DE19813234A1 - Production of sulfated hyaluronic acid with high degree of sulfation useful as anticoagulant, antiinflammatory agent, hydrogel component, etc. - Google Patents
Production of sulfated hyaluronic acid with high degree of sulfation useful as anticoagulant, antiinflammatory agent, hydrogel component, etc.Info
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung sulfatierter Polysaccharide, insbesonde re hochsulfatierter Hyaluronsäuren.The invention relates to a method for producing sulfated polysaccharides, in particular re highly sulfated hyaluronic acids.
Der Versuch der Darstellung sulfatierter Polysaccharide, einschließlich die der Hyaluron säuresulfatester, beruht auf deren schon zeitig erkannter Ähnlichkeit mit dem natürlich vorkommenden Heparin, sowohl auf struktureller Ebene als auch in Bezug auf pharmazeu tisch nutzbare Wirkungen. Der hohe Preis der Heparine war vor altem der Anlaß, die Herstellung synthetischer oder halbsynthetischer Präparate mit Heparinwirkung zu versu chen. Als Biopolymer-Derivate mit zum Teil den synthetischen Polymeren überlegenen Spezialeigenschaften finden sie in zahlreichen Einsatzgebieten der Medizin, Medizintechnik und Pharmazie wichtige Anwendungsmöglichkeiten.Attempting to depict sulfated polysaccharides, including that of hyaluron acid sulfate ester, is based on its already recognized similarity to that of course occurring heparin, both at the structural level and in relation to pharmazeu table usable effects. The high price of heparins was the reason that old Production of synthetic or semi-synthetic preparations with heparin effect chen. As biopolymer derivatives with some of them superior to synthetic polymers You will find special properties in numerous areas of application in medicine and medical technology and pharmacy important applications.
So sind die antikoagulanten und anti-inflammatorischen Wirkungen sulfatierter Hyaluron säuren seit langem bekannt und Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (US 4 240 163, WO 88/07060, US 5 262 403). Ebenso spielt die Verwendung substituierter, also auch sulfatierter, Polysaccharide zur Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen wie Arthrose (WO 92/13541) eine zunehmende Rolle. Bekannt ist auch die anti-enzymatische Aktivität sulfatierter Hyaluronsäuren. In einer Publikation von E. A. Balazs et. al. (Acta Phys. Scandinav. 23, 1951, 169-175) wird auf die inhibierende Wirkung von sulfatierten Hyaluronsäuren eingegangen.The anticoagulant and anti-inflammatory effects are sulfated hyaluron acids have long been known and have been the subject of numerous investigations (US 4,240,163, WO 88/07060, US 5 262 403). The use of substituted also plays a role sulfated, polysaccharides for the treatment of degenerative joint diseases such as Osteoarthritis (WO 92/13541) plays an increasing role. The anti-enzymatic is also known Activity of sulfated hyaluronic acids. In a publication by E. A. Balazs et. al. (Acta Phys. Scandinavian. 23, 1951, 169-175) is based on the inhibitory effect of sulfated Hyaluronic acids received.
Neuere Anwendungen zielen auf Hydrokolloide bzw. Hydrogele auf der Basis von Hyalu ronsäure und sulfatierten Hyaluronsäuren hin, die meistens mit weiteren polymeren Werk stoffen und Hydrokolloidgelsystemen zu medizinischen Produkten kombiniert bzw. in pharmazeutischen Präparaten eingesetzt werden.More recent applications are aimed at hydrocolloids or hydrogels based on Hyalu ronic acid and sulfated hyaluronic acids, mostly with other polymeric plants substances and hydrocolloid gel systems combined to medical products or in pharmaceutical preparations are used.
Bei den angestrebten Produkten handelt es sich in erster Linie um hydroaktive Wund verbände auf der Basis von Hyaluronsäure/Cellulose-Kombinationen mit Wirkstoffen sowie um Hygieneprodukte mit verbesserten Eigenschaften wie Kondome, Windeln, Binden und Tampons. Bei diesen Produktentwicklungen werden die guten kosmetischen Eigenschaften und die wundheilende und entzündungshemmende Wirkung der Hyaluronsäure und ihrer Derivate genutzt. The targeted products are primarily hydroactive wounds associations based on hyaluronic acid / cellulose combinations with active ingredients as well to hygiene products with improved properties such as condoms, diapers, bandages and Tampons. With these product developments, the good cosmetic properties and the wound healing and anti-inflammatory effects of hyaluronic acid and its Derivatives used.
Die aufgeführten Anwendungsbeispiele von sulfatierten Hyaluronsäuren zogen eine Vielzahl von Publikationen mit möglichen Herstellungsverfahren für diese sulfatierten Polysaccharide nach sich.The listed application examples of sulfated hyaluronic acids attracted a large number of publications with possible manufacturing processes for these sulfated polysaccharides after itself.
Es ist bekannt, daß der Sulfatierungsgrad für die biologische Wirksamkeit eine entscheiden de Rolle spielt; mit steigender Anzahl der Sulfatgruppen im Molekül ist oftmals eine erhebliche Wirkungssteigerung auszumachen.It is known that the degree of sulfation is decisive for the biological effectiveness de role plays; with increasing number of sulfate groups in the molecule there is often one identify significant increases in effectiveness.
Sulfatierungen der Hydroxylgruppen von Hyaluronsäure (maximal 4 OH-Gruppen pro Disaccharideinheit im Hyaluronsäure-Molekül) mit ClSO3H in Pyridin werden von T. Wada et. al. (Chemistry Letters 1994, 2027-2030) und in US 2 599 172 bzw. EP 11 322 be schrieben. "Supersulfatiertes" Heparin wird mit Hilfe eines Gemisches aus konz. H2SO4 und ClSO3H hergestellt, der Sulfatierungsgrad wird mit 2,5 angegeben (EP 0 116 801). In FR 2 584 728 wird die Sulfatierung von Glucosaminoglycanen offenbart, unter anderem auch die von Hyaluronsäure, mit SO3/Pyridin- oder SO3/Trimethylamin-Komplexen in Dimethyl formamid (DMF) als Lösungsmittel. Hier wird als reaktive Form das Triethylammoniumsalz des Glucosaminoglycans eingesetzt. Ein Prozeß der Sulfatierung von Glucosaminoglycanen und ihren biologischen Applikationen ist Gegenstand von US 5 013 724. Ausgehend von einem Ammoniumsalz eines Glucosaminoglycans wird in einem dipolar aprotischen Lö sungsmittel mit einem SO3/Trimethylamin- bzw. SO3/Pyridin-Komplex sulfatiert. Der Sulfatierungsgrad wird mit mehr als 2,5 angegeben. WO 95/25751 und Publikationen in Gazetta Chimica Italiana (125 (1995) 169-181) sowie in Carbohydrate Research (158 (1986) 183-190) beschreiben neue, dem Heparin ähnliche, sulfatierte Polysaccharide mit einem Sulfatierungsgrad von 0,5 bis 3,5. Sulfatierungsreagens ist hier auch der schon mehrmals erwähnte SO3/Pyridin-Komplex.Sulfation of the hydroxyl groups of hyaluronic acid (maximum 4 OH groups per disaccharide unit in the hyaluronic acid molecule) with ClSO 3 H in pyridine are described by T. Wada et. al. (Chemistry Letters 1994, 2027-2030) and in US 2,599,172 and EP 11,322, respectively. "Supersulfated" heparin is made using a mixture of conc. H 2 SO 4 and ClSO 3 H are produced, the degree of sulfation is given as 2.5 (EP 0 116 801). FR 2 584 728 discloses the sulfation of glucosaminoglycans, including that of hyaluronic acid, with SO 3 / pyridine or SO 3 / trimethylamine complexes in dimethyl formamide (DMF) as a solvent. The triethylammonium salt of glucosaminoglycan is used here as the reactive form. A process for the sulfation of glucosaminoglycans and their biological applications is the subject of US 5,013,724. Starting from an ammonium salt of a glucosaminoglycan, sulfation is carried out in a dipolar aprotic solvent with an SO 3 / trimethylamine or SO 3 / pyridine complex. The degree of sulfation is given as more than 2.5. WO 95/25751 and publications in Gazetta Chimica Italiana (125 (1995) 169-181) and in Carbohydrate Research (158 (1986) 183-190) describe new, heparin-like, sulfated polysaccharides with a degree of sulfation of 0.5 to 3 , 5th Sulfating reagent is also the SO 3 / pyridine complex, which has already been mentioned several times.
Eine sowohl strukturelle als auch in ihrer Wirkung vergleichbare Ähnlichkeit mit dem Heparinmolekül wird durch sulfatierte Aminopolysaccharide erreicht. US 2 832 766 und US 3 027 363 gehen von deacetylierten Aminopolysacchariden aus und sulfatieren mit ClSO3H in Pyridin bzw. mit SO3/Pyridin-Komplex in wässrig alkalischem Medium. Während bei erstgenannter Methode sowohl NH2- als auch OH-Gruppen reagieren, konnte in US 3 027 363 eine selektive Sulfatierung der NH2-Gruppe erreicht werden. In EP 0 340 628 und US 5 008 253 werden Sulfoamino-Derivate von Chondroitinsulfaten, Dermatansulfat und Hyaluronsäure durch Deacetylierung der entsprechenden Verbindungen in Gegenwart von wasserfreiem Hydrazin bzw. Hydrazinsulfat und anschließender Sulfatierung derselben mit SO3/Triethylamin-Komplex oder ClSO3H/H2SO4 hergestellt. Der Sulfatierungsgrad wird mit einem DS von 1,5 bis 2,3 angegeben.A structural and similar effect with the heparin molecule is achieved by sulfated aminopolysaccharides. US 2,832,766 and US 3,027,363 start from deacetylated aminopolysaccharides and sulfate with ClSO 3 H in pyridine or with SO 3 / pyridine complex in an aqueous alkaline medium. While both NH 2 and OH groups react in the first-mentioned method, selective sulfation of the NH 2 group was achieved in US Pat. No. 3,027,363. EP 0 340 628 and US Pat. No. 5,008,253 describe sulfoamino derivatives of chondroitin sulfates, dermatan sulfate and hyaluronic acid by deacetylation of the corresponding compounds in the presence of anhydrous hydrazine or hydrazine sulfate and subsequent sulfation thereof with SO 3 / triethylamine complex or ClSO 3 H / H 2 SO 4 manufactured. The degree of sulfation is given with a DS of 1.5 to 2.3.
Eine weitere Methode zur Darstellung hochsulfatierter Glucosaminoglycane wird in WO 88/0211 beschrieben. Es wird hier die Möglichkeit genutzt, mittels NaBH4 die endständigen Gruppen der Polysaccharidkette zu Hydroxylgruppen zu reduzieren und anschließend das gesamte Molekül mit ClSO3H in Pyridin zu sulfatieren. Dabei wird von kürzerkettigen Polysacchariden mit relativ niedrigen Molmassen ausgegangen.Another method for the preparation of highly sulfated glucosaminoglycans is described in WO 88/0211. The possibility is used here to reduce the terminal groups of the polysaccharide chain to hydroxyl groups using NaBH 4 and then to sulfate the entire molecule with ClSO 3 H in pyridine. It is assumed that shorter-chain polysaccharides with relatively low molecular weights.
All die hier aufgeführten Beispiele zeigen die vielfältigen Möglichkeiten der Sulfatierung von verschiedenartigsten Oligo- und Polysacchariden.All the examples listed here show the diverse possibilities of sulfation of various oligosaccharides and polysaccharides.
Die Sulfatierungsgrade (degree of sulfatation = DS) pro Disaccharideinheit eines Hyaluron säuremoleküls, die mit den in der Literatur aufgeführten Verfahren erreicht wurden, über steigen nicht den DS von 3,5. Eine mögliche Ursache dafür und somit auch ein nicht zu übersehender Nachteil dieser Verfahren besteht in der oft auftretenden Inhomogenität der Reaktionslösungen. Das bezieht sich nicht auf die Löslichkeit des Ausgangspolymers in einem organisch aprotischen Lösungsmittel, denn mit der Darstellung der Ammonium verbindungen des Polymermoleküls konnte eine sehr gute Löslichkeit in entsprechenden Lösungsmitteln erreicht werden. Jedoch ist es häufig der Fall, daß z. B. bei Sulfatierungen mit dem SO3/Pyridin-Komplex das Reaktionsprodukt, nämlich das sulfatierte Polysaccharid, noch während der Reaktion ausfällt und somit die Reaktion regelrecht abgestoppt oder zumindestens, infolge der Inhomogenität, in ihrer Reaktionsgeschwindigkeit stark verlang samt wird. Niedrigere, nicht einstellbare Sulfatierungsgrade sind die Folge.The degrees of sulfation (DS) per disaccharide unit of a hyaluronic acid molecule, which were achieved with the methods listed in the literature, do not exceed the DS of 3.5. A possible cause for this and thus a not to be overlooked disadvantage of these processes is the often inhomogeneity of the reaction solutions. This does not refer to the solubility of the starting polymer in an organic aprotic solvent, because with the representation of the ammonium compounds of the polymer molecule a very good solubility in corresponding solvents could be achieved. However, it is often the case that e.g. B. in sulfations with the SO 3 / pyridine complex, the reaction product, namely the sulfated polysaccharide, still fails during the reaction and thus the reaction is literally stopped or at least, due to the inhomogeneity, the reaction rate is slowed down considerably. The result is lower, non-adjustable degrees of sulfation.
