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DE19801730A1 - Verfahren zur kombinierten Analyse von Zellinhalten, insbesondere den in biologischen Zellen enthaltenen Nukleinsäuren sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur kombinierten Analyse von Zellinhalten, insbesondere den in biologischen Zellen enthaltenen Nukleinsäuren sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

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Publication number
DE19801730A1
DE19801730A1 DE19801730A DE19801730A DE19801730A1 DE 19801730 A1 DE19801730 A1 DE 19801730A1 DE 19801730 A DE19801730 A DE 19801730A DE 19801730 A DE19801730 A DE 19801730A DE 19801730 A1 DE19801730 A1 DE 19801730A1
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DE
Germany
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reaction vessel
cell
cell contents
buffer solution
reaction
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19801730A
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English (en)
Inventor
Stefan Dr Kiesewetter
Uwe Dr Vohrer
Andreas Schuele
Achim Gueth
Marius Michniewski
Hannes Dobler
Hans Lindner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to DE19801730A priority Critical patent/DE19801730A1/de
Publication of DE19801730A1 publication Critical patent/DE19801730A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur kombinierten Analyse von Zellin­ halten, insbesondere den in biologischen Zellen enthaltenen Nukleinsäuren sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Für die Untersuchung biologischer Zellen und insbesondere der Analyse der Zellin­ halte, insbesondere Proteine und Nukleinsäuren (DNA und RNA), beispielweise zu Zwecken medizinischer Diagnostik, müssen die Zellwände und Membranen aufge­ schlossen werden, um das Zellinnere in einer geeigneten Form aus den Zellen ex­ trahieren zu können.
Hierzu sind eine Reihe bekannter Verfahren geeignet, die in dem Beitrag von Carl A. Schnaitman, "Cell Franctionation" in Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Mikrobiology, Washington, DC 20006, 1981, Chapter 5, Seite 52-61, in einer Übersichtsdarstellung beschrieben sind.
So sind mechanische Verfahre zur Erzeugung lokaler Druckschwankungen am Ort der aufzuschließenden Zellen bekannt, durch die die Zellwände und Membranen re­ gelrecht aufgebrochen werden. Aufgrund der für die Zellwandzerstörung notwendi­ gen starken Druckschwankungen bedarf es jedoch entsprechend stabil ausgebildeter Vorrichtungen, wie sie beispielsweise in dem Artikel von J.R. Raper und E.A. Hyatt, "Modified Press For Disruption Of Microorganisms", J. of Bacteriology, V. 85, S. 712-­ 713, beschrieben sind. Weitere Vorrichtungen zur Erzeugung derartig großer Druck- oder Scherkräfte sind sogenannte Kugelmühlen oder die sogenannte French press, die in "Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology", American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1986 in Kapitel 9.3.6. auf Seiten 103-104 dargestellt sind.
Die vorstehend genannten Vorrichtungen bedürfen neben einen sehr großen techni­ schen und mechanischen Aufwand, der betrieben werden muß, um derartig große Druckkräfte zu erzeugen und sicher zu beherrschen, viel Platz und lassen sich über­ dies schwer automatisieren. Ein weiterer Nachteil der bekannten Druckbehandlung biologischer Zellen besteht überdies auch darin, daß die Zellinhalte, hierbei sind ins­ besondere die langkettigen DNA-Moleküle gemeint, stark fragmentiert werden, so daß eine vollständige DNA-Analyse erschwert ist.
Auch sind Ultraschall-Aufschlußmethoden bekannt, bei denen die Zellwände und Membranen durch Kavitationseffekte regelrecht aufgerissen wird, so daß das Zellin­ nere nach außen gelangen kann. Beim Ultraschallaufschluß wird jedoch eine erheb­ liche Schall-Leistung in der zu untersuchenden Probe dissipiert, wodurch die Probe unnötigerweise erwärmt wird. Kühlvorkehrungen sind daher nötig. Durch die auftre­ tenden Temperaturschwankungen ist jedoch eine einigermaßen genaue Prozeßfüh­ rung erschwert.
Ein zentrales Problem bekannter Aufschlußverfahren für biologische Zellen mit dem Ziel der Isolierung und Detektion von Nukleinsäuren besteht in der Vielzahl einzelner nacheinander durchzuführender Verfahrensschritte, für die bis heute in der Regel ein erheblicher manueller Aufwand erforderlich ist. So sind die mit den bekannten Ver­ fahren freigesetzten Nukleinsäuren für nachgeschaltete Polymerasekettenreaktionen in einer Vielzahl von Waschschritten zu reinigen. Ebenso muß das im Verlauf der PCR-Reaktionen entstehende Amplikon für eine weitere Detektion, beispielsweise mit Hilfe von Gelelektrophorese gereinigt werden.
