DE19503359C1 - Plants with increased tolerance towards stress - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Pflanze mit erhöhter Streßtoleranz mit den Merkmalen des Anspruchs 1, zu deren Herstellung mit den Merkmalen des Anspruchs 1.The present invention relates to a plant with elevated Stress tolerance with the features of claim 1, for their manufacture with the features of claim 1.
In sämtlichen Organismen, so auch in Pflanzen, werden Hitze schockproteine (HSP) in Reaktion auf stark erhöhte Temperaturen oder Hitzeschock (HS) synthetisiert. Die biologische Bedeutung dieser als HS-Antwort bekannten Reaktion ist der Schutz zellulä rer Proteine und Strukturen während einer Streßphase und/oder in der darauffolgenden Erholungsphase. Die HS-Antwort kann auch durch andere abiotische Streßfaktoren (Stressoren) wie z. B. Schwermetalle, Arsenit oder Trockenheit ausgelöst werden. Es handelt sich bei der HS-Antwort um eine allgemeine Streßreakti on, die das Überleben der Zelle und damit des Organismus unter ungünstigen Umweltbedingungen sichert. Die Schutzwirkung der HSPs beruht überwiegend auf einer Minimierung der Schäden, die durch die Denaturierung von Proteinen aufgrund der Einwirkung der Stressoren auf den Organismus entstehen. Fast alle HSP sind molekulare Chaperone (vgl. Tab. 1), die eine reversible Bindung mit partiell denaturierten Proteinen eingehen und dadurch eine korrekte Renaturierung (Faltung) dieser Moleküle ermöglichen bzw. beschleunigen. HSPs sind in der Lage, den Anteil an denatu riertem Protein aufgrund der Streßeinwirkung zu senken, bzw. den Anteil korrekt gefalteter, biologisch aktiver Proteine zu erhö hen. Weitere Einzelheiten über die Rolle der Heat-Shock-Proteine in Pflanzen sind beschrieben bei Vierling, E. in Annu. Rev. Plant Physiology Plant Mol. Biol. 1991, Band 42, Seiten 579-620.Heat occurs in all organisms, including plants shock proteins (HSP) in response to high temperatures or heat shock (HS) synthesized. The biological meaning This reaction, known as the HS response, is cellular proteins and structures during a stress phase and / or in the subsequent recovery phase. The HS answer can too by other abiotic stress factors (stressors) such. B. Heavy metals, arsenite or dryness are triggered. It the HS response is a general stress reaction on that the survival of the cell and thus the organism under unfavorable environmental conditions. The protective effect of HSPs relies primarily on minimizing the damage that by denaturing proteins due to exposure the stressors on the organism arise. Almost all HSP are molecular chaperones (see Tab. 1) that have a reversible bond with partially denatured proteins and thereby one enable correct renaturation (folding) of these molecules or accelerate. HSPs are able to share in denatu reduced protein due to the stress, or the Increase the proportion of correctly folded, biologically active proteins hen. More details on the role of heat shock proteins in plants are described by Vierling, E. in Annu. Rev. Plant Physiology Plant Mol. Biol. 1991, volume 42, pages 579-620.
Obwohl, wie oben ausgeführt, sämtliche Organismen bei Streß eine HS-Antwort zeigen, kommt dieser Antwort bei Pflanzen eine beson dere Bedeutung zu. Pflanzen können aufgrund ihrer Gebundenheit an den Standort am wenigsten einen Umweltstreß vermeiden oder diesem Ausweichen und sind am extremsten den abiotischen Stres soren ausgesetzt. Dabei haben die kleinen HSPs (HSP20-Gruppe mit einem Molekulargewicht von ungefähr 17-20 kDa) eine besonders wichtige Bedeutung für die Antwort der Pflanzen auf Streß. Diese Proteine werden stark exprimiert, und es gibt mehrere verwandte Gene (ein Genfamilie). Im Gegensatz zu anderen HSP-Gruppen (z. B. HSP70), gibt es keine HSP20 oder HSP20-ähnliche Proteine, die auch bereits bei Normalbedingungen, z. B. bei der normalen Umge bungstemperatur, gebildet werden. Ohne Umweltstreß werden HSP nur in bestimmten Stadien der Pflanzenentwicklung synthetisiert, wobei dies speziell in den Spätphasen der Pollenentwicklung und der Embryogenese (Dessikationsphase der Samenreifung) beobachtet wird.Although, as stated above, all organisms in stress one HS answer show, this answer comes in a special in plants their importance. Plants can because of their bond least avoid environmental stress at the site or avoiding this and are most extreme the abiotic stress sensors exposed. The small HSPs (HSP20 group with a molecular weight of approximately 17-20 kDa) important importance for the response of the plants to stress. These Proteins are highly expressed and there are several related ones Genes (a gene family). In contrast to other HSP groups (e.g. HSP70), there are no HSP20 or HSP20-like proteins even under normal conditions, e.g. B. in the normal reverse exercise temperature. Without environmental stress, HSP synthesized only in certain stages of plant development, this being especially in the late stages of pollen development and of embryogenesis (dessication phase of semen maturation) becomes.
