DE19749277C2 - Peptide of the sequence NH¶2¶-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH and its use - Google Patents
Peptide of the sequence NH¶2¶-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH and its useInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Peptid NH2-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH und seine Verwendung zum Abtrennen von Albumin aus biologischen Flüssigkeiten gemäß den Patentansprüchen.The invention relates to a peptide NH 2 -Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH and its use for separating albumin from biological liquids according to the patent claims.
Zum Abtrennen von Albumin aus wäßrigen Lösungen, insbesondere aus biologi schen Flüssigkeiten, sind folgende Verfahren bekannt: Fällung der Nicht-albumin proteine durch Ethanol und nachfolgende isoelektrische Präzipitation des Albumins (Hao Y, Vox Sang 36, 1979, 313), Ionenaustauschchromatographie (König, BW, et al., EP 0 319 067 [Bsp. 1], Trujillo, LE et al., Biotechniques 9, 1990, 620; Nochumson, S., Biotechniques 12, 1992, 436) und Affinitätschromatographie unter Einsatz von Farbstoffen (Angal, S., und Dean, PD, Biochem. J., 176, 1977, 301; McCreath, GE et al., J. Chromatogr. 597, 1992, 189), Concanavalin A (Ikehara, Y., et al., J. Biochem. Tokyo 81, 1977, 1293), Fettsäuren (Peters, T., J. Biol. Chem. 248, 1973, 2447) oder anderen lipophilen Liganden (Wichmann, A. Und Anderson, LO, Biochim. Biophys. Acta 372, 1974, 218, König, BW. Et al., EP 0 319 067 A1) sowie Antikörpern gegen Albumin (Schlipfenbacher R. Et al., EP 0 657 420 A2 [Bsp. 1], Mannuk, M., und Person RE, Rheumatolog. Int. 13, 1993, 121). Diese Verfahren sind zur Albuminentfernung aus Lösungen der beschriebenen Art geeignet, jedoch weisen sie einige Nachteile auf.For separating albumin from aqueous solutions, especially from biological fluids, the following methods are known: precipitation of the non-albumin proteins by ethanol and subsequent isoelectric precipitation of the albumin (Hao Y, Vox Sang 36, 1979, 313), ion exchange chromatography (König, BW, et al., EP 0 319 067 [Ex. 1], Trujillo, LE et al., Biotechniques 9, 1990, 620; Nochumson, S., Biotechniques 12, 1992, 436) and affinity chromatography below Use of dyes (Angal, S., and Dean, PD, Biochem. J., 176, 1977, 301; McCreath, GE et al., J. Chromatogr. 597, 1992, 189), Concanavalin A (Ikehara, Y., et al., J. Biochem. Tokyo 81, 1977, 1293), fatty acids (Peters, T., J. Biol. Chem. 248, 1973, 2447) or other lipophilic ligands (Wichmann, A. And Anderson, LO, Biochim. Biophys. Acta 372, 1974, 218, King, BW. Et al., EP 0 319 067 A1) and antibodies against albumin (Schlipfenbacher R. Et al., EP 0 657 420 A2 [Ex. 1], Mannuk, M., and Person RE, Rheumatolog. Int. 13, 1993, 121). This procedure are suitable for removing albumin from solutions of the type described, however they have some disadvantages.
Die Fällungsmethoden liefern Albumin unbefriedigenden Reinheitsgrades.The precipitation methods give albumin an unsatisfactory degree of purity.
Die Ionenaustauschchromatographie ist als Methode zum Abtrennen von Albumin unspezifisch und erfordert in ihrer Anwendung und Durchführung einen hohen Zeit aufwand. Die zu geringe Spezifität ist darin begründet, daß die elektrischen Ladun gen des Albumins und weiterer Gemischkomponenten ähnlich sind, diese deshalb im Chromatographieprozeß nicht differenziert werden können. Der hohe Zeitauf wand erklärt sich aus der methodisch notwendigen Arbeitsweise. Es ist erforderlich, die Lösung in Fraktionen zu trennen, den Albumingehalt in den Fraktionen zu be stimmen und die albuminfreien Fraktionen wieder zu vereinigen. Dabei ist die Peak identifikation mühsam und aufwendig, auch zeitaufwendig.Ion exchange chromatography is a method of separating albumin unspecific and takes a long time to use and implement expenditure. The insufficient specificity is due to the fact that the electrical charge genes of the albumine and other mixture components are similar, these therefore cannot be differentiated in the chromatography process. The high time wand is explained by the methodologically necessary way of working. It is necessary, to separate the solution into fractions, to keep the albumin content in the fractions agree and reunite the albumin-free fractions. Here is the peak identification laborious and time-consuming.
