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DE19740770A1 - Mikrofiltrationsfilterschicht sowie deren Verwendung - Google Patents

Mikrofiltrationsfilterschicht sowie deren Verwendung

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Publication number
DE19740770A1
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Authority
DE
Germany
Prior art keywords
filter layer
derivatives
layer according
microfiltration filter
endotoxin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19740770A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Beeskow
Wolf-Dieter Prof Dr Deckwer
Birger Dr Anspach
Dagmar Petsch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 38124 BRAUNSCHWEIG DE
Original Assignee
GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 38124 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 38124 BRAUNSCHWEIG DE filed Critical GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 38124 BRAUNSCHWEIG DE
Priority to DE19740770A priority Critical patent/DE19740770A1/de
Priority to PCT/EP1998/005974 priority patent/WO2000016897A1/de
Publication of DE19740770A1 publication Critical patent/DE19740770A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
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  • Genetics & Genomics (AREA)
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  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft eine Mikrofiltrationsfilterschicht zur Abtrennung von Endotoxinen aus flüssigen Medien sowie die Ver­ wendung dieser Mikrofiltrationsfilterschicht.
Endotoxine sind Lipopolysaccharide aus der äußeren Zellfilter­ schicht Gram-negativer Bakterien, die als Pyrogene wirken. Auf­ grund der Allgegenwärtigkeit von Bakterien sind auch Endotoxine ubiquitär. Sie können im Gegensatz zu Bakterien jedoch nicht durch Standard-Methoden wie Sterilfiltrieren oder Autoklavieren entfernt bzw. unschädlich gemacht werden (1). Aus diesem Grund ist steril nicht gleichbedeutend mit endotoxin-frei. Besonders kritisch ist die Anwesenheit von Endotoxinen in Injektions- bzw. Infusionslösungen (Parenteralia), da sie intravenös appliziert bereits in Mengen von 1 ng pro kg Körpergewicht fiebererregend wirken. Die Symptomatik reicht bei entsprechend hoher Dosierung (z. B. durch großvolumige Parenteralia) bis zu schwerem Schock und Tod (2, 3)). Daher schreiben fast alle pHarmacopöen neben der Keimfreiheit strenge Endotoxin-Höchstwerte vor: z. B. 0,2 EU pro mg ChlorampHenicol zur Injektion oder nur 0,003 EU pro Hepa­ rin-Unit (4). Die Erfüllung dieser Forderungen bereitet in der Praxis einige Schwierigkeiten. Insbesondere die Produktion bio­ logischer Arzneimittel kann nicht in allen Schritten endotoxin­ frei erfolgen. Als Endotoxin-Quellen kommen hauptsächlich in Frage:
  • - Rohstoffe wie Plasma oder Gewebe, die bereits Bakterien-konta­ miniert sein können.
  • - Bei rekombinanten Produkten ist mit dem Eintrag von Host-spe­ zifischen Endotoxinen zu rechnen.
  • - Bakterielle Kontamination von Geräten, Filtern oder Hilfsstof­ fen während der Herstellung.
Die für thermostabile Wirkstoffe übliche Hitzedekontamination (30 Minuten bei 250°C) ist für die Präparate ebenso wenig ge­ eignet wie Behandlung mit Säuren, Laugen oder stark oxidierenden Agenzien (H2O2) (1).
Beim Einsatz von Aktivkohle sind häufig merkliche Produktverlu­ ste zu verzeichnen, so daß ihre Anwendung auf die Wasseraufbe­ reitung beschränkt bleibt (5, 6).
Die Ultrafiltration hat als sehr schonende Methode große Popula­ rität auf dem Gebiet der Endotoxin-Entfernung erlangt. Hierbei wird i.a. mit cut-offs von 10 000 oder 5000 gearbeitet, um auch monomere Bestandteile (MW ca. 14000) wirkungsvoll abzutrennen, die neben hochmolekularen Aggregaten (bis zu mehreren Millionen Molekulargewicht) vorliegen. Trotzdem treten immer wieder Pro­ bleme mit niedermolekularen Spaltstücken auf, die ebenfalls py­ rogen wirken (z. B. Lipid A). Das betrifft vor allem die Hämo­ dialyse: Obwohl die Dialysepuffer ultrafiltriert werden, ent­ wickeln z. B. in den USA jährlich 400 000 Hämodialyse-Patienten septische Symptome (7). - Die Notwendigkeit der kleinen cut-offs beschränkt die Anwendung der Ultrafiltration zudem auf die De­ kontaminierung niedermolekularer Substanzen (8).
