DE19731684A1 - Reagent for determining plasma sample by measuring clotting time - Google Patents
Reagent for determining plasma sample by measuring clotting timeInfo
- Publication number
- DE19731684A1 DE19731684A1 DE1997131684 DE19731684A DE19731684A1 DE 19731684 A1 DE19731684 A1 DE 19731684A1 DE 1997131684 DE1997131684 DE 1997131684 DE 19731684 A DE19731684 A DE 19731684A DE 19731684 A1 DE19731684 A1 DE 19731684A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- thrombin
- reagent
- fibrinogen
- activating system
- reagent according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 230000035602 clotting Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 title abstract description 7
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 57
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 39
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 39
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 29
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 26
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 26
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 26
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 10
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 8
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 8
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 7
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 claims description 5
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 108010085662 ecarin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims 1
- 159000000007 calcium salts Chemical group 0.000 claims 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 206010051122 Acquired dysfibrinogenaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000002004 Afibrinogenemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030238 Congenital dysfibrinogenaemia Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- GJAARPKBDFKHFS-UHFFFAOYSA-N Gerin Natural products COC(=O)C(=C)C1CC2C(=C)C(=O)C=CC2(C)CC1OC(=O)C GJAARPKBDFKHFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 201000007182 congenital afibrinogenemia Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/974—Thrombin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Charakterisierung einer Plasma- oder Vollblut-Probe durch Messung der Zeit zwischen der Zugabe des Reagenzes und dem Auftreten einer Gerinnselbildung sowie ein Reagenz hierzu.The invention relates to a method for the characterization of a plasma or whole blood sample by measuring the time between the addition of the Reagent and the appearance of clot formation as well as a reagent For this.
Das Prinzip der Thrombinzeit-Methode wird durch Bartels ("Gerinnungsana lysen" 2. Auflage, Thieme Verlag 1980, Seite 123-7) wie folgt beschrieben: Durch Zugabe des Enzyms Thrombin zum Plasma bildet sich aus Fibrinogen Fibrin. Damit entfällt die plasmaeigene Thrombinbildung und damit der Einfluß aller zur Thrombinbildung erforderlichen Faktoren.The principle of the thrombin time method is described by Bartels ("Gerinnungsana lysen "2nd edition, Thieme Verlag 1980, pages 123-7) as follows: By adding the enzyme thrombin to the plasma, fibrinogen is formed Fibrin. This eliminates the plasma-specific thrombin formation and thus the Influence of all factors necessary for thrombin formation.
Die Thrombinzeit reagiert in erster Linie und konzentrationsabhängig auf die Anwesenheit gerinnungshemmender Substanzen. Hierbei handelt es sich vor allem um Heparin (Hemmung der Thrombinwirkung durch Steigerung der Antithrombin-III-Aktivität) und die Fibrin(ogen)-Spalt-Produkte (Hemmung der Fibrinpolymerisation). Eine Verlängerung der Thrombinzeit tritt weiter auf bei angeborener oder erworbener Dysfibrinogenämie und schwerem Fibrinogenmangel.The thrombin time reacts primarily and depending on the concentration Presence of anticoagulant substances. This is it especially heparin (inhibition of thrombin by increasing the Antithrombin III activity) and the fibrin (ogen) -cleavage products (inhibition fibrin polymerization). An extension of the thrombin time continues for congenital or acquired dysfibrinogenemia and severe Fibrinogen deficiency.
