DE19655440B4

DE19655440B4 - Verfahren zur Herstellung eines Influenzaimpfstoffs

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Publication number: DE19655440B4
Application number: DE1996155440
Authority: DE
Inventors: Albrecht Gröner
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: GSK Vaccines GmbH
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 2013-09-05
Anticipated expiration: 2016-04-02

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Influenzaimpfstoffs, bei dem man (a) durch Influenzaviren infizierbare MDCK-Zellen in Zellkultur kultiviert, wobei die MDCK-Zellen adhärent wachsen, (b) die Zellen in einem serumfreien Medium mit Influenzaviren infiziert, (c) die Zellen nach der Infektion im Bereich von 30–33°C zur Virusvermehrung kultiviert, (d) die vermehrten Viren 2 bis 10 Tage nach der Infektion erntet und isoliert, (e) die Influenzaviren zu einem Impfstoff formuliert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur bei erniedrigten Temperaturen.
Alle Influenza-Impfstoffe, die seit den 40er Jahren bis heute als zugelassene Impfstoffe zur Behandlung von Mensch und Tier angewandt werden, bestehen aus einem oder mehreren Virusstämmen, die in embzyonierten Hühnereiern vermehrt worden waren. Diese Viren werden aus der Allantoisflüssigkeit infizierter Hühnereier isoliert und deren Antigene entweder als intakte Viruspartikel oder als durch Detergentien und/oder Lösungsmittel desintegrierte Viruspartikel – sog. Spaltimpfstoff- oder als isolierte, definierte Virusproteine – sog. Subunit-Impfstoff – als Impfstoff angewandt. In allen zugelassenen Impfstoffen sind die Viren durch den Fachmann bekannte Verfahren inaktiviert. Auch die Vermehrung lebend attenuierte Viren, die in Versuchsvaccinen erprobt werden, erfolgt in embzyonierten Hühnereiern.
Die Benutzung embryonierter Hühnereier zur Impfstoff-Produktion ist zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Die Eier – aus tierärztlich überwachten, gesunden Hühnerherden – müssen vor der Infektion bebrütet werden, üblicherweise 12 Tage. Vor der Infektion müssen die Eier hinsichtlich lebender Embryonen selektiert werden, da nur diese Eier zur Virusvermehrung geeignet sind. Nach der Infektion werden die Eier erneut bebrütet, üblicherweise 2 bis 3 Tage. Die zu diesem Zeitpunkt noch lebenden Embryonen werden in der Kälte abgetötet und die Allantoisflüssigkeit wird dann durch Absaugen aus den einzelnen Eiern gewonnen. Durch aufwendige Reinigungsverfahren werden Substanzen aus dem Hühnerei, die zu unerwünschten Nebenwirkungen des Impfstoffes führen, von den Viren getrennt, und die Viren konzentriert. Da Eier nicht steril (pathogenfrei) sind, ist es außerdem erforderlich, Pyrogene und alle eventuell vorhandenen Pathogene zu entfernen und/oder zu inaktivieren. Zur Erhöhung der Virusausbeute wird die Vermehrung der Influenzaviren in Hühnereiern in der Regel bei erniedrigten Temperaturen durchgeführt (ca. 34°C), Auch Viren, die respiratorische Erkrankungen hervorrufen, können in Zellkultur vermehrt werden. Auch hierbei werden zum Teil erniedrigte Temperaturen verwendet (ca. 33°C), die jedoch keinen Einfluß auf die Qualität eines gegebenenfalls erhältlichen Impfstoffs haben, sondern lediglich die Vermehrung begünstigen.
Viren anderer Impfstoffe wie z. B. Tollwutviren, Mumps-, Masern-, Röteln-Viren, Polioviren und FSME-Viren können in Zellkultuxen vermehrt werden. Da Zellkulturen, ausgehend von geprüften Zellbänken, pathogenfrei sind und im Gegensatz zu Hühnereiern ein definiertes Virusvermehrungssystem darstellen, das (theoretisch) in beinahe unbegrenzter Menge zur Verfügung steht, ermöglichen sie unter Umständen auch im Fall von Influenzaviren eine wirtschaftliche Virusvermehrung. Eine wirtschaftliche Impfstoffproduktion wird eventuell auch dadurch erreicht, daß die Virus-Isolierung und -Reinigung aus einem definierten, sterilen Zellkulturmedium einfacher erscheint als aus der stark proteinhaltigen Allantoisflüssigkeit.
Die Isolierung und Vermehrung von Influenzaviren in Eiern führt zu einer Selektion bestimmter Phenotypen, von denen sich die Mehrzahl vom klinischen Isolat unterscheidet. Im Gegensatz dazu steht die Isolierung und Vermehrung der Viren in Zellkultur bei der keine passagenabhängige Selektion eintritt (Oxford, J. S. et al., J. Gen. Virology 72 (1991), 185–189; Robertson, J. S. et al., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047–2051). Für einen wirksamen Impfstoff ist deshalb die Virusvermehrung in Zellkultur auch unter diesem Aspekt der in Eiern vorzuziehen.
Es ist bekannt, daß Influenzaviren sich in Zellkulturen vermehren lassen. Neben Hühnerembryozellen und Hamsterzellen (BHK21-F und HKCC) sind MDBK-Zellen, sowie insbesondere MDCK-Zellen als geeignete Zellen zur in vitro-Vermehrung von Influenzaviren beschrieben worden (Kilbourne, E. D., in: Influenza, Seiten 89–110, Plenum Medicak Book Company-New York und London, 1987). Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion ist die Zugabe von Proteasen zum Infektionsmedium, vorzugsweise Trypsin oder ähnliche Serinproteasen, da diese Proteasen extrazellulär das Vorläuferprotein des Hämagglutinin [HA₀] in das aktive Hämagglutinin [HA₁ und HA₂] spalten. Nur gespaltenes Hämagglutinin führt zur Adsorption der Influenzaviren an Zellen mit nachfolgender Virusaufnahme in die Zelle (Tobita, K. et al., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9–14; Lazarowitz, S. G. & Choppin, P. W., Virology, 68 (1975) 440–454; Klenk, H.-D. et al., Virology 68 (1975) 426–439) und somit zu einem weiteren Vermehrungszyklus des Virus in der Zellkultur.
Im Patent US 4 500 513 wurde die Vermehrung von Influenzaviren in Zellkulturen adhärent wachsender Zellen bei Temperaturen im Bereich von 34–37°C beschrieben.
Nach Zellvermehrung wird das Nährmedium entfernt und frisches Nährmedium bei gleichzeitiger oder kurz darauf folgender Infektion der Zellen mit Influenzaviren zu den Zellen gegeben. Eine vorgegebene Zeit nach der Infektion wird Protease (z. B. Trypsin) zugesetzt, um eine optimale Virusvermehrung zu erhalten. Die Viren werden geerntet, gereinigt und zu inaktiviertem oder attenuiertem Impfstoff verarbeitet. Eine wirtschaftliche Influenzavirus-Vermehrung als Voraussetzung für eine Impfstoff-Produktion läßt sich mit der im genannten Patent beschriebenen Methodik jedoch nicht leisten, da der Medienwechsel, die nachfolgende Infektion sowie die später erfolgende Zugabe von Trypsin mehrmaliges Öffnen der einzelnen Zellkulturgefäße erfordert und somit sehr arbeitsintensiv ist. Ferner steigt die Gefahr einer Kontamination der Zellkultur durch unerwünschte Mikroorganismen und Viren mit jeder Manipulation der Kulturgefäße. Eine kostengünstigere Alternative stellt die Zellvermehrung in dem Fachmann bekannten Fermenter-Systemen dar, wobei die Zellen adhärent auf Microcarriern wachsen. Das für das Anwachsen der Zellen auf den Microcarriern erforderliche Serum (üblicherweise fötales Kälberserum) enthält jedoch Trypsin-Inhibitoren, so daß auch bei dieser Produktionsmethode ein Mediumwechsel auf serumfreies Medium notwendig ist, um die Spaltung des Influenzahämaglutinins durch Trypsin und damit eine ausreichend hohe Virusvermehrung zu erzielen. Somit erfordert auch diese Methodik mehrfaches Öffnen der Kulturgefäße und bringt so die erhöhte Gefahr der Kontamination mit sich.
Im Stand der Technik wurden mehrere Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in MDCK-Zellen beschrieben (siehe Merten et al. 1996, Adv. Exp. Med. Biol., 397, 141–51; Portari Mancini & Yano 1993, Rev. Bioquim. Univ. S. Paulo, 29, 89–95; Kaverin et al. 1995, J. Virol., 69, 2700–2703; Boycott et al. 1994, Virology, 203, 313–319; Govorkova et al. 1995, J. Inf. Diseases, 172, 250–253; Tree et al. 2001, Vaccine, Vol. 19, 3444–3450; und Nakamura et al. 1980, J. Jpn. Assn. Infect. Dis., 54, 306–312). Ähnliche Verfahren werden auch in WO 96/15231 und WO 96/15232 beschrieben. Tannock et al. 1985, Vaccine, 3, 333–338 und Herrero-Uribe et al. 1983 J. Gen. Virol., 64, 471–475 beschreiben eine Vermehrung von Influenzaviren in Hühnerzellen bzw. in humanen diploiden MRC-5 Zellen. In diesen Verfahren werden bei der Vermehrung der Viren Temperaturen im Bereich von 33–37°C verwendet.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Verfügung zu stellen, die eine einfache und wirtschaftliche Influenzavirus-Vermehrung in Zellkultur ermöglichen und zu einem hochwirksamen Impfstoff führen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Influenzaimpfstoffs, bei dem man