Es sind jedoch keine Pflanzen bekannt, bei denen unter normalen streßfreien Bedingungen merkliche Spiegel an HSPs vorliegen. Insbesondere sind keine Pflanzen bekannt, bei denen unter streß freien Bedingungen eine ganze Gruppe an HSPs oder gar sämtliche HSPs in biologisch relevanten Konzentrationen in der Pflanze vorliegen.However, there are no known plants in which under normal Stress-free conditions present noticeable levels of HSPs. In particular, no plants are known in which under stress free conditions a whole group of HSPs or even all HSPs in biologically relevant concentrations in the plant available.
Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, Pflanzen bereitzustellen, die eine erhöhte Streßtoleranz aufweisen, und die insbesondere auf eine Vielzahl verschiedener Stressoren mit erhöhter Toleranz reagieren können.The present invention was based on the technical problem To provide plants that have an increased stress tolerance, and especially on a variety of different stressors can react with increased tolerance.
Dieses Problem wird gelöst durch eine Pflanze mit erhöhter Streßtoleranz, enthaltend mindestens einen konstitutiv exprimierten und aktiven Transkriptionsaktivator für die konstitutive Expression von mindestens einem Schutzprotein, das üblicherweise nur durch Streßfaktoren induziert wird.This problem is solved by a plant with increased stress tolerance, containing at least a constitutively expressed and active transcription activator for the constitutive expression of at least one Protective protein, which is usually only induced by stress factors.
Ein weiteres technisches Problem bestand darin, ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhter Streßtoleranz bereit zustellen.Another technical problem was a process ready to produce a plant with increased stress tolerance deliver.
Dieses technische Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren, umfassend die Schritte:According to the invention, this technical problem is solved by a Procedure comprising the steps:
- (a) Einbringen einer Nukleinsäure, die für einen konstitutiv aktiven Transkriptionsaktivator kodiert, in eine Pflanzen zelle, und(a) Introducing a nucleic acid that is constitutive for a encoded active transcription activator into a plant cell, and
- (b) Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der in Schritt (a) erzeugten Pflanzenzelle.(b) regenerating a transgenic plant from the one in step (a) plant cell produced.
Ein weiteres technisches Problem bestand in der Bereitstellung von Mitteln zur Erzeugung einer Pflanze mit erhöhter Streßtole ranz.Another technical problem was the provision of means for producing a plant with increased stress tolerance ranc.
Dieses technische Problem wird gelöst durch eine Nukleinsäure, die für einen in der Pflanze konstitutiv aktiven Transkriptions aktivator kodiert.This technical problem is solved by a nucleic acid, for a transcription that is constitutively active in the plant activator coded.
Fig. 1: Alternative Modelle der Regulation der HS-Antwort in höheren Eukaryonten. Fig. 1: Alternative models of regulation of the HS response in higher eukaryotes.
Fig. 2 Expression des HSF-GUS-Fusionsgens in transgener Arabi dopsis. Fig. 2 Expression of the HSF-GUS fusion gene in transgenic Arabi dopsis.
- A) zeigt schematisch die Komponenten des Genfusionskonstrukts.A) shows schematically the components of the gene fusion construct.
- B) zeigt die konstitutiven GUS-Aktivitäten in transgenen Arabi dopsis-Pflanzen. Die GUS-Aktivitäten wurden ermittelt für jedes Konstrukt in Proteinextrakten aus 30 einzelnen Transformanten (F0) und deren F1-Nachkommen. Die GUS-Aktivität wurde gemessen in pMol NAD/mg Protein/Minute.B) shows the constitutive GUS activities in transgenic Arabi dopsis plants. The CIS activities were identified for each Construct in protein extracts from 30 individual transformants (F0) and their F1 descendants. The GUS activity was measured in pMol NAD / mg protein / minute.
- C) zeigt konstitutive HSF und HSF-GUS (GH, HG) mRNAs durch Northern-Blot-HybridisierungC) shows constitutive HSF and HSF-GUS (GH, HG) mRNAs Northern blot hybridization
Fig. 3 Konstitutive Expression von HSP18 in transgener Arabi dopsis, die HSF-Fusionsproteine überexprimiert. Fig. 3 constitutive expression of HSP18 in transgenic Arabidopsis that overexpresses HSF fusion proteins.
- A) zeigt den Nachweis von HSP18 in Western-Blots. A) shows the detection of HSP18 in Western blots.
-
B) zeigt den Nachweis von HSP18-mRNA durch Nothern-Blot-Hybridi
sierung.
WT = nicht transformierte Arabidopsis; HG1, HG2, GH1, GH2 = ein zelne Transformanten, enthaltend HSF-GUS bzw. GUS-HSF.B) shows the detection of HSP18 mRNA by means of Northern blot hybridization.
WT = untransformed Arabidopsis; HG1, HG2, GH1, GH2 = a single transformant containing HSF-GUS or GUS-HSF.
