DE19709649A1 - Meßanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen, chronisch toxischen und/oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mit Hilfe von Perfusionszellkulturen - Google Patents
Meßanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen, chronisch toxischen und/oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mit Hilfe von PerfusionszellkulturenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Meßanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen,
chronisch toxischen und/oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mittels
Biosensoren, die in verschiedenen Kompartimenten von Zellkultursystemen die
kontinuierliche Bestimmung von Stoffwechselparametern unter unterschiedlichen
Kulturbedingungen und Einflüssen auf diese realisieren. Ziel der Erfindung ist die
kontinuierliche spezifische Erfassung und Beurteilung des Zellwachstums in
Perfusionszellkulturen zur Früherkennung von Einflußfaktoren in Verbindung mit einer
Warn- oder Alarmvorrichtung.
Aufgabe der Erfindung ist die kontinuierliche und spezifische Überwachung und rechtzeitige
Erkennung von Einflußfaktoren auf den Stoffwechsel perfundierter Zellen zur Realisierung
stoffwechselkinetischer Untersuchungen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst,
daß Biosensoren zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Messung von
Stoffwechselprodukten von Zellkulturen eingesetzt werden. Erfindungsgemäß sind dafür
insbesondere enzymatische Glucosesensoren geeignet. Die Sensoren werden entweder direkt
in dem die Zellkultur durchströmenden Flüssigkeitsstrom angeordnet oder können sich in
einem separaten Meßsystem befinden, bei dem kontinuierlich oder diskontinuierlich ein
Austausch mit dem die Zellen umströmenden Medium erfolgt. Ferner ist bei Verwendung
einer Gradienten-Perfusionszellkultur die parallele oder zeitlich versetzte biosensorische
Messung in verschiedenen Medien möglich.
Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen Anordnung von Biosensoren sind die
kontinuierliche Überwachung von Langzeitkulturen, und die Überwachung der Qualität von
Oberflächen- und Trinkwasser, von Böden in wäßrigen Extrakten und von Luftschadstoffen
nach vorheriger Überführung in ein wäßriges System.
Die Erfindung betrifft die Anordnung von Biosensoren bzw. biosensorischen Systemen im
Zusammenhang mit Perfusionszellkulturen zur kontinuierlichen Erfassung und Überwachung
biochemischer Stoffwechselparameter der perfundierten Zellen. Die erfindungsgemäße
Anwendung von Biosensoren ist besonders dort geeignet, wo die mittels der Biosensoren
kontinuierlich erfaßbaren Parameter frühzeitig durch äußere Einflüsse hervorgerufene
Veränderungen und/oder Störungen des Stoffwechsels der Zellen erkennen lassen, bevor
beispielsweise in der Perfusionslösung Schadstoffe in toxischen Konzentrationen auftreten.
Erfindungsgemäße Anordnungen von Biosensoren im Zusammenhang mit perfundierten
Zellkulturen sind insbesondere für die Überwachung von Oberflächen- und Trinkwasser, und
von schadstoffgefährdeten Zuflüssen, an Ausgängen von Wasserreinigungs- und Kläranlagen,
und zur Untersuchung von anderen wäßrigen Medien und Böden, also für den Einsatz in der
Umweltmedizin und im Umweltschutz, geeignet.
Es ist bekannt, daß Zellkulturexperimente unter Perfusionskulturbedingungen die
Aussagekraft zytologischer Untersuchungen stark erhöhen (Minuth W.W.: Vorrichtung für die
Kultivierung von Zellen DE 39 23 279; 1991; Minuth W.W.: Apparatus for cultivating cells,
US-Patent No. 5, 190, 878, 1993). Unter den Bedingungen der Perfusionszellkultur wird die
Unterlage für die Zellen optimiert, das Subkultivieren unterlassen und die Zellen werden
permanent mit neuem Kulturmedium umströmt. Dadurch werden sowohl ständig Nährstoffe
zugeführt als auch Nährstoffe und Stoffwechselprodukte abgeführt. Durch das Weglassen
mitotisch wirkender Stimuli kann die Zelle in einer organtypischen Interphase gehalten
werden.