Die Thrombinzeit-Methode wird am häufigsten zur Überwachung der Heparintherapie eingesetzt. Ein Nachteil der Methode besteht jedoch darin, daß die Abhängigkeit der Gerinnungszeit zur Heparinkonzentration in hohem Maße nicht linear ist (Siehe Penner 1974, A.J.C.P. 61: 645-53). Somit bedeutet eine gute Empfindlichkeit bei niederer Heparinkonzentration, daß bei höheren Heparingehalten die Mischung Plasma/Reagenz nicht zur Gerinnung kommt. Derzeit wird dieses Problem in der Regel gelöst indem die Bestimmung, falls keine Gerinnung eingetreten ist, mit erhöhtem Verhältnis von Thrombin zu Plasma (d. h. auch Heparin) wiederholt wird, entweder indem eine höhere Thrombinkonzentration angewendet, oder die Plasmamenge im Verhältnis zur Reagenzmenge verringert wird.The thrombin time method is most often used to monitor the Heparin therapy used. However, a disadvantage of the method is that that the dependence of the clotting time on the heparin concentration in high Dimensions are not linear (see Penner 1974, A.J.C.P. 61: 645-53). Consequently means a good sensitivity at low heparin concentration that at higher heparin contents the plasma / reagent mixture is not used Coagulation is coming. Currently this problem is usually solved by the determination, if no coagulation has occurred, with increased Ratio of thrombin to plasma (i.e. also heparin) is repeated, either by applying a higher thrombin concentration, or the The amount of plasma is reduced in relation to the amount of reagent.
Die Heparinempfindlichkeit kann ebenfalls mittels Substanzen, welche die Fibrinpolymerisation beeinflussen, gesteuert werden. Beispiele für solche Substanzen sind: CaCl2, Polyvinyl-pyrrolidone und Dextran (Burnstein und Guinard 1954, Rev. d'Hematol. 9: 567-70), Ristocetin (Aronstam et al. 1978, J. Clin. Path. 31: 1106-10) und die Ionenstärke (Prohaska 1987 Ärztl. Lab. 33: 99-105). Weiter ist aus der Literatur bekannt, daß die Inaktivierung von Thrombin durch AT-III/Heparin von inaktivem Thrombin kompetitiv inhibiert wird (Zbigniew et al. 1986 Thromb. Res. 43: 523-37). Diese kompetitive Inhibierung der Heparinwirkung führt ebenfalls zu eine Erweiterung des Meßbereichs.The sensitivity to heparin can also be controlled by means of substances which influence fibrin polymerization. Examples of such substances are: CaCl 2 , polyvinyl-pyrrolidone and dextran (Burnstein and Guinard 1954, Rev. d'Hematol. 9: 567-70), ristocetin (Aronstam et al. 1978, J. Clin. Path. 31: 1106 -10) and the ionic strength (Prohaska 1987 Medical Lab 33: 99-105). It is also known from the literature that the inactivation of thrombin by AT-III / heparin is competitively inhibited by inactive thrombin (Zbigniew et al. 1986 Thromb. Res. 43: 523-37). This competitive inhibition of the heparin effect also leads to an expansion of the measuring range.
Aber auch wenn diese Modulationsmöglichkeiten angewendet werden, bleibt der Nachteil des begrenzten dynamischen Bereichs bestehen. Das Problem liegt darin begründet, daß die Heparin-katalysierte Inhibierung des Thrombins eine sehr schnelle Reaktion ist, auch bei Anwendung obiger Möglichkeiten. Wird nur eine geringe Menge Thrombin eingesetzt (eine Voraussetzung für eine gute Heparinempfindlichkeit bei niedrigen Heparin konzentrationen), ist in Kürze das Thrombin vollständig inaktiviert und es kommt zu keiner Gerinnselbildung. Diese Verhältnisse sind in Fig. 2 schematisch dargestellt. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die oben beschriebenen Nachteile zu beseitigen und ein Reagenz zu schaffen, welches bei allen therapeutischen Heparinkonzentrationen (bis etwa 1 U/ml) zu einer Gerinnung führt und gleichzeitig bei niedrigen Heparinkonzentrationen eine deutlich verlängerte Gerinnungszeit aufweist.But even if these modulation options are used, the disadvantage of the limited dynamic range remains. The problem lies in the fact that the heparin-catalyzed inhibition of thrombin is a very fast reaction, even when using the above possibilities. If only a small amount of thrombin is used (a prerequisite for good heparin sensitivity at low heparin concentrations), the thrombin will soon be completely inactivated and no clot formation will occur. These relationships are shown schematically in FIG. 2. The invention is therefore based on the object of eliminating the disadvantages described above and creating a reagent which leads to coagulation at all therapeutic heparin concentrations (up to about 1 U / ml) and at the same time has a significantly longer coagulation time at low heparin concentrations.