DE19726823A1

DE19726823A1 - Detoxification proteins

Info

Publication number: DE19726823A1
Application number: DE1997126823
Authority: DE
Inventors: Christian Dipl Biol Praml; Manfred Prof Dipl Biol Schwab
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Praml Christian Dr 68535 Edingen-Neckarhausen
Priority date: 1997-06-24
Filing date: 1997-06-24
Publication date: 1999-01-07
Also published as: WO1998059055A3; WO1998059055A2

Abstract

Proteins are disclosed which can neutralise the effect of genotoxic and/or cytotoxic substances, as well as DNAs that code for these proteins and a process for producing the same. Also disclosed are the use of the DNAs and proteins, as well as antibodies against these proteins.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die befähigt sind die Wirkung geno- und/oder zytotoxischer Substanzen aufzuheben, solche kodierende DNAs und ein Verfahren zur Herstellung. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNAs und der Proteine sowie gegen die Proteine gerichtete Antikörper.The present invention relates to proteins that are capable of geno- and / or to abolish cytotoxic substances, such coding DNAs and a method of manufacture. The invention also relates to the use of the DNAs and the proteins as well as antibodies directed against the proteins.

Es gibt eine Anzahl toxischer Substanzen, deren metabolische Abbauprodukte im menschlichen oder tierischen Organismus Schäden, im schlimmsten Fall Krebs, verursachen. Ein typisches Beispiel für solche Substanzen sind die Aflatoxine. Aflatoxine werden z. B. vom Schimmelpilz Aspergillus flavus produziert und befinden sich als Verunreinigungen in der Nahrung, wie z. B. in Getreide, Soja bohnen und Erdnüssen. Aflatoxine sind relativ hitzestabil, besonders Aflatoxin B₁, weshalb das Rösten von Erdnüssen bei 180°C nur ca. 40-73% der Aflatoxi ne zerstört. In Untersuchungen zur Toxizität und karzinogenen Wirkung von Aflatoxinen an vielen unterschiedlichen Tierarten wurde gezeigt, daß sie Leber zell-Karzinome, kolorektale Karzinome, Cholangio-Karzinome, Lungen-Adenome und -Karzinome, osteogene Sarkome, Adenokarzinome der Gallenblase und des Gallengangs, Pankreas-Karzinome, Brust-, Zervix- und Hirntumore auslösen können.There are a number of toxic substances whose metabolic breakdown products cause damage, in the worst case cancer, in the human or animal organism. Aflatoxins are a typical example of such substances. Aflatoxins are z. B. produced by the mold Aspergillus flavus and are found as impurities in food, such as. B. in cereals, soybeans and peanuts. Aflatoxins are relatively heat-stable, especially aflatoxin B ₁ , which is why roasting peanuts at 180 ° C only destroys approx. 40-73% of the aflatoxins. Studies of the toxicity and carcinogenic effects of aflatoxins in many different animal species have shown that they can cause liver cell carcinomas, colorectal carcinomas, cholangiocarcinomas, lung adenomas and carcinomas, osteogenic sarcomas, adenocarcinomas of the gallbladder and bile duct, and pancreatic carcinomas , Breast, cervical and brain tumors.

Als Verbindungen, die bzw. deren metabolische Abbauprodukte im Körper Schäden anrichten, sind weiter Malondialdyd, Abbauprodukte des Fettstoff wechsels und Retinalstoffwechsels sowie Arachidonsäurestoffwechsels bei Entzündungsreaktionen zu nennen.As compounds that or their metabolic breakdown products in the body Further causing damage are malondialdyd, a breakdown product of the fatty substance and retinal metabolism as well as arachidonic acid metabolism To name inflammatory reactions.

Da viele metabolische Abbauprodukte von in den Körper aufgenommenen bzw. Since many metabolic breakdown products are absorbed or absorbed in the body.

schon dort vorhandenen Substanzen, insbesondere der oben genannten Aflato xine, als hoch geno- und/oder zytotoxisch anzusehen sind, besteht der Bedarf nach einer weiteren Aufklärung der Wirkung solcher Verbindungen und damit verbunden nach einem Mittel, das die Wirkung dieser aufheben und wieder rückgängig kann (Detoxifizierung).substances already present there, especially the aflato mentioned above There is a need for xins, which are to be regarded as highly genotoxic and / or cytotoxic after further clarification of the effect of such compounds and thus connected for a means that cancel the effect of this and again can be reversed (detoxification).