Darüberhinaus bringt die Verwendung des Pyridins, wie bei Sulfatierungsreaktionen mit ClSO3H beschrieben, grundsätzliche Probleme und Nachteile mit sich. Das betrifft be sonders die Verwendung erheblicher Mengen des ökologisch bedenklichen Pyridins als Lösungsmittel und die Schwierigkeiten, die bei dessen vollständiger Abtrennung vom polymeren Endprodukt auftreten.In addition, the use of pyridine, as described in sulfation reactions with ClSO 3 H, has fundamental problems and disadvantages. This relates in particular to the use of considerable amounts of the ecologically questionable pyridine as solvent and the difficulties which arise when it is completely separated from the polymeric end product.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von hochsulfatier ten Hyaluronsäuren mit einem DS < 3,5 pro Disaccharideinheit des Hyaluronsäuremoleküls. Durch eine geeignete Prozeßführung und Vorbehandlung der Hyaluronsäure soll eine vollständige Löslichkeit in einem technisch gebräuchlichen, organischen Lösungsmittel erreicht werden. Durch ein geeignetes Sulfatierungsreagens soll eine in vollkommen homo genem Medium durchzuführende Sulfatierung ermöglicht werden, wobei je nach Konzen tration des Sulfatierungsreagens und der Reaktionszeit der Sulfatierungsgrad wahlweise eingestellt werden kann. Die Reaktionslösungen sollen auch nach Reaktionsende noch vollkommen homogen sein, um einen vorzeitigen Reaktionsabbruch zu verhindern.The aim of the invention is to provide a process for the production of highly sulfated ten hyaluronic acids with a DS <3.5 per disaccharide unit of the hyaluronic acid molecule. A suitable process control and pretreatment of hyaluronic acid is said to be a complete solubility in a commercially available organic solvent can be achieved. By means of a suitable sulfating reagent, one should be completely homo to be carried out in the medium to be carried out, depending on the concentration tration of the sulfation reagent and the reaction time the degree of sulfation optional can be adjusted. The reaction solutions should continue after the end of the reaction be completely homogeneous to prevent premature termination of the reaction.
Die so hergestellten sulfatierten Hyaluronsäureproben sollen medizinisch verwertbare Eigenschaften besitzen, so z. B. hinsichtlich ihrer heparinähnlichen Wirkungen oder ihres Einsatzes als Hydrokolloide bzw. -gele in Kombination mit weiteren polymeren Wirkstoffen wie beispielsweise Cellulose und Cellulosederivate.The sulfated hyaluronic acid samples produced in this way are said to be medically usable Have properties such. B. in terms of their heparin-like effects or Use as hydrocolloids or gels in combination with other polymeric active ingredients such as cellulose and cellulose derivatives.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von hoch sulfatierten Hyaluronsäuren zu entwickeln, das es gestattet, vollständig homogene Sulfatie rungsreaktionen durchzuführen und lösliche sulfatierte Hyaluronsäuren in gezielt einstell baren DS-Bereichen zu synthetisieren.The invention is therefore based on the object of a method for producing high to develop sulfated hyaluronic acids, which allows completely homogeneous sulfation and carry out soluble sulfated hyaluronic acids in a targeted manner Synthesible DS areas.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man die Na-Form der Hyaluron säure in eine in geeigneten, technisch gebräuchlichen, organischen Lösungsmitteln lösliche Form überführt. Dies erfolgt durch Versetzen der wässrigen Hyaluronsäurelösung (Na- Form) mit einem Ionenaustauscher (H-Form) und nachfolgender Umsetzung der ent standenen H-Form der Hyaluronsäure mit einem Trialkyl- (insbesondere Tri-C1-C5-alkyl-) oder Triarylamin (insbesondere Triphenylamin) bzw. einem cyclischen aliphatischen Amin (z. B. Piperidin, Morpholin) oder mit einer quarternären Aminoniumverbindung (z. B. einem Tetra-C1-C5-alkylammoniumhalogenid, wie Tributylammoniumchlorid) zu einer Ammoniumverbindung der Hyaluronsäure.According to the invention the object is achieved in that the Na form of hyaluronic acid is converted into a form which is soluble in suitable, technically customary, organic solvents. This is done by adding the aqueous hyaluronic acid solution (Na form) with an ion exchanger (H form) and then reacting the resulting H form of hyaluronic acid with a trialkyl (especially tri-C 1 -C 5 alkyl) or triarylamine (in particular triphenylamine) or a cyclic aliphatic amine (e.g. piperidine, morpholine) or with a quaternary aminonium compound (e.g. a tetra-C 1 -C 5 -alkylammonium halide, such as tributylammonium chloride) to form an ammonium compound of hyaluronic acid.
Insbesondere wird das Ammoniumsalz der Hyaluronsäure dadurch erhalten, indem man eine wässrige Lösung des Alkalimetallsalzes der Hyaluronsäure mit einer wässrigen Amin- Lösung bis zu einem pH-Wert von ca. 9 bei einer Temperatur zwischen 25 und 60°C und einer Reaktionszeit zwischen 15 und 60 min umsetzt und anschließend die Reaktionslösung gegen Wasser dialysiert und gefriertrocknet. Das Ammoniumsalz wird dann vorzugsweise in einem dipolar aprotischen Lösungsmittel wie z. B. Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und die Lösung mit einem Sulfatierungsreagens versetzt. Für das erfindungsgemäße Verfahren kommt als Sulfatierungsreagens der SO3/Dimethylformamid-Komplex (SO3/DMF-Komplex) zur Anwendung. Dieser wird als Feststoffim Molverhältnis OH/SO3 = 1 : 1 bis 1 : 30, vorzugsweise 1 : 15, zur Hyaluronsäurelö sung gegeben, wobei er innerhalb weniger Minuten in Lösung geht.In particular, the ammonium salt of hyaluronic acid is obtained by mixing an aqueous solution of the alkali metal salt of hyaluronic acid with an aqueous amine solution up to a pH of about 9 at a temperature between 25 and 60 ° C. and a reaction time between 15 and 60 min and then dialyzed the reaction solution against water and freeze-dried. The ammonium salt is then preferably in a dipolar aprotic solvent such as. B. dimethylformamide (DMF) or dimethyl sulfoxide (DMSO) dissolved and the solution with a sulfating agent. The SO 3 / dimethylformamide complex (SO 3 / DMF complex) is used as the sulfating reagent for the process according to the invention. This is added as a solid in the molar ratio OH / SO 3 = 1: 1 to 1:30, preferably 1:15, to the hyaluronic acid solution, and it dissolves within a few minutes.
Entsprechend ist das Verfahren zur Herstellung von sulfatierter Hyaluronsäure durch Sulfatierung von Hyaluronsäure dadurch gekennzeichnet, daß Hyaluronsäure oder ein Alkalimetallsalz davon in ein Ammoniumsalz überführt wird, welches in dipolar aprotischen Lösungsmitteln löslich ist, und das erhältliche Ammoniumsalz der Hyaluronsäure mit dem Schwefeltrioxid/Dimethylformamid-Komplex als Sulfatierungsreagens sulfatiert wird, wobei der Sulfatierungsgrad DS größer als 3,5 ist.The process for the production of sulfated hyaluronic acid is correspondingly complete Sulfation of hyaluronic acid characterized in that hyaluronic acid or a Alkali metal salt thereof is converted into an ammonium salt which is dipolar aprotic Solvents is soluble, and the available ammonium salt of hyaluronic acid with the Sulfur trioxide / dimethylformamide complex is sulfated as a sulfating reagent, wherein the degree of sulfation DS is greater than 3.5.