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Reagenz für die Charakterisierung einer Plasma- oder Vollblut-Probe, vorzugsweise einer Plasmaprobe, durch Messung der Zeit zwischen der Zugabe des Reagenz zu einer Probe und Auftreten einer Gerinnselbildung, enthaltend Thrombin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es zusätzlich zu Thrombin, das das erste Fibrinogen-aktivierende System bildet, zumindest ein weiteres Fibrinogen aktivierendes System enthält. Bevorzugt wird das weitere Fibrinogen aktivierende System in einer solchen Menge eingesetzt, daß bei der höchsten zu erwartenden Heparin-Konzentration in der Probe die Gerinnselbildung innerhalb einer vorgeschriebenen Meßzeit erfolgt. Abhängig Fibrinogengehalt und der Heparinkonzentration und eventuell anderen Parametern kann es dennoch bei wenigen vereinzelten Proben zu keiner oder einer zu langsamen, d. h. außerhalb der Meßzeit des jeweils benutzten Gerätes, Gerinnselbildung kommen. Die Anzahl der nicht meßbaren Probe wird durch das erfindungsgemäße Reagenz jedoch sehr stark vermindert.This object is achieved by a reagent for the Characterization of a plasma or whole blood sample, preferably one Plasma sample, by measuring the time between adding the reagent a sample and occurrence of clot formation containing thrombin, which is characterized in that, in addition to thrombin, the the first fibrinogen activating system forms at least one other Fibrinogen activating system contains. The further one is preferred Fibrinogen activating system used in such an amount that at the highest expected heparin concentration in the sample Clot formation occurs within a prescribed measuring time. Dependent Fibrinogen content and heparin concentration and possibly others However, there can be no parameters for a few isolated samples or one too slow, d. H. outside the measuring time of the used Device, clot formation are coming. The number of unmeasurable samples is however greatly reduced by the reagent according to the invention.
Als weiteres Fibrinogen aktivierendes System wird erfindungsgemäß ein System bevorzugt, welches Fibrinogen unter Umgehung von Thrombin zu aktivieren vermag. Ein besonders geeignetes System für diesen Zweck ist Batroxobin, ein Schlangengiftpräparat, welche eine Gerinnung ohne Beteiligung der Gerinnungskaskade hervorruft.According to the invention, another system activating fibrinogen is a System preferred which fibrinogen bypassing thrombin too can activate. A particularly suitable system for this purpose is Batroxobin, a snake venom preparation that does not clot Involvement of the coagulation cascade.
Alternativ kann als Fibrinogen aktivierendes System auch eine Prothrombin aktivierende Substanz oder ein entsprechendes System verwendet werden. Physiologisch besteht der natürliche Prothrombin aktivierende Komplex aus vier Komponenten, nämlich Faktor Xa, Va, Calcium und Phospholipiden. Die verschiedenen Prothrombin aktivierenden Systeme ersetzen entweder zumindest eine dieser Komponenten oder greifen in die Bildung dieses Komplexes ein. Ein Beispiel für ein Fibrinogen aktivierendes System, welches Prothrombin aktiviert ist ein PTT-Reagenz + CaCl2. Bei seiner Verwendung genügt eine sehr geringe Menge, beispielsweise 0.2%, bezogen auf die gesamte Reagenzmenge.Alternatively, a prothrombin-activating substance or a corresponding system can also be used as the fibrinogen-activating system. Physiologically, the natural prothrombin activating complex consists of four components, namely factor Xa, Va, calcium and phospholipids. The various prothrombin activating systems either replace at least one of these components or intervene in the formation of this complex. An example of a fibrinogen activating system which activates prothrombin is a PTT reagent + CaCl 2 . When used, a very small amount, for example 0.2%, based on the total amount of reagent is sufficient.