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, das im Sinne eines Detoxifizierungsystems die Wirkung geno- und/oder zytotoxischer Substanzen aufheben und wieder rückgängig machen kann.The present invention is therefore based on the object of providing a means represent, which in the sense of a detoxification system, the effect geno- and / or can cancel and reverse cytotoxic substances.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.According to the invention, this is provided by the subjects in the claims achieved.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Proteine, die sich als Detoxifi kanten eignen, wobei die Proteine die Aminosäuresequenz von Fig. 1, 2, 3, 4 oder 5 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfassen.The present invention thus relates to proteins which are suitable as detoxifiants, the proteins comprising the amino acid sequence of FIGS. 1, 2, 3, 4 or 5 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß in Tieren, besonders Säugetieren, ganz besonders dem Menschen, Proteine exi stieren, die eine Detoxifizierung des Organismus bewirken. Diese Proteine umfassen die Aminosäuresequenz von Fig. 1, 2, 3, 4 oder 5 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz.The present invention is based on the applicant's finding that in animals, especially mammals, especially humans, proteins exist which cause detoxification of the organism. These proteins comprise the amino acid sequence of FIGS. 1, 2, 3, 4 or 5 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids.

Die in den Fig. 1 bis 3 gezeigten Proteine sind menschliche Proteine, während die in den Fig. 4 und 5 gezeigten Proteine die entsprechenden aus Maus dar stellen. Alle diese Proteine wirken im Sinne einer Reduktase und sind geeignet, eine Detoxifizierung geno- und/oder zytotoxischer Substanzen herbeizuführen. Es wurde nämlich gefunden, daß diese Proteine (Enzyme) in der Lage sind, die karzinogenen Abbauprodukte des Aflatoxin-B₁ so umzubauen, daß dessen tumorauslösende Wirkung beseitigt und die Tumorentstehung insbesondere in der Leber gänzlich verhindert werden kann. Die erfindungsgemäßen Proteine katalysieren dabei die Bildung eines Dialkohols aus der toxischen Dialdyd-Form des Aflatoxin B₁-8,9-dihydrodiols. An dessen Entstehung über das ebenfalls toxische AFB₁-8,9-epoxid sind Gluthation-S-Transferasen und Cytochrom P450 beteiligt.The proteins shown in FIGS. 1 to 3 are human proteins, while the proteins shown in FIGS. 4 and 5 represent the corresponding ones from mouse. All of these proteins act in the sense of a reductase and are suitable for detoxifying genotoxic and / or cytotoxic substances. It has been found that these proteins (enzymes) are able _{to convert the carcinogenic degradation products of aflatoxin B 1 in} such a way that its tumor-inducing effect can be eliminated and the development of tumors, especially in the liver, can be completely prevented. The proteins according to the invention catalyze the formation of a dialcohol from the toxic dialdyd form of aflatoxin B ₁ -8,9-dihydrodiol. Glutathione-S-transferases and cytochrome P450 are involved in its formation via the likewise toxic AFB _{1 -8,9-epoxide.}

In der vorliegenden Erfindung werden vorstehende Proteine mit CPRM (Chemo protector Regulated Modifier) bezeichnet.In the present invention, the above proteins with CPRM (Chemo Protector Regulated Modifier).

Die genetische Information für das mit CPRM 1 (Fig. 1) bezeichnete menschliche Protein befindet sich auf dem Chromosom 1p35-36. Es ist somit in einer Region, die in vielen unterschiedlichen Tumorarten sehr häufig deletiert ist, weshalb eine Beeinträchtigung seiner Funktion erwartet werden kann, ähnlich wie bei Tumor suppressorgenen. CPRM 2, CPRM 3 und mCprm 1r bzw. mCprm 1s wurden aufgrund ihrer starken Homologien zu CPRM 1 kloniert und deren chromosomale Lokalisationen befinden sich nach letzten Befunden der Erfinder ebenfalls in Regionen des Genoms, in denen aufgrund mannigfaltiger Untersuchungen krebsrelevante Gene zu erwarten sind.The genetic information for the human protein designated CPRM 1 (FIG. 1) is located on chromosome 1p35-36. It is therefore in a region that is very often deleted in many different tumor types, which is why an impairment of its function can be expected, similar to that of tumor suppressor genes. CPRM 2, CPRM 3 and mCprm 1r or mCprm 1s were cloned because of their strong homologies to CPRM 1 and, according to the inventors' latest findings, their chromosomal locations are also located in regions of the genome in which cancer-relevant genes are to be expected on the basis of various studies.