"Erhöhte Streßtoleranz" wie hierin verwendet, bedeutete die Fä higkeit einer erfindungsgemäßen Pflanze, unter dem Einfluß von Streßfaktoren eine geringere Beeinträchtigung ihrer Leistungs fähigkeit zu zeigen als die Wildtyppflanze oder gar die volle Erhaltung ihrer Leistungsfähigkeit beizubehalten. Die erhöhte Streßtoleranz beruht vermutlich, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, auf dem Vorhandensein von einem oder mehreren Schutz proteinen unter Normalbedingungen in einer erhöhten Konzentrati on im Vergleich zu der jeweiligen Wildtyppflanze. Die Leistungs fähigkeit einer Pflanze zeigt sich beispielsweise in der Wachs tumsgeschwindigkeit, der Stabilität der Merkmalsausprägung, der Widerstandsfähigkeit gegenüber Pathogenen, der Qualität und des Ertrags der Ernteprodukte, der Nährstoffeffizienz, der Effizienz des Wasserhaushalts und dem Verhalten gegenüber Pflanzenschutz mitteln."Increased stress tolerance" as used herein meant the fa ability of a plant according to the invention, under the influence of Stress factors less impact on their performance ability to show as the wild type plant or even the full one Maintain their performance. The increased Stress tolerance presumably rests without being tied to any theory to be on the presence of one or more protections proteins under normal conditions in an increased concentration on compared to the respective wild type plant. The performance The ability of a plant is shown, for example, in the wax speed, the stability of the characteristics, the Resistance to pathogens, quality and the Yield of crop products, nutrient efficiency, efficiency of water balance and behavior towards crop protection average.
"Transkriptionsaktivator", wie hierin verwendet, bedeutet ein regulatorisches Protein, das im aktiven Zustand die Transkrip tion von bestimmten Genen stimuliert. Dazu muß der Transkripti onsaktivator an bestimmte Sequenzen (sogenannte Responsive Ele ments) in den Promotoren der seiner Kontrolle unterstehenden Ge ne und/oder deren flankierende Regionen (i) erkennen, (ii) daran binden und (iii) die Transkription der Gene initiieren oder för dern."Transcription activator" as used herein means one regulatory protein that is in the active state of the transcript tion of certain genes stimulated. To do this, the transcript activator on certain sequences (so-called Responsive Ele ment) in the promoters of the Ge under his control recognize ne and / or their flanking regions (i), (ii) from them bind and (iii) initiate or promote the transcription of the genes other.
Ein Transkriptionsaktivator kann als Protein entweder im aktiven (dereprimierten) oder im inaktiven (reprimierten) Zustand vor liegen. Nur im aktiven Zustand stimuliert der Aktivator die Transkription und damit die Expression der regulierten Gene. A transcription activator can act as a protein either in the active (derepressed) or inactive (repressed) state lie. The activator only stimulates the active state Transcription and thus the expression of the regulated genes.
Beispiele für Transkriptionsaktivatoren in Pflanzen sind be schrieben in K. D. Scharf, S. Rose, W. Zott, F. Schöffl und L. Nover in: The EMBO Journal, Band 9, S. 4495-4501 (1990).Examples of transcription activators in plants are wrote in K. D. Scharf, S. Rose, W. Zott, F. Schöffl and L. Nover in: The EMBO Journal, Volume 9, pp. 4495-4501 (1990).
"Konstitutiv exprimiert und aktiv" heißt im Zusammenhang mit dem Transkriptionsaktivator, daß der Aktivator ständig, d. h. unter Normalbedingungen wie unter Streßbedingungen, exprimiert wird und ständig in einer Form vorliegt, die seine Bindung an die Kontrollelemente der DNA erlaubt."Constitutively expressed and active" means in connection with the Transcriptional activator that the activator is constantly d. H. under Normal conditions as under stress conditions, is expressed and is always in a form that ties in with the Control elements of DNA allowed.
"Hitzeschockfaktor (HSF)" ist gleichzusetzen mit dem Begriff "Hitzeschock-Transkriptionsaktivator", der im aktiven Zustand über seine DNA-Bindungsdomäne an die Hitzeschockelemente (HSE) in Promotorsequenzen bindet und dadurch die Transkription der entsprechenden Gene beeinflußt. Die Aktivierung des Transkrip tionsaktivators zu seiner DNA-bindenden Form erfolgt beispiels weise durch Multimerisierung, wie Trimerisierung, einzelner Ak tivatorproteine."Heat shock factor (HSF)" is synonymous with the term "Heat shock transcription activator" that is in the active state via its DNA binding domain to the heat shock elements (HSE) binds in promoter sequences and thereby the transcription of the corresponding genes affected. Activation of the transcript tion activator to its DNA-binding form is for example wise by multimerization, such as trimerization, individual Ak tivator proteins.
Ein natürlich vorkommender HSF in Wildtyppflanzen benötigt für seine Aktivierung ein durch Unweltstreß, z. B. Hitzestreß, er zeugtes Signal.A naturally occurring HSF in wild type plants needs for its activation by environmental stress, e.g. B. heat stress, he witnessed signal.
Gene, die von HSF reguliert werden, sind z. B. die Gene für Schutzproteine, wie die Hitzeschockproteine.Genes that are regulated by HSF are e.g. B. the genes for Protective proteins, such as the heat shock proteins.
