DE19716884A1

DE19716884A1 - 4'-Methyl-substituierte Fluoresceinderivate

Info

Publication number: DE19716884A1
Application number: DE19716884A
Authority: DE
Inventors: Mitali Ghoshal; Salvatore Joseph Salamone; Robert Sundoro Wu
Original assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1997-04-22
Publication date: 1997-10-30
Also published as: FR2748027B1; FR2748027A1; US5986094A; JPH1045764A; IT1298693B1; ITMI970847A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Reagenzien, die zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von 4′-Methyl-substi tuierten Fluorescein-Konjugaten, die als Tracer-Reagenzien in Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays geeignet sind.

Arzneimittelgehalte in Serumproben können mit kompetitiven Bindungs-Immunoassays bestimmt werden. Kompetitive Bindungs- Immunoassays zur Messung der Konzentration eines Analyten (auch als Ligand bezeichnet), wie eines Arzneimittels, in einer Testprobe basieren auf der Konkurrenz zwischen einem Liganden in einer Testprobe und einem markierten Reagenz, das als Tracer bezeichnet wird, um eine begrenzte Anzahl von Rezeptor-Bindungsstellen auf Antikörpern, die für Ligand und Tracer spezifisch sind. Die Konzentration des Liganden in der Probe bestimmt die Menge des Tracers, der spezifisch an einen Antikörper bindet. Die Menge an Tracer-Antikörper-Konjugat, die erzeugt wird, kann quantitativ gemessen werden und ist umgekehrt proportional zur Menge des Liganden in der Test probe.

Beispiele für Liganden oder Arzneimittel, die mit den Verfah ren der vorliegenden Erfindung meßbar sind, schließen Steroide, wie Östriol, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Östron, Cholesterin, Östradiol, Cortison, Testosteron, Pro gesteron, Chenodesoxycholsäure, Digoxin, Cholsäure, Digi toxin, Desoxycholsäure, Lithocholsäure und die Ester und Aminderivate davon; Vitamine, wie B-12, Folsäure, Thyroxin, Triiodthyroxin, Histamin, Serotonin, Prostaglandine, wie Prostaglandin E (PGE), Prostaglandin F (PGF), Prostaglandin A (PGA); antiasthmatische Arzneimittel, wie Theophyllin; anti neoplastische Arzneimittel, wie Doxorubicin und Methotrexat; antiarrhythmische Arzneimittel, wie Disopyramid, Lidocain, Procainamid, Propanolol, Chinidin, N-Acetylprocainamid; krampfhemmende Arzneimittel, wie Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Valproinsäure, Carbamazepin, Flecainid und Etho suximid; Antibiotika, wie Penicilline, Cephalosporine, Erythromycin, Vancomycin, Gentamycin, Amikacin, Chloramphe nicol, Streptomycin und Tobramycin; antiarthritische Mittel, wie Salicylate; Antidepressiva einschließlich von Tricyclica, wie Nortriptylin, Amitriptylin, Imipramin und Desipramin und dergleichen, ebenso wie die Metabolite davon, ein. Außerdem können Arzneimittel Mißbrauchs-Arzneimittel einschließen, wie Morphin, Heroin, Hydromophon, Oxymorphon, Methadon, Code in, Hydrocodon, Dihydrocodein, Dihydrohydroxycodeinon, Dextro metorphan, Phenazocin, Benzoylecgonin, Tetrahydrocannabinoide (THC), Barbiturate, Benzodiazepin, Lysergsäurediethylamid (LSD), Propoxyphen, Phencyclidin, Amphetamine, Methaqualon und deren Metabolite. Solche Substanzen können mit den erfin dungsgemäßen Verfahren gemessen werden. Außerdem können umweltverschmutzende Mittel mit den Verfahren der vorliegen den Erfindung gemessen werden. Beispiele für die umweltver schmutzenden Mittel schließen Pestizide, Herbizide, Insekti zide, Fungizide, wie polychlorierte Biphenyle (PCBs), Atra zin, Simazin, Terbutryn, s-Triazine, Amitrol, Trifluralin, Nortflurazon, Permethrin, Cypermethrin, Paraquat, Alachlor, Metolachlor, Chlorsulfuron, Phenyl-Harnstoff-Herbizide, Aldrin, Chlordan, Endosulan, Parathion, Dioxine, 2-Aminobenzimidazol, Pentachlorphenol, Benzo-α-pyren, poly aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) und deren Metabolite ein.

Es ist auf dem Gebiet der Immunoassays wohlbekannt, daß die Fluoreszenz-Polarisation (FP) ein quantitatives Mittel lie fert, um die Menge an Tracer-Antikörper-Konjugat, die in einem kompetitiven Bindungs-Immunoassay erzeugt wird, zu messen (siehe Biochem. Biophys. Res. Comm. 5 : 299, 1961). Im allgemeinen basieren Fluoreszenz-Polarisationstechniken auf dem Prinzip, daß eine mit Fluorescein markierte Verbindung, wenn sie mit linear polarisiertem Licht angeregt wird, Fluo reszenz mit einem Polarisationsgrad aus strahlt, der in umge kehrter Beziehung zur Drehungsrate steht.

Bei Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays (FPIA) ist die Fluoreszenz-Polarisation eine reproduzierbare Funktion der Liganden-oder Arzneimittel-Konzentration und ist daher ge eignet für die quantitative Bestimmung der Liganden- oder Arzneimittel-Konzentrationen im Serum, um therapeutische Arz neimittel zu überwachen. Wenn Tracer, Serum, das Antikörper, die für die zu messende Droge spezifisch sind, enthält, und arzneimittelfreies Patientenserum miteinander vermischt wer den, bindet der größte Teil des Tracers an die Antikörper. Wenn der gebundene Tracer mit polarisiertem Licht mit 489 nm angeregt wird, bleibt daher das bei 520 nm emittierte Licht stark polarisiert. Wenn jedoch Arzneimittel in der Patienten probe vorhanden ist, konkurriert das Arzneimittel mit dem Tracer um die Bindung an die Antikörper. Daher bleibt mehr Tracer ungebunden und das emittierte Licht wird depolari siert.

Ein erfindungsgemäßer FPIA kann irgendeine Art von automati siertem oder manuellem FPIA sein. Bevorzugt wird der FPIA an dem automatisierten chemischen System COBAS FARA II® (Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg, N.J. USA) durchgeführt, der die Bindung von mit Fluorescein markiertem Arzneimittel (dem Tracer) an spezifische Antikörper messen kann (siehe Dandliker und Feigen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 5 : 299, 1961).

Bei dem FPIA können die Ergebnisse als Millipolarisations einheiten (mP) quantifiziert werden, aus denen eine Kali brierungskurve erstellt werden und die Spanne kann berechnet werden. Die Spanne ist die Differenz (oder delta) zwischen der maximalen und minimalen Bindung von Tracer an Antikörper, die in mP-Einheiten (delta-mP) gemessen wird, wenn das freie Arzneimittel mit dem gebundenen Tracer um Bindungsstellen am Antikörper konkurriert. Eine größere Spanne liefert eine höhere Genauigkeit beim FPIA. Die Polarisation der Fluores zenz nimmt in regelmäßiger Weise ab, wenn die Konzentration des Analyten ansteigt. Je höher der delta-Wert oder die Spanne, desto besser die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Tests. Die Konzentration des Arzneimittels in der Probe kann bestimmt werden durch Vergleich mit einer Standard-Kalibrie rungskurve.

Verschiedene Fluorescein-Derivate, aus denen fluoresceinmar kierte Verbindungen oder Tracer hergestellt werden können, sind bekannt und im Handel erhältlich. Die meisten Fluores cein-Derivate leiten sich von der Position 5 oder 6 des Fluoresceins ab (auch als Isomer I für die Position 5 und Isomer II für die Position 6 bezeichnet) und schließen 5- oder 6-N-Hydroxyxuccinimidylcarboxyfluorescein, 5-Amino methylfluorescein und 5- oder 6-Dichlor-1,3,5-triazin-2- ylaminofluorescein (DTAF) ein.

Fluorescein-Derivate, die ausgehend von Position 4′ des Fluorescein synthetisiert wurden, sind auch bekannt. Zum Bei spiel ist 4′-Aminomethylfluorescein geeignet als Nucleophil, um Arzneimittel-Derivate oder Liganden, die eine Carboxyl gruppe tragen, zu kuppeln (siehe US-Patent Nr. 4,614,823 und US-Patent Nr. 4,510,251). Die Amingruppe des Fluoresceins reagiert mit einer Carboxygruppe eines Analyten unter Bildung einer Peptidbindung. Diese Methode läßt es jedoch nicht zu, daß ein Analyt, der einen cyclischen Ring enthält, direkt an das 4′-Methyl-Kohlenstoffatom gebunden wird.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Fluorescein-Derivat bereitzustellen, das direkt mit cyclischen Aminen reagieren kann, um einen cyclischen Linker zwischen dem Fluorescein-Molekül und dem Analyt bereitzustel len.