Das in Fig. 6 gezeigte Protein stellt wohl ein Allel zu CPRM 2 dar und zeigt ein aufgrund einer DNA-Mutation verkürztes Protein. Die Person von der dieses Protein stammt, weist möglicherweise kein funktionelles Protein auf und hat deshalb wahrscheinlich ein erhöhtes Krebsrisiko.The protein shown in FIG. 6 probably represents an allele to CPRM 2 and shows a shortened protein due to a DNA mutation. The person who received this protein may not have a functional protein and is therefore likely to be at increased risk of cancer.

Die in den Fig. 4 und 5 gezeigten Mausproteine (mCprm 1r und mCprm 1s) stellen zueinander Allele dar.The mouse proteins shown in FIGS. 4 and 5 (mCprm 1r and mCprm 1s) represent alleles to one another.

Desweiteren wurde mit Hilfe eines Maus-Modells für Familiäre Adenomatöse Polyposis Coli (FAP) gezeigt, daß bei der Maus in der syntenischen Region des menschlichen Chromosoms 1p35-36 ein Gen lokalisiert sein muß, welches in diesem Modell als Modifikator für Darmkrebs verstanden werden kann, weil es die Anzahl der im Darm bestehenden Neoplasien bestimmt. Von den Erfindern wurde nun herausgefunden, daß das erfindungsgemäße mCprm die wichtigen Voraussetzungen erfüllt, daß es in der richtigen chromosomalen Region codiert wird und daß bestimmte Inzucht-Labormausstämme unterschiedliche Ausprägun gen davon enthalten. Toxizitätsuntersuchungen an den Labormausstämmen BALB/c und C57/B16, von denen die beiden mCprm 1-Allele entstammen, weisen ebenfalls eine unterschiedliche Resistenz gegenüber Aflatoxin B₁ auf. Der hierbei größere Resistenz zeigende Stamm BALB/c stellt auch in dem oben beschriebenen Modifikator-Modell für Darmkrebs das resistentere Allel, d. h. es entstehen weniger Neoplasien als im Falle des C57/B16-Allels.Furthermore, with the help of a mouse model for familial adenomatous polyposis coli (FAP) it was shown that a gene must be localized in the mouse in the syntenic region of the human chromosome 1p35-36, which in this model can be understood as a modifier for colon cancer, because it determines the number of neoplasms present in the intestine. The inventors have now found that the mCprm according to the invention meets the important requirements that it is encoded in the correct chromosomal region and that certain inbred laboratory mouse strains contain different Ausprägun conditions thereof. Toxicity studies on the laboratory strains BALB / c and C57 / B16, from which the two mCprm 1 alleles originate, also show different levels of resistance to aflatoxin B ₁ . The strain BALB / c, which shows greater resistance here, also represents the more resistant allele in the modifier model for colon cancer described above, ie fewer neoplasias arise than in the case of the C57 / B16 allele.

In Modellversuchen wurde erkannt, daß Antioxidantien, z. B. Ethoxiquin (6- Ethoxy-1,2-dihydro-2,2,4-trimethylchinolin), Phenobarbital, Oltipraz(5-(2-pyrazi nyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thion), BHA (butyliertes Hydroxyanisol) und butylier tes Hydroxytoluol in der Lage sind, die Expression von CPRM zu erhöhen, wodurch beispielsweise die karzinogenen Abbauprodukte des Aflatoxins schnel ler unschädlich gemacht werden kann. So ist es bevorzugt, Antioxidantien zu sätzlich zu verabreichen, um die Expression der Detoxifizierungsproteine anzure gen.In model experiments it was recognized that antioxidants, e.g. B. Ethoxiquin (6- Ethoxy-1,2-dihydro-2,2,4-trimethylquinoline), phenobarbital, oltipraz (5- (2-pyrazi nyl) -4-methyl-1,2-dithiol-3-thione), BHA (butylated hydroxyanisole) and butylated tes hydroxytoluene are able to increase the expression of CPRM, whereby, for example, the carcinogenic breakdown products of aflatoxin quickly ler can be rendered harmless. So it is preferred to have antioxidants too to be administered additionally to increase the expression of the detoxification proteins gene.