(a) durch Influenzaviren infizierbare MDCK-Zellen in Zellkultur kultiviert, wobei die MDCK-Zellen adhärent wachsen,
(b) die Zellen in einem serumfreien Medium mit Influenzaviren infiziert,
(c) die Zellen nach der Infektion im Bereich von 30–33°C zur Virusvermehrung kultiviert,
(d) die vermehrten Viren 2 bis 10 Tage nach der Infektion erntet und isoliert,
(e) die Influenzaviren zu einem Impfstoff formuliert.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die Zellen nach der Infektion mit den Influenzaviren bei einer Temperatur von 32–33°C zur Virusvermehrung kultiviert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zu den kultivierten Zellen vor, während oder nach der Infektion mit Influenzaviren eine Protease, vorzugsweise eine Serinprotease, wie z. B. Trypsin, gegeben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Ernten und Isolieren der Influenzaviren 2 bis 7 Tage nach der Infektion.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der Impfstoff in Schritt (e) gegebenenfalls in Kombination mit Stoffen vor, die die Immunantwort verstärken.
Die Influenzaviren können dabei als intakte Viruspartikel, als attenuierte Viren, oder als desintegrierte Viruspartikel vorliegen. Alternativ dazu kann der Impfstoff isolierte Proteine des Influenzavirus enthalten.
Es wurde überraschend gefunden, daß durch die Vermehrung der Influenzaviren in infizierten Zellen bei erniedrigten Temperaturen Viren erhalten werden, die eine wesentlich höhere Wirksamkeit als Impfstoff aufweisen als solche Viren, die durch Vermehrung bei 37°C gewonnen werden. Die Vermehrung bei 37°C, der üblicherweise verwendeten Temperatur zur Influenzavermehrung in Zellkultur, führt zwar zu verhältnismäßig hohen Virusausbeuten in kurzer Zeit. Jedoch besitzen die so erzeugten Viren im Vergleich zu Viren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, eine geringe Wirksamkeit als Impfstoff.
Bei den Zellen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Vermehrung der Influenzaviren verwendet werden, kann es sich prinzipiell um jede beliebige Art von adhärent wachsenden MDCK-Zellen handeln, die sich in Zellkultur kultivieren lassen und die durch Influenzaviren infizierbar sind.
Für die Kultivierung der Zellen in dem erfindungsgemäßen Verfahren können die dem Fachmann bekannten üblichen Methoden zur Zellkultur verwendet werden, insbesondere solche, die bereits bekannt sind für die Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur.
Die Kultivierung der Zellen erfolgt in der Regel bei einem geregelten pH-Wert der vorzugsweise im Bereich von pH 6,6 bis pH 7,8, insbesondere im Bereich von pH 6,8 bis pH 7,3 liegt.
Ferner kann vorteilhafterweise der pO₂-Wert geregelt werden und liegt dann in der Regel zwischen 25% und 95%, insbesondere zwischen 35% und 60% (bezogen auf die Luftsättigung).
Werden adhärent wachsende Zellen verwendet, hängt die optimale Zelldichte für die Infektion von der jeweiligen Zellinie ab.
Die Infektion der Zellen mit Influenzaviren erfolgt vorzugsweise bei einer m. o. i. (multiplicity of infektion) von ca. 0,0001 bis 10, vorzugsweise von 0,002 bis 0,5.
Die Zugabe einer Protease, die die Spaltung des Vorläuferproteins des Hämagglutinins [HA₀] und somit die Adsorption der Viren an die Zellen bewirkt, kann erfindungsgemäß kurz vor, gleichzeitig mit oder kurz nach der Infektion der Zellen mit Influenzaviren erfolgen. Erfolgt die Zugabe gleichzeitig mit der Infektion, so kann die Protease entweder direkt zu der zu infizierenden Zellkultur zugegeben werden oder beispielsweise als Konzentrat gemeinsam mit dem Virus-Inokulat. Wird ein serumhaltiges Medium zur Kultivierung verwendet, sollte dieses vor der Proteasezugabe entfernt werden. Die Protease ist vorzugsweise eine Serinprotease, und besonders bevorzugt Trypsin.
Wird Trypsin verwendet, so beträgt die zugesetzte Endkonzentration im Kulturmedium vorteilhafterweise 1 bis 200 μg/ml, vorzugsweise 5 bis 50 μg/ml, und besonders bevorzugt 5 bis 30 μg/ml.
Nach der Infektion wird die infizierte Zellkultur zur Vermehrung der Viren weiter kultiviert, insbesondere bis ein maximaler cytophatischer Effekt bzw. eine maximale Virusantigenmenge nachgewiesen werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt das Ernten und Isolieren der vermehrten Influenzaviren 2 bis 10 Tage, vorzugsweise 2 bis 7 Tage, nach der Infektion. Hierzu werden beispielsweise die Zellen bzw. Zellreste mittels dem Fachmann bekannten Methoden vom Kulturmedium getrennt, z. B. durch Separatoren oder Filter. Nachfolgend erfolgt die Konzentrierung der im Kulturmedium vorhandenen Influenzaviren nach dem Fachmann bekannten Methoden, wie z. B. Gradientenzentrifugation, Filtration, Präzipitation u. ä.
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlichen Influenzaviren können nach bekannten Methoden zu einem Impfstoff für die Anwendung am Menschen oder Tier formuliert werden. Wie bereits oben erläutert, haben derartige Influenzaviren eine höhere Wirksamkeit als Impfstoff als Influenzaviren, die durch Vermehrung bei 37°C in Zellkultur erhalten werden.
Die Immunogenität bzw. Effektivität der gewonnenen Influenzaviren als Impfstoff kann nach dem Fachmann bekannten Methoden, z. B. durch den vermittelten Schutz im Belastungsversuch oder als Antikörpertiter virusneutralisierender Antikörper bestimmt werden.
Die erzeugte Virus- bzw. Antigenmenge kann beispielsweise durch die Bestimmung der Menge an Hämagglutinin nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen. Es ist beispielsweise bekannt, daß gespaltenes Hämagglutinin an Erythrozyten verschiedener Spezies, z. B. an Hühnererythrozyten, bindet. Dies ermöglicht eine einfache und schnelle Quantifizierung der produzierten Viren bzw.. des gebildeten Antigens durch entsprechende Nachweismethoden.
Durch Vergleichsversuche im Tiermodell konnte nachgewiesen werden, daß erfindungsgemäße Influenzaviren einen wesentlich höheren Titer neutralisierender Antikörper hervorrufen als bei 37°C vermehrte Viren und dadurch einen wesentlich besseren Schutz gegenüber Influenzavirusinfektion vermittelten. Der Titer neutralisierender Antikörper war beispielsweise in Versuchen mit Mäusen als Tiermodell 2 Wochen nach Vaccination um mindestens den Faktor 4 höher als der Titer neutralisierender Antikörper nach Impfung mit Influenzaviren, die bei 37°C vermehrt worden waren. 4 Wochen nach der Impfung war der Titer neutralisierender Antikörper mindestens um den Faktor 17 höher z. T. bis zu 27 mal höher. Wurde eine Revaccination durchgeführt, konnte der Titer neutralisierender Antikörper sogar um einen Faktor von über 60 höher sein bei Verwendung erfindungsgemäßer Influenzaviren im Vergleich zu Influenzaviren, die bei 37°C vermehrt wurden. Dementsprechend kann die Überlebensrate von Tieren in einem Belastungsversuch mit einer Applikation von 1000 LD₅₀ (Letale Dosis 50%) von 1/10 auf mindestens 8/10, vorzugsweise auf 9/10 und besonders bevorzugt auf 10/10 (100%) gesteigert werden.
Offenbart werden ferner Vakzinen, die die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Influenzaviren enthalten. Derartige Vakzinen können gegebenenfalls die für Impfstoffe üblichen Zusatzstoffe enthalten, insbesondere Stoffe, die die Immunantwort verstärken, d. h. sogenannte Adjuvantien, z. B. Hydroxide verschiedener Metalle, Bestandteile von Bakterienzellwänden, Öle oder Saponine, und darüber hinaus gängige pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe.
Die Viren können in den Vakzinen als intakte Viruspartikel, insbesondere als lebend attenuierte Viren vorliegen. Hierzu werden Viruskonzentrate auf den gewünschten Titer eingestellt und entweder lyophilisiert oder in flüssiger Form stabilisiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Vakzinen desintegrierte, d. h. inaktivierte, oder intakte, jedoch inaktivierte Viren enthalten. Hierzu wird die Infektiosität der Viren mittels chemischer und/oder physikalischer Methoden (z. B. durch Detergentien oder Formaldehyd) zerstört. Der Impfstoff wird anschließend auf die gewünschte Antigenmenge eingestellt und nach eventueller Zumischung von Adjuvantien oder nach eventueller Impfstoffformulierung, z. B. als Liposome, Microspheres oder ”slow release”-Formulierungen, abgefüllt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann schließlich die erfindungsgemäße Vakzine als Subunit-Impfstoff vorliegen, d. h. sie kann definierte, isolierte Virusbestandteile, vorzugsweise isolierte Proteine des Influenzavirus enthalten. Diese Bestandteile können nach dem Fachmann bekannten Methoden aus den Influenzaviren isoliert werden.
Der Unterschied, daß die Influenzaviren, die bei niedrigeren Temperaturen hergestellt wurden, eine höhere Antigenität besitzen, als Viren, die nach herkömmlichen Methoden bei höheren Temperaturen hergestellt wurden, kann für diagnostische Zwecke verwendet werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Es ist zu beachten, dass die Beispiele 2–5 keine Ausführungsformen der Erfindung darsteller sondern lediglich zum leichteren Verständnis der Erfindung dienen.
Beispiel 1
Vermehrung von Influenzaviren in MDCK-Zellen bei 33°C
MDCK-Zellen (ATCC CCL 34) wurden in Zellkulturflaschen vermehrt (Eagle's MEM [EMEM] mit 2% FKS, Inkubation bei 37°C für 4 Tage). Der entstandene dichte Zellrasen wurde mit Trypsin-Lösung von der Gefäßwand abgelöst, die Zellen vereinzelt und das Zellkonzentrat in serumhaltigem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml in Rollflaschen (200 ml/Flasche) ausgesät und bei 4 Upm bei 37°C inkubiert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Influenzaviren infiziert. Dazu wurde das Medium über dem dichten Zellrasen entfernt und durch serumfreies EMEM ersetzt. Influenzavirus A/PR/8/34 wurde mit einer m. o. i. (multiplicity of infection) von 0,1 und Trypsin in einer Endkonzentration von 25 μg/ml zum Medium zugegeben. Je zwei Rollflaschen wurden bei 37°C bzw. bei 33°C inkubiert. Die Virusvermehrung als Antigenmenge (gemessen als Hämagglutin-Einheiten) und als Infektiosität (gemessen im CCID₅₀-Test wurde bestimmt und ist in Tabelle I wiedergegeben. Tabelle I Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 in Rollflaschen (MDCK-Zellinie) nach Inkubation bei 37°C und 33°C, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten und Infektiosität (CCID₅₀)

HA-Gehalt CCID₅₀/ml [log₁₀]

2 dpi 3 dpi 4 dpi 4 dpi

37°C 1:128 1:512 1:1024 6,4

33°C 1:64 1:256 1:1024 5,7

dpi = Tage nach Infektion
Die angegebenen Verhältnisse bedeuten, daß eine 1:X-Verdünnung der Virusernte noch hämagglutinierende Eigenschaften besitzt. Die hämmagglutinierenden Eigenschaften können bespielsweise bestimmt werden wie in Mayer et al., Virologische Arbeitsmethoden, Band I (1974), Seite 260 bis 261 oder in Grist, Diagnostic Methods in Clinical Virology, Seite 72 bis 75 beschrieben, durchgeführt werden.
Die Bestimmung des CCID₅₀-Wertes kann z. B. nach der Methode erfolgen, die in Paul, Zell- und Gewebekultur (1980), S. 395 beschrieben ist.
Beispiel 2
Herstellung einer Zellinie, die an das Wachstum in Suspension angepaßt und durch Influenzaviren infizierbar ist
Eine Zellinie, die an das Wachstum in Suspensionskultur angepaßt ist und durch Influenzaviren infizierbar ist wurde ausgehend von MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)), die nur wenige Passagen oder über mehrere Monate im Labor vermehrt worden waren, selektioniert. Diese Selektion erfolgte durch Vermehrung der Zellen in Rollflaschen, die sich mit 16 Upm (anstatt ca. 3 Upm wie für Rollflaschen mit adhärent wachsenden Zellen üblich) drehten. Nach mehreren Passagen der im Medium suspendiert vorliegenden Zellen wurden in Suspension wachsende Zellstämme gewonnen. Diese Zellstämme wurden mit Influenzaviren infiziert und die Stämme ausgewählt, die die höchste Virusausbeute erbrachten. Eine Erhöhung der Rate an in Suspension wachsenden Zellen wähnend der ersten Passagen bei 16 Upm wird durch die Zugabe von dem Fachmann bekannten Selektionssystemen wie Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin, oder Alanosin und Adenin, einzeln oder in Kombination, über 1 bis 3 Passagen erreicht. Die Selektion von in Suspension wachsenden Zellen ist auch in anderen bewegten, dem Fachmann bekannten, Zellkultursystemen wie Rührflaschen möglich. Ein Beispiel für Zellen, die an das Wachstum in Suspension angepaßt sind und durch Influenzaviren infizierbar sind, ist die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219).
Beispiel 3
Vermehrung von Influenzaviren in MDCK 33016-Zeller bei 33°C
Die in Suspension wachsende Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Isove's Medium mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 Upm drehte, bei 37°C vermehrt. 4 Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenzastamm A/PR/8/34 (m. o. i. = 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 μg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 37°C bzw. 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 3 Tage bestimmt (Tab. II.) Tabelle II Vermehrung von Influenza A/PR/8/34, gemessen als Antigengehalt (RA-Einheiten) in Rollflaschen (MDCK-Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel bei einer Inkubationstemperatur von 37°C bzw. 33°C

HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)

1 dpi 2 dpi 3 dpi

37°C 1:64 1:512 1:1024

33°C 1:16 1:128 1:1024
Beispiel 4
Vermehrung verschiedener Influenzastämme in MDCK 33016-Zellen (DSM ACC 2219) bei 33°C

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC 2219) wurde in Iscove's Medium mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 Upm drehte, bei 37°C vermehrt. 4 Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit verschiedenen Influenzastämmen (m. o. i ≈ 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 μg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung am 5. Tage nach der Infektion bestimmt (Tab. III). Tabelle III Vermehrung von Influenzastämmen, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten) in Rollflaschen (MDCK-Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel

HA-Gehalt 5-Tage nach Infektion
Influenzastamm	HA-Gehalt
A/Singapore	1:1024
A/Sichuan	1:256
A/Shanghai	1:256
A/Guizhou	1:128
A/Beijing	1:512
B/Beijing	1:256
B/Yamagata	1:512
A/PR/8/34	1:1024
A/Equi 1/Prag	1:512
A/Equi 2/Miami	1:256
A/Equi 2/Fontembleau	1:128
A/Swine/Gent	1:512
A/Swine/Iowa	1:1024
A/Swine/Arnsberg	1:512

Beispiel 5
Herstellung eines experimentellen Influenza-Impfstoffes
Humanpathogene Influenzaviren führen nach einer Inokulation in Mäuse üblicherweise nicht zu deren Infektion mit pathologischen Prozessen, so daß Schutzversuche mit Mäusen experimentell sehr schwierig darstellbar sind. Der Influenzavirusstamm A/PR/8/34 ist jedoch mäuseadaptiert und verursacht nach intranasaler Applikation eine disosabhängige Mortalität bei Mäusen.
Aus Influenzavirus A/PR/8/34 aus Beispiel 3 (A/PR/8 bei 37°C bzw. 33°C vermehrt) wurde ein experimenteller Impfstoff hergestellt. Die Influenzaviren in Zellkulturmedium wurden von Zellen und Zellbruchstücken durch niedertourige Zentrifugation (2,000 g, 20 min, 4°C) getrennt und durch eine Saccharosegradientenzentrifugation gereinigt (10 bis 50% (Gew./Gew.) linearer Saccharosegradient, 30,000 g, 2 h, 4°C) Die Influenzavirus-haltige Bande wurde gewonnen, mit PBS pH 7,2 1:10 verdünnt, bei 20,000 Upm sedimentiert und der Niederschlag in PBS aufgenommen (Volumen: 50% des ursprünglichen Zellkulturmediums). Die Influenzaviren wurden mit Formaldehyd inaktiviert (zweimalige Zugabe von 0,025% einer 35%igen Formaldehydlösung im Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C unter Rühren).
Je 10 NMRI-Mäuse, 18 bis 20 g schwer, wurden mit je 0,3 ml dieser inaktivierten Versuchsimpfstoffe am Tag 0 und Tag 28 durch subcutane Injektion geimpft. 2 und 4 Wochen nach der Impfung sowie 1 und 2 Wochen nach der Revaccination wurde den Tieren Blut zur Bestimmung des Titers neutralisierender Antikörper gegen A/PR/8/34 entnommen. Zur Bestimmung der Schutzrate wurden die Mäuse 2 Wochen nach Revaccination (6 Wochen nach Versuchsbeginn) durch intranasale Applikation von 1000 LD₅₀ (Letale Dosis 50%) belastet. Die Ergebnisse des Versuches sind in Tabelle IV zusammengefaßt: Tabelle IV Wirksamkeit von Versuchsvaccinen: für Vaccine A wurde das Influenzavirus A/PR/8/34 bei 37°C und für Vaccine B bei 33°C vermehrt. Untersucht wurden die Titer neutralisierender Antikörper gegen A/PR/8 sowie die Schutzrate nach Belastung der Mäuse

Titer neutralisierender Antikörper/ml* Schutzrate Anzahl lebend/gesamt

2 w pvacc 4 w pvacc 1 w prevacc 2 w prevacc

37°C <28 56 676 1620 1/10

33°C 112 1549 44670 112200 9/10

* Wochen nach Vaccination (w pvacc) bzw. Wochen nach Revaccination (w prevacc)
Die Versuche belegen, daß Influenzaviren, die bei 37°C in Zellkultur mit hoher Antigenausbeute (HA-Titer) vermehrt worden waren, in der Maus nur geringe neutralisierende Antikörper-Titer induzierten und kaum Schutz vermittelten, während Influenzaviren, die bei 33°C in Zellkultur mit ebenfalls hoher Antigenausbeute (HA-Titer) vermehrt worden waren, in der Maus sehr hohe neutralisierende Antikörper-Titer induzierten und zu sehr gutem Schutz führten.
Beispiel 6
Vermehrung von Influenzaviren in MDCK-Zellen bei 33°C und Wirksamkeit des gewonnenen Impfstoffes

Die Zellinie MDCK (ATCC CL34) wurde in Eagle's MEM (EMEM) mit 2% FKS mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Zellkulturflasche bei 37°C vermehrt. 4 Tage nach Umsetzen war ein dichter Zellrasen entstanden. Nach Wechsel des Mediums auf serumfreies EMEM wurde die Zellkultur mit Influenza 2/Beijing (m. o. i. = 0,1) infiziert, Trypsin in einer Endkonzentration von 25 μg/ml zum Medium zugegeben und die infizierten Zellkulturflaschen entweder bei 37°C oder bei 33°C inkubiert. 4 Tage nach der Infektion war der HA-Gehalt in beiden Versuchsansätzen 256 HA-Einheiten. Nach niedertouriger Zentrifugation zur Entfernung von Zellen/Zellresten wurden die Viren im Überstand mit Formaldehyd inaktiviert (zweimalige Zugabe von 0,025% einer 35%igen Formaldehydlösung im Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C unter Rühren). Als Adjuvans wurde bei jedem Versuchsglied Aluminiumhydroxid (10% Endkonzentration einer 2%igen Al(OH)₃-Lösung) zugegeben. Mit diesen Versuchsimpfstoffen wurden pro Versuchsglied jeweils 3 Meerschweinchen (400 bis 500 g) mit 0,2 ml intraplantar vacciniert und 4 Wochen danach mit demselben Impfstoff revacciniert. Zur Untersuchung der Wirksamkeit des Impfstoffes wurden 2, 4 und 6 Wochen nach der Impfung Blutproben entnommen und im Hämagglutinationshemmtest und Serumneutralisationstest geprüft (vgl. Tabelle V). Tabelle V Wirksamkeit von Versuchsimpfstoffen aus Influenza B/Beijing nach Vermehrung des Virus bei 37°C und 33°C in Zellkultur: Untersucht wurden die serologischen Parameter Hämagglutinationshemmung und neutralisierende Antikörper (Durchschnittswerte von 3 Meerschweinchen

Hämagglutinationshemmung Titer				Neutralisierende Antikörper Titer
	2 w pvacc*	4 w pvacc	6 w pvacc	2 w pvacc	4 w pvacc	6 w pvacc
37°C	85	341	1024	851	1290	6760
33°C	85	341	853	3890	22400	117490

* w pvacc = Wochen nach Impfung (6 w pvacc = 2 Wochen nach Revaccination

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Influenzaimpfstoffs, bei dem man (a) durch Influenzaviren infizierbare MDCK-Zellen in Zellkultur kultiviert, wobei die MDCK-Zellen adhärent wachsen, (b) die Zellen in einem serumfreien Medium mit Influenzaviren infiziert, (c) die Zellen nach der Infektion im Bereich von 30–33°C zur Virusvermehrung kultiviert, (d) die vermehrten Viren 2 bis 10 Tage nach der Infektion erntet und isoliert, (e) die Influenzaviren zu einem Impfstoff formuliert.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zellen nach der Infektion mit Influenzaviren bei einer Temperatur von 32–33°C zur Virusvermehrung kultiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem zu den kultivierten Zellen vor, während oder nach der Infektion mit Influenzaviren eine Protease gegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Protease eine Serinprotease ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Serinprotease Trypsin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, bei dem das Ernten und Isolieren der Influenzaviren 2 bis 7 Tage nach der Infektion erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–6, wobei der Impfstoff in Schritt (e) gegebenenfalls in Kombination mit Stoffen vorliegt, die die Immunantwort verstärken.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Influenzaviren als intakte Viruspartikel vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Influenzaviren als attenuierte Viren vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Influenzaviren als desintegrierte Viruspartikel vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Vakzine isolierte Proteine des Influenzavirus enthält.