Auch in der Perfusionszellkultur können die Zellen mit Hilfe spezieller Vorrichtungen, die
ebenfalls dem Stand der Technik zuzuordnen sind, morphologisch unter dem Mikroskop
beurteilt werden. Bekannt ist ferner, metabolische Aktivitäten der Zellkultur durch Messung
unspezifischer physikalisch-chemischer Parameter wie pH-Wert und Sauerstoffpartialdruck
mit Hilfe von Sensoren zu erfassen. Diese Parameter sind lediglich als globale Kriterien für
Vitalität und Reaktivität der Zellkulturen geeignet (M. Brischwein, W. Baumann, R. Ehret, A.
Schwinde, M. Kraus, B. Wolf: Naturwissenschaften 83 (1996) 193-200).
Für eine differenzierte Beurteilung ist jedoch die spezifische Messung von Substraten und
Produkten des Zellstoffwechsels in Perfusionszellkulturen erforderlich, die bisher noch nicht
verwirklicht wurde. Das gilt insbesondere für die Testung von Wirkstoffen in standardisierten
Zellkulturen, bei der eine umfassende Mehrparameteranalyse gefordert wird (M. Brischwein
et al.: Naturwissenschaften 83 (1996) 193-200), die aber allein mit der Messung
unspezifischer Parameter nicht realisiert werden kann. Die Erfassung subtoxischer und
chronisch toxischer Effekte, die bei der Untersuchung von Umweltnoxen eine Rolle spielen
und die nicht zu einer Verschiebung des extrazellulären Milieus führen, ist mit dem bisherigen
Stand der Technik nicht realisierbar.
Für die umfassende Charakterisierung des Zellstoffwechsels geeignete enzymatische
Biosensoren sind prinzipiell bekannt und bisher zur Erfassung von für die Überwachung der
Stoffwechselsituation relevanten biochemischen Spezies in der klinischen Diagnostik
eingesetzt worden. So wurden enzymatische Glucose- und Lactatsensoren mit dem Ziel der
Erfassung der Glukose- bzw. Lactatkonzentration im Blut, in der interstitiellen Flüssigkeit des
subcutanen Gewebes sowie in anderen intrakorporalen Meßkompartimenten entwickelt (P.
Abel, W.-D. Jülich, Th. von Woedtke, U. Fischer, A. Kramer: Implantierbare Biosensor- und
Pharmakaapplikationsanordnung und Verfahren zur Sterilisation, DE 43 31 934 C1 (1995);
P. Abel, W. Kautek, Th. von Woedtke, J. Krüger: Membran und Anordnung für definierten
Analyt-Transfer, Reg.-Nr. P 195 47 923.8, eingereicht 7.12.95). Ein Einsatz von
enzymatischen Biosensoren in Perfusionszellkultursystemen ist bisher nicht bekannt.
Eine kontinuierliche spezifische Erfassung und Beurteilung des Zellwachstums in
Perfusionszellkulturen ist bisher nicht möglich. Die morphologische Beurteilung erlaubt nur
Momentaufnahmen. Nur stärkere Einflüsse, die zu einer veränderten Morphologie der Zellen
und/oder zu einer Verschiebung des extrazellulären Milieus führen, können erfaßt werden.
Damit ist ein Frühwarnsystem ausgeschlossen. Weiterhin ist ein Einsatz der dem Stand der
Technik entsprechenden Perfusionszellkultur zur kontinuierlichen Überwachung z. B. von
umwelthygienisch relevanten Medien (Wasser, Boden oder Luft) nicht möglich. Die
Kombination einer Perfusionszellkultur mit einer Alarmvorrichtung ist bisher nicht in
Betracht gezogen worden.