Für die Durchführung der einzelnen, nacheinander zu erfolgenden Waschschritte werden in der Regel manuelle Pipettierschritte bzw. Dekantiervorgänge durchgeführt, bei denen die Gefahr der Querkontamination zwischen verschiedenen Proben be­ steht. In der Regel sind aufwendige und ebenfalls manuell zu bedienende Laborge­ räteausstattungen notwendig, die es nicht gestatten, eine parallele oder verknüpfte Prozeßführung zu ermöglichen, so daß die Verfahrensschritte mit relativ hohem Zeit­ aufwand sequentiell hintereinander durchgeführt werden müssen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur kombinierten Analyse von Zellinhalten, insbesondere den in biologischen Zellen enthaltenen Nukleinsäu­ ren, derart weiterzubilden, daß die einzelnen, für die Isolierung und Detektion erfor­ derlichen Behandlungsschritte zeitlich und räumlich zugleich durchgeführt werden können. Insbesondere sollte die Probenvorbereitung, d. h. der Zellaufschluß und die nachfolgende Analyse der isolierten Zellinhalte ohne Gefahr einer Querkontamination möglichst vollautomatisch durchgeführt werden können. Überdies soll eine Vorrich­ tung zur Durchführung des Verfahrens angegeben werden.
Die Lösung der Erfindung ist im Anspruch 1 angegeben. Gegenstand des Anspruchs 15 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Den Erfindungsgedanken vorteilhaft ausgestaltende Merkmale sind Gegenstand der Un­ teransprüche.
Die Erfindung geht von der Idee aus, die Probenvorbereitung, d. h. den Vorgang des Zellaufschlusses und Isolierung des Zellinhaltes sowie den Vorgang der Amplifikati­ on, d. h. die Durchführung von Polymerasekettenreaktionen sowie nachfolgender Detektion, in einem einzigen Reaktionsgefäß durchzuführen, wobei die erforderlichen Waschschritte sequentiell nacheinander innerhalb des Reaktionsgefäßes erfolgen.
Für den Zellaufschluß werden in einer Pufferlösung suspendierte Zellen in ein Reak­ tionsgefäß eingebracht, dem zusätzlich makroskopische Partikel, vorzugsweise klei­ ne Glasperlen, hinzugefügt werden. Die als kleine Glasperlen ausgebildeten Partikel sind an ihrer Oberfläche mit einer Substanz überzogen, durch die sich Zellinhalts­ stoffe, vorzugsweise Nukleinsäuren, bevorzugt an lagern.
Für den Zellaufschluß wird die in dem Reaktionsgefäß befindliche Zellsuspension einem Ultraschallfeld ausgesetzt, das durch die Gegenwart der in dem Reaktions­ gefäß vorhandenen makroskopischen Partikel zusätzliche Scherkräfte in die Puffer­ lösung einbringt, wodurch die Zellmembranen erhöhten Deformationen unterliegen, die schließlich zum lokalen Aufbruch der Zellwand und dem Austreten bzw. Auf­ schluß der Zellinhaltsstoffe führen. Durch die Gegenwart der Glasperlen können die biologischen Zellen mit Hilfe der Ultraschallfelder leichter aufgeschlossen werden, wodurch die beim Stand der Technik bekannten Nachteile weitgehend ausgeschlos­ sen werden können.