Eine weitere Prothrombin aktivierende Substanz wäre beispielsweise Schlangengift mit Faktor Xa Aktivierungsaktivität oder mit Faktor Xa Aktivität. Geeignet wäre beispielsweise auch Gewebefaktor (tissue factor) + CaCl2 (Quick-Reagenzien), wobei eine geringe Menge hierbei ausreichend ist. Als besonders geeignet unter den Prothrombin aktivierenden Substan zen hat sich das Schlangegift Ecarin herausgestellt.Another prothrombin activating substance would be, for example, snake venom with factor Xa activation activity or with factor Xa activity. For example, tissue factor + CaCl 2 (quick reagents) would also be suitable, a small amount being sufficient. The snake venom Ecarin has proven to be particularly suitable among the prothrombin activating substances.
Als weiteres Fibrinogen aktivierendes System kann auch ein Thrombinderi vat eingesetzt werden, beispielsweise ein rekombinantes Thrombin welches modifiziert ist daß es seine Affinität für Heparin und/oder Antithrombin teilweise oder völlig verloren hat. Ein derartiges Thrombin wurde zum Beispiel von Tsiang et al beschrieben (J. Biol. Chem. (1997), 272, 12 024-12 029).A thrombinderi can also be used as a further fibrinogen-activating system vat are used, for example a recombinant thrombin which modified is that it has an affinity for heparin and / or antithrombin partially or totally lost. Such a thrombin became Example described by Tsiang et al (J. Biol. Chem. (1997), 272, 12 024-12 029).
Auch Thrombin, dessen AT III/Heparin-Empfindlichkeit auf andere Weise modifiziert wurde, zum Beispiel durch Peptide oder Antikörper, welche Thrombin spezifisch binden und die Bindung von AT III und/oder Heparin blockieren (Hsieh 1997 Thromb. Res. 86: 301-16), kann als weiteres Fibrinogen aktivierendes System eingesetzt werden. Das so modifizierte Thrombin kann gleichen Ursprungs sein wie das Thrombin, das das erste Fibrinogen-aktivierende System im Test bildet. Die Peptide oder allgemein Modulatoren der AT III/Heparin-Empfindlichkeit können der Thrombin-Lösung Unterschuß zugesetzt werden. Hierdurch entsteht innerhalb des Thrombin-enthaltenden Reagenzes das weitere Fibrinogen-aktivierende System (Latallo and Jackson, Thrombosis Research 43, S. 523-37 (1986)). Das weitere Fibrinogen aktivierende System kann auch ein Thrombin einer anderen Spezies sein, bei dem die AT III/Heparin-Inhibierungskinetik signifikant schwächer im Vergleich zum Thrombin, das das erste Fibrinogen aktivierende System im Test bildet, ist.Also thrombin, its AT III / heparin sensitivity in a different way was modified, for example by peptides or antibodies, which Binding thrombin specifically and the binding of AT III and / or heparin block (Hsieh 1997 Thromb. Res. 86: 301-16), can be another Fibrinogen activating system can be used. The so modified Thrombin can be of the same origin as the thrombin that is the first Forms fibrinogen-activating system in the test. The peptides or in general Modulators of AT III / heparin sensitivity can use the thrombin solution Deficit can be added. This creates within the Thrombin-containing reagent that activates the further fibrinogen System (Latallo and Jackson, Thrombosis Research 43, pp. 523-37 (1986)). The further fibrinogen activating system can also be a thrombin other species in which the AT III / heparin inhibition kinetics significantly weaker compared to thrombin, which is the first fibrinogen activating system in the test is.
Das im erfindungsgemäßen Reagenz enthaltene Thrombin kann ein übliches Thrombinpräparat sein. Eine besondere Reinheit ist nicht erforderlich. Puffer, pH-Wert, Ionenstärke, Serumalbumin als weitere Merkmale des Reagens können die hierfür bekannten Werte aufweisen, wie sie z. B. aus Carr und Gabriel (Southern Medical Journal 1986, 79: 563-70) bekannt sind. The thrombin contained in the reagent according to the invention can be a conventional one Be thrombin preparation. A special purity is not necessary. Buffer, pH, ionic strength, serum albumin as further characteristics of the Reagent can have the values known for this purpose, such as, for. B. from Carr and Gabriel (Southern Medical Journal 1986, 79: 563-70) are known.