Das Ziel der Erfindung ist die kontinuierliche spezifische Erfassung ausgewählter, den
Stoffwechselzustand perfundierter Zellkulturen charakterisierender biochemischer
Stoffwechselparameter mittels Biosensoren zur Überwachung und frühzeitigen Erkennung
von schädigenden Einflüssen.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine kontinuierliche und spezifische
Erfassung von Stoffwechselvorgängen in einer Zellkultur zu realisieren und damit
stoffwechselkinetische Untersuchungen zu ermöglichen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Biosensoren zur kontinuierlichen
oder diskontinuierlichen Messung von Stoffwechselprodukten von Zellkulturen eingesetzt
werden. Erfindungsgemäß sind dafür insbesondere enzymatische Glukosesensoren geeignet.
Die Sensoren werden entweder direkt in dem die Zellkultur durchströmenden
Flüssigkeitsstrom angeordnet oder können sich in einem separaten Meßsystem befinden, bei
dem kontinuierlich oder diskontinuierlich ein Austausch mit dem die Zellen umströmenden
Medium erfolgt. Ferner ist bei Verwendung einer Gradienten-Perfusionszellkultur die
parallele oder zeitlich versetzte biosensorische Messung in verschiedenen Medien möglich.
Vorhandene kommerzielle Zellkultursystem wie das Perfusionskultursystem (Minucells and
Minutissue Vertriebs-GmbH, Bad Abbach) oder das PhysioControl-Microsystem
(Physikalische Technische Studien GmbH, Freiburg) können mit dem erfindungsgemäßen
Biosensorsystem nachgerüstet werden.
Die Erfindung gestattet eine mit anderen Methoden bisher nicht mögliche kontinuierliche
Überwachung von Langzeitkulturen. Dadurch eröffnen sich völlig neue Perspektiven für
Untersuchungen zur subakuten, akuten und chronischen toxischen Effekten von Wirk- und
Schadstoffen. Bei der Untersuchung zur chronischen Intoxikation wird durch die Erfindung
eine völlig neue Qualität erreicht. Die Erfindung gestattet es, Untersuchungen in einem
Konzentrationsbereich durchzuführen, der noch nicht zum Absterben der Zellen führt. Damit
wird eine wesentlich bessere Einschätzung der Gefährdungsmöglichkeiten durch chronisch
einwirkende Umweltschadstoffe möglich. Wird die Erfindung bei der Überwachung der
Umweltmedien eingesetzt, beispielsweise bei der Überwachung von Oberflächen- oder
Trinkwasser, kann die Meßanordnung zweckmäßigerweise mit einer Alarmvorrichtung
gekoppelt werden. Bei der Überwachung von Böden ist die Untersuchung von wäßrigen
Extrakten möglich, bei der Untersuchung der Luft müssen eventuelle Schadstoffe vorher in
ein wäßriges System überführt werden.
Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen erläutert werden.
Methodik: Es wurde ein Perfusionskultursystem (Minucells and Minutissue Vertriebs-GmbH,
Bad Abbach) eingesetzt.
Vorkultur: Humane Amnionepithelzellen (FL-Zellen) wurden trypsiniert. 100 µl einer
Zellsuspension (3 × 106 Zellen/ml) in Wachstumsmedium (Dulbecco modifiziertes Eagle-
Medium mit 10% neonatales Kälberserum, 1% Natriumhydrogencacbonat und 2%
Antibiotika) werden auf einen Zellträger (Thermanox Nunc Inc) gebracht und 24 h bei 37°C
und 5% CO2-Gehalt bebrütet, bis ein geschlossener Zellrasen entsteht.
Perfusionszellkultur: Der bewachsene Zellträger wird in den Perfusionsträger überführt.
Kulturmedium (MEM Dulbecco mit 1% Hepes und 0,1% Natriumhydrogencarbonat und N-
Acetyl-L-alanyl-L-Glutamin) mit einem 10%igen Zusatz der zu untersuchenden Probe bzw.
bei der Kontrolle mit sterilem destilliertem Wasser wird bei 37°C mit einer
Geschwindigkeit von 1 ml/h über den Träger gepumpt, so daß die Zellen ständig mit frischen
Nährstoffen versorgt und die Stoffwechselprodukte ständig abgeführt werden. Hinter die
Zellkultur wird erfindungsgemäß ein enzymatischer Glucosesensor angeordnet. Über einen
Meßverstärker mit Datenspeicher werden die Signale kontinuierlich aufgezeichnet. Durch
Berechnung der Differenz zwischen der gemessenen Glucosekonzentration hinter der
Perfusionszellkultur und der bekannten und konstanten Glucosekonzentration des
perfundierten Kulturmediums wird der Glucoseverbrauch der Zellkultur festgestellt.