Genauer ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes 4′-methylsubstituiertes Fluorescein-Derivat her zustellen, das mit einer Verbindungsgruppe modifiziert ist, die leicht an einen Liganden mit einem nucleophilen Zentrum konjugiert werden kann. Es ist auch eine Aufgabe der vorlie genden Erfindung, ein 4′-methylsubstituiertes Fluorescein- Derivat herzustellen, das leicht mit einem Liganden konju giert werden kann, der mit einer Verbindungsgruppe modifi ziert ist, die ein nucleophiles Zentrum aufweist.

Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein 4′-methylsubstituiertes Fluorescein-Derivat herzustellen, das eine Abgangsgruppe enthält, die leicht durch eine Aminogruppe ersetzt werden kann, wodurch die Bindung des Fluoresceins an ein Arzneimittel-Derivat erleichtert wird. Das 4′-methylsub stituierte Fluorescein selbst kann mit der Aminogruppe modi fiziert sein, bevorzugt durch die Reaktion mit einem cyclischen Amin. Alternativ kann die Aminogruppe Teil eines Arzneimittel-Derivats sein, an das das 4′-methylsubstituierte Fluorescein konjugiert werden kann, am meisten bevorzugt ein Arzneimittel-Derivat mit einem ein cyclisches Amin enthalten den Linker.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein 4′-methylsubstituiertes Fluorescein-Derivat bereitzustellen, das verwendet werden kann, um einen Fluorescein-Tracer mit einer größeren dynamischen Spanne herzustellen, was zu einer genaueren und empfindlicheren Leistung bei dem FPIA führt.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse von Fluorescein-Derivaten der Formel

worin X eine Abgangsgruppe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyresten, einem Halogenatom und einem Sulfonsäureester der Formel -O-SO₂-R, worin R-C₆H₄-CH₃ oder CH₃ ist.

Das Halogenatom ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Chloratom, dem Bromatom und dem Iodatom. Bevorzugt ist das Halogenatom ein Chlor- oder Bromatom, am meisten bevor zugt ein Chloratom.

Die Fluorescein-Derivate der Formel I sind geeignet als Zwischenprodukte für die Synthese von neuen Reagenzien, die in Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays verwendet werden können.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Arzneimittel-Fluores cein-Konjugate, die einen cyclischen Linker enthalten, die als Tracer in Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays verwen det werden.

Die vorliegende Erfindung kann leichter verstanden werden unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren. Die hier für die Verbindungen verwendeten Nummern entsprechen den Nummern der Verbindungen, die in den Fig. 1 bis 9 gezeigt sind.

Fig. 1 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an der Synthese von 4′-Hydroxymethyl- Fluorescein beteiligt sind: [rac-4′-(Hydroxymethyl)-3′,6′-di hydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on] (2) und 4′-Piperazinylmethylfluorescein: [rac-3′,6′-Dihydroxy-4′- (1-piperazinylmethyl)spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]-xan then]-3-on (4).

Fig. 2 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an der Synthese von (5-[[[4-[4-[(3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro-[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′- yl)methyl]-1-piperazinyl]-carbonyl]amino]-2-propyl]pentan säure (11), einem Valproinsäure-FP-Tracer mit einem cyclischen Linker, beteiligt sind.

Fig. 3 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an der Synthese von rac-5-[[[3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-6- yl]carbonyl]amino]-2-propylpentansäure (13), einem Valproin säure-FP-Tracer, der einen acyclischen Linker enthält, be teiligt sind.

Fig. 4 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an der Synthese von (S)-4′-[[4-[[4-(2- Aminopropyl]-phenyl]phenyl]sulfonyl]-1-piperazinyl]methyl]- 3′,6′-dihydroxyspiro-[isobenzofuran-1(3H)9′-[9H]xanthen]-3-on (Epimere 1 : 1) (19), einem Amphetamin-FP-Tracer, der Piperazin als cyclischen Linker enthält, beteiligt sind.

Fig. 5 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an der Synthese von [rac-4-[(3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),3′-[9H]xanthen]-4′- yl)methyl]-N-(4-hydroxyphenyl)-gamma-oxo-1-piperazinbutamid (26), einem Acetaminophen-FP-Tracer, der einen cyclischen Linker enthält, beteiligt sind.

Fig. 6 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an-der Synthese von [rac-4-[3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′- yl)methyl]amino]-N-(4-hydroxyphenyl)-4-oxobutanamid (28), einem Acetaminophen-FP-Tracer, der einen acyclischen Linker enthält, beteiligt sind.

Fig. 7 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an der Synthese von [(2S)-4′-[[4-[2- Amino-3-[4(4-hydroxy-3,5-diiodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]-1- oxopropyl]-1-piperazinyl]methyl]-3′,6′-dihydroxyspiro[iso benzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]3-on (Epimere 1 : 1) (33), einem Thyroxin-FP-Tracer, der einen cyclischen Linker ent hält, beteiligt sind.

Fig. 8 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an der Synthese von [N-[[[1-[3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H)-9′-[9H]-xanthen]-4′- yl)methyl]-4-piperidinyl]methyl]-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-car boxamid (37), einem Carbamezepin-FP-Tracer, der einen cyclischen Linker enthält, beteiligt sind.

Fig. 9 zeigt die Formeln der Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, die an der Synthese von N-[(5H-Dibenz- [b,f]azepin-5-carbonyl)methyl]-N-3′,6′-dihydroxy-3-oxospiro- [isobenzofuran-1(3H,9′-[9H]xanthen-5-yl]thioharnstoffdihydrat (40), einem Carbamazepin-FP-Tracer, der einen acyclischen Linker enthält, beteiligt sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Fluorescein-Derivate der oben definierten Formel (I). In der letzteren Formel ist X bevorzugt ein Hydroxyrest. Ein besonders geeignetes Fluorescein-Derivat ist somit 4′-Hydroxymethylfluorescein, das die folgende Formel hat:

Die obige Verbindung wurde über eine Friedel-Crafts-Reaktion erhalten, die an Fluorescein durchgeführt wurde unter Verwen dung von Chlormethylmethylether in Gegenwart von Methansul fonsäure (Fig. 1).

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die neuen 4′-Fluorescein-Derivate an einen cyclischen Linker ge kuppelt werden, um die neuen Arzneimittel-Fluorescein-Tracer der vorliegenden Erfindung zu bilden.

Zum Beispiel wurde das 4′-methylsubstituierte Fluorescein- Derivat so modifiziert, daß es eine Hydroxy-Abgangsgruppe trug. Eine nucleophile Reaktion wurde an dem 4′-Fluorescein- Derivat durchgeführt unter Verwendung eines cyclischen Amins in Gegenwart einer organischen Base, was ein 4′-methylsubsti tuiertes Fluorescein-Derivat mit einem cyclischen Linker lie ferte, was eine Verbindung der Formel

lieferte, worin R₁ ausgewählt ist aus H oder einem Arzneimit tel-Derivat, z. B. Valproinsäure oder einem Valproinsäure- Derivat, z. B. einem der Formel

Das entstehende 4′-methylsubstituierte Fluorescein-Konjugat wurde dann mit einem Arzneimittel umgesetzt, was die neuen Arzneimittel-Fluorescein-Tracer der vorliegenden Erfindung liefert.

Wie unten gezeigt wird, sind die neuen 4′-methylsubstituier ten Fluorescein-Derivate der vorliegenden Erfindung ein nütz liches Reagenz zur Herstellung von Fluorescein-Arzneimittel- Konjugaten. Es ist ungewöhnlich, daß eine Hydroxylgruppe durch ein Nucleophil ersetzt wird. Überraschenderweise kann die Hydroxygruppe an Position C-4′ durch eine Anzahl von Nucleophilen verdrängt werden, wie unten beschrieben. Der Einbau eines cyclischen Linkerarms an der C-4′-Methylgruppe liefert eine größere Spanne bei den Fluoreszenz-Polarisa tions-Immunoassays, was eine größere Genauigkeit und bessere Empfindlichkeit liefert. Daher sind Tracer, die einen cyclischen Linkerarm enthalten, überlegene Reagenzien bei dem FPIA.

