DE19757984A1

DE19757984A1 - Regulatorische DNA-Sequenzen aus der 5'-Region vom Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit udn deren diagnostische und therapeutische Verwendung

Info

Publication number: DE19757984A1
Application number: DE1997157984
Authority: DE
Inventors: Gustav Dr Hagen; Maresa Dr Wick; Dmitry Dr Zubov
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 1999-07-01
Also published as: CA2316282A1; WO1999033998A3; AU742489B2; WO1999033998A2; JP2003519462A; AU2272999A; EP1040195A2

Description

Aufbau und Funktion der Chromosomenenden

Das genetische Material eukaryontischer Zellen ist auf linearen Chromosomen verteilt. Die Enden der Erbanlagen werden, abgeleitet von den griechischen Wörtern telos (Ende) und meros (Teil, Segment), als Telomere bezeichnet. Die meisten Telomere bestehen aus Wiederholungen von kurzen Sequenzen, die überwiegend aus Thymin und Guanin aufgebaut sind (Zakian, 1995). In allen bislang untersuchten Wirbeltieren werden die Telomere aus der Sequenz TTAGGG aufgebaut (Meyne et al., 1989).

Die Telomere üben verschiedene wichtige Funktionen aus. Sie verhindern die Fusion von Chromosomen (McClintock, 1941) und damit die Entstehung von dizentrischen Erbanlagen. Solche Chromosomen mit zwei Centromeren können durch Verlust der Heterozygotie bzw. Verdopplung oder Verlust von Genen zur Entwicklung von Krebs führen.

Des weiteren dienen Telomere dazu, intakte Erbanlagen von beschädigten zu unter scheiden. So stellten Hefezellen ihre Zellteilung ein, wenn sie ein Chromosom ohne Telomer enthielten (Sandell und Zakian, 1993).

Eine weitere wichtige Aufgabe erfüllen Telomere bei der DNA-Replikation eukaryon tischer Zellen. Im Gegensatz zu den zirkulären Genomen von Prokaryonten können die linearen Chromosomen der Eukaryonten von dem DNA Polymerase-Komplex nicht vollständig repliziert werden. Zur Initiation der DNA-Replikation sind RNA- Primer notwendig. Nach Abspaltung der RNA-Primer, Verlängerung der Okazaki- Fragmente und anschließender Ligation fehlt dem neu-synthetisierten DNA-Strang das 5'-Ende, denn dort kann der RNA-Primer nicht durch DNA ersetzt werden. Ohne besondere Schutzmechanismen würden daher die Chromosomen mit jeder Zellteilung schrumpfen ("end-replication problem"; Harley et al., 1990). Die nicht-kodierenden Telomersequenzen stellen vermutlich eine Pufferzone dar, um dem Verlust von Genen vorzubeugen (Sandell und Zakian, 1993).

Darüber hinaus spielen Telomere auch eine wichtige Rolle bei der Regulation der zel lulären Alterung (Olovnikov, 1973). Humane somatische Zellen zeigen in Kultur eine limitierte Replikationskapazität; sie werden nach einer gewissen Zeit seneszent. In diesem Zustand teilen sich die Zellen selbst nach Stimulierung mit Wachstumsfaktoren nicht mehr, sterben aber nicht, sondern bleiben metabolisch aktiv (Goldstein, 1990). Verschiedene Beobachtungen sprechen für die Hypothese, daß eine Zelle anhand der Länge ihrer Telomere bestimmt, wie oft sie sich noch teilen kann (Allsopp et al., 1992).

Zusammenfassend besitzen die Telomere somit zentrale Funktionen bei der Alterung von Zellen sowie der Stabilisierung des genetischen Materials und Verhinderung von Krebs.

Das Enzym Telomerase synthetisiert die Telomere

Wie oben beschrieben können Organismen mit linearen Chromosomen ohne einen speziellen Schutzmechanismus ihr Genom nur unvollständig replizieren. Die meisten Eukaryonten verwenden zur Regeneration der Telomersequenzen ein spezielles En zym, die Telomerase. In den bislang untersuchten Einzellern wird Telomerase konsti tutiv exprimiert. Dagegen wurde in Menschen die Telomerase-Aktivität nur in Keim zellen und Tumorzellen gemessen, wogegen benachbartes somatisches Gewebe keine Telomerase enthielt (Kim et al., 1994).