Die Messung der Thrombinzeit selbst kann nach geläufigen Methoden erfolgen, beispielsweise mechanisch unter Verwendung des STA-Gerätes. Da die Gerinnungszeit durch mechanische Methoden unzuverlässig wird, wenn die Gerinnungszeit sehr lang ist wird normalerweise eine maximale Meßzeit von 3 bis 5 Minuten, je nach verwendeter Vorrichtung, vorgege ben. Bei einem Normalplasma, unter Verwendung der Reagenzien der Firma Boehringer Mannheim liegt die Zeit bis zur Gerinnselbildung im Bereich von 16-20 Sekunden für die Heparin empfindliche und 10-13 für die Heparin unempfindlichere Methode (Ratio Thrombin/Heparin erhöht). Diese Zeit wird in Gegenwart von Heparin, insbesondere für die heparinempfindliche Methode, rasch vergrößert bis innerhalb der am STA vorgegebene Meßzeit von 4 Minuten keine Gerinnung mehr auftritt, wie Fig. 1 der Zeichnung zeigt. Durch das erfindungsgemäße Reagenz wird jedoch erreicht, daß diese Meßzeit bei hohe Heparinkonzentrationen deutlich verkürzt wird, wie folgenden Beispiele in Verbindung mit der Zeichnung zeigen.The thrombin time itself can be measured using conventional methods, for example mechanically using the STA device. Since the clotting time becomes unreliable by mechanical methods, if the clotting time is very long, a maximum measuring time of 3 to 5 minutes, depending on the device used, is usually specified. In the case of a normal plasma, using the reagents from Boehringer Mannheim, the time to clot formation is in the range of 16-20 seconds for the heparin-sensitive and 10-13 for the heparin-less sensitive method (ratio thrombin / heparin increased). This time is rapidly increased in the presence of heparin, in particular for the heparin-sensitive method, until no coagulation occurs within the measuring time of 4 minutes specified at the STA, as shown in FIG. 1 of the drawing. However, the reagent according to the invention has the effect that this measuring time is significantly shortened at high heparin concentrations, as the following examples in conjunction with the drawing show.
Die Thrombin-Konzentration des ersten Fibrinogen-aktivierenden Systems bestimmt den Normalbereich (Gerinnungszeit bei Plasmen von gesunden Spendern) und die Sensitivität bei niedrigen Heparinkonzentrationen und kann vom Fachmann für ein bestimmtes Thrombinpräparat leicht ermittelt werden.The thrombin concentration of the first fibrinogen activating system determines the normal range (clotting time for plasmas from healthy Donors) and sensitivity at low heparin concentrations and can easily be determined by a person skilled in the art for a specific thrombin preparation become.