In einer Ausführungsform wurde eine nucleophile Reaktion an 4′-Hydroxymethylfluorescein durchgeführt unter Verwendung von t-Butyl-1-piperazincarboxylat in Gegenwart von 2,6-Lutidin in Dimethylformamid (DMF) und Natriumiodid bei 130 bis 140°C, was rac-4-(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro-[isobenzofuran- 1(3H),9′-[9H]xanthen-4′yl]methyl)-1-piperazincarbonsäure-1,1- dimethylethylester (3) (Fig. 1) lieferte. Die Abspaltung der t-Butylcarbamat-(t-Boc)-Gruppe unter Verwendung von Trifluor essigsäure lieferte 4′-Piperazinylmethyl-fluorescein (4) mit der folgenden Formel:

Das 4′-Piperazinylmethylfluorescein kann mit einem Liganden oder Arzneimittel unter Bildung eines FP-Tracers konjugiert werden. Zum Beispiel wurde 4′-Piperazinylmethylfluorescein verwendet, um einen Valproinsäure-FP-Tracer, der einen cyclischen Linker enthielt, herzustellen (Fig. 2). Das Piperazinylmethylfluorescein wurde an ein Valproinsäure-Deri vat (9) gekuppelt, was zur Bildung des Harnstoffs (10) führte. Die Abspaltung der t-Boc-Gruppe mit Trifluoressig säure lieferte den Valproinsäure-Tracer, der einen cyclischen Linker enthielt, 5-[[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[iso benzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1-pipera zinyl]carbonyl]amino]-2-propylpentansäure (II) mit der Formel

Das Arzneimittel-Fluorescein-Konjugat von Valproinsäure, das einen acyclischen Linker enthält, rac-5-[[[3′,6′-Dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′[9H]xanthen]-6-yl]carbonyl] amino]-2-propylpentansäure (13) wurde auch hergestellt (Fig. 3). Der 6-Carboxy-N-hydroxysuccinimidester wurde mit dem Val proinsäure-Derivat (8) mit einer Aminofunktion gekuppelt. Die Abspaltung der t-Boc-Gruppe in Trifluoressigsäure lieferte den Valproin-Tracer ohne cyclischen Linker.

Die zwei Valproinsäure-Tracer 5-[[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxo spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1- piperazinyl]carbonyl]amino]-2-propylpentansäure (11) und rac-5-[[[3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9′[9H]xanthen]-6-yl)carbonyl]amino]-2-propylpentansäure (13) wurden an dem COBAS FARA II® Chemiesystem unter Verwen dung von polyklonalen Antiseren (COBAS-FP Reagenz Nr. 44065) ausgewertet. Die Spanne (delta mP), die für die Kalibrie rungskurve beobachtet wurde, war für den Tracer, der den cyclischen Linker enthielt (146 mP) größer, als bei dem Tracer, der den acyclischen Linker enthielt (121 mP).

Das Fluorescein-Derivat reagiert direkt mit cyclischen Aminen, was einen cyclischen Linker zwischen dem Fluorescein- Molekül und dem Analyten liefert. Diese Art des Molekülauf baus verhindert eine größere Freiheit der Drehung des Arznei mittel-Fluorescein-Konjugats, das den cyclischen Linker auf weist, sobald es an den Antikörper gebunden ist, was eine größere Spanne liefert als bei dem Arzneimittel-Fluorescein- Konjugat, das in Abwesenheit des cyclischen Linkers syntheti siert wurde. Der neue Tracer mit dem cyclischen Linker zeigte einen verbesserten dynamischen Bereich der Standardkurve und eine verbesserte Polarisation, wenn er im FPIA verwendet wurde.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein 4′-methylsubsti tuiertes Fluorescein-Derivat, das direkt an ein Arzneimittel, das mit einem cyclischen Linker modifiziert ist, gekuppelt wird, um neue Arzneimittel-Fluorescein-Konjugate der folgen den allgemeinen Formel

herzustellen, worin Y ein cyclischer Linker ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Piperazin, Homopiperazin, 4-Aminomethylpiperidin, 4-Carboxypiperidin, Prolin und 3-Carboxydihydropyridin und Q ein Arzneimittel, ein therapeu tisches Mittel oder ein die Umgebung verschmutzendes Mittel, wie hier beschrieben, ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist Y ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Piperazin, Homopiperazin und 4-Amino methylpiperidin und Q ist ein Arzneimittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thyroxin, Acetaminophen, Amphetamin und Carbamazepin. Bevorzugt ist Y Piperazin und Q ist Amphetamin oder Acetaminophen oder Y ist Homopiperazin und Q ist Thyroxin oder Y ist 4-Aminomethylpiperidin und Q ist Carbama zepin.

Im allgemeinen umfaßt das Verfahren, um ein 4′-methylsubsti tuiertes Fluorescein-Derivat, bevorzugt 4′-Hydroxymethyl fluorescein an ein Arzneimittel mit einem cyclischen Linker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Piperazin, Homopiperazin oder Piperidin, zu kuppeln, daß man 4′-Hydroxy methylfluorescein mit einem Arzneimittel oder Liganden, das/der einen cyclischen Linker enthält, in Gegenwart von 2,6-Lutidin und Natriumiodid in Dimethylformamid bei einer Temperatur von 120 bis 140°C umsetzt.

Ein Amphetamin-FP-Tracer, der einen Piperazin-Linker enthält, wurde synthetisiert unter Verwendung eines Amphetamin-Deri vats mit einem Piperazinring, (S)-2,2,2-Trifluor-N-[1-methyl- 2-[4-(1-piperazinyl-sulfonyl)phenyl]ethyl]-acetamid (17) wurde mit 4′-Hydroxy-methylfluorescein in Gegenwart von 2,6-Lutidin und Natriumiodid in Dimethylformamid bei 120°C umgesetzt, was (S)-N-[2-[4-[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro- [isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1-pipera zinyl]sulfonyl]phenyl]-1-methylethyl]-2,2,2-trifluoracetamid als epimere 1:1-Mischung (18) lieferte (Fig. 4). Bei der Abspaltung der Schutzgruppen mit Methylamin in Ethanol wurde das Amphetamin-Derivat (S)-4′-[[4-(2-Aminopropyl)phenyl]-sul fonyl]-1-piperazinyl]-methyl]-3′,6′-dihydroxy spiro[isobenzofuran-1(3H)-9′-[9H]xanthen]3-on (Epimere 1 : 1) (19) erzeugt.

Für die Synthese eines Acetaminophen-FP-Tracers mit einem Piperazinlinker wurde p-Nitrophenol als Ausgangsmaterial ver wendet, das in dem Methoxyethoxymethylether (21) umgewandelt wurde (Fig. 5). Das geschützte Nitrophenol wurde zu einer Aminogruppe reduziert in Gegenwart von Ammoniumformiat und 10% Pd-C in Ethanol, was 4-[(2-Methoxy-ethoxy)methoxy]benz amin (22) lieferte. Die Aminogruppe wurde succinyliert und das entstehende Säurederivat wurde an Piperazin gekuppelt. Das Acetaminophen-Derivat, das die Piperazingruppe enthielt, wurde an 4′-Hydroxymethylfluorescein gekuppelt und anschlie ßend wurde der Methoxyethoxymethylether in Gegenwart von Tri fluoressigsäure abgespalten unter Bildung von rac-4-[(3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen1-4′- yl)methyl]-N-(4-hydroxyphenyl)-gamma-oxo-1-piperazinbutamid (26).

Für die Synthese eines Acetaminophen-FP-Tracers mit einem acyclischen Linker wurde p-Nitrophenol als Methoxyethoxy methylether geschützt (Fig. 6). Die Nitrogruppe wurde zu einer Aminogruppe reduziert in Gegenwart von Ammoniumformiat und 10% Pd-C in Ethanol, was 4-[(2-Methoxy-ethoxy)methoxy] benzolamin (22) lieferte. Die Aminogruppe wurde succinyliert und das erzeugte Säurederivat an 4′-Aminomethylfluorescein gekuppelt. Die Abspaltung des Methoxyethoxyethers (27) in Gegenwart von Trifluoressigsäure lieferte rac-4-[[[3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro-[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′- yl)methyl]amino]-N-(4-hydroxyphenyl)-4-oxobutamid (28).

Die Leistung der beiden Acetaminophen-FP-Tracer wurde ausge wertet an dem chemischen System COBAS FARA II-unter Verwen dung von polyklonalen Antiseren (Charge Nr. P34, Bindungs stelle, Kalifornien). Die Ergebnisse des Vergleichs der Kali brierungskurven, die mit den Acetaminophen-FP-Tracern, die an Position 4′ des Fluoresceins mit den cyclischen und acyclischen Linkern derivatisiert waren, erzeugt wurden, wur den erhalten unter Verwendung eines Testprotokolls, wie in Beispiel 31 beschrieben und sind in Tabelle 1 unten gezeigt.

Tabelle 1

Wie in Tabelle 1 gezeigt, hatte der Acetaminophen-Tracer mit dem cyclischen Ring, rac-4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[iso benzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-N-(4-hydroxy phenyl)-gamma-oxo-1-piperazinbutamid (26) eine größere Spanne (156,7 mP) und war daher stärker polarisiert, als der Acet aminophen-Tracer mit dem acyclischen Linker, rac-4-[[[3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′- yl)methyl]amino]-N-(4-hydroxyphenyl)-4-oxobutamid (28) (Spanne 112 mP). Dieses Ergebnis zeigte, daß der Tracer mit einem cyclischen Linker eine bessere Empfindlichkeit und Genauigkeit in dem FPIA zeigte.