Funktionell kann die Telomerase auch als terminale Telomertransferase bezeichnet werden, die als Multiproteinkomplex im Zellkern lokalisiert ist. Während der RNA- Anteil der humanen Telomerase schon seit längerem bekannt ist (Feng et al., 1995), wurde kürzlich die katalytische Untereinheit dieser Enzymgruppe in verschiedenen Organismen identifiziert (Lingner et al., 1997; vgl. unsere Anmeldung DE-Akz. 19726329.1). Diese katalytischen Untereinheiten der Telomerase sind sowohl untereinander als auch zu bisher allen bekannten reversen Transkriptasen auffällig homolog.

Aktivierung der Telomerase in menschlichen Tumoren

Eine Aktivität der Telomerase konnte in Menschen ursprünglich nur in Keimbahnzel len, nicht aber in normalen somatischen Zellen (Hastie et al., 1990; Kim et al., 1994) nachgewiesen werden. Nach der Entwicklung eines sensitiveren Nachweisverfahrens (Kim et al., 1994) wurde auch in hematopoietischen Zellen eine geringe Telomerase aktivität detektiert (Broccoli et al., 1995; Counter et al., 1995; Hiyama et al., 1995). Allerdings wiesen diese Zellen trotzdem eine Reduktion der Telomere auf (Vaziri et al., 1994; Counter et al., 1995). Noch ist nicht geklärt, ob die Menge an Enzym in diesen Zellen nicht ausreichend für eine Kompensation des Telomerverlustes ist, oder ob die gemessene Telomerase-Aktivität von einer Subpopulation, z. B. unvollständig ausdifferenzierten CD34⁺38⁺-Vorläuferzellen, herrührt (Hiyama et al., 1995). Zur Klärung wäre ein Nachweis der Telomerase-Aktivität in einer einzelnen Zelle nötig.

Interessanterweise wurde jedoch in einer großen Zahl der bislang getesteten Tumor gewebe eine signifikante Telomerase-Aktivität nachgewiesen (1734/2031, 85%; Shay, 1997), während in normalem somatischen Gewebe keine Aktivität gefunden wurde (1/196, <1%, Shay, 1997). Verschiedene Untersuchungen zeigten außerdem, daß in seneszenten Zellen, die mit viralen Oncoproteinen transformiert wurden, die Telomere weiterhin schrumpften und Telomerase nur in der Subpopulation entdeckt werden konnte, die die Wachstumskrise überlebte (Counter et al., 1992). In diesen immortali sierten Zellen waren auch die Telomere stabil (Counter et al., 1992). Ähnliche Befunde aus Untersuchungen an Mäusen (Blasco et al., 1996) stützen die Annahme, daß eine Reaktivierung der Telomerase ein spätes Ereignis in der Tumorgenese ist.

Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine "Telomerase-Hypothese" entwickelt, die den Verlust von Telomersequenzen und Zellalterung mit der Aktivität von Telomerase und der Entstehung von Krebs verbindet. In langlebigen Spezies wie dem Menschen kann das Schrumpfen der Telomere als ein Mechanismus zur Tumorsuppression ange sehen werden. Ausdifferenzierte Zellen, die keine Telomerase enthalten, stellen bei einer bestimmten Länge der Telomere ihre Zellteilung ein. Mutiert eine solche Zelle, so kann aus ihr nur dann ein Tumor entstehen, wenn die Zelle ihre Telomere verlän gern kann. Ansonsten würde die Zelle weiterhin Telomersequenzen verlieren, bis ihre Chromosomen instabil werden und sie schließlich zugrunde geht. Die Reaktivierung der Telomerase ist vermutlich der Hauptmechanismus von Tumorzellen zur Stabilisation ihrer Telomere.

Aus diesen Beobachtungen und Überlegungen ergibt sich, daß eine Inhibition der Te lomerase eine Therapie von Tumoren erlauben sollte. Konventionelle Krebstherapien mit Zytostatika oder kurzwelligen Strahlen schädigen nicht nur die Tumorzellen, son dern alle sich teilenden Zellen des Körpers. Da aber außer Tumorzellen nur Keim bahnzellen eine signifikante Telomerase-Aktivität enthalten, würden Telomerase-In hibitoren spezifischer die Tumorzellen angreifen und somit weniger unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen. In allen bislang getesteten Tumorgeweben wurde eine Telomerase-Aktivität nachgewiesen, so daß diese Therapeutika gegen alle Krebsarten eingesetzt werden könnten. Die Wirkung von Telomerase-Inhibitoren würde dann eintreten, wenn die Telomere der Zellen sich soweit verkürzt haben, daß das Genom instabil wird. Da Tumorzellen meist kürzere Telomere aufweisen als normale somati sche Zellen, würden zuerst Krebszellen durch Telomerase-Inhibitoren eliminiert wer den. Zellen mit langen Telomeren, wie die Keimzellen, würden dagegen erst viel spä ter geschädigt werden. Telomerase-Inhibitoren stellen somit einen zukunftsweisenden Weg für die Therapierung von Krebs dar.

Eindeutige Antworten auf die Frage nach der Art und den Angriffspunkten physiolo gischer Telomerase-Inhibitoren werden möglich sein, wenn auch die Regulation der Genexpression der Telomerase identifiziert ist.

Regulation der Genexpression in Eukaryonten

Die eukaryotische Genexpression, d. h. der zelluläre Informationsfluß von der DNA über die RNA zum Protein, weist vielfältige Ansatzpunkte für regulatorische Mecha nismen auf. Einzelne Kontrollstufen sind z. B. die Gen-Amplifikation, Rekombination von Genloci, Chromatinstruktur, DNA-Methylierung, Transkription, posttranskrip tionelle mRNA-Modifikationen, mRNA-Transport, Translation und post-translatio nale Proteinmodifikationen. Nach bisherigen Studien besitzt die Kontrolle auf der Ebene der Transkriptionsinitiation die größte Bedeutung (Latchnian, 1991).

Unmittelbar stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines von der RNA-Polymerase II transkribierten Gens liegt eine Region, die für die Steuerung der Transkription ver antwortlich ist und als Promotorregion bezeichnet wird. Ein Vergleich der Nukleo tidsequenzen von Promotorregionen vieler bekannter Gene zeigt, daß bestimmte Sequenzmotive in dieser Region häufig vorkommen. Zu diesen Elementen gehören unter anderem die TATA-Box, die CCAAT-Box und die GC-Box, die von spezifi schen Proteinen erkannt werden. Die TATA-Box, die etwa 30 Nukleotide stromauf wärts vom Transkriptionsstart entfernt positioniert ist, wird z. B. von der TFIID- Untereinheit TBP ("TATA-box binding protein") erkannt, wogegen bestimmte GC-reiche Sequenzabschnitte vom Transkriptionsfaktor Sp1 ("specificity protein1") spe zifisch gebunden werden.

Funktionell kann man den Promotor in einen regulativen und einen konstitutiven Ab schnitt unterteilen (Latchman, 1991). Der konstitutive Kontrollbereich umfaßt den sogenannten Kernpromotor ("corepromoter"), der die korrekte Initiation der Trans kription ermöglicht. Er enthält die als UPE's (upstream promoter elements") beschrie benen Sequenzelemente, die für eine effiziente Transkription notwendig sind. Die regulativen Kontrollabschnitte, die mit den UPE's verflochten sein können, weisen Sequenzelemente auf, die an der signalabhängigen Regulation der Transkription durch Hormone, Wachstumsfaktoren usw. beteiligt sein können. Sie vermitteln gewebs- oder zellspezifische Promotoreigenschaften.

Ein charakteristisches Merkmal eukaryotischer Gene sind DNA-Abschnitte, die über vergleichsweise große Distanzen hinweg Einfluß auf die Genexpression nehmen kön nen. Diese Elemente können stromaufwärts, stromabwärts oder innerhalb einer Transkriptionseinheit lokalisiert sein und unabhängig von ihrer Orientierung ihre Funktion wahrnehmen. Diese Sequenzabschnitte können die Promotoraktivität ver stärken (Enhancer) oder ab schwächen (Silencer). Ähnlich wie die Promotorregionen beherbergen auch Enhancer und Silencer mehrere Bindungsstellen für Transkriptions faktoren.

Die Erfindung betrifft die DNA-Sequenzen aus der 5'-flankierenden Region des Gens der katalytisch aktiven humanen Telomerase-Untereinheit.

Die Erfindung betrifft weiterhin die 5'-flankierende regulatorische DNA-Sequenz, enthaltend die Promotor-DNA-Sequenz für das Gen der humanen katalytischen Telomerase Untereinheit gemäß Fig. 4.

Die Erfindung betrifft weiterhin regulatorisch wirksame Teilbereiche der 5'-flankie renden regulatorischen DNA-Sequenz gemäß Fig. 4.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes Konstrukt, das die 5'-flankierende DNA-Sequenz des Gens der humanen katalytischen Telomerase Untereinheit oder Teilbereiche davon beinhaltet.