Im Fall von hochmolekularen Produkten wie pHarmaproteinen, Albu­ min-Präparaten oder Heparin existieren nach wie vor große Schwierigkeiten: Treten in diesen Präparaten Fndotoxin-Verunrei­ nigungen auf, bleibt gegenwärtig nur die Möglichkeit des Repro­ zessierens, um den Vorschriften von FDA, USP oder EP gerecht zu werden.
Um dieses aufwendige Verfahren zu vermeiden, das Produkt aber trotzdem seiner Bestimmung zuzuführen, wurde die Möglichkeit ge­ prüft, verseuchte Produkte über chromatograpHische Sorbentien mit endotoxin-spezifischen Liganden selektiv zu dekontaminieren. Auch dies brachte nicht den gewünschten Erfolg: Bisher beschrie­ bene Affinitätssorbentien mit His, Him, PMB als Liganden erwie­ sen sich trotz hoher bis sehr hoher Assoziationskonstanten bei hohen Endotoxin-Eingangskonzentrationen als nicht geeignet (9).
Ferner wurde in Gegenwart von Proteinen konkurrierende Pro­ teinadsorption beobachtet, die zu verringerten Endotoxin-Abrei­ cherungsraten und teilweise hohen Proteinverlusten führte (insbesondere bei sauren Proteinen wie BSA).
Literatur
  • (1) S.K. Sharma
    Endotoxin detection and elimination in biotechnology Biotechnol. Appl. Biochem. 8 (1986), 5-22
  • (2) N. Haeffner-Cavaillon, J.M. Cavaillon, L. Szabó
    Cellular receptors for endotoxin Handbook of Endotoxins, Vol. 3: Biology of Endotoxins, 1-24 Elsevier Science Publishers B.V. (1985)
  • (3) D.C. Morrison, J.L. Ryan
    Endotoxins and disease mechanisms Ann. Rev: Med. 38 (1987), 417-32
  • (4) USP XXII Suppl. 5 (Nov. 1991)
  • (5) K.C. Hou, R. Zaniewski
    Depyrogenation by endotoxin removal with positively charged depth filter cartridge J. Parenteral Sci. Tech., Vol. 44, No. 4 (1990), 204-209
  • (6) CUNO Newsletter for pHarmaceuticals (Okt. 1995), S. 3
  • (7) B.P. Smollich, D. Falkenhagen, J. Schneidewind, S. Mitzner, H. Klinkmann
    Importance of endotoxins in high-flux dialysis NepHrol. Dial. Transplant 3 (Suppl.) (1991) 83-85
  • (8) E. Flindt
    Pyrogenentfernung mittels Ultrafiltration Memoscript CONCEPT-Symposium "Pyrogene II" (Juni 1983), S. 54-60
  • (9) F.B. Anspach, O. Millbeck
    Removal of endotoxins by affinity sorbents J. Chromatogr. A 711 (1995), 81-92.
Dieser Stand der Technik läßt sich erfindungsgemäß durch eine Mikrofiltrationsfilterschicht zur Abtrennung von Endotoxinen aus flüssigen Medien, insbesondere Wasser, Proteinlösungen oder Pa­ renteralien verbessern, wobei die Mikrofiltrationsfilterschicht durch kovalent gebundene Liganden für Endotoxine gekennzeichnet ist, wobei die Liganden von einem Polymeren getragen werden, das auf der Filterschicht aufgebracht ist.
Zur Filterschichttechnologie und auch Filterschichtherstellung kann auf C. Dickenson, Filters and Filtration Handbook, Flsevier Science Publishers, Oxford 1992, sowie Ho & Sirkar (Herausgeber), Membrane Handbook, Verlag van Nostrand Reinhold, New York, 1992, verwiesen werden. Insbesondere kann es sich bei den Filterschichtmaterialien um Tiefenfilter handeln.
Bei den kovalent gebundenen Liganden kann es sich um
  • (a) einen endotoxin-spezifischen Liganden, vorzugsweise Hist­ amin, Histidin, Polyethylenimin, Poly-L-lysin oder Polymyxin B und/oder
  • (b) einen per se nicht-endotoxin-spezifischen Liganden handeln, vorzugsweise Diaminohexan, Diethylaminoethyl oder Desoxycho­ lat.