"Schutzproteine", wie hierin verwendet, sind Genprodukte von Ge nen, deren Expression von HSF reguliert wird. Zu den bekannte sten Schutzproteinen zählen die Hitzeschockproteine, die als mo lekulare Chaperone in den Zellen fungieren und dadurch andere Proteine bzw. biochemische und physiologische Prozesse in der Zelle bei Streßeinwirkung schützen. Schutzproteine können en zymatische Aktivitäten besitzen, die biochemische Reaktionen ka talysieren und so den Schutz von Zellen und Organismen vor streßbedingten Schädigungen (z. B. durch oxidativen Streß, zur Übersicht siehe [C.H. Foyer, P. Descourvieres und K.J. Kunert in: Plant, Cell and Environment, Band 17, S. 507-523 (1994)], Anaero biose [Y. Yang, H.-B. Kwon, H.-P. Peng, M.-C. Shin in: Plant Phy siology, Band 101, S. 209-216 (1993)] betreffend Schwermetall toxidität [D. Neumann, O. Lichtenberger, D. Günther, K. Tschiersch und L. Nover in: Planta, Band 194, S. 360-367 (1994)] Photoinhibition [G. Schuster, D. Even, K. Kloppstech und J. Ohad in: The EMBO Journal, Band 7, S. 1-6 (1988)] und oxidativem Streß [P. Mehlen, J. Briolag, L. Smith, C. Diaz-Latoud, M. Fa bre, D. Pauli, A.-P. Arrigo in: Eur. J. Biochemistry, Band 215, S. 277-284 (1993)]) bewirken. Hierzu zählen u. a. auch die Protei ne der HSP20-Familie."Protective proteins" as used herein are gene products from Ge nen whose expression is regulated by HSF. To the well-known Protective proteins include heat shock proteins, which are mo lecular chaperones act in the cells and thereby others Proteins or biochemical and physiological processes in the Protect the cell from stress. Protective proteins can have zymatic activities, the biochemical reactions ka and thus protect cells and organisms Stress-related damage (e.g. due to oxidative stress, for For an overview, see [C.H. Foyer, P. Descourvieres and K.J. Kunert in: Plant, Cell and Environment, Vol. 17, pp. 507-523 (1994)], Anaero biose [Y. Yang, H.-B. Kwon, H.-P. Peng, M.-C. Shin in: Plant Phy siology, volume 101, pp. 209-216 (1993)] regarding heavy metal toxicity [D. Neumann, O. Lichtenberger, D. Günther, K. Tschiersch and L. Nover in: Planta, Volume 194, pp. 360-367 (1994)] Photoinhibition [G. Schuster, D. Even, K. Kloppstech and J. Ohad in: The EMBO Journal, Volume 7, pp. 1-6 (1988)] and oxidative Stress [P. Mehlen, J. Briolag, L. Smith, C. Diaz-Latoud, M. Fa bre, D. Pauli, A.-P. Arrigo in: Eur. J. Biochemistry, volume 215, Pp. 277-284 (1993)]). These include a. also the Protei ne of the HSP20 family.
"Streßfaktoren (Stessoren)" sind biotische oder abiotische Fak toren, die zu einer Minderung der Leistungsfähigkeit einer Pflanze führen können."Stress factors (stressors)" are biotic or abiotic factors gates that reduce the performance of a Plant can lead.
Solche Faktoren können sein: Pathogenbefall (Viren, Viroide, Pilze, Bakterien, Insekten, Nematoden), Verwundung, Hitze (insbesondere bei der Blütenausbildung und während der Samenrei fe), Kälte (insbesondere während der Keimung), UV-Strahlung, ho he Lichtintensität, hohe Konzentration an Schwermetall, an Salz und/oder an Ozon, Azidität, Trockenheit und O₂-Mangel.Such factors can be: Pathogen infestation (viruses, viroids, Fungi, bacteria, insects, nematodes), wounding, heat (especially during flower formation and during the seed row fe), cold (especially during germination), UV radiation, ho he light intensity, high concentration of heavy metal, salt and / or ozone, acidity, dryness and O₂ deficiency.
"Wildtyppflanze" hierin bedeutet eine Pflanze, die eine normale Streßtoleranz zeigt und die die Ausgangspflanze bzw. -pflanzen zelle für das erfindungsgemäße Verfahren liefert."Wild type plant" herein means a plant that is normal Stress tolerance shows and the starting plant or plants cell for the inventive method provides.
"Fusionsprotein", wie hierin verwendet, bedeutet ein Fusionspro tein aus einem Transkriptionsaktivator und mindestens einem wei teren Proteinbestandteil, der üblicherweise nicht in dem ent sprechenden Transkriptionsaktivator vorkommt. Das Fusionsprotein besitzt die DNA-bindende Eigenschaft des Transkriptionsaktiva tors und ggf. weitere Eigenschaften aufgrund des weiteren Pro teinbestandteils. Der Aktivatorbestandteil des Fusionsproteins besitzt die Fähigkeit zur DNA-Bindung und zur Regulierung der Transkription der unter seiner Kontrolle stehenden Gene, und er kann den Fremdproteinanteil an seinem N-Terminus, C-Terminus und/oder innerhalb der Proteinkette tragen. Dabei umfaßt der Fremdproteinanteil vorzugsweise ca. 500-600 Aminosäuren. "Fusion protein" as used herein means a fusion pro tein from a transcription activator and at least one white ther protein component, which is usually not in the ent speaking transcription activator occurs. The fusion protein possesses the DNA-binding property of the transcription assets tors and possibly other properties due to the further pro stone component. The activator component of the fusion protein has the ability to bind and regulate DNA Transcription of the genes under his control, and he can the foreign protein portion at its N-terminus, C-terminus and / or wear within the protein chain. The includes Foreign protein content preferably about 500-600 amino acids.