Für die Synthese eines Thyroxin-FP-Tracers mit Homopiperazin als Linker wurde Thyroxin mit di-t-Butyldicarbonat versetzt, was das Thyroxin-Derivat (30) (Fig. 7) lieferte. Die Car boxygruppe des Thyroxin-Derivats (30) wurde zu einem N-Hydroxysuccinimidester aktiviert und an Homopiperazin ge kuppelt. Das Thyroxin-Derivat mit der Homopiperazingruppe (31) wurde an 4′-Hydroxymethylfluorescein konjugiert und anschließend die Schutzgruppen abgespalten, was (2S)-4′-[4′- [[4-[2-Amino-3-[4-(4-hydroxy-3,5-diiodophenoxy)-3,5-diiod phenyl]-1-oxopropyl]-1-piperazinyl]methyl]-3′,6′-dihydroxy spiro-[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (Epimere 1 : 1) (33) lieferte.

Der Thyroxin-Tracer wurde mit FPIA an dem chemischen System COBAS FARA II® ausgewertet unter Verwendung von monoklonalen
Antikörpern (COBAS-FP Reagenz Nr. 46200) und unter Verwendung eines Testprotokolls ähnlich dem, das in Beispiel 31 gezeigt ist. Tabelle 2 unten gibt die Daten an, die für die Kalibrie rungskurve unter Verwendung des neuen Thyroxin-Tracers, der einen cyclischen Linker enthält, erzeugt wurden.

Tabelle 2

Wie in Tabelle 2 gezeigt, nimmt die Fluoreszenz-Polarisation des neuen Thyroxin-Tracers proportional ab, wenn die Konzen tration des Thyroxin-Kalibrators ansteigt, was eine Standard- Dosis-Wirkungskurve erzeugt, die für die quantitative Bestim mung von Thyroxin in einer Probe geeignet ist. Daher ist dieser Thyroxin-FP-Tracer ein wirksames Reagenz für den FPIA.

Bei der Synthese eines Carbamazepin-FP-Tracers mit dem cyclischen Linker Piperidin wurde N-Carbamoylchlorid (35) mit 4-Aminomethylpiperidin gekuppelt, was ein Carbamazepin-Deri vat mit einer Piperidingruppe lieferte (36) (Fig. 8). Dieses Carbamazepin-Derivat wurde mit 4′-Hydroxymethylfluorescein konjugiert, was einen Carbamazepin-FP-Tracer mit einem cyclischen Linker lieferte, N-[[1-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxo spiro[isobenzofuran-1(3H)-9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-4- piperidinyl]methyl]-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-carboxamid (37).

Zusätzlich zu der Gegenwart eines cyclischen Linkers zwischen Fluorescein und Arzneimittel-Molekül induziert die Anordnung des Linkerarms benachbart zu dem Phenolring eine Chiralität, die zu der gehinderten Drehung des gesamten Arzneimittel- Fluorescein-Moleküls führt, wodurch der dynamische Bereich der Standardkurve in dem FPIA verbessert wird.

Die Herstellung eines Carbamazepin-FP-Tracers mit einem acyclischen Linker ist in Fig. 9 dargestellt. Iminostilben wurde mit α-Bromacetylbromid umgesetzt, was das Bromderivat (38) lieferte. Das Bromderivat wurde mit Ammoniak und Natriumiodid umgesetzt, was das aminohaltige Carbamazepin- Derivat (39) lieferte. Dieses. Carbamazepin-Derivat wurde mit 5-Fluoresceinisothiocyanat gekuppelt und lieferte den Carba mazepin-Tracer mit einem acyclischen Linker, N-[(5H-Dibenz- [b,f]azepin-5-yl-carbonyl)methyl]-N′-3′,6′-dihydroxy-3-oxo spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen-5-yl]thioharnstoff dihydrat (40).

Die Carbamazepin-Tracer wurden ausgewertet mit einem FPIA unter Verwendung eines Testprotokolls ähnlich dem in Beispiel 31 gezeigten und unter Verwendung von polyklonalen Antiseren (COBAS-FP Reagenz Nr. 46206). Der Vergleich der mit den Carbamazepin-FP-Tracern, die cyclische und acyclische Linker enthielten, erzeugten Kalibrierungskurven ist in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Die Daten in Tabelle 3 zeigen, daß die Gegenwart eines cyclischen Linkers in dem Carbamazepin-Tracer (40), der an einem der phenolischen Ringe des Fluoresceins substituiert ist, eine verbesserte Polarisation lieferte (Spanne von 167 mP) verglichen mit dem Carbamazepin-FP-Tracer, der einen acyclischen Linkerarm enthielt ausgehend von Position 5 des Fluoresceins (Spanne von 135,9 mP), was somit eine höhere Genauigkeit bei dem FPIA liefert.

Beispiele

Im folgenden sind nicht beschränkende Beispiele angegeben, die die Synthese der neuen 4′-methylsubstituierten Fluores cein-Derivate der vorliegenden Erfindung und ein Protokoll für einen Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay erläutern. Die numerischen Bezeichnungen der Verbindungen in den Kopf zeilen und in den Beispielen 1 bis 30 beziehen sich auf die Strukturformeln, die in den Fig. 1 bis 9 gezeigt sind.

Alle Lösungsmittel wurden von Fisher Scientific (Springfield, NJ, USA) erworben, wenn nicht anders angegeben. Die für die Dünnschicht-Chromatographie verwendeten Silicagel 60-F₂₅₄- Platten und das für die Blitzchromatographie geeignete Silicagel für die Säulen-Chromatographie wurden von E.M. Science (Gibbstown, NJ, USA) erhalten. 6-Carboxyfluorescein und 4′-Aminomethylfluoresceinhydrochlorid wurden von Mole cular Probes (Eugene, Oregon, USA) erworben. 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), L-Thyroxin und d-Amphetaminsulfat wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA) erworben. Ethyl-4-brombutyrat und di-t-Butyl dicarbonat wurden von Fluka (Schweiz) erworben. Alle anderen Chemikalien wurden von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA) erworben.

Beispiel 1 Herstellung von rac-4′-(Hydroxymethyl)-3′,6′-dihydroxyspiro- [isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (2)

Zu einer Lösung von 50 mg (0,15 mmol) Fluorescein in 0,3 ml Methansulfonsäure wurden 13 µl (0,16 mmol) Chlormethylmethyl ether bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in 10 ml eiskaltes Wasser gegossen. Ein gelb-oranger Feststoff fiel aus und wurde abfiltriert. Das Rohprodukt wurde durch präparative Dünnschicht-Chromatographie (Silica gel, 2 mm) gereinigt unter Verwendung von Chloroform:Metha nol:Toluol 8 : 1 : 1, was 20 mg (37%) rac-4′-(Hydroxymethyl)- 3′,6′-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (2) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigen die Iden tität der Verbindung. Um die strukturelle Identität der Ver bindung (2) zu bestätigen, wurde die Verbindung zu dem ent sprechenden Triacetat derivatisiert. Die NMR- und MS-Daten bestätigten die Identität des Triacetats. Die Hydrolyse des Triacetats lieferte Verbindung (2).

Beispiel 2 Herstellung von rac-4-(3′,6′-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzo furan-1(3H),9′-[9H]xanthen-4′-yl]methyl)-1-piperazincarbon säure-1,1-dimethylethylester (3)

Zu einer Lösung von 25 mg (0,065 mmol) rac-4′-(Hydroxy methyl)-3′,6′-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H),9′- [9H]xanthen]-3-on in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid wur den 50 mg (0,26 mmol) t-Butylpiperazincarboxylat und anschließend 100 µl (0,85 mmol) 2,6-Lutidin und 100 mg (0,66 mmol) Natriumiodid gegeben. Die Mischung wurde 3 Stun den lang auf 120°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abküh len gelassen. Die Reaktionsmischung wurde bei vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde zweimal mit präparativer Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Chloroform:Methanol 7 : 3 als Elutionsmittel, was 10 mg (0,018 mmol, 30%) rac-4-(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro- [isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen-4′-yl]methyl)-1-pipera zincarbonsäure-1,1-dimethylethylester (3) als orange-rotes Pulver lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 3 Herstellung von rac-3′,6′-Dihydroxy-4′-(1-piperazinylmethyl) spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (4)

Eine Mischung von 40 mg (0,75 mmol) rac-4-(3′,6′-Dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen-4′-yl]methyl)-1- piperazincarbonsäure-1,1-dimethylethylester (3) in 5 ml Tri fluoressigsäure wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang rüh ren gelassen. Die Mischung wurde bei vermindertem Druck ein geengt. Die restliche Trifluoressigsäure wurde durch gleich zeitige Destillation mit 3 × 5 ml Toluol entfernt. Das ver bleibende rohe Produkt wurde durch Dünnschicht-Chromato graphie gereinigt unter Verwendung von 1% Triethylamin in Methanol, was 20 mg (0,46 mmol, 63%) rac-3′,6′-Dihydroxy-4′- (1-piperazinylmethyl)spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xan then]-3-on (4) als orangefarbenen Feststoff lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbin dung.