Ein weiterer Nachteil der Ionenaustauschchromatographie ist darin zu sehen, daß die Arbeitsweise notwendig zu einer Instabilität der Analysenlösung führt. Die Ursa che liegt in der notwendigen Pufferzuführung und der dadurch bedingten Ionen gradientenänderung. Diese muß aber während des Trennprozesses kompensiert werden. Das erfolgt durch Einbringen weiterer Fremdstoffe in die Lösung, was zwangsläufig zur Instabilität derselben führt.Another disadvantage of ion exchange chromatography is that the way of working necessarily leads to instability of the analytical solution. The Ursa che lies in the necessary buffer supply and the resulting ions gradient change. However, this must be compensated for during the separation process become. This is done by introducing other foreign substances into the solution, what inevitably leads to instability of the same.
Die Affinitätschromatographie wird ebenfalls zur Abtrennung von Albumin aus biologischen Flüssigkeiten eingesetzt. Eine dabei angewendete Methode ist die Abtrennung des Albumins mit Antikörpern, eine zweite die Verwendung von Farb stoffen wie Cibacronblau.Affinity chromatography is also used to separate albumin biological fluids used. One method used is Separation of the albumin with antibodies, a second the use of color fabrics like cibacron blue.
Der Einsatz von Antikörpern verspricht aus theoretischen Überlegungen heraus guten Erfolg. Dieser hat sich aber nicht eingestellt. Es hat sich gezeigt, daß die Antikörper letztlich zu teuer sind. Das ist in ihrer Herstellung begründet. Des weite ren hat sich gezeigt, daß die Antikörper in ihrem Einsatz zur Albuminabtrennung nur eine geringe Lebensdauer aufweisen. Das ist dadurch bedingt, daß sie bei Mehr fachnutzung denaturieren. Weiterhin ist es so, daß sie schon bei längerfristiger Aufbewahrung in ihrer Aktivität merklich nachlassen und deshalb als kommerzielles Produkt ausfallen.The use of antibodies promises based on theoretical considerations Good luck. However, this has not occurred. It has been shown that the Antibodies are ultimately too expensive. This is due to their manufacture. The far Ren has been shown that the antibodies in their use for albumin separation only have a short lifespan. This is due to the fact that at more Denature specialist use. Furthermore, it is the case that they are already in the longer term Storage activity declines markedly and therefore as a commercial Product fail.
Der Einsatz von Farbstoffen in der Affinitätschromatographie erfüllt die Erwartungen ebenfalls nicht, weil Cibacronblau, andere verwendete Farbstoffe sowie weitere Liganden unspezifisch sind. Albumin wird mit oder neben vielen anderen Proteinen abgetrennt, weil ihre Wechselwirkung mit dem Farbstoff ähnlich ist. Weiterhin ist nachteilig, daß die Trennleistung recht schnell nachläßt. Die Ursache liegt in der nur unzureichend zu verwirklichenden Immobilisierung des Farbstoffs an einem Träger material. Die Säule "blutet aus" und bringt keine Leistung mehr. The use of dyes in affinity chromatography meets expectations also not because cibacron blue, other dyes used and others Ligands are unspecific. Albumin is made with or along with many other proteins separated because their interaction with the dye is similar. Still is disadvantageous that the separation performance deteriorates quite quickly. The cause lies in the only inadequate immobilization of the dye on a support material. The column "bleeds" and no longer performs.
Die Erfindung hat den Zweck, ein Verfahren zur Abtrennung von Albumin aus biologischen Flüssigkeiten anzubieten, das ein spezifisches Abtrennen des Albu mins ermöglicht. Es soll schnell ablaufen und die biologische Flüssigkeit soll stabil bleiben. Das Verfahren muß kostengünstig arbeiten, das zur Verfügung gestellte Adsorbens soll langfristig haltbar sein und eine dauerhafte Trennleistung sichern.The invention has the purpose of a method for the separation of albumin biological fluids that require a specific separation of the Albu mins allows. It should run off quickly and the biological fluid should be stable stay. The process must be inexpensive, the one provided Adsorbent should be durable in the long term and ensure permanent separation performance.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in einem Verfahren, das seinem Wesen nach ein affinitätschromatographisches Verfahren bleibt, eine spezifische Bindung zwischen Albumin und dem Adsorbens herzustellen. In nur wenigen Arbeitsschritten soll eine biologische Flüssigkeit albuminfrei erhalten werden. Es soll unter physiolo gischen Bedingungen gearbeitet werden und das mit einer langfristig stabilen Ma trix.The invention has for its object in a method that is its essence after an affinity chromatographic procedure remains, a specific binding between albumin and the adsorbent. In just a few steps a biological liquid should be obtained free of albumin. It is said to be under physiolo conditions are worked with and that with a long-term stable measure trix.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine albuminhaltige biologi
sche Flüssigkeit auf eine chromatographische Säule aufgegeben wird, die mit einer
Füllung aus an sich bekanntem Trägermaterial beschickt worden ist, welches aus
Agarose in Kugelform, Polyacrylbeads oder Silicagel besteht. Das Trägermaterial ist
mit chemisch aktiven Gruppen modifiziert wie zum Beispiel
A. EAH-Sepharose(R) 4B in Anwesenheit von Carbodiimid (Firma Pharmacia)
B. Affigel 102(R) in Anwesenheit von Carbodiimid (Firma BioRad).The object is achieved in that an albumin-containing biological liquid is applied to a chromatographic column which has been charged with a filling made of carrier material known per se, which consists of spherical agarose, polyacrylic beads or silica gel. The carrier material is modified with chemically active groups, for example