Von den erfindungsgemäßen CPRM-Proteinen werden beispielsweise 4-NBA (4- Nitrobenzaldehyd), SSA (Bernsteinsäure-Semialdehyd) und 9,10-PQ(9,10-Phen anthrachinon) als Substrate umgesetzt.Of the CPRM proteins according to the invention, for example, 4-NBA (4- Nitrobenzaldehyde), SSA (succinic acid semialdehyde) and 9,10-PQ (9,10-phen anthraquinone) implemented as substrates.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind für CPRM kodierende Nukleinsäuren. Diese können eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z. B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgen des umfaßt:
The present invention also relates to nucleic acids coding for CPRM. These can be an RNA or a DNA. The latter can e.g. B. be a genomic DNA or a cDNA. Preferred is a DNA which comprises the following:

(a) the DNA of Fig. 7, 8, 9, 10 or 11 or a DNA different therefrom by one or more base pairs,
(b) a DNA which hybridizes with the DNA of (a), or
(c) one with the DNA from (a) or (b) above the degenerate genetic Code related DNA.

Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.The term "hybridizing DNA" refers to DNA that is classified under conventional Conditions, especially at 20 ° C below the melting point of the DNA, with hybridized to a DNA of (a).

Die in Fig. 12 gezeigte DNA stellt ein Allel zu der in Fig. 8 gezeigten DNA von CPRM 2 dar. Diese cDNA weist eine Nonsense-Mutation auf, weshalb nur ein sehr verkürztes Protein (s. Fig. 6) exprimiert wird.The DNA shown in FIG. 12 represents an allele to the DNA of CPRM 2 shown in FIG. 8. This cDNA has a nonsense mutation, which is why only a very shortened protein (see FIG. 6) is expressed.

Die DNAs der Fig. 7 bis 12 wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig) am 11. Juni 1997 als E. coli- Kulturen hinterlegt:
The DNAs of FIGS. 7 to 12 were deposited with the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig) on June 11, 1997 as E. coli cultures:

CPRM 1 - A21261CPRM 1 - A21261 DSM 11596DSM 11596 mCprm 1s - 518470mCprm 1s - 518470 DSM 11597DSM 11597 mCprm 1r - 571384mCprm 1r - 571384 DSM 11598DSM 11598 CPRM 2 - SKRV5CPRM 2 - SKRV5 DSM 11599DSM 11599 CPRM 2 - SKRVA8CPRM 2 - SKRVA8 DSM 11600DSM 11600 CPRM 3 - SKRV7CPRM 3 - SKRV7 DSM 11601DSM 11601

Nachstehend wird eine erfindungsgemäße DNA in Form einer cDNA beschrieben. Diese steht beispielhaft für jede unter die vorliegende Erfindung fallende DNA.A DNA according to the invention in the form of a cDNA is described below. This is an example of each DNA falling under the present invention.

Eine erfindungsgemäße cDNA kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Günstig ist es von einer humanen Expressions-Bibliothek auszugehen und diese mit der DNA von Fig. 7, 8 oder 9, insbesondere mit Primern, die den 5'- bzw. 3'-Bereich betreffen, zu screenen. Als Hybridisierungs-Bedingungen können übliche, insbesondere vorstehend angegebene, gewählt werden. Für eine murine cDNA wird entsprechend von einer Maus-Expressions-Bibliothek ausgegangen und mit der DNA von Fig. 10 oder 11 gescreent. Positive Klone können dann auf ihre Detoxifizierungsaktivität in üblichen Verfahren getestet werden.A cDNA according to the invention can be produced by conventional methods. It is favorable to start from a human expression library and to screen it with the DNA of FIGS. 7, 8 or 9, in particular with primers which relate to the 5 'or 3' region. The hybridization conditions that can be selected are customary, in particular those specified above. For a murine cDNA, a mouse expression library is assumed and the DNA from FIG. 10 or 11 is used for screening. Positive clones can then be tested for detoxification activity in standard procedures.