Bevorzugt sind rekombinante Konstrukte, die neben der 5'-flankierenden DNA- Sequenz des Gens der humanen katalytischen Telomerase Untereinheit oder Teilberei chen davon eine oder mehrere weitere DNA-Sequenzen, die für Polypeptide oder Pro teine kodieren, enthalten.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodieren diese weiteren DNA- Sequenzen für antitumorale Proteine.

Besonders bevorzugte antitumorale Proteine sind solche, die die Angiogenese direkt oder indirekt inhibieren. Zu diesen Proteinen zählen beispielsweise:
Plasminogenaktivatorinhibitor (PAI-1), PAI-2, PM-3, Angiostatin, Endostatin, Platelet factor 4, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, Leukemia Inhibitory Factor (LIF).

Ebenfalls besonders bevorzugt sind antitumorale Proteine, welche direkt oder indirekt eine zytostatische Wirkung auf Tumoren aufweisen. Hierzu zählen im besonderen:
Perforin, Granzym, IL-2, IL-4, IL-12, Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF, TNF-α, TNF-β, Oncostatin M; Tumorsuppressorgene, wie z. B. p53, Retinoblastoma.

Weiterhin besonders bevorzugt sind antitumorale Proteine, welche gegebenenfalls zusätzlich zur antitumoralen Wirkung Entzündungen stimulieren und hierdurch zur Elimination von Tumorzellen beitragen. Hierzu zählen beispielsweise:
RANTES, Monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), IL-8, Macrophage inflammatory protein (MIP-1α, -β), Neutrophil activating protein-2 (NAP-2), IL-3, IL-5, human leukemia inhibitory factor (LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF.

Weiterhin besonders bevorzugt sind antitumorale Proteine, welche aufgrund ihrer Wirkung als Enzyme in der Lage sind, Vorstufen eines antitumoralen Wirkstoffes in einen antitumoralen Wirkstoff zu überführen. Zu diesen Enzymen zählen beispiels weise:
Herpes Simplex Virus Thymidinkinase, Varizella Zoster Virus Thymidinkinase, bak terielle Nitroreductase, bakterielle β-Glukuronidase, pflanzliche β-Glukuronidase aus Secale careale, humane Glukuronidase, humane Carboxypeptidase, bakterielle Car boxypeptidase, bakterielle β-Lactamase, bakterielle Cytosindeaminidase, humane Katalase bzw. Phosphatase, humane alkalische Phosphatase, Typ 5 saure Phosphatase, humane Lysooxidase, humane saure D-Aminooxidase, humane Glutathion Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase, humane Schilddrüsen Peroxidase.

Die obengenannten rekombinanten Konstrukte können auch DNA-Sequenzen enthal ten, die für ein Reporterprotein kodieren. Zu diesen Reporterproteinen zählen bei spielsweise:
Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Glühwürmchen Luziferase (LUC), β-Galak tosidase (β-Gal), Sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP), Humanes Wachstums hormon (hGH), β-Glukuronidase (GUS), Grün-fluoreszierendes Protein (GFP) und alle davon abgeleiteten Varianten, Aquarin, Obelin.

Die rekombinanten Konstrukte können neben der DNA, kodierend für die humane katalytische Telomerase Untereinheit, sowie deren Varianten und Fragmente auch andere Protein-Untereinheiten der humanen Telomerase und die Telomerase-RNA- Komponente enthalten.

Erfindungsgemäße rekombinante Konstrukte können auch DNA kodierend für die humane katalytische Telomerase Untereinheit und deren Varianten und Fragmente in antisense Orientierung enthalten. Gegebenenfalls können diese Konstrukte auch andere Protein-Untereinheiten der humanen Telomerase und die Telomerase-RNA- Komponente in antisense Orientierung enthalten.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, enthaltend die oben genannten 5'-flan kierenden DNA-Sequenzen, sowie eine oder mehrere der oben genannten DNA- Sequenzen.

Bevorzugter Vektor für solche Konstrukte ist ein Virus, beispielsweise ein Retrovirus, Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus, Herpes Simplex Virus, Vaccina Virus, len tivirales Virus, Sindbis Virus und ein Semliki Forest Virus.

Ebenfalls bevorzugt sind Plasmide als Vektoren.

