,2 g di-Natrium-Tetraborat in 1 l konzentrierter Schwefelsäure) gemischt. Nun wurden jeweils 0,02 ml 0,1% Carbazol in Ethanol zugegeben, gemischt und abermals 10 min. lang gekocht. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur konnte die HA-Konzentration photometrisch bei 520 nm bestimmt werden. Als Leerwert diente Aqua dest., als Standard 0,2 µM HA/ml in Aqua dest. 0.1 ml of each sample was removed and placed in an ice bath 0.6 ml staining solution (5.2 g di-sodium tetraborate in 1 l concentrated sulfuric acid) mixed. Now were each 0.02 ml 0.1% carbazole in ethanol added, mixed and again 10 min. cooked long. After cooling down The HA concentration could be measured photometrically at room temperature 520 nm can be determined. Aqua dest. Served as the blank Standard 0.2 µM HA / ml in aqua dest.
Zur Stimulation wurden den Zellen am vierten Tag der Kultivierung unterschiedliche HA-Fragmente in einer Konzentration von 0,025 mg/ml (25 µg/ml) Medium zugesetzt. Als Positivkontrolle dienten Lipopolysaccharide (LPS) von Escherichia coli Serotyp 0177 (Sigma).The cells were stimulated on the fourth day of stimulation Cultivation of different HA fragments in one Concentration of 0.025 mg / ml (25 µg / ml) medium was added. As Lipopolysaccharides (LPS) from served as positive controls Escherichia coli serotype 0177 (Sigma).
- 1. Auftrennung der erhaltenen Fragmente mittels Gelelektrophorese und ANTES-Färbung. Die erfindungsgemäß verwendeten Fragmente weisen eine Größe von 2 bis hin zu 12- fach-Zuckern auf. Die Konzentrationsmessung ergab Werte von etwa 1 mg/ml gespaltene HA. Eine weitere Aufspaltung dieser Fraktion in einzelne Zucker ist prinzipiell mittels einer HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) möglich. Die Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß besonders die kleinen Fragmente für die Stimulation verantwortlich sind.1. Separation of the fragments obtained using Gel electrophoresis and ANTES staining. The invention fragments used range in size from 2 to 12 fold up sugar. The concentration measurement gave values of about 1 mg / ml split HA. Another split this up Fraction into individual sugars is principally by means of an HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) possible. The results allow the conclusion that especially the small fragments for are responsible for the stimulation.
- 2. Einfluß der DC-Stimulierung mittels HA-Fragmenten auf die Expression von Oberflächenmarkern.2. Influence of DC stimulation by means of HA fragments on the Expression of surface markers.
Über die FACS Abbildungen kann die Oberflächendichte verschiedener Rezeptoren mittels Antikörper festgestellt werden. Integriert man die Fläche unter den Kurven, erhält man die sogenannte MFI (Mean fluorescence intensity). Diese Werte sind in der Tabelle 1 für verschiedene Rezeptoren aufgelistet. The surface density can be determined using the FACS images different receptors detected using antibodies become. If you integrate the area under the curves, you get the so-called MFI (Mean fluorescence intensity). These values are listed in Table 1 for various receptors.
Zur Bedeutung der einzelnen, in Tabelle 1 aufgeführten
Oberflächenmarker:
ICAM-1 ist ein fast ubiquitär vorkommendes InterCelluläres
AdhäsionsMolekül. Die Ergebnisse zeigen eine leichte
Aufregulation, wie sie bei verschiedensten Arten der
Zellaktivierung beobachtet wird. CD1a ist ein Marker für
dendritische und Langerhanszellen der Haut; während Monozyten
ausschließlich CD14 exprimieren, kommt es im Laufe der
Ausreifung immer mehr zum Verlust von CD14 und Expression von
CD1a. LPS, HA-Fragmente und MCM-Medium drängen diesen Prozeß
wieder leicht zurück, funktionelle Konsequenzen dieser
Regulation sind aber nicht bekannt.
The meaning of the individual surface markers listed in Table 1:
ICAM-1 is an almost ubiquitous InterCellular Adhesion molecule. The results show a slight upregulation, as is observed with various types of cell activation. CD1a is a marker for dendritic and Langerhans cells of the skin; While monocytes only express CD14, there is an increasing loss of CD14 and expression of CD1a in the course of maturation. LPS, HA fragments and MCM medium slightly push this process back, but no functional consequences of this regulation are known.
Tabelle 2 zeigt die Stimulierung anderer Oberflächenmarker (CD44s, CD83 und CD115). Weiteres Anzeichen der DZ-Ausreifung sind eine Herunterregulation von CD115 (dem G-CSF Rezeptor) sowie eine Aufregulation von CD83, eine funktionelle Relevanz dieser Veränderungen ist noch nicht bekannt. In der Tabelle 2 ist deutlich zu sehen, daß die Kriterien der DZ-Ausreifung durch Stimulation mit kleinen HA-Fragmenten voll erfüllt werden.Table 2 shows the stimulation of other surface markers (CD44s, CD83 and CD115). Another sign of double maturation are a down regulation of CD115 (the G-CSF receptor) as well as an upregulation of CD83, a functional relevance these changes are not yet known. In Table 2 it can be clearly seen that the criteria for the maturation of the double room fully satisfied by stimulation with small HA fragments become.
CD44 ist ein Adhäsionsmolekül, eine beschriebene Funktion ist die Bindung von HA. CD44 is an adhesion molecule that is a described function the binding of HA.
Tabelle 3 zeigt die Expression von weiteren Oberflächenmarkern.Table 3 shows the expression of further surface markers.