Bei dem Filterschichtmaterial für die erfindungsgemäße Mikrofil­ trationsfilterschicht kann es sich um Polysaccharide, z. B. Zel­ lulose, insbesondere regenerierte und mikrokristalline Zellulose und -derivate, insbesondere Zelluloseacetat, Agarose und -deri­ vate, quervernetztes Dextran und -derivate, Chitosan und -deri­ vate,
Synthetische organische Polymere, z. B. Polyacrylnitril, Polysul­ fon, Polyamid, insbesondere Nylon, Polyvinylalkohol, Polyethy­ lenvinylalkohol, Polystyrol und Polyacrylate sowie deren Deri­ vate,
Anorganische Materialien, z. B. Kieselgel, Glas und keramische Träger sowie deren Derivate handeln.
Die Materialien können faserförmig oder partikulär, spHärisch oder unregelmäßig geformt mit porösem oder unporösem Aufbau vor­ kommen, wie sie beispielsweise für chromatograpHische Träger zum Einsatz kommen; ebenso können Teile anderer Strukturen einge­ setzt werden, wie z. B. Bruchstücke oder speziell zugeschnittene Hohlfasermembranen, gebrochene Partikel oder Perlen. Vorzugs­ weise sollten die Materialien wasserunlöslich sein.
Die Größe der Grundstoffe wird so gewählt, daß die herzustel­ lende Struktur in der Schicht einen Porendurchmesser aufweist, wie er für die Mikrofiltration gebräuchlich ist, insbesondere zwischen 0,1 und 10 µm.
Bei dem Polymeren, das auf die erfindungsgemäße Mikrofiltrati­ onsfilterschicht aufgebracht ist, kann es sich um ein hydropHi­ les Polymere handeln, insbesondere um Dextran, Polyvinylalkohol oder modifizierte Zellulose, vorzugsweise Hydroxyethylzellulose.
Dieses hydropHile Polymere kann für sich wasserlöslich, in Was­ ser quellbar oder wasserunlöslich sein.
Das Polymere kann von der erfindungsgemäßen Mikrofiltrationsfil­ terschicht mit Hilfe eines Spacers getragen werden. Auch die ko­ valent gebundenen Liganden können von einem Spacer getragen wer­ den. Bei diesen Spacern kann es sich um Spacer handeln, die sich von Bisoxiran, Glutardialdehyd, Epihalogenhydrin oder Diisocya­ nat herleiten, gegebenenfalls nach oxidativer Aktivierung.
Zur Aktivierungs- und Immobilisierungschemie, die auch auf endo­ toxin-spezifische Liganden und Spacer eingeht, sei beispiels­ weise auf Hermanson, Mallia & Smith, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press Inc., San Diego, 1992, verwiesen.
Erfindungsgemäß werden also Mikrofiltrationsfilterschichten vor­ gesehen, die in geeigneter Weise oberflächenmodifiziert sind und aus Wasser und wäßrigen Lösungen (Puffer, Proteinlösungen) En­ dotoxine entfernen. Die Oberflächenmodifikation kann im Aufbrin­ gen eines bifunktionellen kovalent gebundenen Spacers bestehen, der mit einem hydropHilen Polymeren umgesetzt wird, wobei unspe­ zifische Wechselwirkungen der Filterschicht, speziell mit Pro­ teinen, reduziert werden. Das kovalent gebundene hydropHile Po­ lymere kann mit endotoxin-spezifischen Liganden umgesetzt wer­ den, gegebenenfalls über einen weiteren Spacer. Zum Prinzip der Oberflächenmodifikation der Filterschicht vergleiche man Fig. 1.
Der Endotoxin-Abreicherungserfolg kann sich in Gegenwart von Proteinen als abhängig von der Nettoladung der Proteine erwei­ sen. Durch Optimierung der Bedingungen (pH-Wert) können saure Proteine (wie BSA und Maus-IgG 1) vollständig dekontaminiert werden, und zwar ohne nennenswerte Verluste an Protein. Im Fall basischer Proteine (wie beispielsweise Lysozym und bFGF) lassen sich ebenfalls hohe Abreicherungen erzielen.