Pharmazeutische Präparate, enthaltend erfindungsgemäße rekombinante Konstrukte bzw. Vektoren; beispielsweise eine Zubereitung in einem kolloidalen Dispersions system.

Geeignete kolloidale Dispersionssysteme sind beispielsweise Liposome oder Polyly sin-Liganden.

Die Zubereitungen der erfindungsgemäßen Konstrukte bzw. Vektoren in kolloidalen Dispersionssystemen können um einen Liganden ergänzt sein, der an Membranstruk turen von Tumorzellen bindet. Ein solcher Ligand kann z. B. an das Konstrukt bzw. den Vektor angeknüpft sein oder auch Bestandteil der Liposomenstruktur sein.

Geeignete Liganden sind insbesondere polyklonale oder monoklonale Antikörper oder Antikörperfragmente hiervon, die mit ihren variablen Domänen an Membranstruktu ren von Tumorzellen binden, oder endständige Mannose-tragende Substanzen, Zyto kine, Wachstumsfaktoren oder Fragmente bzw. Teilsequenzen hiervon, die an Rezep toren auf Tumorzellen binden.

Entsprechende Membranstrukturen sind beispielsweise Rezeptoren für ein Zytokin oder einen Wachstumsfaktor, wie z. B. IL-1, EGF, PDGF, VEGF, TGF β, Insulin oder Insulin-like Growth Factor (ILGF), oder Adhäsionsmoleküle, wie z. B. SLeX, LFA-1, MAC-1, LECAM-1 oder VLA-4, oder der Mannose-6-Phosphat-Rezeptor.

Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten auch nichttoxische, inerte, pharmazeutisch geeignete Trägerstoffe enthalten können. Vorstellbar sind die Applikation (z. B. intra venös, intraarteriell, intramuskulär, subkutan, intradermal, anal, vaginal, nasal, trans dermal, intraperitonal, als Aerosol oder oral) am Ort eines Tumors oder die syste mische Applikation dieser Zubereitungen.

Die erfindungsgemäßen Vektorkonstrukte können in der Gentherapie eingesetzt wer den.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine rekombinante Wirtszelle, insbesondere eine rekombinante eukaryotische Wirtszelle, enthaltend die vorstehend beschriebenen Kon strukte bzw. Vektoren.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Promotor-, Silencer- oder Enhanceraktivität der katalytischen Telomerase Unter einheit beeinflussen, wobei diese Methode beihaltet:

A. Zugabe einer Kandidatensubstanz zu einer Wirtszelle, enthaltend die 5'-flankie rende regulatorische DNA-Sequenz für das Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit oder einen regulatorisch wirksamen Teilbereich davon, funktionell verknüpft mit einem Reportergen,
B. Messung des Substanzeffektes auf die Reportergenexpression.

Das Verfahren kann eingesetzt werden zur Identifizierung von Substanzen, die die Promotor-, Silencer- oder Enhanceraktivität der katalytischen Telomerase Unterein heit verstärken.

Das Verfahren kann weiterhin eingesetzt werden zur Identifizierung von Substanzen, die die Promotor-, Silencer- oder Enhanceraktivität der katalytischen Telomerase Untereinheit inhibieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von Faktoren, die spezifisch an Fragmente der 5'-flankierenden regulatorischen DNA-Sequenz der kata lytischen Telomerase Untereinheit binden. Diese Methode beinhaltet ein Screening einer Expressions-cDNA-Bibliothek mit der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilfragmenten unterschiedlichster Länge als Sonde.

Die vorstehend beschriebenen Konstrukte bzw. Vektoren können auch zur Her stellung transgener Tiere verwendet werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Detektion Telomerase-assoziierter Zustände in einem Patienten, das folgende Schritte umfaßt:

A. Inkubation eines Konstruktes bzw. Vektors, enthaltend die 5'-flankierende regulatorische DNA-Sequenz für das Gen der humanen katalytischen Telo merase-Untereinheit oder einen regulatorisch wirksamen Teilbereich davon sowie ein Reportergen mit Körperflüssigkeiten oder zellulären Proben,
B. Detektion der Reportergenaktivität, um einen diagnostischen Wert zu erhalten;
C. Vergleich des diagnostischen Werts mit Standardwerten für das Reportergen konstrukt in standardisierten normalen Zellen oder Körperflüssigkeiten des gleichen Typs wie die Testprobe;
D. Detektion diagnostischer Werte, die höher oder niedriger als Standardvergleichswerte liegen, indiziert einen Telomerase-assoziierten Zustand, der wiederum einen pathoge nen Zustand indiziert.