Beispiel 4 Herstellung von Tetrahydro-3-propylpyridin-2(1H)-on (6)

Eine Lösung von 4,2 g (42,3 mmol) δ-Valerolactam (5) in 35 ml Tetrahydrofuran wurde auf -78°C unter Argon-Atmosphäre ge kühlt. Zu dieser gekühlten Lösung wurden 32 ml n-BuLi (2,5 M Lösung in Hexan, 80 mmol) tropfenweise über einen Zeitraum von 40 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und magnetisch 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf 0°C gekühlt und eine Lösung von 3,87 ml (42,5 mmol) 1-Brompropan in 20 ml Tetrahydrofuran wurde tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und magnetisch 16 Stunden lang ge rührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 75 ml Wasser versetzt und eingeengt, um Tetrahydrofuran zu entfernen. Der Rückstand wurde mit 3 × 200 ml Diethylether extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, eingeengt, was einen weißen Feststoff lie ferte, der aus Petrolether umkristallisiert wurde, was 3,2 g (22,6 mmol, 54%) Tetrahydro-3-propylpyridin-2(1H)-on (6) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identi tät der Verbindung.

Beispiel 5 Herstellung von rac-5-Amino-2-propylpentansäure-monohydro chlorid (7)

Eine Mischung von 2,0 g (14,1 mmol) Tetrahydro-3-propylpyri din-2(1H)-on (6) und 10 ml 6n Salzsäure wurde 6 Stunden lang am Rückfluß erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und bei ver mindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit 2 × 50 ml Toluol zusammen destilliert, was 1,9 g (11,9 mmol, 84%) 5-Amino-2-propylpentansäure-monohydrochlorid (7) als fahl gelbes Öl lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 6 Herstellung von rac-5-Amino-2-propylpentansäure-1,1-dimethyl ethyl-ester (8)

Zu einer gekühlten Lösung von 7 ml Dioxan wurden 0,7 ml konz. H₂SO₄ tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde rot. Zu dieser Lösung wurden 700 mg (3,5 mmol) 5-Amino-2-propylpentansäure monohydrochlorid (7) langsam zugegeben und die entstehende Lösung in eine Druckflasche überführt. Zu dieser Lösung wur den 12 ml Isobutylen zugegeben und die entstehende Lösung langsam magnetisch unter Druck bei Raumtemperatur 20 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgefäß wurde in Trockeneis gekühlt, der Druck entspannt und das Reaktionsgefäß auf Raumtemperatur erwärmt, um überschüssiges Isobutylen zu verdampfen. Die Reaktionsmischung wurde in 100 ml kaltes Wasser gegossen. Der wäßrige Teil wurde mit 2 × 150 ml Ether extrahiert, mit 4n Natriumhydroxid auf pH 10 basisch gemacht und mit 3 × 100 ml Ethylacetat extrahiert, was 380 mg (1,76 mmol) 49%) rac-5- Amino-2-propylpentansäure-1,1-dimethylethylester (8) als Öl lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identi tät der Verbindung.

Beispiel 7 Herstellung von rac-5-[[(4-Nitrophenoxy)carbonyl]amino]-2- propyl]pentansäure-1,1-dimethylethylester (9)

Zu einer Suspension von 160 mg (0,74 mmol) rac-5-Amino-2-pro pylpentansäure-1,1-dimethylethylester (8) in 1 ml Wasser und 1 ml Dichlormethan, wurden 153 mg (0,76 mmol) 4-Nitro phenylchloroformiat und 267 mg Natriumbicarbonat bei 0°C zu gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht ge rührt und dann mit 50 ml Dichlormethan und 30 ml Wasser ver dünnt. Der organische Teil wurde abgetrennt. Der wäßrige Teil wurde mit 2 × 50 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Anteile wurden vereinigt und mit 2 × 50 ml 5% Natriumbicar bonat und anschließend 50 ml Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mit präpara tiver Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Ethylacetat:Hexan 1 : 1 als Elutionsmittel, was 185 mg (0,48 mmol, 66%) rac-5-[[(4-Nitrophenoxy)carbonyl]amino]-2- propyl]pentansäure-1,1-dimethylethylester (9) als grauweißen Feststoff lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 8 Herstellung von 5-[[[4-(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzo furan-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1-piperazinyl]car bonyl]-amino]-2-propylpentansäure-1,1-dimethylethylester (10)

Zu 20 mg (0,052 mmol) (3) wurden 1 ml Pyridin und 1 ml troc kenes Dimethylformamid zugegeben. Zu der entstehenden Lösung wurden 26 mg (0,068 mmol) rac-5-[[(4-Nitrophenoxy)car bonyl]amino]-2-propyl]pentansäure-1,1-dimethylethylester (9) zugegeben. Die entstehende Mischung wurde auf einem vorge heizten Ölbad 30 Minuten lang auf 120°C erhitzt. Die Reak tionsmischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und bei ver mindertem Druck eingeengt. Der entstehende Rückstand wurde mit präparativer Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Ethylacetat:Chloroform 1 : 1, was 10 mg (0,014 mmol, 28%) 5-[[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[iso benzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1-pipera zinyl]carbonyl]amino]-2-propylpentansäure-1,1-dimethylethyl ester (10) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 9 Herstellung von 5-[[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzo furan-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1-piperazinyl]car bonyl]-amino]-2-propylpentansäure (11)

Zu 15 mg (0,022 mmol) 5-[[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro- [isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1-pipera zinyl]carbonyl]amino]-2-propylpentansäure-1,1-dimethylethyl ester (10) wurden 2 ml Trifluoressigsäure zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang rühren gelassen. Die entstehende Reaktionsmischung wurde eingeengt und mit Dünnschicht-Säulen-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Ethylacetat:Methanol 10 : 2 als Elutionsmittel, was 8 mg (0,013 mmol, 61%) 5-[[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxo spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1- piperazinyl]carbonyl]amino]-2-propylpentansäure (11) lie ferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 10 Herstellung von rac-5-[[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzo furan-1(3H),9′-[9H]xanthen]-6-yl)carbonyl]amino]-2-propyl pentansäure (13)

Eine Lösung von 50 mg (0,13 mmol) 6-Carboxyfluorescein in 1 ml Dimethylformamid wurde auf 0°C gekühlt. Hierzu wurden 40 mg (0,19 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid und anschließend 30 mg (0,26 mmol) N-Hydroxysuccinimid zugegeben. Die Mischung wurde bei 4°C 24 Stunden lang gerührt und tropfenweise zu einer Lösung von 50 mg (0,23 mmol) (8) in 1 ml Pyridin und 0,3 ml trockenem Dimethylformamid zugegeben. Die Reaktions mischung wurde bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt und eingeengt. Der Rückstand wurde mit präparativer Dünnschicht- Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Ethylace tat:Chloroform 6 : 4, was 80 mg rac-5-[[[3′,6′-Dihydroxy-3-oxo spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-6-yl)carbonyl] amino]-2-propyl]-pentansäure-1,1-dimethylethylester (12) lie ferte. Zu 80 mg (12) wurden 3 ml Trifluoressigsäure zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt und mit präpa rativer Dünnschicht-Chromatographie (Silica, 0,25 mm) gerei nigt, was 42 mg (0,081 mmol, 62%) rac-5-[[(3′,6′-Dihydroxy- 3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-6- yl)carbonyl]amino]-2-propyl-pentansäure (13) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbin dung.

Beispiel 11 Herstellung von (S)-N-(1-Methyl-2-phenylethyl)-trifluoracet amid (15)

Eine Suspension von 10 g d-Amphetaminsulfat (14) in 55 ml Dichlormethan wurde mit 54 ml In Natriumhydroxid versetzt.

Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase wurde mit 2 × 100 ml Dichlormethan extrahiert. Der pH der wäßrigen Phase war ungefähr 7. 5 ml 1n Natriumhydroxid-Lösung wurden zu der wäßrigen Phase zugegeben. Die wäßrige Phase wurde dann mit 2 × 50 ml Dichlormethan extrahiert. Alle orga nischen Phasen wurden vereinigt und mit 100 ml Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingeengt, was 6,6 g freie Amphetamin-Base lieferte. Zu einer Lösung von 6,6 g (48,8 mmol) der freien Amphetamin-Base in 50 ml destilliertem Dichlormethan wurden 40 ml Trifluoressigsäureanhydrid tropfenweise eine Stunde lang unter Argon-Atmosphäre bei 0°C zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Zu der Reaktionsmischung wurden 1 g Eis und 250 ml Ether zugegeben. Die organische Phase wurde mit 2 × 100 ml Wasser, 100 ml gesättigtem Natriumacetat und an schließend 100 ml Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet, was 8,35 g (36,7 mmol, 74%) (S)-N-(1-Methyl-2-phenylethyl) trifluoracetamid (15) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 12 Herstellung von (S)-4-[2-[(Trifluoracetyl)amino]propyl]ben zolsulfonylchlorid (16)