Die Reaktionstemperatur wird zwischen 0°C und 60°C, vorzugsweise 25°C (Raum temperatur) gewählt, die Reaktionszeit beläuft sich auf 4 bis 24 h. Die Reaktion ist im Gegensatz zu Sulfatierungen mit anderen Sulfatierungsmitteln dadurch gekennzeichnet, daß es hierbei nicht zum Ausfallen sulfatierter Hyaluronsäure schon während und somit zum unkontrollierten Abstoppen der Reaktion kommt, sondern es liegt auch nach Reaktionsende noch eine homogene, klare Lösung vor. Die Reaktion wird durch Zugabe einer geringen Menge an Wasser abgestoppt, wobei überschüssiger SO3/DMF-Komplex zerstört wird. Die Aufarbeitung der Polymerlösung erfolgt analog den in der Literatur beschriebenen Verfah ren. In den meisten Fällen wird das Polymer durch Eintropfen in Ethanol bzw. Aceton ausgefällt, neutralisiert, gewaschen und gegen Wasser dialysiert. Die so gereinigte Polymer lösung wird anschließend gefriergetrocknet. Erfindungsgemäß werden sulfatierte Hyaluron säuren mit einem DS größer als 3,5 erhalten. Der Schwefelgehalt und somit der DS des Polymers wird mittels elementaranalytischer und NMR-spektroskopischer Untersuchungen bestimmt. Die Bestimmung des Restwassergehaltes, der auch nach Trocknung der Polymer proben noch im Polymer vorliegt, erfolgt durch Thermoanalysen und Karl-Fischer-Titratio nen.The reaction temperature is between 0 ° C and 60 ° C, preferably 25 ° C (room temperature), the reaction time is 4 to 24 h. In contrast to sulfations with other sulfating agents, the reaction is characterized in that sulfated hyaluronic acid does not precipitate out during and thus to an uncontrolled stopping of the reaction, but a homogeneous, clear solution is still present even after the end of the reaction. The reaction is stopped by adding a small amount of water, excess SO 3 / DMF complex being destroyed. The polymer solution is worked up analogously to the processes described in the literature. In most cases, the polymer is precipitated by dropping in ethanol or acetone, neutralized, washed and dialyzed against water. The polymer solution thus purified is then freeze-dried. According to the invention, sulfated hyaluronic acids with a DS greater than 3.5 are obtained. The sulfur content and thus the DS of the polymer is determined by means of elemental analysis and NMR spectroscopic investigations. The residual water content, which is still present in the polymer even after the polymer samples have dried, is determined by thermal analysis and Karl Fischer titratation.
Der Vorteil der Sulfatierung mit SO3/DMF-Komplex liegt in der vollkommen homogenen Reaktionsführung, wobei die Homogenität der Reaktion eindeutig mit dem Löseverhalten von sulfatierter Hyaluronsäure bzw. seiner Ammoniumverbindung in DMF zusammenhängt. Das Auftreten des ökologisch bedenklichen und bei der Aufarbeitung schwer handhabbaren Pyridins, welches beim Einsatz von SO3/Pyridin-Komplex als Sulfatierungsmittel entsteht, wird somit vermieden. Durch die Wahl der Menge an dem Sulfatierungsreagens SO3/DMF- Komplex, der Reaktionstemperatur und Reaktionszeit ist es möglich, den Sulfatierungsgrad des Polymers gezielt einzustellen und die Reaktionsführung zu beherrschen.The advantage of sulfation with SO 3 / DMF complex lies in the completely homogeneous reaction procedure, the homogeneity of the reaction clearly being related to the dissolving behavior of sulfated hyaluronic acid or its ammonium compound in DMF. The occurrence of the ecologically questionable pyridine, which is difficult to handle during processing, and which arises when SO 3 / pyridine complex is used as the sulfating agent, is thus avoided. By choosing the amount of the sulfating agent SO 3 / DMF complex, the reaction temperature and reaction time, it is possible to adjust the degree of sulfation of the polymer in a targeted manner and to master the reaction.
Desweiteren soll im Rahmen dieser Erfindung eine bevorzugte Variante der Herstellung des Ausgangsmaterials, eine neue Möglichkeit zur Darstellung der Ammoniumverbindung der Hyaluronsäure, als Vorstufe zur Sulfatierung, vorgestellt werden. Hierbei wird eine wäss rige Hyaluronsäurelösung (Na-Salz) erwärmt, vorzugsweise auf 50°C, und mit einer Aminlösung, insbesondere 75%iger Tributylaminlösung, solange versetzt, bis der pH-Wert der Lösung sich auf den pH-Wert 9 eingestellt hat. Die Lösung wird noch ca. 1 h bei oben angegebener Temperatur gerührt und anschließend gegen Wasser dialysiert. Die so von überschüssigem Amin gereinigte Polymerlösung wird gefriergetrocknet und zur Sulfatie rung, wie oben beschrieben, eingesetzt. Vorteil dieser Methode ist die Einsparung des relativ teuren Ionenaustauschers und des Umweges über die H-Form des Polymers.Furthermore, a preferred variant of the production of the Starting material, a new way of representing the ammonium compound Hyaluronic acid, as a precursor to sulfation. Here an aq Rige hyaluronic acid solution (Na salt) heated, preferably to 50 ° C, and with a Amine solution, in particular 75% tributylamine solution, added until the pH the solution has adjusted to pH 9. The solution is still about 1 h at the top specified temperature stirred and then dialyzed against water. The so of Excess amine purified polymer solution is freeze-dried and sulfated tion as described above. The advantage of this method is the saving of relatively expensive ion exchanger and the detour via the H-form of the polymer.
Bei der erfindungsgemäßen Sulfatierungsmethode kommt es zu einem Molmasseabbau des Polymermoleküls. Ausgehend von Polymermolmassen von etwa 1 Mill. werden im sulfatier ten Endprodukt Molmassen zwischen 60.000 und 300.000 erreicht.In the sulfation method according to the invention, the molecular weight of the Polymer molecule. Starting from polymer molar masses of about 1 million th final product molar masses between 60,000 and 300,000.
Die erfindungsgemäß hergestellten sulfatierten Hyaluronsäuren haben interessante biologisch-medizinische Wirksamkeiten.The sulfated hyaluronic acids produced according to the invention have interesting ones biological-medical effects.
So sind die sulfatierten Hyaluronsäurederivate nicht direkt fibrinolytisch wirksam. Sie entfalten aber in Gegenwart von Gefäßendothel eine profibrinolytische Wirkung, indem sie den Gewebeaktivator (t-PA), der für die körpereigene Fibrinolyse von entscheidender Bedeutung ist, vermehrt freisetzen.For example, the sulfated hyaluronic acid derivatives are not directly fibrinolytically active. she but develop a profibrinolytic effect in the presence of vascular endothelium by the tissue activator (t-PA), which is crucial for the body's own fibrinolysis The meaning is to release more.
Im Humanzitratplasma entfalten die sulfatierten Hyaluronsäurederivate konzentrations abhängig eine antikoagulierende Wirkung.The sulfated hyaluronic acid derivatives develop concentrations in the human citrate plasma depending on an anticoagulant effect.
In den Gruppentesten - Thrombinzeit, aktivierte partielle Thromboplastinzeit und Thrombo plastinzeit, ausgeführt im Humanzitratplasma - lassen sich für die sulfatierten Hyaluronsäu rederivate Angriffspunkte an Faktoren im intrinsischen Gerinnungssystem und am Thrombin erkennen.In the group tests - thrombin time, activated partial thromboplastin time and thrombo plastin time, carried out in human citrate plasma - can be used for the sulfated hyaluronic acid rederative points of attack on factors in the intrinsic coagulation system and on thrombin detect.
Die erfindungsgemäßen sulfatierten Hyaluronsäuren zeigen heparinähnliche Wirkungen hinsichtlich der profibrinolytischen und der antikoagulierenden Wirkung. Dabei ist die profibrinolytische Wirkung erheblich stärker ausgeprägt als beim unfraktionierten Heparin.The sulfated hyaluronic acids according to the invention show heparin-like effects with regard to profibrinolytic and anticoagulant effects. Here is the profibrinolytic effect much more pronounced than in unfractionated heparin.
Aufgrund des antikoagulierenden und profibrinolytischen Wirkprofils der sulfatierten Hyaluronsäurederivate sind diese vielfältig medizinisch einsetzbar: Zur prä-, peri- und postoperativen Thromboseprophylaxe in der Allgemeinchirurgie, zur Prophylaxe und Therapie oberflächlicher und tiefer Beinvenenthrombosen, zur Thrombo-Embolie-Prophy laxe, zur Therapie der Becken-Venen-Thrombose, zur Antikoagulation beim extrakorpora len Kreislauf (Herz-Lungen-Maschine) und der künstlichen Niere (Dialyse), in der hyper koagulatorischen Phase der Verbrauchskoagulophathie, die sich bei zahlreichen Erkrankun gen und Vergiftungen im Verlauf des Grundleidens entwickeln kann, zur Verhütung von Gefäßverschlüssen durch Blutgerinnsel nach Hüftgelenkoperationen, zur Auflösung von frischen fibrinhaltigen Gefäßverschlüssen, zur Verhinderung der Restenose nach Herz infarkt, Herzinfarktlangzeitbehandlung, wenn ein erhöhtes Risiko für thromboembolische Komplikationen gegeben ist.Due to the anticoagulant and profibrinolytic activity profile of the sulfated Hyaluronic acid derivatives can be used for a variety of medical purposes: for pre-, peri- and postoperative thrombosis prophylaxis in general surgery, for prophylaxis and Therapy of superficial and deep leg vein thrombosis, for thrombo-embolism prophy lax, for therapy of pelvic vein thrombosis, for anticoagulation in the extracorpora len circulation (heart-lung machine) and the artificial kidney (dialysis), in the hyper coagulatory phase of consumption coagulophathy, which occurs in numerous diseases can develop intoxications and poisoning in the course of basic suffering, for the prevention of Vascular occlusion by blood clot after hip joint surgery, to dissolve fresh vascular occlusions containing fibrin to prevent cardiac restenosis infarction, long-term heart attack treatment if an increased risk of thromboembolic Complications.
Als Wirkstoff in transdermalen therapeutischen Systemen (z. B. Pflaster) können sulfatierte Hyaluronsäurederivate zur Behandlung oberflächlicher Thrombosen mit Begleitentzündung (oberflächliche Thrombophlebitis) als eine aussichtsreiche Anwendung in Erwägung gezo gen werden.As an active ingredient in transdermal therapeutic systems (e.g. plasters) sulfated Hyaluronic acid derivatives for the treatment of superficial thrombosis with concomitant inflammation (superficial thrombophlebitis) is considered as a promising application be.
Zur Untersuchung der inhibierenden Wirkung von sulfatierter Hyaluronsäure wurden sulfatierte Hyaluronsäureproben mit einem Sulfatierungsgrad zwischen 13,6% und 8,3% Schwefel eingesetzt. Die sulfatierte Hyaluronsäure ist ein starker Inhibitor für Hyaluronida se, während die Aktivität von Hyaluronatlyase nur schwach gehemmt wird. Innerhalb des untersuchten Bereiches von Sulfatierungsgraden besteht kein Zusammenhang zwischen Sulfatierungsgrad und Inhibitorwirkung. Die sulfatierte Hyaluronsäure besitzt im Vergleich zum Heparin eine 1000-fach höhere inhibierende Aktivität gegenüber Hyaluronidase. 0,1 µg/ml sulfatierte Hyaluronsäure hat die gleiche inhibierende Wirkung wie 100 µg/ml Heparin sowohl gegenüber Hyaluronidase wie auch Hyaluronatlyase.To investigate the inhibitory effects of sulfated hyaluronic acid sulfated hyaluronic acid samples with a degree of sulfation between 13.6% and 8.3% Sulfur used. The sulfated hyaluronic acid is a strong inhibitor of hyaluronida se, while the activity of hyaluronate lyase is only weakly inhibited. Within the examined range of degrees of sulfation there is no connection between Degree of sulfation and inhibitory activity. The sulfated hyaluronic acid has in comparison for heparin a 1000 times higher inhibitory activity against hyaluronidase. 0.1 µg / ml sulfated hyaluronic acid has the same inhibitory effect as 100 µg / ml Heparin against both hyaluronidase and hyaluronate lyase.
Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen diese aber in keiner Weise einschränken.The following exemplary embodiments serve to explain the invention, but are intended to do so do not restrict in any way.
500 mg (1,24 mmol) Hyaluronsäure (Na-Salz) und 100 ml Wasser (bidest.) werden in einem geschlossenen Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Lösung des Polymers gerührt. Die klare viskose Lösung wird auf 0°C gekühlt, mit 2,5 g Ionenaustau scher (Dowex WX 8, H-Form) versetzt und 30 min gerührt. Die vom Ionenaustauscher abzentrifugierte Polymerlösung wird durch Zugabe von 10%-iger ethanolischer Tributyla minlösung auf den pH-Wert 9 eingestellt. Anschließend wird die Lösung dreimal mit Diethylether bzw. tert.-Butyl-methylether extrahiert, 24 h gefriergetrocknet und bei 50°C im Vakuum getrocknet.500 mg (1.24 mmol) hyaluronic acid (Na salt) and 100 ml water (bidist.) Are in a closed reaction vessel at room temperature until the Polymer stirred. The clear viscous solution is cooled to 0 ° C, with 2.5 g of ion exchange shear (Dowex WX 8, H-form) and stirred for 30 min. The one from the ion exchanger centrifuged polymer solution is by adding 10% ethanolic tributyla min solution adjusted to pH 9. Then the solution with three times Extracted diethyl ether or tert-butyl methyl ether, freeze-dried for 24 h and at 50 ° C. dried in vacuo.
Das so erhaltene Ammoniumsalz des Polymers wird in ca. 80 ml absolutem Dimethylforma
mid (DMF) unter Argon bei Raumtemperatur gelöst, auf 0°C gekühlt und mit 5 g (32,6
mmol) SO3/DMF-Komplex (OH/SO3 = 1 : 10) versetzt. Es wird 4 h bei 0°C gerührt. In die
nach dieser Zeit immer noch klare Reaktionslösung werden zum Reaktionsabbruch einige
ml Wasser (bidest.) gegeben, die Lösung in 700 ml Aceton ausgefällt und mit 1n ethanol.
NaOH neutralisiert. Der Niederschlag wird mehrmals mit Ethanol gewaschen, in Wasser
(bidest.) gelöst, gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Das erhaltene
Produkt wird zur weiteren Trocknung bei 50°C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet.
The ammonium salt of the polymer thus obtained is dissolved in about 80 ml of absolute dimethylformamide (DMF) under argon at room temperature, cooled to 0 ° C. and with 5 g (32.6 mmol) of SO 3 / DMF complex (OH / SO 3 = 1:10). The mixture is stirred at 0 ° C for 4 h. A few ml of water (bidistilled) are added to the reaction solution, which is still clear after this time, and the solution is precipitated in 700 ml of acetone and with 1N ethanol. NaOH neutralized. The precipitate is washed several times with ethanol, dissolved in water (bidistilled), dialyzed against water and then freeze-dried. The product obtained is dried for further drying at 50 ° C. in vacuo to constant weight.
Molgewicht: ~ 63.000
SO3 -/COO-: ~ 3,8
C(%): 21,5 (ger.: 18,99)
H(%): 3,45 (ger.: 3,12)
N(%): 3,16 (ger.: 1,58)
S(%): 13,81 (ger.: 13,76)
H2O-Gehalt (%): 12,1
Schwermetalle (%/g): < 10 ppmMolecular Weight: ~ 63,000
SO 3 - / COO - : ~ 3.8
C (%): 21.5 (ger .: 18.99)
H (%): 3.45 (ger .: 3.12)
N (%): 3.16 (ger .: 1.58)
S (%): 13.81 (ger .: 13.76)
H 2 O content (%): 12.1
Heavy metals (% / g): <10 ppm
500 mg (1,24 mmol) Hyaluronsäure (Na-Salz) und 100 ml Wasser (bidest.) werden in einem geschlossenen Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Lösung des Polymers gerührt. Die klare viskose Lösung wird auf 50°C erwärmt und eine wässrige 75%-ige Tributylmethylammoniumchlorid-Lösung solange zugetropft, bis die Lösung den pH-Wert 9 erreicht. Anschließend wird noch 1 h bei der oben angegebenen Temperatur gerührt. Die leicht gelblich gefärbte Lösung wird nun gegen Wasser (bidest.) dialysiert, 24 h gefriergetrocknet und bis zur Gewichtskonstanz bei 50°C an der Trockenpistole nach getrocknet.500 mg (1.24 mmol) hyaluronic acid (Na salt) and 100 ml water (bidist.) Are in a closed reaction vessel at room temperature until the Polymer stirred. The clear viscous solution is heated to 50 ° C and an aqueous 75% tributylmethylammonium chloride solution was added dropwise until the solution pH 9 reached. This is followed by a further 1 h at the temperature given above touched. The slightly yellowish solution is now dialyzed against water (bidist.), 24 h freeze-dried and to constant weight at 50 ° C on the drying gun dried.
Die so erhaltene Ammoniumverbindung des Polymers wird in ca. 80 ml absolutem DMF
unter Argon bei Raumtemperatur gelöst und mit 6,4 g (41,7 mmol) SO3/DMF-Komplex
(OH/SO3 = 1 : 15) versetzt. Die Reaktionsmischung wird 16 h bei Raumtemperatur gerührt.
Die klare Reaktionslösung wird nach Abbruch der Reaktion - durch Zugabe einiger ml
Wasser (bidest.) - in 700 ml Aceton oder Ethanol ausgefällt und mit in ethanol. NaOH
neutalisiert. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert, mehrmals mit Ethanol
gewaschen, in Wasser (bidest.) gelöst und gegen Wasser dialysiert. Nach anschließender
Gefriertrocknung des Polymers wird noch bis zur Gewichtskonstanz bei 50°C im Vakuum
getrocknet.
The ammonium compound of the polymer thus obtained is dissolved in about 80 ml of absolute DMF under argon at room temperature and mixed with 6.4 g (41.7 mmol) of SO 3 / DMF complex (OH / SO 3 = 1:15). The reaction mixture is stirred for 16 h at room temperature. After the reaction has been terminated, the clear reaction solution is precipitated in 700 ml of acetone or ethanol by adding a few ml of water (bidistilled) and in ethanol. NaOH neutralized. The precipitate is centrifuged off, washed several times with ethanol, dissolved in water (bidist.) And dialyzed against water. After the freeze-drying of the polymer, the mixture is dried in vacuo to constant weight at 50 ° C.
Molgewicht: ~ 65.000
SO3 -/COO-: ~ 3,6
C(%): 19,88 (ger.: 19,35)
H(%): 3,18 (ger.: 3,21)
N(%): 2,11 (ger.: 1,61)
S(%): 13,30 (ger.: 13,28)
H2O-Gehalt (%): 13,00
Schwermetalle (%/g): < 10 ppmMolecular Weight: ~ 65,000
SO 3 - / COO - : ~ 3.6
C (%): 19.88 (ger .: 19.35)
H (%): 3.18 (ger .: 3.21)
N (%): 2.11 (ger .: 1.61)
S (%): 13.30 (ger .: 13.28)
H 2 O content (%): 13.00
Heavy metals (% / g): <10 ppm
Am isoliert durchströmten Gefäßpräparat (Schweineohr) wurde der kanulierte Ramus intermedius der Ateria auricularis magna zur Entfernung des Blutes 30 Minuten mit Tyrode lösung durchströmt. Danach wurden Perfusate im Abstand von 2 Minuten fraktioniert gesammelt: Fraktionen 1-4 zur Bestimmung der spontanen Freisetzung von Gewebeakti vator (t-PA), Fraktionen 5 und 6 unter Durchströmung mit prüfsubstanzhaltiger Tyrodelö sung, danach Fraktionen 7-12 unter Durchströmung mit Tyrodelösung ohne Prüfsubstanz. Der Gehalt der Perfusate der Fraktionen 1-12 wurde als fibrinolytische Aktivität mit der Fibrinplattentechnik bestimmt und anhand einer Eichkurve mit Standard-Gewebefaktor in Internationale Einheiten (IE)/ml Perfusat umgerechnet. The cannulated ramus was placed on the isolated vascular preparation (pig's ear) intermedius of the auricular artery magna to remove the blood 30 minutes with Tyrode solution flows through. Perfusates were then fractionated every 2 minutes collected: fractions 1-4 to determine the spontaneous release of tissue stock vator (t-PA), fractions 5 and 6 under flow with test substance-containing Tyrodelö solution, then fractions 7-12 under flow with Tyrode solution without test substance. The perfusate content of fractions 1-12 was determined as the fibrinolytic activity with the Fibrin plate technique determined and based on a calibration curve with standard tissue factor in International units (IU) / ml perfusate converted.