"Erhöhter Spiegel an Schutzprotein" bedeutet, daß die erfin dungsgemäße Pflanze mit erhöhter Streßtoleranz ein oder mehrere Schutzproteine in einer Konzentration enthält, die höher ist als bei dem vergleichbaren Wildtyp mit normaler Streßtoleranz. Ein erhöhter Spiegel liegt beispielsweise bereits dann vor, wenn die Pflanze mit erhöhter Streßtoleranz unter streßfreien Bedingungen eine Konzentration an Schutzproteinen erreicht, die 5%, vor zugsweise ca. 15-20% oder mehr- der Konzentration an Schutzpro teinen unter Streßbedingungen entspricht."Increased level of protective protein" means that the invented Plant according to the invention with increased stress tolerance one or more Contains protective proteins in a concentration that is higher than in the comparable wild type with normal stress tolerance. On increased level is already present, for example, when the Plant with increased stress tolerance under stress-free conditions a concentration of protective proteins reached 5% before preferably about 15-20% or more of the concentration of protection pro teins corresponds to stressful conditions.
"Normalbedingungen", wie hierin verwendet, bedeutet, daß keine "Streßfaktoren", wie oben erläutert, auf die Pflanze einwirken. Ein Übergang von Normalbedingungen auf Streßbedingungen wird beispielsweise bewirkt durch eine Temperaturerhöhung von ca. 20-25°C (Normal) auf ca. 37°C (Streß). Streßreaktionen können aber auch schon bei niedrigeren und/oder höheren Temperaturen als 37°C ausgelöst werden."Normal conditions" as used herein means that none "Stress factors", as explained above, act on the plant. There will be a transition from normal conditions to stress conditions caused, for example, by a temperature increase of approx. 20-25 ° C (normal) to approx. 37 ° C (stress). Stress reactions can but also at lower and / or higher temperatures than 37 ° C.
Eine wichtige Schaltstelle für die Regulation der HS-Antwort, d. h. der HSP-Synthese, ist die Transkription der HSPs. Die koor dinierte Expression der HSPs wird durch den zentralen Regulator, d. h. den HS-Transkriptionsfaktor (HSF) bewirkt. Der HSF nimmt somit eine Schlüsselfunktion bei der Initiation der HS-Antwort ein. Diese Funktion besteht darin, Hitzeschockpromotoren zu er kennen, daran zu binden und die Transkription der HS-Gene (die für HSP kodieren) zu stimulieren. Dieses Regulationsprinzip ist bei allen höheren Eukaryonten, einschließlich der Pflanzen, kon serviert (Vgl. Fig. 1). Das zentrale Regulatorprotein HSF wird konstitutiv (d. h. permanent) gebildet, aber es ist bei normalen bzw. optimalen Wachstumsbedingungen inaktiv hinsichtlich seiner Fähigkeit an DNA zu binden und die Transkription der HS-Gene zu aktivieren. Streßeinwirkung auf die Pflanze hat zur Folge, daß der HSF aktiviert wird, d. h. er gewinnt seine Fähigkeit zur DNA-Bindung und Transkriptionsaktivierung der HS-Gene, und dies wie derum führt zur vermehrten Herstellung von HSPs. Die Aktivierung von HSF korreliert häufig mit einer Trimerisierung bzw. Multi merisierung von HSF-Monomeren. Die HSF-Trimere binden an konser vierte HS-Promotorelemente (als HSE bezeichnet, die das Konsen susmotiv [nGAAnnTTCn]n enthalten). Die so erzeugten Transkripte der HS-Gene werden dann während eines Hitzeschocks bevorzugt translatiert und in relativ großen Mengen angereichert mit der Folge, daß unter Streß ein hoher Spiegel an HSPs und an anderen Schutzproteinen in der Pflanze vorliegt.An important switching point for the regulation of the HS response, ie the HSP synthesis, is the transcription of the HSPs. The coordinated expression of the HSPs is brought about by the central regulator, ie the HS transcription factor (HSF). The HSF thus plays a key role in initiating the HS response. This function consists of knowing and binding heat shock promoters and stimulating the transcription of the HS genes (which code for HSP). This principle of regulation is served in all higher eukaryotes, including plants (see FIG. 1). The central regulatory protein HSF is constitutive (ie permanent), but it is inactive under normal or optimal growth conditions with regard to its ability to bind to DNA and to activate the transcription of the HS genes. Stress on the plant has the consequence that the HSF is activated, ie it gains its ability to bind DNA and activate the transcription of the HS genes, and this in turn leads to the increased production of HSPs. The activation of HSF often correlates with a trimerization or multi-merization of HSF monomers. The HSF trimers bind to conserved HS promoter elements (referred to as HSE, which contain the Konsen susmotiv [nGAAnnTTCn] n ). The transcripts of the HS genes generated in this way are then preferably translated during a heat shock and enriched in relatively large amounts, with the result that, under stress, a high level of HSPs and other protective proteins is present in the plant.