Zu einer Lösung von 2,0 g (8,64 mmol) von (S)-N-(1-Methyl-2- phenyl-ethyl)trifluoracetamid (15) in 200 ml Chloroform wur den 24 ml Chlorsulfonsäure tropfenweise bei 0°C zugegeben. Die Mischung wurde bei 0°C 4 Stunden lang gerührt. Die Reak tionsmischung wurde in 100 ml Eiswasser gegossen und mit 3 × 200 ml Chloroform extrahiert. Die organischen Phasen wur den vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, was 2,58 g (7,82 mmol, 90%) (S)-4-[2- [(Trifluoracetyl)amino]propyl]-benzolsulfonylchlorid (16) als weißen Feststoff lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestä tigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 13 Herstellung von (S)-2,2,2-Trifluor-N-[1-methyl-2-[4-(1- piperazinylsulfonyl)phenyl]ethyl]acetamid (17)

Zu 856 mg (9,9 mmol) Piperazin wurden 40 ml frisch destilliertes Tetrahydrofuran und anschließend 850 µl (6,09 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von 830 mg (2,51 mmol) (S)-4-[2-[(Trifluoracetyl)amino]propyl]benzolsulfonylchlorid (16) in 25 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran wurde tropfenweise zu der obigen Lösung zugegeben. Die Reaktions mischung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt und wieder in 200 ml Ethylacetat aufgelöst, mit 2 × 100 ml Wasser gewa schen, über MgSO₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mit Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwen dung von 10% Methanol in Chloroform als Elutionsmittel, was 780 mg (2,05 mmol, 82%) (S)-2,2,2-Trifluor-N-[1-methyl-2-[4- (1-piperazinylsulfonyl)phenyl]ethyl]acetamid (17) lieferte. Die NMR- IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Ver bindung.

Beispiel 14 Herstellung von (S)-N-[2-[4-[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxo spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]4′-yl)methyl]-1- piperazinyl]sulfonyl]-phenyl]-1-methylethyl]-2,2,2-tri fluoracetamid (18)

Eine Mischung von 61 mg (0,160 mmol) rac-4′-(Hydroxymethyl)- 3′,6′-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (2), 125 mg (0,33 mmol) (S)-2,2,2-trifluor-N-[1-methyl-2-[4- (1-piperazinyl-sulfonyl)phenyl]ethyl]acetamid (17), 150 mg (1,0 mmol) Natriumiodid und 600 µl (5,15 mmol) 2,6-Lutidin in 4,5 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurde 2 Stunden lang auf 120°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt und 20 ml einer Mischung von Methanol:THF 1 : 1 wurden zugegeben. Das anorganische Salz wurde abfiltriert und das Filtrat ein geengt. Der Rückstand wurde mit Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von 50% Chloroform in Ethylace tat, was 41 mg (S)-N-[2-[4-[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxo spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-1- piperazinyl]-sulfonyl]phenyl]-1-methylethyl]-2,2,2-trifluor acetamid (Epimere 1 : 1) (18) (0,056 mmol, 35%) als orange rotes Pulver lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 15 Herstellung von (S)-4′-[[4-(2-Aminopropyl)phenyl]sulfonyl]-1- piperazinyl]methyl]-3′,6′-dihydroxyspiro[isobenzofuran- 1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (19)

Zu 31 mg (0,042 mmol) (S)-N-[2-[4-[[4-[(3′,6′-Dihydroxy-3- oxo-spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]- 1-piperazinyl]-sulfonyl]phenyl]-1-methylethyl]-2,2,2-tri fluoracetamid (18) wurden 2 ml Methanol und anschließend 2 ml gesättigtes Methylamin in Methanol zugegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden lang auf 60°C erhitzt und eingeengt. Der Rückstand wurde mit Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Chloroform:Methanol 8 : 2, was 10 mg (0,015 mmol, 38%) (S)-4′-[[4-(2-Aminopropyl)phenyl]sul fonyl]-1-piperazinyl]methyl]-3′,6′-dihydroxyspiro-[isobenzo furan-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (Epimere 1 : 1) (19) als orange-rotes Pulver lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 16 Herstellung von 1-[(2-Methoxyethoxy)methoxy]-4-nitrobenzol (21)

Zu 200 mg (0,5 mmol) Natriumhydrid (60%ige Dispersion in Öl) wurden 10 ml Hexan zugegeben. Nach dem Absetzen wurde das Hexan dekantiert. Zu dem Rückstand wurden 10 ml frisch destilliertes Tetrahydrofuran zugegeben und die Aufschläm mungsmischung wurde auf 0°C gekühlt. Hierzu wurden langsam 200 mg (1,43 mmol) 4-Nitrophenol (20) als Feststoff portions weise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 5 Minuten lang bei 0°C gerührt und 197 µl (1,71 mmol) 2-Methoxyethoxymethyl chlorid wurden zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtempera tur 18 Stunden lang gerührt. Zu der Reaktionsmischung wurden 25 ml Wasser langsam zugegeben und die Reaktionsmischung mit 50 ml Ethylacetat verdünnt. Der organische Teil wurde abge trennt und die wäßrige Phase wurde mit 2 × 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und mit 7 × 100 ml gesättigter Natriumcarbonat-Lösung und anschlie ßend mit 100 ml Wasser gewaschen. Die Ethylacetatphase wurde über MgSO₄ getrocknet und eingeengt, was 225 mg (0,99 mmol, 69%) 1-[(2-Methoxyethoxy)methoxy]-4-nitrobenzol (21) als fahlgelbes Öl lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätig ten die Identität der Verbindung.

Beispiel 17 Herstellung von 4-[(2-Methoxyethoxy)methoxy]benzolamin (22)

Eine Mischung von 200 mg (0,88 mmol) 1-[(2-Methoxyethoxy) methoxy]-4-nitrobenzol (21), 100 mg 10% Pd/C und 550 mg (8,7 mmol) Ammoniumformiat in 10 ml absolutem Ethanol wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Die Reaktions mischung wurde mit 100 ml absolutem Ethanol verdünnt und durch ein kleines Kissen aus Celite^TM geleitet. Das Filtrat wurde eingeengt und mit Silicagel-Säulen-Chromatographie ge reinigt unter Verwendung von Ethylacetat:Hexan 8 : 2 als Elu tionsmittel, was 130 mg (0,65 mmol, 75%) 4-[(2-Methoxy ethoxy)methoxy]benzolamin (22) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 18 Herstellung von 4-[[4-[(2-Methoxyethoxy)methoxy]phenyl] amino]-4-oxobutansäure (23)

Zu einer Lösung von 510 mg (2,58 mmol) 4-[(2-Methoxyethoxy) methoxy]benzolamin (22) in 8 ml Dichlormethan und 2 ml was serfreiem Pyridin (Aldrich) wurden 380 mg (3,8 mmol) Bern steinsäureanhydrid portionsweise zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Zu der Reaktionsmischung wurden 20 ml Methanol zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde eingeengt und mit präparativer Dünnschicht- Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Chloro form:Methanol 8 : 2 als Elutionsmittel, was 420 mg (1,41 mmol, 55%) 4-[[4-[(2-Methoxyethoxy)methoxy]phenyl]amino]-4-oxo butansäure (23) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestä tigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 19 Herstellung von N-[4-[(2-Methoxyethoxy)methoxy]phenyl]-gamma oxo-1-piperazinbutamid (24)

Zu einer Lösung von 407 mg (1,36 mmol) 4-[[4-[(2-Methoxy ethoxy)methoxy]phenyl]amino]-4-oxobutansäure (23) in 8 ml wasserfreiem Dimethylformamid (Aldrich) wurden 339 mg (1,64 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid und 236 mg (2,05 mmol) N-Hydroxysuccinimid bei 0°C zugegeben. Die Mischung wurde bei 4°C 18 Stunden lang gerührt. Der aktive Ester wurde in situ ohne Isolierung in der folgenden Reaktion verwendet. Zu einer Lösung von 1,4 g (16,2 mmol) Piperazin in 20 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran wurden 1,5 ml Triethylamin zu gegeben. Zu dieser Mischung wurde die vorher hergestellte N-Hydroxysuccinimidester-Lösung tropfenweise bei Raumtempera tur zugegeben und die Mischung magnetisch bei Raumtemperatur 2 Tage lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt. Der Rückstand wurde mit Silicagel-Säulen-Chromatographie ge reinigt unter Verwendung von Ethylacetat:Methanol 6 : 4, was 384 mg (1,05 mmol, 77%) N-[4-[(2-Methoxyethoxy)methoxy] phenyl]gamma-oxo-1-piperazinbutamid (24) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 20 Herstellung von rac-4-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzo furan-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-N-(4-hydroxy phenyl)-gamma-oxo-1-piperazinbutamid (26)