Eine erfindungsgemäße cDNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Ex pressionsvektors für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDMB und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.A cDNA according to the invention can be in a vector or expression vector are present. Examples of such are known to the person skilled in the art. In the case of an ex pressure vector for E. coli are z. B. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b and pQE-8. For expression in yeast, for. B. pY100 and Ycpad1 too call, while for expression in animal cells z. B. pKCR, pEFBOS, cDMB and pCEV4. Suitable for expression in insect cells the baculovirus expression vector pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende cDNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.The person skilled in the art knows suitable cells to an inventive, in a Expression vector to express the cDNA present. Examples of such cells include E. coli strains HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 and SG 13009, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa as well as the insect cells sf9.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße cDNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße cDNA in Form eines Fu sionsproteins exprimiert werden kann.The person skilled in the art knows how a cDNA according to the invention is converted into a Expression vector must be inserted. He is also aware that this DNA in connection with a DNA coding for another protein or peptide can be inserted so that the cDNA according to the invention in the form of a Fu sion protein can be expressed.

Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße cDNA exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Ein solches Protein, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.Furthermore, the person skilled in the art knows conditions, transformed or trans cultivate infected cells. He is also aware of processes that are carried out by the cDNA of the invention to isolate and purify expressed protein. A such a protein, which can also be a fusion protein, is thus likewise Subject of the present invention.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragment davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklona len Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.Another object of the present invention is a protrude against a of the protein or fusion protein directed antibodies. Such an antibody can be prepared by conventional methods. It can be polyclonal or be monoclonal. For its production it is favorable to animals, in particular Rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclona len antibody, with a preceding (fusion) protein or fragment thereof to immunize. Further "boosters" of the animals can be added with the same (Fu sions) protein or fragments thereof. The polyclonal antibody can can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclona len antibodies, spleen cells of the animals are fused with myeloma cells.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, geno- und/oder zytotoxische Substan zen, insbesondere Aflatoxine und ihre Wirkungen z. B. bei Krebserkrankungen im Detail zu untersuchen. Mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, und hiervon abgeleiteten Primern, kann in Säugetieren, insbesondere dem Menschen, festgestellt werden, ob sie ein vollständig aktives, ein funktio nell unterschiedliches oder gar durch eine Mutation inaktiviertes Gen enthalten und/oder exprimieren, das für ein CPRM-Protein im vorstehenden Sinne kodiert, und somit möglicherweise zur Gruppe mit erhöhtem Risiko für Krebsentstehung gehören. Hierzu wird der Fachmann übliche Verfahren, wie Reverse Transkrip tion, PCR-Reaktion, Hybridisierung und Sequenzierung, durchführen. Erfindungs gemäß wird auch ein Kit bereitgestellt, der eine vorstehende Nukleinsäure, insbesondere DNA, und/oder hiervon abgeleitete Primer sowie Träger und übliche Hilfsstoffe enthält.The present invention enables genotoxic and / or cytotoxic substances zen, especially aflatoxins and their effects z. B. in cancer in the Examine detail. With a nucleic acid according to the invention, in particular a DNA, and primers derived therefrom, can in mammals, in particular the human being can be determined whether they are a fully active, a func nell different genes or genes that have been inactivated by a mutation and / or express which codes for a CPRM protein in the above sense, and thus possibly to the group with an increased risk of developing cancer belong. For this purpose, the person skilled in the art will use customary methods, such as reverse transcript Execution, PCR reaction, hybridization and sequencing. Invention accordingly, a kit is also provided which contains an above nucleic acid, in particular DNA, and / or primers derived therefrom and carriers and Contains the usual auxiliaries.