Die jeweilige Konzentration des weiteren Fibrinogen aktivierenden Systems kann vom Fachmann anhand von routinemäßigen Versuchen am besten mit Proben von Patienten unter Heparintherapie ermittelt werden. Diese Konzentration hängt natürlich von dem verwendeten Gerät zur Messung der Gerinnungszeit ab. Die maximale Meßzeit kann von Gerät zu Gerät bzw. Meßmethode zu Meßmethode variieren. Die Konzentration der Fibrinogen aktivierenden Substanz wird dabei bevorzugt derart eingestellt, daß gegen Ende der maximalen Meßzeit eine Gerinnung eintritt, trotz einer hohen Heparinkonzentration in der Probe. The respective concentration of the further fibrinogen-activating system can best be described by a specialist using routine tests Samples from patients on heparin therapy are identified. This Concentration naturally depends on the device used to measure the Clotting time from. The maximum measuring time can vary from device to device or Measurement method vary from measurement method. The concentration of fibrinogen activating substance is preferably set such that against Coagulation occurs at the end of the maximum measuring time, despite a high one Heparin concentration in the sample.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Charak terisierung einer Plasma- oder Vollblutprobe, vorzugsweise einer Plasma probe, durch Messung der Zeit zwischen der Zugabe eines gerinnungslösen den Reagenzes und dem Auftreten der Gerinnselbildung, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es neben Thrombin mindestens ein zusätzliches Fibrinogen aktivierendes System enthält. Die Konzentration dieses zusätzlichen Fibrinogen aktivierenden Systems wird je nach Gerät und Meßmethode so gewählt, daß bei den üblicherweise zu erwartenden Heparin-Konzentrationen die Gerinnselbildung noch innerhalb der maximalen Meßdauer erfolgt. Hierdurch wird erreicht, daß bei Proben, bei denen aufgrund der hohen Heparinkonzentration keine Bestimmung der Gerin nungszeit mehr möglich war bzw. für diese Bestimmung weitere Messungen notwendig werden, nun eine einfache Bestimmung möglich ist. Dieses Verfahren kann mit den oben beschriebenen Reagenzien durchgeführt werden und wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:Another object of the invention is a method for character terization of a plasma or whole blood sample, preferably a plasma sample, by measuring the time between the addition of a clot the reagent and the occurrence of clot formation, which thereby is characterized in that in addition to thrombin there is at least one additional Fibrinogen activating system contains. The concentration of this additional fibrinogen activating system will depend on the device and Measurement method chosen so that the usual expected Heparin concentrations the clot formation still within the maximum Measurement time takes place. This ensures that for samples in which due to the high heparin concentration, no determination of the gerin time was more possible or further measurements for this determination become necessary, a simple determination is now possible. This Process can be performed with the reagents described above are and are explained in more detail by the following examples:
In der Zeichnung stellen dar:In the drawing:
Fig. 1 eine graphische Darstellung der Gerinnselbildungszeit in Abhängig keit von der Heparinkonzentration, welche die Nichtlinearität der Kurve deutlich macht; Fig. 1 is a graphical representation of the clot formation time as a function of the heparin concentration, which shows the non-linearity of the curve;
Fig. 2 eine schematische Darstellung der Zeit für die Gerinnselbildung in Abhängigkeit von der Heparinmenge mit einem Thrombinzeitreagenz des Standes der Technik; Fig. 2 is a schematic representation of the time of clot formation as a function of the amount of heparin with a Thrombinzeitreagenz of the prior art;
Fig. 3 eine schematische Darstellung der Kurve der Gerinnselbildung in Abhängigkeit von der Zeit bei Zusatz von Batroxobin alleine; Figure 3 is a schematic representation of the curve of clot formation as a function of time when Batroxobin alone is added.
Fig. 4 eine schematische Darstellung der Abhängigkeit der Gerinnselbil dung von der Heparinmenge bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenz. Sie zeigt, daß bei normalem Plasma die Thrombinzeit nicht geändert wird, bei Plasma mit hohem Heparingehalt eine Gerinnselbildung innerhalb eines vorgegebenen Zeitrahmens stattfindet; Fig. 4 is a schematic representation of the dependence of the clot formation on the amount of heparin when using the reagent according to the invention. It shows that with normal plasma the thrombin time is not changed, with plasma with a high heparin content a clot formation takes place within a given time frame;
Fig. 5 eine graphische Darstellung der Thrombinzeitkurve in Gegenwart unterschiedlicher Mengen von Heparin für das Reagenz von Beispiel 1, welches Calciumionen enthält und welche die erfindungsgemäß erreichte Verbesserung des dynamischen Bereichs verdeutlicht; Fig. 5 is a graph showing the Thrombinzeitkurve in the presence containing various amounts of heparin for the reagent of Example 1, calcium ions, and which illustrates the improvement of the dynamic range according to the invention reached;
Fig. 6 eine graphische Darstellung einer Kurve, wie in Fig. 5 für das Reagenz von Beispiel 2, welches keine Calciumionen enthält; Figure 6 is a graphical representation of a curve as in Figure 5 for the reagent of Example 2 which contains no calcium ions;
Fig. 7 eine graphische Darstellung einer Kurven wie in Fig. 5 für das Reagenz von Beispiel 3, welches als weiteres Fibrinogen aktivierendes System Ecarin enthält (Kurve 2) im Vergleich zur Kurve 1 mit einem handelsüblichen Thrombinzeitreagenz (Kurve 1) und der bei Herabsetzung der Menge Probe im Verhältnis zum Reagenz erhaltenen Kurve 3; Fig. 7 is a graphical representation of a curve as in Fig. 5 for the reagent of Example 3, which contains Ecarin as a further fibrinogen-activating system (curve 2 ) compared to curve 1 with a commercially available thrombin time reagent (curve 1 ) and that when the Amount of sample in relation to the reagent curve 3 obtained ;
Fig. 8 eine graphische Darstellung der Thrombinzeitkurve für Beispiel 4 mit PTT-Reagenz als weiterem Fibrinogen aktivierenden System im Vergleich mit der Kurve, die mit Thrombin alleine erhalten wird. Fig. 8 is a graphical representation of the Thrombinzeitkurve for Example 4 with PTT reagent as a further fibrinogen activating system in comparison with the curve obtained with thrombin alone.