Erläuterung der Abbildungen

Fig. 1: Southern Blot-Analyse mit genomischer DNA verschiedener Spezies,

Abb. 1: Foto eines Ethidiumbromid gefärbten 0,7%igen Agarosegels mit etwa 4 µg Eco RI geschnittener genomischer DNA. Die Spur 1 enthält Hind III geschnittene λ-DNA als Größenmarker (23,5, 9,4, 6,7, 4,4, 2,3, 2,0, und 0,6 kb). Die Spuren 2 bis 10 enthalten genomische DNA von Mensch, Rhesusaffe, Spraque Dawley Ratte, BALB/c Maus, Hund, Rind, Kaninchen, Huhn und Hefe (Saccharomyces cerevisiae).

Abb. 2: Zu Fig. 1, Abb. 1 korrespondierendes Autoradiogramm einer Southern- Blot-Analyse, hybridisiert mit einer radioaktiv-markierten 1233 bp langen hTC-cDNA Sonde.

Fig. 2: Restriktionsanalyse der rekombinanten B-DNA des Phagenklons, der mit einer Sonde aus dem 5'-Bereich der hTC-cDNA hybridisiert.

Die Abbildung zeigt ein Foto eines Ethidiumbromid gefärbten 0,4%igen Agarosegels. Die Spuren 1 und 2 enthalten Eco RI/Hind III geschnittene λ- DNA bzw. eine 1 kb Leiter der Firma Gibco als Größenmarker. Die Spuren 3-7 enthalten 250 ng mit Bam HI (Spur 3), Eco RI (Spur 4), Sal I (Spur 5), Xho I (Spur 6) und Sac I (Spur 7) geschnittene DNA des rekombinanten Phagens. Die Pfeile kennzeichnen die zwei λ-Arme des Vektors EMBL3 Sp6/T7.

Fig. 3: Restriktionsanalyse und Southern Blot-Analyse der rekombinanten B-DNA des Phagenklons, der mit einer Sonde aus dem 5'-Bereich der hTC-cDNA hybri disiert.

Abb. 1: Die Abbildung zeigt ein Foto eines Ethidiumbromid gefärbten 0,8%igen Agarosegels. Die Spuren 1 und 15 enthalten eine 1 kb Leiter der Firma Gibco als Größenmarker. Die Spuren 2 bis 14 enthalten 250 ng geschnittene λ-DNA vom rekombinanten Phagenklon. Als Enzyme wurden eingesetzt: Spur 2: Sac I, Spur 3: Xho I, Spur 4: Xho I, Xba I, Spur 5: Sac I, Xho I, Spur 6: Sal I, Xho I, Xba I, Spur 7: Sac I, Xho I, Xba I, Spur 8: Sac I, Sal I, Xba I, Spur 9: Sac I, Sal I, BamH I, Spur 10: Sac I, Sal I, Xho I, Spur 11: Not I, Spur 12: Sma I, Spur 13: leer, Spur 14: nicht verdaut.

Abb. 2: Zu Fig. 3, Abb. 1 korrespondierendes Autoradiogramm einer Southern- Blot-Analyse. Als Sonde für die Hybridisierung wurde ein 434 bp langes 5'-hTC-cDNA Fragment eingesetzt.

Fig. 4: DNA-Sequenz der 5'-flankierenden Region und des Promotors vom Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit. Das ATG-Startcodon ist in der Sequenz fett hervorgehoben.

Fig. 5: Identifizierung des Transkriptionsstarts durch Primer Extension-Analyse.

Die Abbildung zeigt ein Autoradiogramm eines denaturierenden Polyacryl amidgels, welches zur Darstellung einer Primer Extension-Analyse gewählt wurde. Als Primer wurde ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5'GTTAAGTTGTAGCTTACACTGGTTCTC 3' benutzt. In der Spur 1 wurde die Primer Extension Reaktion aufgetragen. Die Spuren G, A, T, C, stellen die Sequenzreaktionen mit dem gleichen Primer und den entsprechen den Dideoxynukleotiden dar. Der fette Pfeil kennzeichnet den Haupt-Trans kriptionsstart, die dünnen Pfeile weisen auf drei Neben-Transkriptionsstart punkte hin.