In Tabelle 1 ist die durch die Prüfsubstanzen freigesetzte t-PA-Aktivität im Vergleich zu der von unfraktioniertem Heparin und von Pentosanpolysulfat, einem unter den Namen SP-54 oder Fibrezym kommerziell erhältlichen Fibrinolytikum bzw. Präparat zur Thrombose prophylaxe, induzierten Aktivität in Prozent dargestellt.Table 1 shows the t-PA activity released by the test substances compared to that unfractionated heparin and pentosan polysulfate, one under the names SP-54 or Fibrezym commercially available fibrinolytic or preparation for thrombosis prophylaxis, induced activity shown in percent.
Im Vergleich mit der Kontrolle steigerten die sulfatierten Hyaluronsäurederivate die t-PA- Freisetzung um 100 bis 200 Prozent, Heparin und Pentosanpolysulfat dagegen nur um 20 bis 30 Prozent.Compared to the control, the sulfated hyaluronic acid derivatives increased the t-PA Release by 100 to 200 percent, heparin and pentosan polysulfate, however, only by 20 up to 30 percent.
Die Prüfung auf antikoagulierende Wirkung wurde in Global- und Gruppentesten in vitro vorgenommen.The test for anticoagulant effects was carried out in global and group tests in vitro performed.
Thrombelastographische Aufzeichnungen wurden mit 0,2 ml Humanzitratplasma, 0,1 ml Tris/NaCl-Pufferlösung unter Zusatz von 0,05 ml CaCl2 (0,1 M/L) vorgenommen. Kontroll thrombelastogramme wurden ohne Zusatz von Prüfsubstanz aufgezeichnet.Thromlastographic recordings were made with 0.2 ml of human citrate plasma, 0.1 ml of Tris / NaCl buffer solution with the addition of 0.05 ml of CaCl 2 (0.1 M / L). Control thromlastograms were recorded without the addition of test substance.
Mit Hilfe des Thrombelastographen wurden im Humanzitratplasma die Reaktionszeit r, die Gerinnselbildungszeit k und die maximale Amplitude ma konzentrationsabhängig in Gegen wart der Prüfsubstanzen ermittelt. Eine Verlängerung der Reaktionszeit r bedeutet eine Verzögerung des Gerinnungsvorganges (Tabelle 2). In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse als Konzentrationen, die bei einer Laufzeit von einer Stunde eine Ungerinnbarkeit des Human zitratplasmas bewirken, aufgelistet. Unfraktioniertes Heparin erwies sich von den geprüften Substanzen als am stärksten wirksam. Um eine Ungerinnbarkeit über 60 Minuten zu bewirken, wurde von den sulfatierten Hyaluronsäurederivaten die ca. 30-fache Substanz menge gegenüber Heparin benötigt. Dieser Befund weist darauf hin, daß die Hyaluronsäure derivate einen im Vergleich zu Heparin anderen Wirkungsmechanismus hinsichtlich ihrer antikoagulierenden Wirkung besitzen.With the help of the thrombus loader, the reaction time r, the Clot formation time k and the maximum amplitude ma depending on the concentration in counter were the test substances determined. An extension of the reaction time r means one Delay in the coagulation process (Table 2). In Table 3 the results are as Concentrations that are non-coagulable in human over a period of one hour cause citrated plasma, listed. Unfractionated heparin proved to be one of the tested ones Substances as the most effective. To make it non-coagulable over 60 minutes cause, the sulfated hyaluronic acid derivatives was about 30 times the substance amount required compared to heparin. This finding indicates that the hyaluronic acid derivatives have a different mechanism of action compared to heparin with regard to their have anticoagulant effects.
Zur Bestimmung der Thrombinzeit wurden 0,2 ml Humanzitratplasma mit 0,2 ml Tris/NaCl-Pufferlösung bzw. 0,2 Tris/NaCl-Pufferlösung mit der Prüfsubstanz gemischt. To determine the thrombin time, 0.2 ml of human citrate plasma with 0.2 ml Tris / NaCl buffer solution or 0.2 Tris / NaCl buffer solution mixed with the test substance.
Mit 0,1 ml Thrombinlösung (10 NIH-E/ml) wurde der Gerinnungsvorgang gestartet. Die Thrombinzeitbestimmung ist ein Gruppentest. Verlängerte Thrombinzeiten werden hervorgerufen durch Hemmung von Thrombin bzw. durch Beschleunigung der Thrombin- Antithrombin-III-Reaktion im Plasma.The coagulation process was started with 0.1 ml thrombin solution (10 NIH-E / ml). The thrombin time determination is a group test. Prolonged thrombin times will be caused by inhibition of thrombin or by acceleration of thrombin Antithrombin III reaction in plasma.
Zur Einschätzung der Wirksamkeit der sulfatierten Hyaluronsäurederivate wurde die Konzentration bestimmt, die eine zweifache Verlängerung der Thrombinzeit bewirkt (Tabelle 3).To assess the effectiveness of the sulfated hyaluronic acid derivatives, the Concentration determined, which causes a double extension of the thrombin time (Table 3).
Die sulfatierten Hyaluronsäurederivate waren schwächer wirksam als unfraktioniertes Heparin, aber etwa 5-fach stärker wirksam als Pentosanpolysulfat.The sulfated hyaluronic acid derivatives were less effective than unfractionated ones Heparin, but about 5 times more effective than pentosan polysulfate.
Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit erfaßt als Gruppentest alle intrinsischen (endoge nen) Gerinnungsfaktoren außer Calciumionen und Plättchenfaktor 3. Phospholipidreagens und Humanzitratplasma wurden in Gegenwart der jeweiligen Prüfsubstanzen 3 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend wurde das Gemisch mit Calciumchlorid zur Gerinnung gebracht. Leerwerte wurden ohne Gegenwart von Prüfsubstanzen unter sonst gleichen Bedingungen ermittelt.The activated partial thromboplastin time records all intrinsic (endoge NEN) coagulation factors except calcium ions and platelet factor 3. phospholipid reagent and human citrate plasma were present in the presence of the respective test substances for 3 minutes Incubated 37 ° C and then the mixture was clotted with calcium chloride brought. Blank values were determined without the presence of test substances under otherwise the same Conditions determined.