Ferner wird durch die vorliegende Erfindung ein Mittel bereitgestellt, durch das Schäden, die durch genotoxische Substanzen, insbesondere Aflatoxine, hervor gerufen worden sind, rückgängig gemacht werden können. Ein erfindungsgemä ßes CPRM-Protein kann in Säugetieren, insbesondere den Menschen, einge bracht werden. Hierzu kann es günstig sein, CPRM an ein vom jeweiligen Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder BSA, zu koppeln. Auch kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, in Säugetieren, insbesondere den Menschen, eingebracht und dort exprimiert werden. Hierzu kann es günstig sein, die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure unter die Kontrolle eines Gewebe-spezifischen Promotors zu stel len. Vektoren, die für die Expression einer Nukleinsäure in Säugetieren geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt. Desweiteren kann mit einem erfindungs gemäßen Antikörper die Expression von CPRM kontrolliert und reguliert werden. Der Antikörper kann ferner in vorstehendem Kit vorliegen, um z. B. die Konzen tration der Proteine in Gewebeschnitten (z. B. Tumoren) zu detektieren.Furthermore, the present invention provides a means by which Damage caused by genotoxic substances, especially aflatoxins have been called can be reversed. An inventive ßes CPRM protein can be incorporated in mammals, especially humans be brought. For this, it may be beneficial to take CPRM on one of the individual's bodies protein not regarded as foreign, e.g. B. Transferrin or BSA to couple. A nucleic acid according to the invention, in particular a DNA, can also be in Mammals, especially humans, introduced and expressed there will. For this purpose, it can be advantageous to express the To put nucleic acid under the control of a tissue-specific promoter len. Vectors suitable for the expression of a nucleic acid in mammals are known to the person skilled in the art. Furthermore, with an invention according to antibodies the expression of CPRM can be controlled and regulated. The antibody can also be present in the above kit, e.g. B. the conc Tration of proteins in tissue sections (e.g. tumors) to be detected.

Die vorliegende Erfindung stellt somit einen großen Beitrag zur diagnostischen und therapeutischen Erfassung von geno- und/oder zytotoxischen Prozessen dar. Die diagnostische Erfassung kann dabei nicht nur post-, sondern bereits auch pränatal erfolgen und einen Schritt bei der Krebsprävention darstellen.The present invention thus makes a great contribution to diagnostic and therapeutic detection of genotoxic and / or cytotoxic processes. The diagnostic recording can not only post, but also already be done prenatally and represent a step in cancer prevention.

Brief description of the figures

Fig. 1 zeigt die Basensequenz, die von einem erfindungsgemäßen men schlichen CPRM-Protein (CPRM 1) umfaßt ist.
Die Sequenz von Fig. 1 wird durch DSM 11596 codiert. Fig. 1 shows the base sequence which is comprised by a men creeping CPRM protein (CPRM 1) according to the invention.
The sequence of Figure 1 is encoded by DSM 11596.

Fig. 2 zeigt die Basensequenz, die von einem erfindungsgemäßen men schlichen CPRM-Protein (CPRM 2) umfaßt ist.
Die Sequenz von Fig. 2 wird durch DSM 11599 codiert. Fig. 2 shows the base sequence which is encompassed by a men creep CPRM protein (CPRM 2) according to the invention.
The sequence of Figure 2 is encoded by DSM 11599.

Fig. 3 zeigt die Basensequenz, die von einem erfindungsgemäßen men schlichen CPRM-Protein (CPRM 3) umfaßt ist.
Die Sequenz von Fig. 3 wird durch DSM 11601 codiert. Fig. 3 shows the base sequence which is encompassed by a men creeping CPRM protein (CPRM 3) according to the invention.
The sequence of Figure 3 is encoded by DSM 11601.

Fig. 4 zeigt die Basensequenz, die von einem erfindungsgemäßen Maus- CPRM-Protein (mCprm 1r) umfaßt ist.
Die Sequenz von Fig. 4 wird durch DSM 11598 codiert. Fig. 4 shows the base sequence (1r mCprm) of a mouse according to the invention comprises CPRM protein is.
The sequence of Figure 4 is encoded by DSM 11598.

Fig. 5 zeigt die Basensequenz, die von einem erfindungsgemäßen Maus- CPRM-Protein (mCprm 1s) umfaßt ist.
Die Sequenz von Fig. 5 wird durch DSM 11597 codiert. Fig. 5 shows the base sequence which is comprised of a mouse according to the invention CPRM protein (mCprm 1s).
The sequence of Figure 5 is encoded by DSM 11597.