Nachfolgend werden Beispiele für Zusammensetzungen des erfindungsge mäßen Reagenz angegeben.Below are examples of compositions of the Invention reagent specified.
Das Reagenz besteht aus:
The reagent consists of:
0,25% Rinderserumalbumin
12,5 mM CaCl2
10 mM Tris-Puffer, pH 7,4
50 mM NaCl
1,5 NlH/ml Thrombin
0,24 BU/ml Batroxobin.0.25% bovine serum albumin
12.5 mM CaCl 2
10 mM Tris buffer, pH 7.4
50 mM NaCl
1.5 NlH / ml thrombin
0.24 BU / ml batroxobin.
Die Bestimmung der Thrombinzeit erfolgte, indem ein Teil Plasma von 37°C mit einem Teil Reagenz zur Zeit 0 gemischt und anschließend die Zeit bis zur Gerinnung gemessen wird. Die Messung erfolgte mit einem handelsüblichen STA Analyzer.The thrombin time was determined using a part of plasma at 37 ° C. mixed with a part of reagent at time 0 and then the time until Coagulation is measured. The measurement was carried out with a commercially available one STA Analyzer.
Die mit diesem Reagenz erreichte Thrombinzeitkurve ist in Fig. 5 darge stellt.The thrombin time curve achieved with this reagent is shown in FIG. 5.
Das erfindungsgemäße Reagenz hat folgende Zusammensetzung:
The reagent according to the invention has the following composition:
0,25% Rinderserumalbumin
10 mM Tris-Puffer, pH 7,4
60 mM NaCl
1,5 NlH/ml Thrombin
0,22 BU/ml Batroxobin.0.25% bovine serum albumin
10 mM Tris buffer, pH 7.4
60 mM NaCl
1.5 NlH / ml thrombin
0.22 BU / ml batroxobin.
Die Messung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.The measurement was carried out as described in Example 1.
Die mit diesem calciumfreien Reagenz erzielte Thrombinzeitkurve ist in Fig. 6 dargestellt. The thrombin time curve obtained with this calcium-free reagent is shown in FIG. 6.
Zusammensetzung des Reagenz:
Composition of the reagent:
0,25% Rinderserumalbumin
12,5 mM CaCl2
10 mM Tris-Puffer, pH 7,4
50 mM NaCl
1,5 NlH/ml Thrombin
0,02 U/ml Ecarin.0.25% bovine serum albumin
12.5 mM CaCl 2
10 mM Tris buffer, pH 7.4
50 mM NaCl
1.5 NlH / ml thrombin
0.02 U / ml ecarin.
Die Messung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.The measurement was carried out as described in Example 1.