Zu einer Mischung von 30 mg (0,082 mmol) N-[4-[(2-Methoxy ethoxy)methoxy]phenyl]-gamma-oxo-1-piperazinbutamid (24) und 35 mg (0,091 mmol) rac-4′-(Hydroxymethyl)-3′,6′-dihydroxy spiro[iso-benzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (2) in 2,5 ml Dimethylformamid wurden 250 µl (2,14 mmol) 2,6-Lutidin und 100 mg (0,66 mmol) Natriumiodid zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang unter Argon-Atmosphäre auf 140°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dünnschicht-Chromatographie über wacht unter Verwendung von Chloroform:Methanol 9 : 1 als Elu tionsmittel, was die Gegenwart des neuen Produktes ebenso wie die Gegenwart einer erheblichen Menge an N-[4-[(2-Methoxy ethoxy)methoxy]phenyl]-gamma-oxo-1-piperazinbutamid (24) zeigte. Zu der Reaktionsmischung wurden zusätzlich 25 mg (0,065 mmol) Verbindung (2) zugegeben und die Mischung wurde weitere 2,5 Stunden lang erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt und 2× durch präparative Dünnschicht-Chromato graphie gereinigt, was 15 mg (0,021 mmol, 26%) rac-4-[3′,6′- Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′- yl)methyl]-N-[(4-[2-methoxyethoxy]methoxy)phenyl]-gamma-oxo- 1-piperazinbutamid (25) lieferte. Zu 15 mg (0,021 mmol) (25) wurden 3 ml Trifluoressigsäure zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. Die entstehende Reak tionsmischung wurde eingeengt und mit Dünnschicht-Chromato graphie gereinigt unter Verwendung von Chloroform:Methanol 9 : 1 als Elutionsmittel, was 7 mg (0,011 mmol, 54%) rac-4- [(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′- [9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-N-(4-hydroxyphenyl)-gamma-oxo-1- piperazinbutamid (26) lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 21 Herstellung von rac-4-[[[3′,6′Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzo furan-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]amino]-N-(4-hydroxy phenyl)-4-oxobutamid (28)

Zu einer Lösung von 120 mg (0,40 mmol) 4-[[4-[(2-Methoxy ethoxy)methoxy]phenyl]amino-4-oxobutansäure (23) in 2,5 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurden 83 mg (0,40 mmol) Dicyclohexyl-Carbodiimid und 60 mg (0,52 mmol) N-Hydroxy succinimid bei 0°C unter Argon-Atmosphäre zugegeben. Die ent stehende Mischung wurde 24 Stunden lang bei 4°C gerührt. Der in situ erzeugte N-Hydroxysuccinimidester wurde tropfenweise unter Argon-Atmosphäre zu einer magnetisch gerührten Lösung von 25 mg (0,062 mmol) 4′-Aminomethylfluorescein-Hydrochlorid in 2 ml trockenem Pyridin zugegeben. Die entstehende Mischung wurde bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt und bei ver mindertem Druck eingeengt, was 15 mg (0,023 mmol, 38%) rac- 4-[3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H] xanthen]-4-yl)methyl]amino]-N-[(4-[(2-methoxyethoxy)methoxy] phenyl]-4-oxobutamid (27) als orangefarbenen Rückstand lieferte. Zu 15 mg (0,023 mmol) (27) wurden 3 ml Trifluor essigsäure zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt und mit Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwen dung von Chloroform:Methanol 8 : 2, was 8 mg (0,014 mmol, 67%) rac-4-[[[3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′- [9H]xanthen]-4′-yl]methyl]amino]-N-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo butamid (28) als orangefarbenes Pulver lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 22 Herstellung von (S)-4-[(4-Hydroxy-3,5-diiod)phenoxy-3,5-di iod]-α-[[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]amino]benzolpropansäure (30)

Zu einer magnetisch gerührten Mischung von 4,5 g (5,8 mmol) L-Thyroxin (29) in 18 ml Dimethylformamid, 495 mg (5,9 mmol) Natriumbicarbonat und 18 ml Wasser wurde tropfenweise eine Lösung von 1,28 g (5,8 mmol). Di-t-butyldicarbonat in 18 ml Dimethylformamid zugegeben. Die entstehende Reaktionsmischung wurde 4 Stunden lang gerührt, dann im Hochvakuum bei Raumtem peratur eingeengt. Zu dem Rückstand wurden 45 ml Methanol zu gegeben und das ungelöste Material abfiltriert. Zu dem Fil trat wurde 1n Salzsäure-Lösung (20 ml) zugegeben, bis die Ausfällung vollständig war. Der Feststoff wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet, was 4,2 g (4,8 mmol, 83%) (S)-4- [(4-Hydroxy-3,5-diiod)phenoxy-3,5-diiod]-α-[[(1,1-dimethyl ethoxy)carbonyl]amino]benzolpropansäure (30) als grauweißes Pulver lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 23 Herstellung von (S)-[1-[(Hexahydro-1H-1,4-diazepin-1-yl)car bonyl]-2-[4-[(4-hydroxy-3,5-diiod)phenoxy]-3,5-diiodphenyl] ethyl]carbamidsäure-1,1-dimethylethylester (31)

Eine magnetisch gerührte Lösung von 1,8 g (2,05 mmol) (S)-4- [(4-Hydroxy-3,5-diiod)phenoxy-3,5-diiodphenyl]-α-[[(1,1-Dime thylethoxy)-carbonyl]amino]benzolpropansäure (30) in 55 ml trockenem Dimethylformamid (Aldrich sure seal, 99%) wurde mit 539 mg (4,68 mmol) N-Hydroxysuccinimid und anschließend 1,02 g (5,32 mmol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopro pyl)carbodiimid beschickt. Die Mischung wurde bei Raumtempe ratur 2,5 Stunden lang gerührt und dann tropfenweise zu einer Lösung von 3,6 g (36 mmol) Homopiperazin in 20 ml trockenem Pyridin 25 Minuten lang zugegeben. Die entstehende Reaktions mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und im Hochvakuum eingeengt. Zu dem entstehenden gummiartigen Rück stand wurden 250 ml gesättigte Natriumbicarbonat-Lösung zuge geben. Die Mischung wurde filtriert, was 2,5 g eines rohen Produktes in Form eines grauweißen Feststoffs lieferte. Der Feststoff wurde mit Blitz-Säulenchromatographie gereinigt unter Verwendung von Methanol:Chloroform 1 : 1, was 1,3 g (1,35 mmol, 66%) (S)-[1-[(Hexahydro-1H-1,4-diazepin-1-yl) carbonyl]-2-[4-[(4-hydroxy-3,5-diiod)phenoxy]-3,5-diiod phenyl]ethyl]carbamidsäure-1,1-dimethylester (31) als grau weißen Feststoff lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestä tigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 24 Herstellung von (2S)-4′-[[4-[2-Amino-3-[4-(4-hydroxy-3,5-di iodphenoxy)-3,5-diiodphenyl]-1-oxopropyl]-1-piperazinyl] methyl]-3′,6′-dihydroxy-spiro[isobenzofuran-1(3H),9′- [9H]xanthen]-3-on (Epimere 1 : 1) (33)

Zu einer Lösung von 126 mg (0,131 mmol) (S)-[1-[(Hexahydro- 1H-1,4-diazepin-1-yl)carbonyl]-2-[4-[(4-hydroxy-3,5-diiod) phenoxy]-3,5-diiod-phenyl]ethyl]carbamidsäure-1,1-dimethyl ethyl-ester (31) in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurden 400 µl (3,4 mmol) 2,6-Lutidin, 200 mg (1,3 mmol) Natriumiodid und anschließend 50 mg (131 mmol) rac-4′-(Hydroxymethyl)- 3′,6′-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (2) zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang auf 130°C erhitzt und bei vermindertem Druck eingeengt, was 52 mg (0,048 mmol, 37%) (2S)-4′-[4′-[[4-[2-[(1,1-Dimethylethoxy) carbonyl]amino-3-[4-(4-hydroxy-3,5-diiodphenoxy)-3,5-diiod phenyl]-1-oxopropyl]-1-piperazinyl]methyl]-3′,6′-dihydroxy spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (32) als Rück stand lieferte. Zu 52 mg (0,048 mmol) (32) wurden 3 ml Tri fluoressigsäure zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtempe ratur 5 Minuten lang gerührt und eingeengt. Der Rückstand wurde zweimal mit präparativer Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Chloroform:Methanol 8 : 2, was 15 mg (0,011 mmol, 24%) (2S)-4′-[4′-[2-Amino-3-[4-(4- hydroxy-3,5-diiodphenoxy)-3,5-diiodphenyl]-1-oxopropyl]-1- piperazinyl]methyl]-3′,6′-dihydroxy-spiro[isobenzofuran- 1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (Epimere 1 : 1) (33) als orange-far benes Pulver lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 25 Herstellung von 5H-Dibenz[b,f]azepin-5-carbonylchlorid (35)

Eine Lösung von 2,8 g Iminostilben (34) in 100 ml Dichlor methan wurde mit 1,5 g Triphosgen und anschließend 3 ml Pyri din versetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Eine Dünnschicht-Chromatographie in 40% Ethylacetat/Hexan zeigte die Bildung eines Produktes. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde auf Silica chromatographiert unter Verwendung von 10% Ether/Dichlormethan, was 3,2 g 5H-Dibenz[b,f]azepin-5-car bonylchlorid (35) als grauweißes Pulver lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 26 Herstellung von N-(4-Piperidinylmethyl)-5H-dibenzo[b,f]aze pin-5-carboxamid (36)

Zu einer Lösung von 511 mg (2 mmol) 5H-Dibenzo[b,f]azepin-5- carbonylchlorid (35) in 15 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurden 280 µl Triethylamin und anschließend 2,3 g (2,0 mmol) 4-Aminomethylpiperidin zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und bei vermindertem Druck eingeengt. Zu dem Rückstand wurden 200 ml Dichlormethan und 150 ml gesättigte Natriumbicarbonat-Lösung zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase mit 2 × 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und über MgSO₄ getrocknet, was ein rohes Produkt lieferte, das mit Dünnschicht-Chromatographie gerei nigt wurde unter Verwendung von Methanol:konzentriertem Ammo niumhydroxid 9,5 : 0,5, was zwei isomere Produkte lieferte. Die langsamer laufende Komponente wurde isoliert und lieferte 350 mg (1,04 mmol, 53%) N-(4-Piperidinylmethyl)-5H-dibenzo- [b,f]azepin-5-carboxamid (36) als grauweißen Feststoff. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbin dung.