Nach erfolgtem Aufschluß der Zellinhalte befinden sich die Nukleinsäuren innerhalb der anfänglich in dem Reaktionsgefäß eingebrachten Pufferlösung und lagern sich an den Oberflächen der in die Pufferlösung eingebrachten makroskopischen Partikel an. Durch bloßes Abtrennen der in dem Reaktionsgefäß vorhandenen Flüssigkeit von den makroskopischen Partikeln, die mit Hilfe eines in dem Reaktionsgefäß ein­ gebrachten Siebes erfolgen kann, sind nachfolgende Waschschritte der Partikel nebst Nukleinsäuren innerhalb des gleichen Reaktionsgefäßes ohne Gefahr jeglicher Querkontaminationen möglich. In einem nachfolgenden Trocknungsschritt, der übli­ cherweise mit Hilfe von Einbringen von Trockenluft in das Reaktionsgefäß durchge­ führt werden kann, sind die an der Oberfläche der Partikel anhaftenden Nukleinsäu­ ren von jeglichen Verunreinigungen befreit, so daß durch Wiederbefüllen des Reaktionsgefäßes mit einer geeigneten Pufferlösung die für die Amplifikation erfor­ derlichen Polymerasekettenreaktionen innerhalb des Reaktionsgefäßes ablaufen können. Die im Wege der Polymerasekettenreaktionen entstehenden Amplikone, die durch Verbindung zwischen einzelnen Nukleinsäuren und entsprechend dazu korre­ spondierenden PCR-Sonden, die überdies fluoreszensfähige Markermoleküle ent­ halten, entstehen, werden in einem anschließenden optischen Detektionsschritt, übli­ cherweise mittels Fluoreszenzdetektor detektiert und analysiert.
Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, das zu un­ tersuchende Probengut im Verlaufe des gesamten Verfahrensablaufs nur ein einzi­ ges Mal in ein Reaktionsgefäß einzubringen, in dem zum einen die Probenvorberei­ tung sowie die Analyse durchgeführt werden kann. Umständlich manuell durchzufüh­ rende Pipettierschritte entfallen vollständig, so daß das Problem der Querkontamina­ tion zwischen unterschiedlichen Proben weitgehend entfällt.
Das erfindungsgemäße Verfahren, das für den Aufschlußvorgang Ultraschallenergie vorsieht, die mit Hilfe geeignet präparierter makroskopischer Partikel in besonders effizienter Weise in die Zellsuspension eingebracht werden kann, so daß durch zu­ sätzliches Auftreten von Scherkräften der Aufschlußvorgang unterstützt werden kann, ermöglicht es insbesondere, den gesamten Analyseprozeß vollautomatisch durchzuführen. Hierzu sieht das Reaktionsgefäß für die Vielzahl im Verfahrensablauf erforderlichen Waschschritte eine Trennvorrichtung vor, mit der eine leichte Abtren­ nung der in dem Reaktionsgefäß eingebrachten Flüssigkeit von den makroskopi­ schen Partikeln, an deren Oberfläche sich die isolierten Nukleinsäuren ablagern, möglich ist. Das Reaktionsgefäß kann je nach Probenvolumen beliebig klein ausge­ führt werden, so daß durch arrayförmige Anordnung einzelner Reaktionsgefäße eine Vielzahl nebeneinander angeordneter Proben zeitgleich untersucht werden können.
Das Einbringen von Ultraschallwellen in das Innere des Reaktionsgefäßes kann zum einen mit Hilfe an die Außenkontur des Reaktionsgefäßes angepaßte Becherreso­ natoren oder in das Innere des Reaktionsgefäßes einbringbare Ultraschall-Schwinger erfolgen.
Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsge­ dankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen exemplarisch. Es zeigen:
Fig. 1a, b Prinzipdarstellung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 2a, b Ultraschallquellenanordnung zur Einkopplung von Ultra- Schallenergie in das Innere des Reaktionsgefäßes,
Fig. 3 schematischer Querschnitt durch ein Reaktionsgefäß mit Darstellung der Probenvorbereitung,
Fig. 4 schematisierter Querschnitt durch ein Reaktionsgefäß mit Darstellung der Analyse isolierter Nukleinsäuren, sowie
Fig. 5 arrayförmige Anordnung mehrerer Reaktionsgefäße.
In ein Reaktionsgefäß 1 wird zum Aufschluß und zur Isolierung gemäß Fig. 1a der in Zellen vorhandenen Zellinhalte die Zellenprobe 2 eine Pufferlösung 3, makrosko­ pische Partikel 4, vorzugsweise in Form von Glasperlen, sowie Ultraschallenergie 5 eingebracht. Nach erfolgtem Aufschluß und Isolierung werden gemäß Fig. 1b in dem gleichen Reaktionsgefäß 1 zunächst zur Vorbereitung für die Amplifikation di­ verse Waschschritte durchgeführt, so daß nach Zugabe geeigneter Amplifizierungs­ reagenzien 6 sowie Detektionsreagenzien 7 eine Analyse der Nukleinsäuren inner­ halb desselben Reaktionsgefäßes 1, beispielsweise durch Einbringen geeigneter Lichtenergie 8, möglich ist.