Fig. 6 zeigt die Basensequenz, die von einem erfindungsgemäßen menschlichen mutierten CPRM-Protein umfaßt ist, wobei dieses durch ein Allel zu CPRM 2 codiert wird.
Die Sequenz von Fig. 6 wird durch DSM 11600 codiert. Fig. 6 shows the base sequence of an inventive human mutant protein comprises CPRM, wherein the latter is encoded by an allele to CPRM. 2
The sequence of Figure 6 is encoded by DSM 11600.

Fig. 7 zeigt die DNA-Sequenz, die für ein menschliches CPRM-Protein (CPRM 1) kodiert.
Die Sequenz von Fig. 7 findet sich in DSM 11596. Fig. 7 shows the DNA sequence coding for a human protein CPRM (CPRM 1).
The sequence of FIG. 7 can be found in DSM 11596.

Fig. 8 zeigt die DNA-Sequenz, die für ein menschliches CPRM-Protein (CPRM 2) kodiert.
Die Sequenz von Fig. 8 findet sich in DSM 11599. Fig. 8 shows the DNA sequence coding for a human protein CPRM (CPRM 2).
The sequence of Figure 8 can be found in DSM 11599.

Fig. 9 zeigt die DNA-Sequenz, die für ein menschliches CPRM-Protein (CPRM 3) kodiert.
Die Sequenz von Fig. 9 findet sich in DSM 11601. Fig. 9 shows the DNA sequence coding for a human protein CPRM (CPRM 3).
The sequence of FIG. 9 can be found in DSM 11601.

Fig. 10 zeigt die DNA-Sequenz, die für ein Maus-CPRM-Protein (mCprm 1r) kodiert.
Die Sequenz von Fig. 10 findet sich in DSM 11 598. Fig. 10 shows the DNA sequence which codes for a mouse CPRM protein (mCprm 1r).
The sequence of Figure 10 can be found in DSM 11598.

Fig. 11 zeigt die DNA-Sequenz, die für ein Maus-CPRM-Protein (mCprm 1s) kodiert.
Die Sequenz von Fig. 11 findet sich in DSM 11597. Fig. 11 shows the DNA sequence which codes for a mouse CPRM protein (mCprm 1s).
The sequence of FIG. 11 can be found in DSM 11597.

Fig. 12 zeigt die DNA-Sequenz, die für ein menschliches mutiertes CPRM- Protein kodiert, wobei dieses ein Allel zu CPRM 2 darstellt.
Die Sequenz von Fig. 12 findet sich in DSM 11600. FIG. 12 shows the DNA sequence which codes for a human mutated CPRM protein, this being an allele to CPRM 2.
The sequence of FIG. 12 can be found in DSM 11600.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. The present invention is illustrated by the following examples.

example 1 Production and purification of a CPRM-Pro according to the invention teins

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen CPRM-Proteins wird der kodierende Bereich der DNA von Fig. 7 mit Bam Hl-Linkern versehen, mit Bam Hl nach geschnitten und in den mit Bam Hl gespaltenen Expressionsvektor pQE-8 (Qia gen) inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pQ/CPRM erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen CPRM-Protein von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQ/CPRM wird zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesmann, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 30 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschlie ßend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusions protein einer 18% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733).To produce a CPRM protein according to the invention, the coding region of the DNA of FIG. 7 is provided with Bam HI linkers, cleaved with Bam HI and inserted into the expression vector pQE-8 (Qia gene) which has been cleaved with Bam HI. The expression plasmid pQ / CPRM is obtained. Such codes for a fusion protein of 6 histidine residues (N-terminus partner) and the CPRM protein according to the invention from FIG. 1 (C-terminus partner). pQ / CPRM is used to transform E. coli SG 13009 (cf. Gottesmann, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273). The bacteria are cultivated in an LB medium with 30 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml kanamycin and induced for 4 h with 60 μM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Lysis of the bacteria is achieved by adding 6 M guanidine hydrochloride, then chromatography (Ni-NTA resin) is carried out with the lysate in the presence of 8 M urea according to the manufacturer's instructions (Qiagen) of the chromatography material. The bound fusion protein is eluted in a buffer with pH 3.5. After its neutralization, the fusion protein is subjected to 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (cf. Thomas, JO and Kornberg, RD, J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733).

Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.It turns out that a (fusion) protein according to the invention is in a highly pure form can be produced.