Neben den Reifungsmarkern sind hier Faktoren dargestellt, die für die Funktion der Antigen-Präsentation, d. h. der Stimulation von T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle spielen. Hierzu zählen das MHC Klasse II Molekül HLA-DR sowie die beiden kostimulatorischen Faktoren B7-1 und B7-2. Ohne die Aufregulation dieser Faktoren ist auch ein Einsatz der DZ in den oben beschriebenen Anwendungen nicht sinnvoll. Erfindungsgemäß wurde eine deutliche Aufregulation aller Faktoren nach Behandlung mit HA-Fragmenten gefunden, vergleichbar mit der maximalen Stimulation nach LPS-Gabe.In addition to the maturation markers, factors are shown here that for the function of the antigen presentation, d. H. of stimulation of T lymphocytes play a crucial role. For this include the MHC class II molecule HLA-DR and the two costimulatory factors B7-1 and B7-2. Without that Upgrading these factors is also an application of the DZ in the applications described above does not make sense. According to the invention, a clear upregulation of all Factors found after treatment with HA fragments, comparable to the maximum stimulation after LPS administration.
Um die vermehrte Expression von Oberflächenmolekülen funktionell darzustellen, wurden die DZ vorstimuliert und für 5 Tage mit aufgereinigten naiven allogenen T-Zellen inkubiert, die ebenfalls aus Leukozytenkonzentrat (buffy coats) gewonnen wurden (sog. mixed leukocyte reaction, MLR). Je nach stimulatorischer Kapazität der DZ's kommt es dabei zu mehr oder weniger ausgeprägter T-Zellproliferation, die mittels Einbau von radioaktiven 3H-Thymidin bestimmt wurde. Es wurden die radioaktiven Counts per minute (Cpm) der einzelnen Proben dargestellt, die direkt mit der stattgefundenen T- Zellproliferation korrelieren. Man sieht, daß DZ's, die mit kleinen HA-Fragmenten behandelt wurden, deutlich potentere APC's sind, vergleichbar mit dem für LPS-Stimulation erhaltenen Wert (dargestellt in Tabelle 4B).In order to functionally represent the increased expression of surface molecules, the DCs were pre-stimulated and incubated for 5 days with purified naive allogeneic T cells, which were also obtained from leukocyte concentrate (buffy coats) (so-called mixed leukocyte reaction, MLR). Depending on the stimulatory capacity of the DCs, there is more or less pronounced T cell proliferation, which was determined by incorporating radioactive 3 H-thymidine. The radioactive counts per minute (Cpm) of the individual samples were shown, which correlate directly with the T cell proliferation that took place. It can be seen that DCs treated with small HA fragments are significantly more potent APCs, comparable to the value obtained for LPS stimulation (shown in Table 4B).
Auch dieses Beispiel belegt, daß erfindungsgemäß mit kleinen HA-Fragmenten zwischen 2-12 UDP-Zuckermolekülen eine deutliche Ausreifung von DC erhalten wird, die durchaus vergleichbar ist mit publizierten Daten anderer Methoden. Eine strenge Abhängigkeit von einem einzelnen Zucker erscheint unwahrscheinlich, jedoch haben größere Moleküle (20-30 UDP- Zucker) offensichtlich keinen Einfluß, da die erfindungsgemäß eingesetzten Fraktionen keine Unterschiede in der Wirkung zeigen, auch wenn sie größere Fragmente enthalten. Geschallte HA hat ebenfalls keinen Effekt.This example also shows that according to the invention with small HA fragments between 2-12 UDP sugar molecules a distinct one Maturation of DC is obtained, which is quite comparable with published data from other methods. A strict one Dependence on a single sugar appears unlikely, but larger molecules (20-30 UDP- Sugar) obviously no influence, since the invention used fractions no differences in effect show, even if they contain larger fragments. Sounded HA also has no effect.
Interessanterweise ist der erfindungsgemäße Effekt offensichtlich spezifisch für DZ's, da mit Interferon-gamma (IFNγ) behandelte Monozyten, die zu Makrophagen ausreifen, keine Steigerung ihrer stimulatorischen Kapazität nach Behandlung mit HA-Fragmenten zeigen (siehe Tabelle 4A). Interestingly, the effect according to the invention obviously specific for double rooms, because with interferon-gamma (IFNγ) treated monocytes that mature into macrophages no increase in their stimulatory capacity after Show treatment with HA fragments (see Table 4A).
Claims (10)
- a) aus Blut werden mononucleäre Zellen gewonnen,
- b) Zellen, die den Oberflächenmarker CD14 aufweisen, werden angereichert,
- c) die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen werden in einem Medium kultiviert, das die Zytokine GM-CSF und IL-4 beinhaltet, und
- d) die in Schritt c) erhaltenen Zellen werden mit Hyaluron säurefragmenten, die gegebenenfalls geeignet modifiziert sein können, kultiviert, um die irreversible Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen zu veranlassen.
- a) mononuclear cells are obtained from blood,
- b) cells which have the surface marker CD14 are enriched,
- c) the cells having the surface marker CD14 are cultivated in a medium which contains the cytokines GM-CSF and IL-4, and
- d) the cells obtained in step c) are cultivated with hyaluronic acid fragments, which may optionally be modified in a suitable manner, in order to induce the irreversible maturation of the cells to dendritic cells.
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| DE19839113A DE19839113A1 (en) | 1998-08-27 | 1998-08-27 | Use of hyaluronic acid fragments in vaccine production, especially for cancer treatment |
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Cited By (1)
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-
1998
- 1998-08-27 DE DE19839113A patent/DE19839113A1/en not_active Withdrawn
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