Polymer-gecoatete erfindungsgemäße Mikrofiltrationsfilterschich­ ten mit kovalent gebundenen endotoxin-spezifischen Liganden kön­ nen Endotoxine in einem Durchgang entfernen, und zwar auch aus hochbelasteten Lösungen (6000 EU ml-1).
Vom Prinzip her sind die Filterschichten entsprechend Fig. 1. aufgebaut. Zunächst wird über einen Spacer ein hydropHiles Poly­ mer aufgebracht, das dann weiter, ggf. über einen Spacer, mit endotoxin-spezifischen Liganden umgesetzt wird. Als Filter­ schichtmaterialien kommen insbesondere in Frage:
  • - Polysaccharide, wie
  • - Zellulose, insbesondere regenerierte und mikrokristalline Zellulose und -derivate, insbesondere Zelluloseacetat,
  • - Agarose und -derivate, quervernetztes Dextran und -derivate,
  • - Chitosan und -derivate,
  • - Synthetische organische Polymere, wie
  • - Polyacrylnitril sowie dessen Derivate
  • - Polysulfon sowie dessen Derivate
  • - Polyamid, insbesondere Nylon, sowie dessen Derivate
  • - Polyvinylalkohol sowie dessen Derivate
  • - Polyethylenvinylalkohol sowie dessen Derivate
  • - Polystyrol sowie dessen Derivate und
  • - Polyacrylate sowie deren Derivate,
  • - Anorganische Materialien wie
  • - Kieselgel sowie dessen Derivate
  • - Glas und
  • - keramische Träger.
Als Spacer eignen sich reaktive bifunktionale Verbindungen. Spe­ ziell geeignet sind:
  • - Bisoxiran
  • - Glutardialdehyd
  • - Epihalogenhydrine
  • - Diisocyanate
Zur Aktivierung der bei Verwendung von Bisoxiran und Epihalogen­ hydrin entstehenden vicinalen Diolbindung kann ggf. Oxidation durch Periodat angewandt werden, wobei eine Aldehydgruppe ent­ steht. Der an die Filterschicht gebundene Spacer wird weiter um­ gesetzt mit hydropHilen Polymeren. Als solche kommen bevorzugt in Frage:
  • - Dextran
  • - Polyvinylalkohol (PVA)
  • - Modifizierte Zellulosen, speziell Hydroxyethylzellulose (HEC)
Die weitere Reaktion erfolgt entweder direkt mit dem endotoxin­ spezifischen Liganden oder wiederum über die Vermittlung eines der oben angeführten Spacer, ggf. nach dessen oxidativer Akti­ vierung. Als endotoxin-spezifische Liganden wirken (s. Liste der Abkürzungen): DAH, Him, His, PEI, PLL, PMB. Auch die üblicher­ weise nicht endotoxin-spezifischen Liganden wie DEAE und DOC er­ wiesen sich in der Filterschichtkonfiguration als hochspezifisch bei gleichzeitig hoher Wiederfindung der Proteine.
Die Leistungsfähigkeit der entwickelten Filterschichten geht aus den angeführten Beispielen hervor. Die Endotoxin-Entfernung kann fast immer als vollständig bezeichnet werden. Sie liegt in der Regel unter 1 EU ml-1, oft unterhalb der Nachweisgrenze mit dem LAL-Test.
An Kontrollfilterschichten (Nylon ohne Modifikation und mit auf­ gebrachtem hydropHilen Polymer mit oder ohne Spacer) ohne endo­ toxin-spezifischen Liganden wurde keine Endotoxinabreicherung erhalten.
Die neuen Filterschichten können eingesetzt werden zur Endoto­ xinentfernung aus Wasser und parenteralia. Auch in Gegenwart von Proteinen werden gute Ergebnisse erzielt. Im Fall basischer Pro­ teine ist allerdings zu berücksichtigen, daß Wechselwirkungen der Proteine mit dem Endotoxin auftreten können, die zu einer endotoxischen Maskierung führen können. Proteingebundenes Endo­ toxin kann mit dem LAL-Test nicht eindeutig nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, daß nicht endgültig ge­ klärt ist, ob proteingebundenes Endotoxin noch toxisch wirkt.
Die erfindungsgemäßen Filterschichten können vielseitig ange­ wandt werden.
Medizinisch-pHarmazeutischer Bereich:
  • - Hämodialyse.