Das Einbringen von Ultraschallenergie in das Innere des Reaktionsgefäßes 1 erfolgt gemäß Fig. 2a mit Hilfe eines Becherresonators 9, der vorzugsweise eine Ausneh­ mung aufweist, in die das Reaktionsgefäß 1 zur Ultraschallwelleneinkopplung ein­ bring bar ist. Zu Kühlungszwecken wird zwischen dem Becherresonator 9 und dem Reaktionsgefäß 1 ein Kühlmedium 10 eingebracht, das für eine weitgehend kon­ stante Temperatur innerhalb des Reaktionsgefäßes sorgt.
In Fig. 2b ist eine Alternative zur Ultraschallwelleneinkopplung dargestellt, die einen Ultraschallschwinger 11 vorsieht, der in das Innere des Reaktionsgefäßes 1 hinein­ ragt.
In Fig. 3 ist ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines Reaktionsgefäßes 1 darge­ stellt, in dessen Inneren eine Trennvorrichtung 12 in Art eines Siebes eingebracht ist. Die obere Öffnung des Reaktionsgefäßes ist vorzugsweise mit einem Septum 13 ab­ geschlossen, das zum Einbringen von Reagenzien bzw. der zu untersuchenden Pro­ be mit geeigneten Kanülen durchdrungen werden kann.
Im Inneren des Reaktionsgefäßes 1 ist das Probenvolumen 14 vorgesehen, das ei­ nerseits durch das Septum 13 und andererseits durch die Trennvorrichtung 12 abge­ grenzt ist. Im Probenvolumen 14 befindet sich für die Probenvorbereitung die in einer Pufferlösung suspendierten Zellen 15 sowie makroskopische Partikel 4, deren Ober­ fläche mit einer DNA-affinen Substanz 16 überzogen ist.
Zum Aufschluß der Zelle 15 wird in das Innere des Reaktionsgefäßes und insbeson­ dere in die im Probenvolumen 14 vorhandene Pufferlösung Ultraschallwellenenergie eingebracht, die im Falle des Ausführungsbeispiels gemäß Fig. 3 durch einen in der Wand des Reaktionsgefäßes integrierten Ultraschallresonator 17 generiert wird.
Durch die innerhalb der Pufferlösung vorhandenen makroskopischen Partikel 4 ver­ ursachten Scherkräfte wird die Zellwand leichter aufgebrochen, wodurch freie Nu­ kleinsäuren 18 und Zellbruchstücke 19 in der Pufferlösung frei vorliegen.
In Fig. 4 ist gezeigt, daß die Nukleinsäuren 18 bevorzugt an der Oberfläche der ma­ kroskopischen Partikel 4 anlagern. Über ein Ablaßventil 20 kann die im Inneren des Reaktionsgefäßes 1 befindliche Pufferlösung aus dem Probenvolumen entweichen, wobei die makroskopischen Partikel an der Trennvorrichtung 12, die als Sieb oder Membran, typischerweise mit einem Porendurchmesser von < 100 µm, ausgebildet ist, zurückgehalten werden. Die im Wege der Polymerasekettenreaktion gebildeten Amplikone 21, die ein Konglomerat aus Nukleinsäure, PCR-Sonde mit wenigstens einem geeigneten Markermolekül darstellen können im Wege einer Fluoreszenzde­ tektion analysiert werden. Hierzu ist an geeigneter Stelle in der Gehäusewand des Reaktionsgefäßes ein Sichtfenster 22 eingearbeitet, durch das von außen Detekti­ onslicht in das Innere des Probenvolumens 14 eingekoppelt werden kann.
In Fig. 5 ist eine Anordnung, bestehend aus vier Reaktionsgefäßen, dargestellt, die beliebig arrayförmig erweitert werden kann. Mit Hilfe eines Pipettierapparates 23 können die einzelnen Reaktionsgefäße mit den für den Analysenvorgang erforderli­ chen Substanzen und Lösungen befüllt werden. Die einzelnen Reaktionsgefäße 1 werden von Becherresonatoren 9 umschlossen, die jeweils getrennt voneinander über eine Steuereinheit 24 ansteuerbar sind. Eine Temperaturregeleinheit 25 sorgt für eine konstante Temperatur. Mit Hilfe der in Fig. 5 dargestellten Anordnung kann die gesamte Analyse von Zellinhaltsstoffen vollautomatisch durchgeführt werden, wobei durch die Möglichkeit der Miniaturisierung der einzelnen Reaktionsgefäße eine Vielzahl einzelner Reaktionsgefäße parallel nebeneinander zu Analysezwecken ver­ wendet werden können.