Ansatz:
Approach:
0,1 ml Humanzitratplasma
0,03 ml Trispuffer bzw. Trispuffer + Prüfsubstanz
0,1 ml Phospholipidreagens
0.1 ml human citrate plasma
0.03 ml Tris buffer or Tris buffer + test substance
0.1 ml phospholipid reagent
3 Minuten bei 37°C inkubieren
Incubate for 3 minutes at 37 ° C
0,1 ml Calciumchlorid (0,02 M; 37°C)0.1 ml calcium chloride (0.02 M; 37 ° C)
Eine Verlängerung der aPTT deutet auf eine Hemmung von mehreren endogenen Ger innungsfaktoren möglicherweise in Verbindung mit Antithrombin III hin.Prolongation of aPTT indicates inhibition of several endogenous ger Guild factors may be associated with antithrombin III.
Alle geprüften sulfatierten Hyaluronsäurederivate verlängerten die aktivierte partielle Thromboplastinzeit bei relativ niedrigen Konzentrationen (ca. 1 µg/Ansatz) um das 2-fache. Heparin erwies sich um den Faktor 10, Pentosanpolysulfat nur um das 1,5 bis 2-fache stärker wirksam.All tested sulfated hyaluronic acid derivatives extended the activated partial Thromboplastin time at relatively low concentrations (approx. 1 µg / batch) twice. Heparin turned out to be a factor of 10, pentosan polysulfate only 1.5 to 2 times more effective.
Die Thromboplastinzeitbestimmung (TPZ) ist ein einfacher funktioneller Gruppentest für das exogene System und erfaßt daher die Faktoren X, VII, V, II und das Fibrinogen.Thromboplastin time determination (TPZ) is a simple functional group test for the exogenous system and therefore detects the factors X, VII, V, II and the fibrinogen.
Ansatz:
Approach:
0,1 ml Humanzitratplasma
0,03 ml Trispuffer bzw. Trispuffer + Prüfsubstanz
0,1 ml Thrombokinase
0.1 ml human citrate plasma
0.03 ml Tris buffer or Tris buffer + test substance
0.1 ml thrombokinase
2 Minuten bei 37°C inkubieren
Incubate 2 minutes at 37 ° C
0,1 ml Calciumchlorid (0,02 M; 37°C)0.1 ml calcium chloride (0.02 M; 37 ° C)
Unfraktioniertes Heparin und Pentosanpolysulfat erwiesen sich vergleichsweise als stärker wirksam. Die sulfatierten Hyaluronsäurederivate bewirkten gegenüber Heparin in 3-5-fach höherer Konzentration (6,9-9,0 µg/Ansatz) (Tabelle 3) eine Verdopplung der Thrombopla stinzeiten gegenüber den Kontrollwerten. Der Einfluß auf das exogene System ist allgemein schwächer als im endogenen Gerinnungssystem.Unfractionated heparin and pentosan polysulfate were found to be comparatively stronger effective. The sulfated hyaluronic acid derivatives were 3-5 times more effective than heparin higher concentration (6.9-9.0 µg / batch) (Table 3) a doubling of the thrombopla hours compared to the control values. The influence on the exogenous system is general weaker than in the endogenous coagulation system.
0,1 mg einer gereinigten Hyaluronidase aus Streptococcus agalactiae mit einer spezifischen Aktivität von 250 000 IE/mg werden in 1 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer pH = 6,0 gelöst. Die Aktivität dieser Lösung wird durch Trübungsmessung bestimmt. Dafür wurden 0,05 ml Enzymlösung geometrisch mit 0,05 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer pH = 6,0 verdünnt. Diesen Verdünnungen wurden jeweils 0,05 ml einer Hyaluronsäurelösung zugesetzt, die 0,2 mg Hyaluronsäure/ml destilliertes Wasser enthält. Dieses Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurden jeder Verdünnung 0,2 ml einer 2,5%-igen Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid in 2%-iger Natronlauge (CTA-Lösung) zugesetzt. Nach 20 Minuten wird die entstehende Trübung bei 600 nm vermessen. 1 IE entspricht der Hyaluronidaseaktivität, die 0,03 µg Hyaluronsäure/min abbaut. Zur Inhibierung wurde sulfatierte Hyaluronsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Von dieser Lösung wurde eine geometrische Verdünnungsreihe angelegt. Dieser Verdünnungsreihe wurden jeweils Probenmengen von 0,01 ml entnommen und den jeweiligen geometrischen Verdün nungsstufen der Enzymlösung zugesetzt. Nach der Zugabe wurde für 10 Minuten inkubiert und anschließend die Hyaluronsäuresubstratlösung hinzugesetzt und die Enzymbestimmung in der oben beschriebenen Weise weitergeführt. Als Vergleichsprobe wurden 0,05 ml Natriumacetatpuffer pH = 6,0 mit 0,01 ml sulfatierter Hyaluronsäurelösung des entspre chenden Verdünnungsgrades, 0,05 ml Hyaluronsäuresubstratlösung und 0,2 ml CTA- Lösung gemischt und bei 600 nm vermessen.0.1 mg of a purified hyaluronidase from Streptococcus agalactiae with a specific Activity of 250,000 IU / mg is dissolved in 1 ml of 0.1 M sodium acetate buffer pH = 6.0. The activity of this solution is determined by measuring the turbidity. For this, 0.05 ml Geometric enzyme solution diluted with 0.05 ml 0.1 M sodium acetate buffer pH = 6.0. 0.05 ml of a hyaluronic acid solution, 0.2 mg, was added to each of these dilutions Contains hyaluronic acid / ml distilled water. This mixture was for 30 minutes incubated at 37 ° C. Thereafter, 0.2 ml of a 2.5% solution of Cetyltrimethylammonium bromide in 2% sodium hydroxide solution (CTA solution) added. After The resulting turbidity is measured at 600 nm for 20 minutes. 1 IU corresponds to the Hyaluronidase activity that breaks down 0.03 µg hyaluronic acid / min. For inhibition sulfated hyaluronic acid dissolved in a concentration of 1 mg / ml. From this solution a geometric dilution series was created. This series of dilutions were samples of 0.01 ml were taken and the respective geometric dilution Levels of the enzyme solution added. After the addition, incubation was carried out for 10 minutes and then adding the hyaluronic acid substrate solution and the enzyme determination continued in the manner described above. 0.05 ml Sodium acetate buffer pH = 6.0 with 0.01 ml of sulfated hyaluronic acid solution appropriate degree of dilution, 0.05 ml hyaluronic acid substrate solution and 0.2 ml CTA Mixed solution and measured at 600 nm.
Durch Zugabe der sulfatierten Hyaluronsäure kommt es zu einer Inhibierung der Hyaluroni daseaktivität wie in Abb. 1 gezeigt.Adding the sulfated hyaluronic acid leads to an inhibition of the hyaluronic acid activity as shown in Fig. 1.
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