Eine Möglichkeit, die HS-Antwort zu beeinflussen, schien durch die ektopische Überexpression von HSF gegeben zu sein. Dabei sollte ein HSF-Gen unter der Kontrolle eines starken konstituti ven Promotors zu einer Überexpression des HSF und folglich zu einer vermehrten Transkription der HS-Gene mit der Folge eines erhöhten HSP-Spiegels führen. Wie von den Erfindern überraschen derweise gefunden, führte dieser Ansatz jedoch nicht zu einer Überexpression der HSPs.One way to influence the HS response shone through given the ectopic overexpression of HSF. Here should have an HSF gene under the control of a strong constituti ven promoters to overexpression of the HSF and consequently to an increased transcription of the HS genes with the consequence of a lead to increased HSP levels. As surprised by the inventors however, this approach did not lead to one Overexpression of the HSPs.
Dagegen wurde jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefun den, daß ein erhöhter Spiegel an Schutzproteinen in einer Pflan ze unter Normalbedingungen erhalten wird, wenn die Pflanze einen Transkriptionsaktivator, vorzugsweise einen HSF, enthält, der konstitutiv exprimiert wird und konstitutiv im aktiven Zustand vorliegt, so daß diese Pflanze mindestens ein Schutzprotein kon stitutiv exprimiert. Vorzugsweise werden in einer solchen Pflan ze jedoch mehrere Schutzproteine, wie beispielsweise die Mit glieder der HSP20-Familie, sowie HSP70 und Superoxiddismutase, gleichzeitig unter dem Einfluß des Transkriptionsaktivators kon stitutiv exprimiert. Die konstitutive Expression der Schutzpro teine kann sogar sämtliche Schutzproteine der Pflanze betreffen.In contrast, however, was found within the scope of the present invention that an increased level of protective proteins in a plant ze is obtained under normal conditions when the plant Contains transcription activator, preferably an HSF, which is constitutively expressed and constitutively in the active state is present, so that this plant con at least one protective protein expressed tripitatively. Preferably in such a plant however, several protective proteins, such as the Mit members of the HSP20 family, as well as HSP70 and superoxide dismutase, at the same time under the influence of the transcription activator kon expressed tripitatively. The constitutive expression of the Schutzpro teine can even affect all of the plant's protective proteins.
Die erhöhte Streßtoleranz einer derart manipulierten Pflanze be ruht, ohne jedoch an eine Theorie gebunden zu sein, vermutlich auf einer erhöhten Konzentration an einem bzw. mehreren Schutz proteinen bereits unter Normalbedingungen, so daß bei Auftreten eines Streßfaktors bereits Schutzproteine in größerer Menge vor liegen, um sofort die Schäden zu minimieren, die z. B. durch De naturierung von Proteinen aufgrund der Streßsituation entstehen. Eine solche Pflanze mit erhöhter Streßtoleranz besitzt bereits unter Normalbedingungen, d. h. streßfreien Bedingungen, einen Spiegel an mindestens einem Schutzprotein, der ungefähr 5% des Spiegels an Schutzprotein ausmacht, der bei einer voll unter Streß stehenden Pflanze aufgebaut wird. Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Pflanze bereits unter Normalbedingungen ca. 15-20% oder mehr des Streßproteinspiegels einer Pflanze unter Streßbedingungen, wobei ganz besonders bevorzugt die Mitglieder der HSP20-Familie unter Normalbedingungen bereits 20% des maxi malen Spiegels unter Streßbedingungen erreichen.The increased stress tolerance of such a manipulated plant rests, but is not bound to a theory, probably on an increased concentration of one or more protections proteins already under normal conditions, so that when they occur of a stress factor already protective proteins in large quantities lie to immediately minimize the damage z. B. by De Naturation of proteins arise due to the stress situation. Such a plant with increased stress tolerance already has under normal conditions, d. H. stress-free conditions, a Levels of at least one protective protein that is approximately 5% of the Level of protective protein that is at a full under Stress plant is built. Preferably, the plant according to the invention already under normal conditions approx. 15-20% or more of a plant's stress protein level Stress conditions, with members being particularly preferred of the HSP20 family under normal conditions already 20% of the maxi paint mirror under stress conditions.
Als Aktivator der Schutzproteine kommt vorzugsweise ein soge nannter Hitzeschockfaktor in Betracht. Diese Transkriptionsakti vatoren (Transkriptionsfaktoren) binden i.d.R. an konservierte Elemente innerhalb der HS-Promotoren, die häufig das Konsensus motiv [nGAAnnTTCn]n haben. Ein Beispiel für einen solchen Hitze schockfaktor aus Pflanzen stellt der Arabidopsis-Hitzeschock faktor dar (Vgl. Hübel, A. und Schöffl, F. in Plant Molecular Biology, Band 26, Seite 353-362 (1994). Weitere Hitzeschockfak toren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik wohl bekannt, wie beispielsweise beschrieben in K.D. Scharf, T. Materna, E. Treuter und L. Nover in: L. Nover (ed.) Plant Promotors and Transcription Factors, S. 121-158, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg (1994).A so-called heat shock factor is preferably considered as the activator of the protective proteins. These transcription activators (transcription factors) usually bind to conserved elements within the HS promoters, which often have the consensus motif [nGAAnnTTCn] n . An example of such a heat shock factor from plants is the Arabidopsis heat shock factor (cf. Hübel, A. and Schöffl, F. in Plant Molecular Biology, volume 26, pages 353-362 (1994). Further heat shock factors are known to the person skilled in the art well known from the prior art, as described, for example, in KD Scharf, T. Materna, E. Treuter and L. Nover in: L. Nover (ed.) Plant Promotors and Transcription Factors, pp. 121-158, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg (1994).