Die mit diesem Reagenz erhaltene Thrombinzeitkurve ist in Fig. 7 dargestellt im Vergleich mit der bei einem handelsüblichen Thrombinzeitrea genz erhaltenen Kurve in vorgeschriebener Dosierung und einer mit dem gleichen handelsüblichen Reagenz erhaltenen Kurve mit herabgesetzter Dosierung.The thrombin time curve obtained with this reagent is shown in FIG. 7 in comparison with the curve obtained with a commercial thrombin time reagent in the prescribed dosage and a curve obtained with the same commercial reagent with reduced dosage.
Das Reagenz hat folgende Zusammensetzung:
The reagent has the following composition:
0,25% Rinderserumalbumin
12,5 mM CaCl2
10 mM Tris-Puffer, pH 7,4
50 mM NaCl
1,5 NlH/ml Thrombin
2,5 µl/ml aPTT.0.25% bovine serum albumin
12.5 mM CaCl 2
10 mM Tris buffer, pH 7.4
50 mM NaCl
1.5 NlH / ml thrombin
2.5 µl / ml aPTT.
Die Messung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.The measurement was carried out as described in Example 1.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997131684 DE19731684A1 (en) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | Reagent for determining plasma sample by measuring clotting time |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997131684 DE19731684A1 (en) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | Reagent for determining plasma sample by measuring clotting time |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19731684A1 true DE19731684A1 (en) | 1999-02-18 |
Family
ID=7836664
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1997131684 Ceased DE19731684A1 (en) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | Reagent for determining plasma sample by measuring clotting time |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19731684A1 (en) |
-
1997
- 1997-07-23 DE DE1997131684 patent/DE19731684A1/en not_active Ceased
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1734369B1 (en) | Procedure for the standardisation of coagulation tests | |
| EP0915340B1 (en) | Process for the determination of the anticoagulant potential of a sample and process for the determination of the glycosylation of thrombomodulin | |
| EP2079849B1 (en) | Methods and apparatuses for electrochemical determination of factor xa inhibitors in blood samples | |
| EP0537490B1 (en) | Functional test and reagent for determining fibrinogen | |
| EP0137269B1 (en) | Process for the simultaneous determination of fibrinogen and cleavage products of fibrinogen in plasma | |
| DE69108896T2 (en) | METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF ANTICOAGULANTS. | |
| EP0661383B1 (en) | Method for the determination of thrombocyte aggregation | |
| DE2461969A1 (en) | STABLE BLOOD PLASMA, THE PROCESS FOR PRODUCING IT AND ITS USE AS A COMPARATIVE PLASMA IN COOLAGE EXAMINATIONS | |
| DE69521470T2 (en) | CALIBRATOR FOR PROTHROMBIN TIME ASSAYS | |
| EP1752772A1 (en) | Assay for determination of heparin based on factor Xa using a heparin-modifying component | |
| EP0711838A1 (en) | Method to specifically detect an activated clothing factor V with an increased stability vis à vis activated protein C | |
| DE69427115T2 (en) | METHOD FOR MEASURING ANTITHROMBIN III ACTIVITY | |
| DE3722082A1 (en) | METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF SERINE PROTEASES OR SERINE PROTEASE INHIBITORS | |
| DE60309785T2 (en) | Reagent kit for detection of lupus anticoagulant | |
| EP0062310B1 (en) | Reagent for the optical determination of blood clotting reaction | |
| EP0656424B1 (en) | Assay to determine the sensitivity to activated protein C | |
| DE69016858T2 (en) | Method and reagent kit for determining the functional activity of Protein S in human plasma. | |
| DE2601372C3 (en) | Method for the determination of antithrombin III | |
| AT399055B (en) | METHOD FOR DETERMINING FIBRINOGENS | |
| EP2000805A1 (en) | Stable D-dimer fluid preparation | |
| DE19731684A1 (en) | Reagent for determining plasma sample by measuring clotting time | |
| DE10362199B4 (en) | Detection method for fibrinogen | |
| EP0570356A1 (en) | Reagent for the determination of the activated partial thromboplastin time (aPII) | |
| EP0408075B1 (en) | Method and reagent for the determination of antithrombin III | |
| EP0570355B1 (en) | Use of prothrombin fragments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, 68305 MANNHEIM, DE |
|
| 8131 | Rejection |