Im folgenden ist ein Ausführungsbeispiel eines Analyseverfahrens beschrieben:
In das Reaktionsgefäß wird eine Pufferlösung eingebracht, die bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 Kalium/Natriumphosphat mit einer Konzentration bis zu 100 mM sung werden bei Raumtemperatur typischerweise 102 bis 109 Zellen suspendiert, wobei zusätzlich DNA-affine Glasperlen in das Reaktionsgefäß eingebracht werden.
Das Reaktionsgefäß wird in einen kühl- und beheizbaren Becherresonator überge­ führt, in dem über eine Zeitspanne von 2 bis 10 Minuten hinweg, bei gleichbleibender Amplitude, Ultraschallwellen der Frequenz 10 bis 30 kH auf die Zellsuspension ein­ wirken. Durch den Energieeintrag der Ultraschallwellen in die Pufferlösung erwärmt sich die Zellsuspension typischerweise auf Temperaturen zwischen 60 und 90° C. Im Verlauf dieses Prozesses werden Nukleinsäuren aus dem Inneren der Zelle freige­ setzt, die an die DNA-affinen Glasperlen anbinden.
Die Glasperlen werden anschließend durch ein- bis dreimaliges Waschen mit 0,1 bis 1 ml eines Puffers, typischerweise bestehend aus Kalium/Natriumphosphat mit einer Konzentration bis zu 100 mM, Natriumchlorid mit einer Konzentration bis zu 3 M bei einem PH-Wert zwischen 5 und 8, von anhaftenden Verunreinigungen befreit. Mit Hilfe eines geeigneten Luftstromes werden die an den Glasperlen anhaftenden Nu­ kleinsäuren anschließend getrocknet.
Die trockenen, mit DNA-beladenen Glasperlen werden nachfolgend in einem Puffer suspendiert, der eine Polymerasekettenreaktion gestattet. Hierbei werden typischer­ weise PCR-Sonden verwendet, die zusätzlich ein Markermolekül, beispielsweise ei­ nen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff, enthalten. Der PCR-Prozeß wird durch alter­ nierendes Kühlen und Beheizen des Becherresonators durchgeführt. Während des PCR-Prozesses entstehen markierte Amplikons.
Der im Reaktionsgefäß vorhandene Überschuß an markierter PCR-Sonde wird bei­ spielsweise nach enzymatischer Hydrolyse mit Nuclease S1, durch Waschen ent­ fernt. Nachfolgend kann das Amplikon durch Anregung mit Licht geeigneter Wellen­ länge zur Fluoreszenz gebracht und mit einem handelsüblichen Detektor nachgewie­ sen werden. Die vorstehenden Verfahrensschritte werden erfindungsgemäß mit ei­ nem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt, in dem einmalig die zu untersuchende Zellenprobe eingebracht ist. Querkontaminationen werden hierbei ausgeschlossen.
Bezugszeichenliste
1
Reaktionsgefäß
2
Zellprobe
3
Pufferlösung
4
Makroskopische Partikel
5
Ultraschallenergie
6
Amplifizierungsreagenzien
7
Detektionsreagenzien
8
Lichtenergie
9
Becherresonator
10
Kühlmedium
11
Ultraschallschwinger
12
Trennvorrichtung
13
Septum
14
Probenvolumen
15
Zelle
16
DNA-affine Substanz
17
Ultraschallresonator
18
Nukleinsäure
19
Zellbruchstücke
20
Ablaßventil
21
Amplikone
22
Sichtfenster
23
Pipettierapparat
24
Steuereinheit
25
Wärmetauschereinheit

Claims (22)

1. Verfahren zur kombinierten Analyse von Zellinhalten, insbesondere den in biologischen Zellen enthaltenen Nukleinsäuren, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
  • - Befüllen eines Reaktionsgefäßes (1) mit in einer Pufferlösung (3) suspendier­ ten Zellen (2, 15),
  • - Zugabe makroskopischer Partikel (4), deren Oberfläche jeweils mit einem die Zellinhalte (18) anhaftenden Substrat (16) präpariert ist,
  • - Zellaufschluß und Isolierung der Zellinhalte (18) mittels Einbringen von Ultra­ schallenergie in die mit makroskopischen Partikeln (4) versetzte Pufferlösung (3) innerhalb des Reaktionsgefäßes (1),
  • - Abtrennen der, an den makroskopischen Partikeln (4) anhaftenden Zellinhalte (18) von der zum Aufschluß benötigten Pufferlösung (3) und Waschen der makroskopischen Partikel (4) nebst Zellinhalte (18) innerhalb des Reaktions­ gefäßes (1) mittels Waschflüssigkeit,
  • - Trocknen der makroskopischen Partikel nebst Zellinhalte innerhalb des Reak­ tionsgefäßes,