Wie oben ausgeführt, liegt der Transkriptionsaktivator in Wild typpflanzen unter Normalbedingungen entweder überhaupt nicht vor, oder aber in einer Form, die die DNA-Bindung, insbesondere die Bindung an HSE, nicht erlaubt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß ein solcher inaktiver Transkriptionsaktivator in einen konstitutiv aktiven Transkrip tionsaktivator durch Manipulation seiner nativen, inaktiven Struktur umgewandelt werden kann, vorzugsweise durch Änderung der Proteinsequenz. Die Techniken zum Ändern einer vorgegebenen Proteinsequenz sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik wohl bekannt, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Die Modifikation des inaktiven Transkriptionsaktivators erfolgt mit dem Ziel, dem Aktivator eine konstitutive DNA-Bindungsfähigkeit zu verleihen. As stated above, the transcriptional activator is in wild Type plants either not at all under normal conditions before, or in a form that the DNA binding, in particular binding to HSE, not allowed. As part of the present Invention could be shown that such an inactive Transcription activator in a constitutively active transcript tion activator by manipulating its native, inactive Structure can be converted, preferably by modification the protein sequence. The techniques for changing a given one Protein sequences are well known to those skilled in the art known, as described for example in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). The inactive transcription activator is modified with the aim of giving the activator a constitutive DNA binding ability to rent.
Eine bevorzugte Modifikation eines HSF zu dessen Aktivierung ist die Fusion mit einem weiteren Protein (Fremdprotein), wobei das Fremdprotein vorzugsweise an den N-Terminus oder C-Terminus des HSF fusioniert wird. Geeignete Fusionspartner für einen HSF sind beispielsweise β-Glucuronidase, sowie weitere, sogenannte Repor terproteine, beispielsweise Luziferase, Struktur- oder Enzympro teine, sowie Proteine, die gleichzeitig zur Selektion von Zel len, Geweben und Pflanzen mit einem modifizierten HSF geeignet sind. Insbesondere eignen sich hierfür Neomycinphosphotransfera se II, Phosphinothricinacetyltransferase und Hygromycinphos photransferase. Weiterhin kann der HSF auch durch das Anhängen beliebiger anderer, auch synthetischer Proteine modifiziert wer den.A preferred modification of an HSF to activate it is the fusion with another protein (foreign protein), the Foreign protein preferably at the N-terminus or C-terminus of the HSF is merged. Suitable fusion partners for an HSF are for example β-glucuronidase, as well as other so-called reports terproteins, for example luciferase, structural or enzyme pro teine, as well as proteins that are used for the selection of Zel oils, tissues and plants with a modified HSF are. Neomycin phosphotransfera are particularly suitable for this se II, phosphinothricin acetyltransferase and hygromycinphos photransferase. Furthermore, the HSF can also be attached any other, including synthetic proteins modified the.
Ob eine durchgeführte Modifikation des inaktiven HSF diesen in einen konstitutiv aktiven HSF umgewandelt hat, kann einfach da durch festgestellt werden, daß der modifizierte HSF dahingehend untersucht wird, ob er die Fähigkeit zur DNA-Bindung unter Nor malbedingungen durch die Modifikation erlangt hat. Diese Fähig keit zur DNA-Bindung läßt sich mit aus dem Stand der Technik be kannten herkömmlichen Verfahren ermitteln, wie beispielsweise mit den dem Fachmann geläufigen Gelretardationsassays, wie be schrieben in D.D. Mosser, N.G. Theodorakis und R.J. Morimoto in: Molecular & Cellular Biology, Band 8, S. 4736-4744 (1988).Whether a modification of the inactive HSF was carried out in has converted a constitutively active HSF, can simply be there by being found that the modified HSF to that effect it is examined whether it has the ability to bind DNA under Nor painting conditions through the modification. This capable speed for DNA binding can be with from the prior art known conventional methods, such as with the gel retardation assays familiar to the person skilled in the art, such as be wrote in D.D. Mosser, N.G. Theodorakis and R.J. Morimoto in: Molecular & Cellular Biology, Vol. 8, pp. 4736-4744 (1988).
Als Pflanze mit erhöhter Streßtoleranz sind bevorzugt Pflanzen aus der Familie der Brassicaceae, der Klasse der Magnoliatae und der Klasse der Lilietae, wobei besonders bevorzugt sind Mitglie der der Gattungen Brassica, Beta, Solanum, Lycopersicum, Helian thus, Glycine, Zea, Hordeum, Triticum, Secale und Oryza.Plants are preferred as a plant with increased stress tolerance from the family of the Brassicaceae, the class of the Magnoliatae and the class of the Lilietae, with members being particularly preferred that of the genera Brassica, Beta, Solanum, Lycopersicum, Helian thus, Glycine, Zea, Hordeum, Triticum, Secale and Oryza.