  • - Unbedenkliche Infusions- und Injektionslösungen (Parenteralia)
  • - Sichere Diagnostika (z. B. Antikörper)
In der Biotechnologie:
  • - Herstellung von pHarmaprodukten.
  • - Endotoxin-Abreicherung in Prozeßwasser und Rohstoffen.
  • - Dekontaminierung von Produkten (Aufwand für Prozessierung ent­ fällt)
Methoden 1. Herstellung der Filterschichten
An Mikrofiltrationsfilterschichten werden hydropHile Polymere, insbesondere Dextran, Polyvinylalkohol und Hydroxyethylzellulose kovalent gebunden. Im nächsten Schritt werden an die aufgebrach­ ten Polymere endotoxin-spezifische Liganden immobilisiert. Fig. 1 illustriert den Aufbau eines Filterschichtmaterials auf der Basis von Nylon.
1.1. Coating einer Filterschicht am Beispiel von Dextran
Mikrofiltrationsfilterschichten, z. B. auf der Basis von Nylon- Hohlfasern oder Zellulosefasern, werden zunächst mit Bisoxiran aktiviert:
Solche Schichten auf der Basis von Nylon-Hohlfasern werden 16 Stunden bei 80°C in einer Reaktionslösung aus 1 ml 25 mM Natri­ umcarbonat (pH 11), 1 ml Ethanol (96%-ig) und 9 ml Bisoxiran inkubiert (Fig. 2a).
Solche Schichten auf der Basis von Zellulosefasern werden hierzu drei Stunden bei Raumtemperatur in einer Mischung aus 100 mg Na­ triumborhydrid in 15 ml 2 M Natronlauge, 25 ml Wasser und 5 ml Bisoxiran geschüttelt.
Jeweils beide Filterschichten werden anschließend nach gründli­ chem Waschen mit 5 ml einer 20-prozentigen Dextran 40 000-Lösung (pH 11) 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (s. Abb. 2b am Beispiel Nylon). Anschließend werden die Filterschichten 14 Stunden bei 120°C getrocknet. Um unspezifisch gebundenes Dex­ tran zu entfernen, werden die Filterschichten dreimal mit 0,1 M Natronlauge und dann dreimal mit Wasser gewaschen.
Wie Fig. 3 zeigt, zeichnen sich die Filterschichten auf der Ba­ sis gecoateter Filterschichtmaterialien durch signifikant gerin­ gere unspezifische Wechselwirkungen - ausgedrückt durch adsor­ bierte Menge Hämoglobin - aus.
Aus der Fig. 3 geht auch hervor, daß mit einem einfachen Dex­ tran-coating nicht der gleiche Effekt erreicht werden kann wie mit PVA und HEC. Durch einen zweiten Layer kann eine weitere Verbesserung erzielt werden, während ein dritter Layer nur noch geringfügige Auswirkungen hat. Dextran wurde daher immer als Doppel-coating eingesetzt.
1.2. Immobilisierung von endotoxin-spezifischen Liganden
Die Liganden PLL, PMB und PEI werden entweder direkt an die Per­ jodat-aktivierten Coating-Polymere oder nach Inkorporation eines Perjodat-oxidierbaren Spacers (Bisoxiran) immobilisiert. Das Vorgehen ist beispielhaft in Fig. 4 dargestellt. DEAE wird ohne Spacer direkt an die Matrices gekoppelt, die anderen niedermole­ kularen Liganden wurden über Epibromhydrin gebunden.
1.2.1. PEI-Immobilisierung über Bisoxiran
Zur Aktivierung werden die mit hydropHilen Polymeren gecoateten Filterschichten drei Stunden bei Raumtemperatur in einer Mi­ schung aus 100 mg Natriumborhydrid, 5 ml Bisoxiran und 45 ml 1 M Natronlauge inkubiert. Nach Hydrolyse des freien Oxiranringes (30 Minuten Inkubation bei pH 2,5) und Perjodatoxidation des er­ haltenen vicinalen Diols (90 Minuten Inkubation in 0,2 M Natri­ umperjodat) werden die Filterschichten zwei Stunden mit einer Lösung von 0,5 g PEI (MW 50 000) in 0,1 M pHospHatpuffer, die auf pH 8 eingestellt wird, bei Raumtemperatur umgesetzt, so daß sich der in Fig. 1 gezeigte Aufbau ergibt. Abschließend wird mit ei­ ner 1-molaren Natriumchlorid-Lösung und Wasser gewaschen.