Beispiele

Die 5'-flankierende Sequenz des menschlichen Gens für die katalytische Telomerase Untereinheit (ghTC) wurde kloniert, der Startpunkt der Transkription bestimmt und potentielle Bindungsstellen für DNA-bindende Proteine identifiziert.

Beispiel 1

Durch eine genomische Southern Blot-Analyse wurde bestimmt, ob ghTC im mensch lichen Genom ein Einzelgen darstellt oder mehrere Loci für das hTC-Gen bzw. even tuell auch ghTC-Pseudogene existieren.

Hierzu wurde ein kommerziell erhältlicher Zoo-Blot der Firma Clontech einer Southern Blot-Analyse unterzogen. Dieser Blot enthält 4 µg Eco RI geschnittene genomische DNA von neun verschiedenen Spezies (Mensch, Affe, Ratte, Maus, Hund, Rind, Kaninchen, Huhn und Hefe). Mit Ausnahme von Hefe, Huhn und Mensch wurde die DNA aus Nierengewebe isoliert. Die humane genomische DNA wurde aus Plazenta isoliert und die genomische DNA aus Huhn wurde aus Leberge webe aufgereinigt. Im Autoradiogramm in Fig. 1 wurde als radioaktiv-markierte Sonde ein 1233 bp langes hTC-cDNA Fragment eingesetzt. Die experimentellen Bedingungen für die Hybridisierung und die Waschschritte des Blots erfolgten in Anlehnung an Ausubel et al. (1987).

Im Fall der humanen DNA erkennt die Sonde zwei spezifische DNA-Fragmente. Das kleinere, etwa 1,5 bis 1,8 kb lange Eco RI-Fragment geht wahrscheinlich auf zwei Eco RI-Schnittstellen in einem Intron der ghTC-DNA zurück. Aufgrund dieses Ergebnisses ist davon auszugehen, daß nur ein singuläres ghTC-Gen im menschlichen Genom vorliegt.

Beispiel 2

Zur Isolierung der 5'flankierenden hTC-Gensequenz wurden ca. 1,5 × 10⁶ Phagen einer humanen genomischen Plazenta-Genbibliothek mit einem radioaktiv markierten, 506 bp langen 5'-hTC-cDNA Fragment hybridisiert. Die experimentellen Bedingun gen für Hybridisierung und Waschen der Filter erfolgten in Anlehnung an Ausubel et al. (1987).

Die in dieser Primäruntersuchung identifizierten Phagenklone wurden aufgereinigt. In weitergehenden Analysen stellte sich ein Phagenklon als potentiell positiv heraus. Eine λ-DNA Präparation dieses Phagens und der nachfolgende Restriktionsverdau mit Enzymen, die das genomische Insert in Fragmenten freisetzen, zeigte, daß dieser Pha genklon ein ca. 15 kb Insert im Vektor enthält (Fig. 2).

Beispiel 3

Um zu untersuchen, ob auch das 5'-Ende der hTC-cDNA im Insert des rekombinan ten Phagenklons vorliegt, wurde λ-DNA des positiven Klons in einer Southern Blot Analyse mit einem radioaktiv markierten 434 bp langen hTC-cDNA Fragment aus dem extremen 5'-Bereich hybridisiert (Fig. 3).

Da die isolierte λ-DNA des positiven Klons auch mit dem extremen 5'-Ende der hTC-cDNA hybridisiert, enthält dieser Phage wahrscheinlich auch den das ATG-Startco don flankierenden 5'-Sequenzbereich.

Beispiel 4

Um das gesamte 15 kb lange Insert des positiven Phagenklons in Teilfragmenten um zuklonieren und anschließend zu sequenzieren, wurden zum DNA-Verdau Restrik tionsendonukleasen ausgewählt, die zum einem das gesamte Insert aus EMBL3 Sp3/T7 freisetzen (vgl. Beispiel 2) und zusätzlich im Insert schneiden.

Insgesamt wurden ein etwa 8,3 und ein etwa 6,5 kb langes Xho 1-Subfragment sowie ein etwa 8,5, ein etwa 3,5 und ein etwa 3 kb langes Sac I-Teilfragment in den Vektor pBluescript umkloniert.

Durch Sequenzanalyse dieser Fragmente wurde die Nukleotidsequenz von 6123 bp 5'-flankierenden des ghTC-Genbereichs, ausgehend vom ATG-Startcodon bestimmt (Fig. 4).