Example 2 Production and detection of an antibody according to the invention

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beipiels 1 wird einer 18% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 20-60 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, be stimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsportein werden Tiere wie folgt immunisiert:An inventive fusion protein of Example 1 is an 18% Subjected SDS polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M. Sodium acetate, an approx. 20-60 kD band is cut out of the gel and incubated in phosphate buffered saline. Gel pieces will be sedimented before the protein concentration of the supernatant by a SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by Coomassie blue staining, be is true. With the gel-purified fusion protein, animals become as follows immunized:

Immunization Protocol for Rabbit Polyclonal Antibodies

Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
35 μg of gel-purified fusion protein in 0.7 ml of PBS and 0.7 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant are used per immunization.

Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten.Day 0: 1st immunization (complete Freund's adjuvant)
Day 14: 2nd immunization (incomplete Freund's adjuvant; icFA)
Day 28: 3rd immunization (icFA)
Day 56: 4th immunization (icFA)
Day 80: bleeding.

Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfin dungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse- Andersen), J., J.Biochem.Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wird wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter 1 h bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kanin chens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen- IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µm 5' Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.The rabbit's serum is tested in an immunoblot. For this purpose, a fusion protein according to the invention from Example 1 is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen), J., J.Biochem.Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Western blot analysis is performed as described in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229. For this purpose, the nitrocellulose filter is incubated for 1 hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody is the serum of the rabbit (1: 10000 in PBS). After several washing steps with PBS, the nitrocellulose filter is incubated with a second antibody. This antibody is an alkaline phosphatase-coupled monoclonal goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) in PBS. After incubation for 30 minutes at 37 ° C, several washing steps with PBS and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 µm 5 'bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 400 µM nitro blue tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂ ) at room temperature until bands are visible.

Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.It turns out that polyclonal antibodies according to the invention are produced can.

Polyclonal Antibody Immunization Protocol in Chicken

Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml kompletten bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
40 μg of gel-purified fusion protein in 0.8 ml of PBS and 0.8 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant are used per immunization.

Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA).Day 0: 1st immunization (complete Freund's adjuvant)
Day 28: 2nd immunization (incomplete Freund's adjuvant; icFA)
Day 50: 3rd immunization (icFA).

Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße polyklonale Antikörper nachgewiesen.Antibodies are extracted from egg yolk and tested in a Western blot. It polyclonal antibodies according to the invention are detected.

Immunization Protocol for Mouse Monoclonal Antibodies

Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkompletten Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
12 μg of gel-purified fusion protein in 0.25 ml of PBS and 0.25 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant are used per immunization; in the 4th immunization, the fusion protein is dissolved in 0.5 ml (without adjuvant).

Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion.Day 0: 1st immunization (complete Freund's adjuvant)
Day 28: 2nd immunization (incomplete Freund's adjuvant; icFA)
Day 56: 3rd immunization (icFA)
Day 84: 4th immunization (PBS)
Day 87: Fusion.

Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs gemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.Hybridoma supernatants are tested in a Western blot. Invention appropriate monoclonal antibodies are detected.

Claims

1. Protein capable of neutralizing the effect of genotoxic and / or cytotoxic substances, the protein comprising the amino acid sequence of FIGS. 1, 2, 3, 4 or 5, or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids.

2. DNA encoding the protein of claim 1, wherein the DNA comprises:

(a) the DNA of Fig. 7, 8, 9, 10 or 11, or a DNA different therefrom by one or more base pairs,
(b) a DNA which hybridizes with the DNA of (a) or
(c) a DNA related to the DNA of (a) or (b) via the degenerate genetic code.

3. Expression plasmid comprising the DNA of claim 2.

4. Transformant containing the expression plasmid according to claim 3.

5. A method for producing the protein according to claim 1, comprising the Cultivation of the transformant according to claim 4 under suitable conditions worked.

6. Antibodies directed against the protein according to claim 1.

7. Use of the protein according to claim 1 or the DNA according to claim 2 or antibodies according to claim 6 for detoxification geno- and / or cytotoxic metabolites.

8. Use of the protein according to claim 1 or the DNA according to claim 2 or antibodies according to claim 6 for diagnosing the presence a CPRM protein.

9. Kit to diagnose the presence of a CPRM protein comprising a DNA according to claim 2 and / or primers derived therefrom and Carriers and usual auxiliaries.