1.2.2. Histidin-Immobilisierung
Histidin wird über DAH an Epibromhydrin-aktivierte gecoatete Filterschichten immobilisiert. Epibromhydrin-Aktivierung wird wie für Bisoxiran beschrieben durchgeführt. Immobilisiertes DAH wird durch 8-minütige Reaktion mit einer Mischung von 5 ml Epi­ bromhydrin und 5 ml 4 M Natronlauge bei 90°C aktiviert und so­ fort bei 80°C mit L-Histidin umgesetzt (0,5 g L-Histidin in 20 ml Wasser, pH 12). Die fertige Filterschicht wird mit 1 M Natri­ umchlorid und Wasser gewaschen.
Entsprechende Vorschriften werden angewandt für das Coating mit anderen Polymeren und die kovalente Bindung mit den anderen en­ dotoxin-spezifischen Liganden.
2. Weitere Methode zur Herstellung der Filterschichten
Als Alternative zu der unter 1. genannten Methode können zuerst die Filterschichtmaterialien chemisch modifiziert und im An­ schluß daran die Struktur der Filterschicht durch Anschwemmung der Filterschichtmaterialien auf einen geeigneten Grundkörper hergestellt werden.
Hierzu werden an die Filterschichtmaterialien hydropHile Poly­ mere, insbesondere Dextran, Polyvinylalkohol und Hydroxyethyl­ zellulose kovalent gebunden. Im nächsten Schritt werden an die aufgebrachten Polymere endotoxin-spezifische Liganden immobili­ siert. Die Struktur an den Filterschichtmaterialien wird ebenso durch Fig. l wiedergegeben.
2.1 Coating eines Filterschichtmaterials am Beispiel von SepHa­ rose 4B und Dextran
SepHarose 4B wurde nach einer Vorschrift von Sundberg und Porath (J. Chromatogr. 90, 1974, 87) mit Bisoxiran aktiviert. In Abän­ derung zur Vorschrift wurde die Reaktionsdauer auf 2 Stunden re­ duziert, um einen minimalen Verlust an Oxirangruppen sicherzu­ stellen. Hierzu wurden 40 ml einer SepHarose 4B-Suspension mit 20 ml einer 0,5-molaren NaOH-Lösung, 8 ml Bisoxiran und 40 mg Natriumborhydrid in einem Kolben vereint und bei 40°C über ei­ nen Zeitraum von 2 Stunden geschüttelt. Anschließend wurde die aktivierte SepHarose abgesaugt und mehrmals mit Wasser gewa­ schen. Das aktivierte Gel wurde mit dem gleichen Volumen einer Reaktionslösung vereint, die aus 20% Dextran mit einem mittle­ ren Molekulargewicht von 40 000 und 0,2% Natriumborhydrid in ei­ nem 0,025-molaren Carbonatpuffer bestand und auf pH 11 einge­ stellt war. Diese Lösung wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur ge­ schüttelt. Die gecoatete SepHarose wurde von der Dextranlösung durch Filtration getrennt und anschließend über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 80°C inkubiert.
2.2 Immobilisierung von endotoxin-spezifischen Liganden
Die Liganden PLL, PMB und PFI wurden entweder direkt an die Per­ jodat-aktivierten Coating-Polymere oder nach Inkorporation eines Perjodat-oxidierbaren Spacers (Bisoxiran) immobilisiert. DEAB wurde ohne Spacer direkt an die Matrices gekoppelt, die anderen niedermolekularen Liganden wurden über Bpibromhydrin gebunden.
2.2.1 Immobilisierung von PEI über Bisoxiran
Die Aktivierung der Dextran-gecoateten SepHarose mit Bisoxiran erfolgte nach Sundberg und Porath, wie in 2.1 beschrieben. Nach Hydrolyse des freien Oxiranringes (30 Minuten Inkubation bei pH 2,5) und Perjodatoxidation des erhaltenen vicinalen Diols (90 Minuten Inkubation in 0,2 M Natriumperjodat) wurden die Filter­ schichtmaterialien zwei Stunden bei Raumtemperatur mit einer Lö­ sung versetzt, die auf pH 8 eingestellt und aus 0,5 g PEI mit einem mittleren Molekulargewicht von 50 000 und 10 ml eines 0,1- molaren pHospHatpuffers zusammengesetzt war. Abschließend wurde mit 1 M Natriumchlorid-Lösung und Wasser gewaschen. Die Mi­ schungsverhältnisse von Festkörper und Reaktionslösung wurden bei den einzelnen Reaktionen jeweils so gewählt, daß eine schüt­ telbare Suspension entstand.