Beispiel 27 Herstellung von N-[[1-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzo furan-1(3H),9′-[9H]-xanthen]-4′-yl)methyl]-4-piperidinyl] methyl]-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-carboxamid (37)

Zu einer Lösung von 35 mg (0,104 mmol) N-(4-Piperidinyl methyl)-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-carboxamid (36) in 3 ml was serfreiem Dimethylformamid wurden 200 µl (1,71 mmol) 2,6-Lutidin, 200 mg (1,3 mmol) Natriumiodid und anschließend 40 mg (0,105 mmol) rac-4′-(Hydroxymethyl)-3′,6′-dihydroxy spiro[isobenzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-3-on (2) zugegeben. Die Mischung wurde bei 140°C 3 Stunden lang unter Argon-Atmo sphäre gerührt und bei vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit Dünnschicht-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Ethylacetat:Chloroform:Methanol 7 : 3 : 1 als Elutionsmittel, was ein orangefarbenes Produkt lieferte, das Verunreinigungen enthielt. Dieses wurde wieder mit Dünn schicht-Chromatographie gereinigt unter Verwendung von Chlo roform:Methanol 8 : 2 als Elutionsmittel, was 15 mg (0,022 mmol, 21%) N-[[1-[(3′,6′-Dihydroxy-3-oxospiro[iso benzofuran-1(3H),9′-[9H]xanthen]-4′-yl)methyl]-4-piperi dinyl]methyl]-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-carboxamid (37) als orangefarbenes Pulver lieferte. Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 28 Herstellung von N-Bromacetyliminostilben (38)

Eine Lösung von 6,0 g (0,03 mol) Iminostilben in 250 ml Chlo roform wurde zu einer Lösung von 10 g (0,09 mol) Natriumcar bonat in 100 ml Wasser zugegeben und die Mischung schnell gerührt. Zu dieser schnell gerührten Lösung wurden 6,2 g (0,03 mol) Bromacetylbromid tropfenweise über einen Zugabe trichter zugegeben, wobei zu diesem Zeitpunkt eine Analyse mit Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von THF:Hexan 2 : 1 zeigte, daß die Reaktion nicht abgeschlossen war. Weitere 1,0 g (0,005 mol) Bromacetylbromid wurden zuge geben. Die Dünnschicht-Chromatographie zeigte, daß das Aus gangsmaterial vollständig verbraucht worden war. Die Chloro formphase wurde abgetrennt, über Na₂SO₄ getrocknet und einge engt, was 11,0 g N-Bromacetyliminostilben (38) als hellgelbes Öl lieferte. Dieses Material wurde in der folgenden Reaktion verwendet.

Beispiel 29 Herstellung von 5-(Aminoacetyl)-5H-dibenzo[b,f]azepin-hydro chlorid (39)

Eine Lösung von 2,2 g (7 mmol) rohem N-Bromacetyliminostilben (38) in 25 ml Chloroform wurde vorsichtig zu 250 ml konden siertem flüssigem Ammoniak bei -33°C zugegeben. Zu der Reak tionsmischung wurden 6,0 g (40 mmol) Natriumiodid zugegeben, die Mischung 2 Stunden lang bei -33°C gerührt und über Nacht eingedampft. Eine wasserweiße ölige Lösung blieb zurück und 50 ml Wasser wurden zugegeben. Die Lösung wurde mit 2 × 150 ml Chloroform extrahiert. Das Lösungsmittel wurde über Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft, was ein klares Öl lieferte, das in 25 ml Methanol, das mit Salzsäure gesättigt war, gelöst wurde. Die entstehende Lösung wurde eingeengt und 25 ml Acetonitril wurden zugegeben. Das feste Material, das ausfiel, wurde gesammelt und mit 10 ml Acetonitril gewaschen. Die Umkristallisation aus Methanol/Ether ergab 1,8 g (6,2 mmol, 90%) 5-(Aminoacetyl)-5H-dibenzo[b,f]azepinhydro chlorid (39). Die NMR-, IR- und MS-Daten bestätigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 30 Herstellung von N-[(5H-Dibenz[b,f]azepin-5-ylcarbonyl) methyl]-N′-3′,6′-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′- [9H]xanthen-5-yl]thioharnstoffdihydrat (40)

Eine Lösung von 1,0 g (4 mmol) 5-(Aminoacetyl)-5H-dibenzo- [b,f]azepinhydrochlorid (39) in einer Mischung aus 75 ml trockenem Methanol und 75 ml trockenem Tetrahydrofuran wurde mit 1,4 g (3,6 mmol) 5-Fluorescein-isothiocyanat (Isomer I) versetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Säulenchromatographie gereinigt unter Verwen dung von 12% Methanol in Chloroform als Elutionsmittel, was 800 mg (1,18 mmol′ 35%) N-[(5H-Dibenz[b,f]azepin-5-ylcar bonyl)methyl]-N′-3′,6′-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9′-[9H]xanthen-5-yl]thioharnstoffdihydrat (40) als roten Feststoff lieferte. Die. NMR-, IR- und MS-Daten bestä tigten die Identität der Verbindung.

Beispiel 31 Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung der neuen 4′-Methylfluorescein-Tracer der vorliegenden Erfindung

Die Leistung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurde an einem automatisierten COBAS FARA® II (Roche Diagnostic Systems Inc., Branchburg, N.J. USA) unter Verwen dung von Testreagenzien und Protokollen gemäß dem Bediener- Handbuch des Gerätes gemessen.

Als Beispiel wurde das Gerät konfiguriert zur Fluoreszenz- Polarisationsmessung von Acetaminophen in Serum- oder Plasma proben.

Reagenzformulierungen:

a) Antikörper-Reagenz
0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,1% Natriumazid und 0,1% Rinder-γ-Globulin; Antikörper verdünnt in einem Bereich von 1 : 5 bis 1 : 40.
b) Tracer-Reagenz
0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,1% Rinder-γ- Globulin in 0,1% Natriumazid; 5 × 10^-7 M Tracer.
c) Acetaminophen-Kalibratoren:
Lösungen von 0, 10, 20, 50, 100 und 200 µg/ml Acetamino phen in normalem Humanserum.

Für jede Probe des Acetaminophentracers, der in den Beispie len oben beschrieben wurde:

1) wurden 200 µl Antikörperreagenz mit 30 µl einer Kalibra torlösung vermischt;
2) wurde ein Wert für die Hintergrund-Polarisation abgelesen;
3) wurden 5,2 µl Tracer-Reagenz zugegeben;
4) wurde die Mischung 30 Sekunden lang inkubiert;
5) wurde ein Polarisationswert abgelesen und
6) wurde die Spanne des Tracers berechnet.

Claims

1. Verbindung der Formel worin X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxyresten oder einem Sulfonatester der For mel-O-SO₂-R, worin R-C₆H₄-CH₃ oder CH₃ ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin X ein Hydroxyrest ist.

3. Verbindung der Formel worin R₁ H oder ein Arzneimittel-Derivat ist.

4. Verbindung nach Anspruch 3, worin R₁ H ist.

5. Verbindung nach Anspruch 3, worin R₁ Valproinsäure oder ein Valproinsäure-Derivat der Formel ist.

6. Verbindung der Formel worin Y ein cyclischer Linker ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Piperazin, Homopiperazin, 4-Amino methylpiperidin, 4-Carboxypiperidin, Prolin und 3-Carboxydihydropyridin und Q ein Arzneimittel, thera peutisches Mittel oder die Umgebung verschmutzendes Mit tel ist.

7. Verbindung nach Anspruch 6, worin Q ein Arzneimittel ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amphetamin, Acetaminophen, Thyroxin und Carbamazapin.

8. Verbindung nach Anspruch 6, worin Y Piperazin ist und Q Amphetamin oder Acetaminophen ist.

9. Verbindung nach Anspruch 6, worin Y Homopiperazin ist und Q Thyroxin ist.

10. Verbindung nach Anspruch 6, worin Y 4-Aminomethylpiperi din und Q Carbamazepin ist.