Ergebnisse: Innerhalb der ersten 10 h steigt die Glukoseverwertung in einer
Perfusionszellkultur kontinuierlich an. In dieser Phase überwiegen offenbar mitotische
Prozesse, die mit einer ansteigenden Stoffwechselaktivität verbunden sind, die
erfindungsgemäß über einen erhöhten Glucoseverbrauch der Zellkultur direkt erfaßt werden
kann.
Methodik: wie im Beispiel 1, jedoch biosensorische Erfassung der Glukoseverwertung in einer
Langzeitkultur über 72 h.
Ergebnisse: Nach Abschluß der mitotischen Initialphase mit ansteigender
Stoffwechselaktivität, charakterisiert durch zunehmenden Glucoseverbrauch in der
Perfusionszellkultur (s. Bsp. 1), wird ein sehr stabiles Meßsignal erhalten, das anzeigt, daß es
gelungen ist, die Zellen in einer organtypischen Interphase des Stoffwechsels mit einer
konstanten Stoffwechselaktivität zu halten. Erfindungsgemäß ist die erreichte stabile
Stoffwechselsituation über den konstanten Glucoseverbrauch in der Perfusionszellkultur,
bezogen auf die Glucose-Ausgangskonzentration in der Nährlösung, biosensorisch direkt
erfaßbar (Abb. 1, Mittelwerte aus n = 4 Messungen).
Methodik: wie in Beispiel 2
Ergebnisse: Nach ansteigender Stoffwechselaktivität in der Initialphase (vgl. Bsp. 1) und anschließender stabiler Stoffwechselsituation (vgl. Bsp. 2) wird infolge Einwirkung eines Wirkstoffes die Stoffwechselsituation der Zellkultur in charakteristischer Weise derart verändert, daß es zu einem erhöhten Glucoseverbrauch in der Zellkultur kommt, meßbar als Verringerung der Glucosekonzentration nach der Perfusionszellkultur im Vergleich zur Ausgangskonzentration im Kulturmedium. Nach Absetzen des Wirkstoffs kommt es zu einer allmählichen Normalisierung und erneuten Stabilisierung der Stoffwechselsituation (Abb. 2). Erfindungsgemäß konnte durch kontinuierliche Überwachung des Glucoseverbrauches durch die Zellkultur eine im subtoxischen Bereich liegende Beeinflussung der Stoffwechselaktivität der Zellkultur durch den Wirkstoff erfaßt werden.
Ergebnisse: Nach ansteigender Stoffwechselaktivität in der Initialphase (vgl. Bsp. 1) und anschließender stabiler Stoffwechselsituation (vgl. Bsp. 2) wird infolge Einwirkung eines Wirkstoffes die Stoffwechselsituation der Zellkultur in charakteristischer Weise derart verändert, daß es zu einem erhöhten Glucoseverbrauch in der Zellkultur kommt, meßbar als Verringerung der Glucosekonzentration nach der Perfusionszellkultur im Vergleich zur Ausgangskonzentration im Kulturmedium. Nach Absetzen des Wirkstoffs kommt es zu einer allmählichen Normalisierung und erneuten Stabilisierung der Stoffwechselsituation (Abb. 2). Erfindungsgemäß konnte durch kontinuierliche Überwachung des Glucoseverbrauches durch die Zellkultur eine im subtoxischen Bereich liegende Beeinflussung der Stoffwechselaktivität der Zellkultur durch den Wirkstoff erfaßt werden.