Beispiel 5

Um den oder die Startpunkt(e) der Transkriptionsinitiation zu ermitteln, wurde das 5'- Ende der hTC-mRNA durch Primer-Extension-Analyse (Ausubel et al., 1987) bestimmt. Hierzu wurden 2 µg PolyA⁺-RNA aus HL-60-Zellen mit 5 pmol radioaktiv markiertem Primer inkubiert und anschließend eine Reverse Transkriptase Reaktion durchgeführt. Das Produkt der Primerverlängerung wurde nach Aufarbeitung gelelek trophoretisch aufgetrennt und im Autoradiogramm dargestellt (Fig. 5).

Hierbei wurde eine Haupt-Transkriptionsstartstelle identifiziert, die 1767 bp 5' vom ATG-Startcodon der hTC-cDNA Sequenz lokalisiert ist (Nukleotidposition 3346 in Fig. 4). Die Nukleotidsequenz um diesen Haupttranskriptionsstart (TTA₊₁TTGT) repräsentiert darüber hinaus ein Initiator-Element (Inr), das in 6 von 7 Nukleotiden mit dem Konsensusmotiv (PyPyA₊₁Na/tPyPy) (Smale, 1997) eines Initiator-Elementes übereinstimmt.

In unmittelbarer Nähe des experimentell identifizierten Haupt-Transkriptionsstartes konnte keine eindeutige TATA-Box identifiziert werden, so daß der hTC-Promoter wahrscheinlich in die Familie der TATA-losen Promotoren (Smale, 1997) einzuordnen ist. Allerdings wurde durch bioinformatorische Analysen eine potentielle TATA-Box von Nukleotidposition 1306 bis 1311 gefunden. Die zusätzlich um den Haupt-Trans kriptionsstart beobachteten Neben-Transkriptionsstarts wurden auch bei anderen TATA-losen Promotoren beschrieben (Geng and Johnson, 1993), wie z. B. in den stark regulierten Promotoren einiger Zellzyklusgene (Wick et al., 1995).

Literaturvereichnis

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Claims

1. 5'-flankierende regulatorische DNA-Sequenz für das Gen der humanen kataly tischen Telomerase-Untereinheit gemäß Fig. 4 sowie regulatorisch wirksame Fragmente dieser DNA-Sequenz.

2. Rekombinantes Konstrukt, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1.

3. Rekombinantes Konstrukt gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die für Polypeptide oder Proteine kodieren.

4. Rekombinantes Konstrukt gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz enthält, die für ein antitumerales Protein kodiert.

5. Rekombinantes Konstrukt gemäß Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die für ein Reporterprotein kodieren.

6. Vektor, enthaltend ein rekombinantes Konstrukt gemäß Ansprüchen 2 bis 5.

7. Vektor gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Virus ist.

8. Vektor gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid ist.

9. Verwendung von rekombinanten Konstrukten bzw. Vektoren gemäß Ansprü chen 2 bis 8 zur Herstellung von Arzneimitteln.

10. Rekombinante Wirtszellen, enthaltend rekombinante Konstrukte bzw. Vektoren gemäß Ansprüchen 2 bis 8.

11. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Promotor-, Silencer- oder Enhanceraktivität der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit beeinflussen, das folgende Schritte umfaßt:

A. Zugabe einer Kandidatensubstanz zu einer Wirtszelle, enthaltend DNA- Sequenzen gemäß Anspruch 1, funktionell verknüpft mit einem Repor tergen,
B. Messung des Substanzeffektes auf die Reportergenexpression.

12. Verfahren zur Identifizierung von Faktoren, die spezifisch an die DNA gemäß Anspruch 1 oder an Fragmente davon binden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Expressions-cDNA-Bibliothek mit einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder Teilfragmenten unterschiedlichster Länge als Sonde screent.

13. Transgene Tiere, enthaltend rekombinante Konstrukte bzw. Vektoren gemäß Ansprüchen 2 bis 8.

14. Verfahren zur Detektion Telomerase-assoziierter Zustände in einem Patienten, das folgende Schritte umfaßt:

A. Inkubation eines rekombinanten Konstruktes bzw. Vektors gemäß Ansprüchen 5 bis 8 mit Körperflüssigkeiten oder zellulären Proben,
B. Detektion der Reportergenaktivität, um einen diagnostischen Wert zu erhalten,
C. Vergleich des diagnostischen Wertes mit Standardwerten für das Reportergenkonstrukt in standardisierten normalen Zellen oder Körperflüssigkeiten des gleichen Typs wie die Testprobe.