  • - Zugabe von Reagenzien (6, 7) zur Amplifikation und Detektion der Zellinhal­ te (18) mittels PCR-Prozeß.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als makroskopische Partikel (4) Glasperlen verwen­ detwerden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Glasperlen mit DNA-affinen Sub­ stanzen (16) vorbehandelt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung (3) Kalium- oder Natriumphosphat mit einer Konzentration bis zu 100 mM sowie Natriumchlorid mit einer Konzentration bis zu 3 M und einen pH-Wert zwischen 5-8 aufweist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Pufferlösung 102 bis 109Zellen suspendiert sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (1) an eine kühl- und beheizbare Ultraschallquelle (17) gekoppelt wird, die über eine Zeitspanne von 2-10 Min Ultra­ schallwellen mit Frequenzen zwischen 10 und 30 kHz in die Zellsuspension innerhalb des Reaktionsgefäßes (1) einkoppelt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (1) eine Trennvorrichtung (12) vorsieht, durch die die Partikel (4) nebst Zellinhalte (18) beim Abtrennen von der zum Aufschluß benötigten Pufferlösung (3) im Reaktionsgefäß (1) zurückgehalten wer­ den.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß beim Waschen Wasser als Waschflüssigkeit einge­ setzt wird, das die im Reaktionsgefäß (1) befindlichen an den Oberflächen der Parti­ kel (4) anhaftenden Zellinhalte (18) von Verunreinigungen befreit.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Waschflüssigkeit Kalium- oder Natriumphosphat mit einer Konzentration bis zu 100 mM und Natriumphosphat mit einer Konzentration bis zu 3 M bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 aufweist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Abtrennvorgang sowie die Entnahme der Wasch­ flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß (1) mittels Dekantieren oder Abpipettieren er­ folgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Waschvorgang ein bis dreimal durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die gewaschenen, DNA-behafteten makroskopischen Partikel (4) mittels eines Luftstromes getrocknet werden, der in das Reaktionsgefäß (1) gerichtet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur Amplifikation eine Pufferlösung verwendet wird, in der PCR-Sonden (PCR=Polymerasereaktion) enthalten sind, denen Markermoleküle beigemischt sind.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Markermoleküle Fluoreszenzfarbstoffe enthalten.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (1) während der Amplifikation abwechselnd gekühlt und erwärmt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß zur Detektion ein Fluoreszenzdetektor verwendet wird, dessen Licht in das Reaktionsgefäß (1) eingestrahlt wird.
17 Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (1) eine flüssigkeitsdurchlässige Trennvorrichtung (12) vorsieht, die die in das Reaktionsgefäß (1) eingebrachten ma­ kroskopischen Partikel (4) in einem Reaktionsvolumen (14) zurückhält,
daß das Reaktionsvolumen (14) wenigstens eine Öffnung aufweist, durch die das Reaktionsgefäß (1) befüllbar ist und
daß das Reaktionsvolumen (14) ein Sichtfenster (22) aufweist, durch das Licht in das Innere des Reaktionsvolumens von Außen einkoppelbar ist.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennvorrichtung (12) lösbar fest in das Reakti­ onsgefäß einbringbar ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennvorrichtung (12) ein Sieb, ein Filter oder ei­ ne Membran mit Membranöffnungen von bis zu 100 µm ist.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (1) ein einseitig offenes, aus Kunststoff gefertigtes Behältnis ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Einkopplung der Ultraschallenergie in das Innere des Reaktionsgefäßes (1) mittels einer in das Innere des Reaktionsgefäßes einführ­ baren Sonotrode (11) oder mittels eines am Außenumfang angeordneten Ultraschall­ schwingers (9) erfolgt.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultraschallenergie mittels eines Becherresonators (9) in das Innere des Reaktionsgefäßes einkoppelbar ist.
DE19801730A 1998-01-19 1998-01-19 Verfahren zur kombinierten Analyse von Zellinhalten, insbesondere den in biologischen Zellen enthaltenen Nukleinsäuren sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens Withdrawn DE19801730A1 (de)

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