Claims (8)
1. Meßanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen, chronisch toxischen und/oder
stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mit Hilfe von Perfusionszellkulturen,
dadurch gekennzeichnet, daß durch den Einbau von Biosensoren in verschiedenen
Kompartimenten eines Zellkultursystems eine kontinuierliche und/oder
diskontinuierliche Erfassung von Stoffwechselparametern unter verschiedenen
Kulturbedingungen und unter dem Einfluß stimulierender und hemmender Stoffe bei
akuter oder chronischer Einwirkung möglich wird.
2. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe eines
enzymatischen Glucosesensors die Glucoseverwertung in einer Perfusionszellkultur
kontinuierlich oder diskontinuierlich erfaßt wird.
3. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch Verwendung
von für andere Substrate spezifischen Biosensoren weitere für die
Stoffwechselsituation relevante biochemische Spezies kontinuierlich oder
diskontinuierlich erfaßt werden.
4. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß über einen angepaßten
Algorithmus die biosensorisch erfaßten Meßwerte analysiert und für weitere Funktionen,
z. B. Zuführung weiterer Substrate und Zusätze zum Medium und/oder für
Alarmfunktionen genutzt werden.
5. Meßanordnung nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die biosensorische
Erfassung von Stoffwechselparametern parallel oder zeitlich versetzt in verschiedenen
Medien eines Gradientensystems erfolgt.
6. Meßanordnung nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Hilfe von
Biosensoren erhaltenen Informationen zum Aufbau eines Überwachungs- und
Warnsystems für umwelthygienische Untersuchungen dienen.
7. Meßanordnung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß im Rahmen der
kontinuierlichen Überwachung von Wasser, Luft und Boden bei Überschreitung einer
Schwelle ein Alarm ausgelöst wird.
8. Meßanordnung nach Anspruch 1, 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das System
zur toxikologischen Charakterisierung von Wirkstoffen im akuten, subakuten und
chronischen Versuch eingesetzt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997109649 DE19709649A1 (de) | 1997-03-07 | 1997-03-07 | Meßanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen, chronisch toxischen und/oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mit Hilfe von Perfusionszellkulturen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997109649 DE19709649A1 (de) | 1997-03-07 | 1997-03-07 | Meßanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen, chronisch toxischen und/oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mit Hilfe von Perfusionszellkulturen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19709649A1 true DE19709649A1 (de) | 1998-09-24 |
Family
ID=7822743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1997109649 Withdrawn DE19709649A1 (de) | 1997-03-07 | 1997-03-07 | Meßanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen, chronisch toxischen und/oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mit Hilfe von Perfusionszellkulturen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19709649A1 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102007038777A1 (de) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Zellkulturmesssystem und Verfahren für vergleichende Untersuchungen an Zellkulturen |
| DE102008035442A1 (de) | 2008-07-26 | 2010-01-28 | Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald | Zubereitungen aus Artemisia Annua, ihre Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel und ihre Verwendung |
| WO2011000572A1 (de) | 2009-07-02 | 2011-01-06 | Patenthandel Portfoliofonds I Gmbh & Co. Kg | Verfahren und vorrichtung zum nachweis von biologischen langzeiteffekten in zellen |
-
1997
- 1997-03-07 DE DE1997109649 patent/DE19709649A1/de not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102007038777A1 (de) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Zellkulturmesssystem und Verfahren für vergleichende Untersuchungen an Zellkulturen |
| WO2009021501A3 (de) * | 2007-08-10 | 2009-06-18 | Fraunhofer Ges Forschung | Zellkulturmesssystem und verfahren für vergleichende untersuchungen an zellkulturen |
| US8535935B2 (en) | 2007-08-10 | 2013-09-17 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. | Cell culture measuring system and method for comparative investigations on cell cultures |
| DE102008035442A1 (de) | 2008-07-26 | 2010-01-28 | Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald | Zubereitungen aus Artemisia Annua, ihre Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel und ihre Verwendung |
| WO2011000572A1 (de) | 2009-07-02 | 2011-01-06 | Patenthandel Portfoliofonds I Gmbh & Co. Kg | Verfahren und vorrichtung zum nachweis von biologischen langzeiteffekten in zellen |
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|---|---|---|---|
| 8141 | Disposal/no request for examination |