2.2.2. Immobilisierung von Histidin
Histidin wurde über DAH an Epibromhydrin-aktivierte gecoatete Filterschichtmaterialien immobilisiert. Epibromhydrin-Aktivie­ rung wurde wie für Bisoxiran beschrieben durchgeführt. Immobili­ siertes DAH wurde durch 8-minütige Reaktion mit einer Mischung von 5 ml Epibromhydrin und 5 ml 4 M Natronlauge bei 90°C akti­ viert und sofort bei 80°C mit L-Histidin umgesetzt (0,5 g L-Hi­ stidin in 20 ml Wasser, pH 12). Das fertige Filterschichtmate­ rial wurde mit 1 M Natriumchlorid und Wasser gewaschen. Auch hier wurden die Mischungsverhältnisse von Festkörper und Reak­ tionslösungen so gewählt, daß schüttelbare Suspensionen entstan­ den.
Entsprechende Vorschriften werden angewandt für das Coating mit anderen Polymeren und anderen Filterschichtmaterialien sowie die kovalente Bindung mit anderen endotoxin-spezifischen Liganden.
3. Abreicherungsexperimente
Alle Untersuchungen zum Adsorptionsverhalten von Endotoxinen an den Filterschichten wurden bei Raumtemperatur im Dead-end-Modus durchgeführt.
Je eine Filterschichtscheibe wurde am Boden einer Ultrafiltrati­ onszelle (Filterschichtfläche 13,4 cm2) fixiert und mit 30% ethanolischer 0,1 M Natronlauge, 1,5 M Natriumchlorid-Lösung und pyrogenfreiem Wasser gewaschen, um Endotoxin-Spuren zu entfer­ nen. Nach Equilibrierung der Filterschicht wurden jeweils 20 ml kontaminierter Lösung mit einer Flußgeschwindigkeit von 2 ml/min durch die Filterschicht filtriert. Das Filtrat wurde gesammelt und im LAL-Test untersucht.
4. Endotoxintest
Zur Endotoxin-Quantifizierung in den Ausgangslösungen und Fil­ traten wurde ein chromogener Limulus Amöbozyt Lysat Test (LAL- Test) eingesetzt. Dieser Test beruht darauf, daß Endotoxin die Freisetzung des Chromogens p-Nitroanilin induziert, wobei zwi­ schen der freigesetzten Menge p-Nitroanilin und der vorliegenden Endotoxin-Konzentration im Bereich 0 bis 1,2 EU/ml ein linearer Zusammenhang besteht. Aus der pHotometrischen p-Nitroanilin-Be­ stimmung kann mit Hilfe einer Kalibriergeraden (Standard-Endo­ toxin E. coli 0111:B4) auf die Endotoxin-Konzentration der Pro­ ben geschlossen werden.
Der LAL-Test wurde in Europa 1985 von der Europäischen Arznei­ buch-Kommission zur Prüfung auf Endotoxine eingeführt und er­ setzt seit 1989 auch in der MonograpHie "Wasser für Injektions­ zwecke'1 den Kaninchen-Test.
Anwendungsbeispiele
  • 1. (Fig. 5) Abreicherung aus hochbelasteten Pufferlösungen
    Feed: 20 ml 20 mM pHospHatpuffer (pH 7) mit 6000 EU/ml versetzt
    Die mit -d gekennzeichneten Filterschichten stellen Filter­ schichten dar, bei denen auf Inkorporation eines Spacers ver­ zichtet wurde.