A. EAH-Sepharose (R) 4B in the presence of carbodiimide (company Pharmacia)
B. Affigel 102 (R) in the presence of carbodiimide (BioRad company).
Das derart vorbereitete Trägermaterial wird mit einer Peptidlösung inkubiert, wobei das Peptid erfindungsgemäß eine definierte Sequenz von NH2-Phe-His-Glu-Asn- Trp-Pro-Ser-COOH aufweist. Nach Blockieren der freien aktiven Gruppen am Trägermaterial wie z. B. Agarose wird mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und das Trägermaterial in die Säule eingeschwemmt. Die aufgegebene albuminhaltige biologische Flüssigkeit passiert die Säule. Das albuminfreie Eluat wird gesammelt. Die Säule wird nach erfolgter Beladung regeneriert, indem man die Säule mit einem Puffer (200 mM Glycin-HCl, pH 2,2) wäscht. Anschließend wird die Säule mit PBS neutral gewaschen.The carrier material prepared in this way is incubated with a peptide solution, the peptide according to the invention having a defined sequence of NH 2 -Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH. After blocking the free active groups on the support material such. B. Agarose is washed with phosphate-buffered saline (PBS) and the carrier material is washed into the column. The applied albumin-containing biological fluid passes through the column. The albumin-free eluate is collected. After loading, the column is regenerated by washing the column with a buffer (200 mM glycine-HCl, pH 2.2). The column is then washed neutral with PBS.
Das erfindungsgemäße Abtrennen von Albumin aus biologischen Flüssigkeiten ist ebenso im batch-Verfahren möglich. The separation of albumin from biological liquids according to the invention is also possible in a batch process.
Das Verfahren kann auch verwendet werden, um Albumin in reiner Form aus biolo gischen Flüssigkeiten zu isolieren.The process can also be used to biolo pure albumin isolate liquids.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß unerwartet und aufgrund theoreti scher Überlegungen nicht vorhersehbar die Peptidsequenz NH2-Phe-His-Glu-Asn- Trp-Pro-Ser-COOH für die Bindung des Albumins verantwortlich ist.The invention is based on the knowledge that the peptide sequence NH 2 -Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH is responsible for the binding of the albumin unexpectedly and, due to theoretical considerations, not predictable.
Das erfindungsgemäße Peptid ist nach an sich bekannten Methoden herstellbar.The peptide according to the invention can be prepared by methods known per se.
Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese beschränkt zu sein.The invention will be explained in more detail below using exemplary embodiments, without being limited to them.
- 1. 16 mg des oben genannten Peptids werden mit 8 ml EAH-Sepharose (R) 4B in Anwesenheit von Carbodiimid inkubiert. Das so hergestellte Trägermaterial ist bis zur Anwendung durch Zusatz von 0,02% Thimerosal bei 4°C stabil.1. 16 mg of the above peptide are mixed with 8 ml of EAH-Sepharose (R) 4B in Incubated presence of carbodiimide. The carrier material thus produced is up to stable for use by adding 0.02% thimerosal at 4 ° C.
- 2. Das Trägermaterial (8 ml) wird in eine handelsübliche Chromatographiesäule gefüllt und mit PBS neutral gewaschen.2. The carrier material (8 ml) is placed in a commercially available chromatography column filled and washed neutral with PBS.
- 3. Albuminhaltige biologische Flüssigkeiten werden über die Säule gegeben. Ein Milliliter des Trägermaterials kann 20 µg Albumin binden.3. Biological liquids containing albumin are passed over the column. On Milliliters of the carrier material can bind 20 µg albumin.
- 4. Der albuminfreie Säulendurchlauf wird gesammelt.4. The albumin-free column run is collected.
- 5. Zur Regeneration wird die Säule mit 4 Säulenvolumen Puffer (200 mM Glycin- HCl, pH 2,2) und anschließend mit 5 Säulenvolumen PBS gewaschen.5. For regeneration, the column with 4 column volumes of buffer (200 mM glycine HCl, pH 2.2) and then washed with 5 column volumes of PBS.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8122 | Nonbinding interest in granting licenses declared | ||
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee | ||
| 8370 | Indication of lapse of patent is to be deleted | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |