DE19619114A1

DE19619114A1 - Breeding vessel for cultures, especially for plant and tissue cultures

Info

Publication number: DE19619114A1
Application number: DE19619114A
Authority: DE
Inventors: Bimal Chandra Bhattacharyya; Parthasarathi Bhattacharyya; Satyahari Dey
Original assignee: TARSON PRODUCTS PARTNER; Indian Institutes of Technology
Current assignee: TARSON PRODUCTS PARTNER; Indian Institutes of Technology
Priority date: 1995-05-16
Filing date: 1996-05-11
Publication date: 1996-12-05
Also published as: GB2301374A; IN183604B; JP3035384U; AU4443496A; CN1138095A; CA2176615A1; NL1003139C1; FR2734280A1; GB9609762D0

Abstract

There is disclosed a vessel comprising a transparent cylindrical container (CO) having a releasably fitted cap (ca). A tube (ST) extends from the lower part of the lateral wall such that it is in communication with the container (CO) via at least one, preferably two, openings in the lateral wall (O1 and O2). The side tube also has a releasably fitted cap (cp) which has a membrane (M) which can be punctured by a needle of a syringe. The openings O1 and O2 are spaced such that culture medium may be added or withdrawn from the container (CO) without the removal of cap ca; opening O2 breaks the vacuum in the tube (st). The container (CO) has a float (F) bearing a porous sheet (PS). Plant tissue is placed on tile porous sheet (PS) and is introduced to the container by removing the cap (ca). Liquid medium is introduced through the side tube to a maximum level i.e. lower than the height of opening O2.

Description

Die Erfindung betrifft ein Zuchtgefäß für Kulturen, insbesondere für Pflanzen- und Gewebekulturen. Sie ist insbesondere geeignet für die in vitro-Wiederherstellung und für die Massenverbreitung von Pflanzen. The invention relates to a breeding vessel for cultures, in particular for Plant and tissue cultures. It is particularly suitable for those in in vitro restoration and for the mass spread of plants.

Es ist bekannt, sowohl feste als auch flüssige Kulturmedien für eine solche in-vitro-Regeneration und die Massenverbreitung von Pflanzen zu ver wenden. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Verwendung von flüssigen Kulturmedien bei herkömmlichen Verfahren der in-vitro-Regeneration von Pflanzen wirksamer ist, da die Flüssigkeiten die Aufnahme von größeren Mengen an Sauerstoff und Nährstoffen durch die Zellen bzw. Gewebe be günstigen, wodurch die Produktion gesteigert wird.It is known to use both solid and liquid culture media for such in vitro regeneration and the mass spread of plants to ver turn. However, it has been found that the use of liquid Culture media in conventional methods of in vitro regeneration of Plants are more effective because the liquids absorb larger ones Amounts of oxygen and nutrients through the cells or tissues favorable, which increases production.

Bekannte Zuchtgefäße sind üblicherweise besser geeignet für die Ver wendung von festen Kulturmedien, sie führen aber bei Verwendung von an sich vorteilhaften flüssigen Kulturmedien zu konstruktionsbedingten Nach teilen. Es ist nämlich bei flüssigen Kulturmedien für pflanzliche Gewebekul turen wichtig, daß das pflanzliche Gewebe während des Wachstums frei von irgendwelchen Kontaminationen bleibt, die entweder auf die Atmosphäre oder auf eine falsche Behandlung der Gewebekulturen während der ver schiedenen Wachstumsstufen zurückzuführen sind. Bei Verwendung flüssiger Kulturmedien ist es außerdem notwendig, das Kulturmedium in Abständen zu überwachen, um eine geeignete Menge des flüssigen Kultur mediums zu gewährleisten, die eine zuverlässige Aufnahme des Kultur mediums durch die Gewebekultur für deren Wachstum gewährleisten.Known breeding pots are usually more suitable for ver use of solid culture media, but they lead when using advantageous liquid culture media to design-related after share. It is namely in liquid culture media for vegetable tissue culture It is important that the plant tissue is free from growth during growth any contamination that remains either on the atmosphere or incorrect treatment of tissue cultures during ver different growth levels. Using Liquid culture media, it is also necessary to in the culture medium Monitor intervals to determine an appropriate amount of the liquid culture mediums to ensure the reliable absorption of the culture ensure mediums through the tissue culture for their growth.

Um die verschiedenen Wachstumsstadien der Gewebekultur durchzuführen, ist es darüber hinaus notwendig, daß die flüssigen Kulturmedien während des Wachstumsprozesses von einer Zusammensetzung gegen eine andere ausgetauscht werden. Während des Austauschs des flüssigen Kultur mediums ist es gleichfalls notwendig, daß die Gewebekultur keiner Kontami nation ausgesetzt wird. Die bekannten und gegenwärtig verwendeten Zucht gefäße sind für die Zucht von Pflanzen- und Gewebekulturen mittels flüssiger Kulturmedien nicht geeignet.In order to carry out the various stages of tissue culture growth, it is also necessary that the liquid culture media during the growth process from one composition to another be replaced. During the exchange of the liquid culture mediums it is also necessary that the tissue culture has no contaminants nation is exposed. The well-known and currently used breeding Vessels are used for the cultivation of plant and tissue cultures not suitable for liquid culture media.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Zuchtgefäß für Pflanzen- und Gewebekulturen anzugeben, das in vorteilhafter Weise für das Züchten verschiedener Arten von Pflanzen- und Gewebekulturen mittels flüssiger Kulturmedien verwendet werden kann, wobei diese Kulturmedien innerhalb des gleichen Zuchtgefäßes ohne die Gefahr einer Kontamination ausgewechselt werden können.The invention is therefore based on the object of a breeding vessel for Plant and tissue cultures indicate that is advantageous for the cultivation of various types of plant and tissue cultures liquid culture media can be used, these culture media within the same breeding vessel without the risk of contamination can be replaced.

Die Lösung der gestellten Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durchAccording to the invention, the object is achieved by

a) a transparent container with a removable lid,
b) at least one side-mounted tube that has a removable Has lid and at least one opening with the lower Area of the container communicates, and through
c) a permeable carrier for the cultures.

Das erfindungsgemäße Zuchtgefäß ermöglicht das Züchten von Kulturen, ohne das Gewebe einer Kontamination auszusetzen. Der abnehmbare Deckel des Behälters beschränkt das Einbringen von Schadstoffen in das Gefäß während der Aufzucht. Das seitlich angebrachte Rohr schafft die Möglichkeit für die erforderliche Überwachung sowie einen Austausch des flüssigen Kulturmediums und/oder für die Einstellung eines bestimmten vor gegebenen Flüssigkeitsstandes des flüssigen Kulturmediums innerhalb des Behälters und/oder für die Entleerung und/oder Beschickung des Zuchtge fäßes je nach Bedarf.The breeding vessel according to the invention enables cultures to be grown, without exposing the tissue to contamination. The removable one Lid of the container limits the introduction of pollutants into the Vessel during rearing. The pipe on the side creates that Possibility for the necessary monitoring as well as an exchange of the liquid culture medium and / or for the setting of a certain pre given liquid level of the liquid culture medium within the Container and / or for emptying and / or loading the breeding tank barrel as required.

Die Maßnahme, die Gewebekultur während der Wachstumsstufen mit dem einen oder anderen Kulturmedium zusammenzubringen, kann gleichfalls in demselben Zuchtgefäß durchgeführt werden, indem man in jeder Wachs tumsstufe der Kultur das geeignete flüssige Kulturmedium durch das seitlich angebrachte Rohr in den Behälter einbringt. Durch den abnehmbaren Deckel auf dem offenen Ende des seitlich angebrachten Rohres wird das Eindringen jeglicher Schadstoffe in den Behälter durch dieses seitlich ange brachte Rohr eingeschränkt bzw. verhindert.The measure of tissue culture during the growth stages with the Bringing together one or another culture medium can also be done in the same breeding vessel can be carried out by putting in each wax the appropriate liquid culture medium through the side attached pipe into the container. With the removable The lid on the open end of the side-mounted pipe will Penetration of any pollutants into the container from the side brought pipe restricted or prevented.

Es ist dabei besonders vorteilhaft, wenn eine Seitenwand des Behälters eine zweite Öffnung aufweist, die in einem Höhenabstand über einer ersten Öff nung angeordnet ist, und wenn die Öffnungen mit dem Rohr kommunizieren. It is particularly advantageous if a side wall of the container is a has a second opening which is at a height above a first opening is arranged, and when the openings communicate with the tube.

Es ist weiterhin von Vorteil, wenn der durch lässige Träger an einem Schwimmer angeordnet ist, insbesondere dann, wenn dieser einen radial einwärts gerichteten Flansch aufweist, auf dem der durch lässige Träger an geordnet ist, und zwar entweder durch Aufliegen oder durch eine feste Ver bindung mit dem Flansch.It is also advantageous if the casual wear on one Float is arranged, especially if this is a radial has inward flange on which the by casual support is ordered, either by laying on or by a fixed Ver binding with the flange.

Es ist weiterhin von Vorteil, wenn der Deckel des seitlich angebrachten Rohres eine Membran besitzt, insbesondere dann, wenn diese Membran mittels einer Kanüle einer Spritze durchstechbar ist.It is also advantageous if the cover is attached to the side Rohres has a membrane, especially if this membrane can be pierced by a syringe.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen des Erfindungsgegenstandes ergeben sich aus den übrigen Unteransprüchen.Further advantageous configurations of the subject matter of the invention result from the other subclaims.

Ein Ausführungsbeispiel des Erfindungsgegenstandes wird nachfolgend an hand der Fig. 1 bis 3 näher erläutert.An embodiment of the subject matter of the invention is explained in more detail below with reference to FIGS . 1 to 3.

Es zeigen:Show it:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Zuchtgefäßes, dessen Be hälter mit dem Deckel versehen ist und das den Schwimmer umschließt, dessen durchlässiger Träger innerhalb des Schwimmers unterstützt ist, Fig. 1 is a schematic representation of the breeding vessel, the loading container is provided with the lid and which encloses the float, the permeable carrier is supported inside the float,

Fig. 2 einen Schnitt durch den Schwimmer, der zur Unterstützung des durchlässigen Trägers an seinem unteren Ende einen Flansch aufweist, und Fig. 2 shows a section through the float, which has a flange at its lower end to support the permeable support, and

Fig. 3 einen Schnitt durch das vollständige Zuchtgefäß entlang der Linie A-A in Fig. 1 mit dem aufgesetzten Deckel. Fig. 3 shows a section through the complete breeding vessel along the line AA in Fig. 1 with the lid attached.

In Fig. 1 ist ein Zuchtgefäß V mit einem Behälter CO dargestellt, der eine zylindrische oder jede andere Form aufweisen kann und einen aufschraub baren Deckel Ca besitzt. Der Behälter CO ist mit einem seitlich angebrachten Rohr ST versehen, das unter einem spitzen Winkel zur Seitenwand WS des Behälters CO verläuft. Das seitlich angebrachte Rohr ST besitzt einen ab nehmbaren Deckel Cp.In Fig. 1, a cultivation vessel V is shown with a container CO, which can have a cylindrical or any other shape and has a screwable lid Ca. The container CO is provided with a laterally attached tube ST which runs at an acute angle to the side wall WS of the container CO. The side-mounted pipe ST has a removable cover Cp.

Wie in Fig. 3 dargestellt, besitzt der Deckel Cp eine Membran M, die aus einem geeigneten elastischen oder durchstechbaren Material besteht, so daß in die Membran eine Kanüle einer Spritze eingestochen und aus der Membran wieder zurückgezogen werden kann.As shown in Fig. 3, the lid Cp has a membrane M, which consists of a suitable elastic or pierceable material, so that a cannula of a syringe can be inserted into the membrane and withdrawn from the membrane.

Das seitlich angebrachte Rohr ST kommuniziert mit dem Innern des Behäl ters CO durch Öffnungen 01 und 02, die in der Seitenwand WS vorgesehen sind. Die Öffnungen 01 und 02 haben einen Abstand voneinander, derart, daß die Öffnung 01 das Einströmen, die Ergänzung oder den Abzug eines flüssigen Kulturmediums in den Behälter CO ohne das Abnehmen des Deckels Ca ermöglicht. Die Öffnung 02 ist in einem Höhenabstand über der Öffnung 01 angebracht, wodurch der Unterdruck in dem seitlich angebrach ten Rohr ST aufgehoben wird.The laterally attached pipe ST communicates with the inside of the container CO through openings 01 and 02 , which are provided in the side wall WS. The openings 01 and 02 are spaced from one another in such a way that the opening 01 enables a liquid culture medium to flow into, add to or withdraw into the container CO without removing the lid Ca. The opening 02 is mounted at a height above the opening 01 , whereby the negative pressure in the laterally attached pipe ST is canceled.

Der Behälter CO besitzt einen Schwimmer F, der gleichfalls zylindrisch aus gebildet sein kann oder jede andere Form aufweisen kann. Die Form des Behälters CO und des Schwimmers F ist nicht kritisch. Der Schwimmer F trägt einen durchlässigen oder porösen Träger PS, der als Folie oder Scheibe bzw. Platte ausgeführt sein kann.The container CO has a float F, which is also cylindrical can be formed or can have any other shape. The shape of the CO and float F tank is not critical. The swimmer F carries a permeable or porous support PS, which is used as a film or Disk or plate can be executed.

Gemäß dem in Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel ist der Schwimmer F mit einem radial einwärts gerichteten Flansch FL versehen, der mit dem durchlässigen Träger PS verbunden ist. Bei dem in Fig. 3 dargestellten Ausführungsbeispiel trägt der Flansch FL lediglich den durchlässiger Träger PS.According to the embodiment shown in Fig. 2, the float F is provided with a radially inward flange FL which is connected to the permeable support PS. In the embodiment shown in FIG. 3, the flange FL only carries the permeable support PS.

Das Gewebe wird auf den durchlässigen Trägern PS aufgelegt, wodurch gleichzeitig die Absorption von Nährstoffen durch das Gewebe aus dem flüssigen Medium ermöglicht wird. Dabei wird die Gewebekultur auf den durchlässigen Träger PS aufgelegt, und der Schwimmer F wird durch das offene Ende des Behälters CO eingeführt. Anschließend wird der Behälter CO durch den Deckel Ca verschlossen, so daß die Gewebekultur in einer kontaminationsfreien Atmosphäre gehalten wird.The fabric is placed on the permeable supports PS, whereby at the same time the absorption of nutrients by the tissue from the liquid medium is made possible. The tissue culture is based on the permeable carrier PS, and the float F is by the open end of the container CO introduced. Then the container CO closed by the lid Ca, so that the tissue culture in a contamination-free atmosphere is maintained.

Die Befestigung des Deckels Ca auf dem Behälter CO kann entweder durch ein Gewinde erfolgen, das kontinuierlich oder diskontinuierlich ausgeführt sein kann, oder durch eine kraftschlüssige Verbindung des Deckels Ca mit dem Behälter CO. Das für die Gewebekultur benötigte flüssige Medium wird durch das seitlich angebrachte Rohr ST und die Öffnung 01 in den Behälter CO eingefüllt. Sobald das flüssige Medium den Behälter CO unter dem Schwimmer F anfüllt, steigt dieser auf und schwimmt auf dem flüssigen Medium. Der Spiegel des flüssigen Mediums wird auf einem maximalen oberen Grenzwert gehalten, der niedriger liegt als die Höhe der zweiten Öffnung 02. Die Transparenz des Behälters CO und des seitlich angebrach ten Rohres ST ermöglichen eine ständige Überwachung des Spiegels des flüssigen Mediums im Behälter CO.The lid Ca can be attached to the container CO either by means of a thread, which can be carried out continuously or discontinuously, or by a non-positive connection of the lid Ca to the container CO. The liquid medium required for the tissue culture is filled into the container CO through the pipe ST attached to the side and the opening 01 . As soon as the liquid medium fills the container CO under the float F, it rises and floats on the liquid medium. The level of the liquid medium is kept at a maximum upper limit which is lower than the height of the second opening 02 . The transparency of the container CO and the laterally attached pipe ST enable constant monitoring of the level of the liquid medium in the container CO.

Während des Wachstums des Gewebes wird das flüssige Medium von dem Gewebe aufgenommen, wobei hierdurch der Spiegel der Flüssigkeit zu fallen beginnt. Dieses Absinken des Flüssigkeitsspiegels im Behälter CO wird beobachtet, und der Flüssigkeitsspiegel wird durch Zufuhr frischen flüssigen Mediums durch das seitlich angebrachte Rohr ST aufrechterhalten.As the tissue grows, the liquid medium becomes Tissue added, thereby causing the level of the liquid to increase begins to fall. This drop in the liquid level in the container CO is observed and the liquid level becomes fresh by supply maintain liquid medium through the side-mounted pipe ST.

Falls es während der verschiedenen Stadien des Wachstums der Kultur er forderlich ist, kann das flüssige Medium ausgetauscht werden, wobei das seitliche Rohr ST dazu verwendet werden kann, das flüssige Medium zu entleeren und/oder neues flüssiges Medium einzufüllen, das für das Wachstum der Gewebekultur benötigt wird.In case it occurs during the different stages of the growth of the culture is required, the liquid medium can be replaced, the Lateral tube ST can be used to add the liquid medium empty and / or fill in new liquid medium that is suitable for the Tissue culture growth is needed.

Das seitlich angebrachte Rohr ST ist mit einem abnehmbaren Deckel Cp versehen. Dieser Deckel Cp ist in besonders vorteilhafter Weise mit einer Membran M aus Gummi oder einem anderen durchstechbaren Material ver sehen, um das Entleeren oder die Zufuhr von flüssigen Kulturmedien in den Behälter CO durch das Rohr ST zu ermöglichen. Der abnehmbare Deckel Cp kann mit dem seitlichen Rohr ST eine Gewindeverbindung aufweisen, oder er kann auf dem oberen Ende des Rohres ST kraftschlüssig gehalten werden.The side-mounted pipe ST is with a removable cover Cp Mistake. This cover Cp is in a particularly advantageous manner with a Membrane M made of rubber or another pierceable material see the emptying or supply of liquid culture media in the To allow container CO through the pipe ST. The removable lid Cp can have a threaded connection with the lateral tube ST, or it can be held non-positively on the upper end of the tube ST will.

Nachdem die Gewebekultur von dem durchlässigen Träger PS getragen wird, wird zur Erhaltung einer kontaminationsfreien Atmosphäre innerhalb des Behälters CO die Zufuhr, die Ergänzung oder der Abzug eines Kultur mediums dadurch bewirkt, daß die Membran M mit der Kanüle einer Spritze durchstochen wird.After the tissue culture is carried by the permeable support PS is used to maintain a contamination-free atmosphere within of the container CO the addition, addition or withdrawal of a culture mediums causes the membrane M with the cannula of a syringe is punctured.

Wie aus den Fig. 2 und 3 hervorgeht, besitzt der Schwimmer F eine innere Wandfläche F1, die von einer äußeren Wandfläche F2 einen Abstand aufweist, so daß der Schwimmer F die erforderliche Festigkeit und den not wendigen Auftrieb erhält.As can be seen from FIGS. 2 and 3, the float F has an inner wall surface F1 which is at a distance from an outer wall surface F2, so that the float F receives the required strength and the necessary agile lift.

Die Verbindung der Deckel Ca und Cp durch Kraftschluß, kontinuierliche und/oder diskontinuierliche Gewinde verhindern den Zutritt von Schadstoffen in den Behälter CO. In besonders vorteilhafter Weise ist der Deckel Ca mit einer nach innen und abwärts geneigten Fläche SL versehen, wie dies aus Fig. 3 hervorgeht. Diese geneigte Fläche verhindert eine Kontamination aufgrund von andernfalls festgehaltenen kondensierten Tropfen, die am Deckel haften und/oder entlang der Seitenwand des Behälters CO herab tropfen.The connection of the lid Ca and Cp by friction, continuous and / or discontinuous thread prevent the entry of pollutants in the container CO. In a particularly advantageous manner, the cover Ca is provided with an inwardly and downwardly inclined surface SL, as can be seen from FIG. 3. This inclined surface prevents contamination due to otherwise retained condensed drops that adhere to the lid and / or drip down along the side wall of the container CO.

Es versteht sich, daß der Zuchtbehälter und das seitlich angebrachte Rohr, die in den Figuren mit einem zylindrischen Querschnitt dargestellt sind, jede andere geeignete Form aufweisen können, nämlich dreieckig, kreisförmig, quadratisch, rechteckig, oval oder Polygonal. Auch die Form des Schwimmers und des perforierten Trägers PS kann entsprechend der Form des Behälters variieren. Der Behälter und das seitliche Rohr können ge trennt hergestellt werden, und sie können in einem Autoklaven sterilisations fähig sein. Sie können transparent, halb-transparent sein, aus korrosions beständigem Metall- und/oder Nichtmetall-Verbundmaterial aus Glas, Kunststoff und nicht rostendem Stahl bestehen. It goes without saying that the breeding tank and the side-mounted pipe, which are shown in the figures with a cylindrical cross section, each can have another suitable shape, namely triangular, circular, square, rectangular, oval or polygonal. Even the shape of the Float and perforated support PS can be made according to the shape of the container vary. The container and the side tube can ge separates are made and they can be sterilized in an autoclave be able. They can be transparent, semi-transparent, made of corrosion resistant metal and / or non-metal composite material made of glass, Plastic and stainless steel.

Der Schwimmer kann Seitenwände aufweisen, die entweder massiv oder hohl ausgebildet sind, und er kann hergestellt sein aus korrosionsbe ständigem Metall- und/oder Nichtmetall-Verbundmaterial wie nichtrostendem Stahl oder Kunststoffen.The float can have side walls that are either solid or are hollow, and it can be made of corrosion permanent metal and / or non-metal composite material such as stainless Steel or plastics.

Die Trägerstruktur kann perforiert, porös, gewebt, vliesartig sein oder wahl weise aus korrosionsbeständigem Metall-/Nichtmetall-Verbundwerkstoff her gestellt sein, wie aus Glaswolle, Kunststoff oder nichtrostendem Stahl. Der Träger kann eine Einheit mit dem Schwimmer bilden oder ein getrenntes Bauteil sein, das von dem radial einwärts gerichteten Flansch des Schwimmers getragen wird und/oder in den Schwimmer eingesetzt ist.The support structure can be perforated, porous, woven, non-woven or optional example from corrosion-resistant metal / non-metal composite be made of glass wool, plastic or stainless steel. Of the Carrier can form a unit with the float or a separate one Be part of the radially inward flange of the Float is worn and / or is inserted in the float.

Das Zuchtgefäß bzw. der Behälter kann auch anstelle des in dem beschriebenen Ausführungsbeispielen gezeigten einzigen seitlichen Rohres mehrere seitliche Rohre aufweisen.The breeding vessel or the container can also be used instead of the Described embodiments shown single lateral tube have several side tubes.

Claims

1. Breeding vessel for cultures, in particular for plant and tissue cultures, characterized by

a) a transparent container (CO) with a removable lid (Ca),
b) at least one laterally attached tube (ST), which has a removable cover (Cp) and communicates with the lower region of the container (CO) via at least one opening ( 01 , 02 ), and through
c) a permeable carrier (PS) for the cultures).

2. Breeding vessel according to claim 1, characterized in that a side wall (WS) of the container (CO) has a second opening ( 02 ) which is arranged at a height above a first opening ( 01 ), and that the openings ( 01 , 02 ) communicate with the pipe (ST).

3. breeding vessel according to claim 1, characterized in that the is arranged by casual carrier (PS) on a float (F).

4. breeding vessel according to claim 3, characterized in that the Float (F) on a radially inward flange (FL) points on which the permeable support (PS) is arranged.

5. breeding vessel according to claim 4, characterized in that the permeable support (PS) rests on your flange (FL).

6. Breeding vessel according to claim 4, characterized in that the permeable support (PS) is connected to the flange (FL).

7. breeding vessel according to claim 3, characterized in that the Float (F) an inner wall surface (F1) and an outer wall Surface (F2) which are spaced apart.

8. breeding vessel according to claim 1, characterized in that the Cover (Cp) of the tube (ST) has a membrane (M).

9. breeding vessel according to claim 8, characterized in that the Membrane (M) can be pierced by means of a syringe cannula.

10. Breeding vessel according to claim 1, characterized in that the Lid (Ca) of the container (CO) one inwards and downwards has inclined surface (SL).

11. Breeding vessel according to claim 10, characterized in that the Surface (SL) a cone or with its tip pointing downwards Pyramid surface is.

12. Breeding vessel according to claim 1, characterized in that the laterally attached pipe (ST) at an acute angle to the vertical right axis of the container (CO) runs.