  • 2. (Fig. 6 bis 7) Abreicherung aus Endotoxin-angereicherten BSA-Lösungen
    Feed: 20 ml 20 mM pHospHatpuffer (pH 4,66) mit 1 mg/ml BSA und 6610 EU/ml versetzt
    Proteinwiederfindung BSA
  • 3. (Fig. 8) Abreicherung aus Handels-BSA
    Feed: 20 ml 20 mM pHospHatpuffer (pH 4, 66) mit 1 mg/ml BSA
    Endotoxinkonzentration 65 EU/ml
  • 4. (Fig. 9 bis 10) Abreicherung aus Handels-Lysozym
    Feed: 20 ml 20 mM pHospHatpuffer (pH 7) mit 1 mg/ml Lysozym
    Endotoxinkonzentration 134 EU/ml
    Proteinwiederfindung Lysozym
  • 5. (Fig. 11 bis 12) Abreicherung aus MAX 16 H 5
    Feed: 20 ml 20 mM pHospHatpuffer (pM 5,5) mit 3 mg/ml Protein
    Endotoxinkonzentration 62,5 EU/ml
    Proteinwiederfindung IgG
  • 6. Abreicherung aus bereits aufgereinigtem bFGF
    Feed: 5 ml bFGF, das 9 EU/ml enthielt
    Es wurde das Abreicherungsverfahren einer PEI-Filterschicht untersucht. Im Filtrat waren noch 0,202 EU/ml nachweisbar.
  • 7. Abreicherung aus Milli-Q-Wasser, das mit Endotoxin versetzt wurde
    Feed: 1 1 Wasser mit 270 EU/ml versetzt
    Zur Abreicherung wurden eine PEI- und eine DAHHis-Filter­ schicht eingesetzt.
    PEI-Filtrat: < 0,015 EU/ml
    DAHHis-Filtrat: 0,07 EU/ml

Claims (10)

1. Mikrofiltrationsfilterschicht zur Abtrennung von Endotoxinen aus flüssigen Medien, insbesondere Wasser, Proteinlösungen oder Parenteralien, gekennzeichnet durch kovalent gebundene Liganden für Endotoxine, wobei die Liganden von einem Polymeren getragen werden, das auf dem Filterschichtmaterial aufgebracht ist.
2. Mikrofiltrationsfilterschicht nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • (a) einen endotoxin-spezifischen Liganden, vorzugsweise Hist­ amin, Histidin, Polyethylenimin, Poly-L-lysin oder Polymyxin B und/oder
  • (b) einen per se nicht-endotoxin-spezifischen Liganden, vorzugs­ weise Diaminohexan, Diethylaminoethyl oder Desoxycholat.
3. Mikrofiltrationsfilterschicht nach Anspruch 1 oder 2, gekenn­ zeichnet durch Polysaccharide, z. B. Zellulose, insbesondere re­ generierte und mikrokristalline Zellulose und -derivate, insbe­ sondere Zelluloseacetat, Agarose und -derivate, quervernetztes Dextran und -derivate, Chitosan und -derivate,
Synthetische organische Polymere, z. B. Polyacrylnitril, Polysul­ fon, Polyamid, insbesondere Nylon, Polyvinylalkohol, Polyethy­ lenvinylalkohol, Polystyrol und Polyacrylate sowie deren Deri­ vate,
Anorganische Materialien, z. B. Kieselgel, Glas und keramische Träger sowie deren Derivate als Filterschichtmaterial.
4. Mikrofiltrationsfilterschicht nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein hydropHiles Polymeres, ins­ besondere Dextran, Polyvinylalkohol oder modifizierte Zellulose, vorzugsweise Hydroxyethylzellulose.
5. Mikrofiltrationsfilterschicht nach Anspruch 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das hydropHile Polymere für sich wasserlöslich oder wasserunlöslich ist.
6. Mikrofiltrationsfilterschicht nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere von der Fil­ terschicht mit Hilfe eines Spacers getragen wird.
7. Mikrofiltrationsfilterschicht nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch einen sich von Bisoxiran, Glutardialdehyd, Epihalogenhy­ drin oder Diisocyanat herleitenden Spacer.
8. Mikrofiltrationsfilterschicht nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden von dem Po­ lymeren mit Hilfe eines Spacers getragen werden.
9. Mikrofiltrationsfilterschicht nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch einen sich von Bisoxiran, Glutardialdehyd, Epihalogenhy­ drin oder Diisocyanat herleitenden Spacer, gegebenenfalls nach oxidativer Aktivierung.
10. Verwendung einer Mikrofiltrationsfilterschicht gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zum Entfernen von Endotoxinen aus flüssigen Medien, insbesondere aus Wasser, Proteinlösungen oder Parenteralien.
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