Die erhöhte Streßtoleranz der erfindungsgemäßen Pflanzen zeigt sich in deren Fähigkeit, bei dem Einwirken von Streßfaktoren ih re Leistungsfähigkeit voll aufrecht zu erhalten, zumindest je doch zeigen sie unter gegebenen Streßbedingungen eine geringere Beeinträchtigung ihrer vollen Leistungsfähigkeit als die Wild typpflanze, aus der die erfindungsgemäße Pflanze hervorgegangen ist.The increased stress tolerance of the plants according to the invention shows themselves in their ability, when exposed to stress factors ih to maintain your full capacity, at least ever however, they show less under given stress conditions Impairment of their full performance as the game Type plant from which the plant according to the invention originated is.
Die Leistungsfähigkeit einer Pflanze zeigt sich beispielsweise in deren Wachstumsgeschwindigkeit, der Stabilität der Merkmals ausprägung, Samen und Fruchtsubstanz, der Widerstandsfähigkeit gegenüber Pathogenen, der Qualität und des Ertrags der Erntepro dukte, der Nährstoffeffizienz, der Effizienz des Wasserhaushalts und der Verträglichkeit gegenüber Pflanzenschutzmitteln.The performance of a plant is shown, for example in their growth rate, the stability of the characteristic expression, seeds and fruit substance, resistance towards pathogens, the quality and the yield of the harvest pro products, the nutrient efficiency, the efficiency of the water balance and compatibility with crop protection products.
Vorzugsweise zeigen die erfindungsgemäßen Pflanzen eine verbes serte Streßtoleranz gegenüber mindestens einem der biotischen Streßfaktoren, wie Pathogenbefall (beispielsweise Viren, Viroi de, Pilze, Bakterien, Insekten, Nematoden), und/oder abiotischen Streßfaktoren, Verwundung, Hitze (insbesondere bei der Blüten ausbildung und während der Frucht- und Samenreife), Kälte (insbesondere während der Keimung), UV-Strahlung, hohe Lichtin tensitäten, hohe Konzentrationen von Schwermetallen, von Salz und von Ozon, Azidität, Trockenheit, sowie O₂-Mangel. Besonders bevorzugt sind Pflanzen, die eine erhöhte Toleranz gegen mehrere der genannten Streßfaktoren aufweisen, ganz besonders bevorzugt sind sie toleranter gegenüber sämtlichen Streßfaktoren.The plants according to the invention preferably show a verbes stress tolerance to at least one of the biotic Stress factors such as pathogen infestation (e.g. viruses, Viroi de, fungi, bacteria, insects, nematodes), and / or abiotic Stress factors, wounding, heat (especially with the flowers training and during fruit and seed ripening), cold (especially during germination), UV radiation, high light intensities, high concentrations of heavy metals, of salt and of ozone, acidity, drought, and O₂ deficiency. Especially plants with an increased tolerance to several are preferred of the stress factors mentioned, very particularly preferred they are more tolerant of all stress factors.
Bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen weisen bereits unter streß freien Bedingungen, d. h. unter Bedingungen, unter denen die Pflanzen nicht einem der o.g. Streßfaktoren ausgesetzt sind (Normalbedingungen), einen erhöhten Spiegel mindestens eines Schutzproteins, vorzugsweise jedoch mehrerer Schutzproteine auf. Das Vorliegen eines erhöhten Spiegels an Schutzprotein läßt sich einfach dadurch feststellen, das der Gehalt an Schutzproteinen bei einer erfindungsgemäßen Pflanze ermittelt wird und dieser Gehalt verglichen wird mit dem Schutzproteingehalt der Wild typpflanze. Die Schutzproteine lassen sich mit aus dem Stand der Technik bekannten herkömmlichen Verfahren aus den Pflanzen iso lieren und quantifizieren. Preferred plants according to the invention are already under stress free conditions, d. H. under conditions in which the Do not plant any of the above Stress factors are exposed (Normal conditions), an elevated level of at least one Protective protein, but preferably several protective proteins. The presence of an elevated level of protective protein can be simply determine that the level of protective proteins is determined in a plant according to the invention and this The content is compared with the protective protein content of the game type plant. The protective proteins can be from the state of the Technology known conventional methods from the plants iso and quantify.
Als Vehikel zum Einbringen eines konstitutiven aktiven Trans kriptionsaktivators in die Pflanze wird eine Nukleinsäure ver wendet, die für den gewünschten Transkriptionsaktivator kodiert.As a vehicle for introducing a constitutive active trans Krtionstionsaktivators in the plant is a nucleic acid ver applies, which codes for the desired transcription activator.
Die Nukleinsäure stellt eine DNA dar, beispielsweise in Form ei nes Plasmids, die nach bekannten Verfahren in Pflanzen einge bracht werden kann. Beispielsweise kommt als hierfür geeignetes Plasmid das Ti-Plasmid aus dem Agrobacterium tumefaciens in Be tracht, oder es wird eine der bekannten Techniken zum direkten DNA-Transfer verwendet.The nucleic acid represents a DNA, for example in the form of egg nes plasmid, which is used in plants by known methods can be brought. For example, comes as a suitable one Plasmid the Ti plasmid from the Agrobacterium tumefaciens in Be or it becomes one of the known techniques for direct DNA transfer used.
Die in die Pflanze eingebrachte Nukleinsäure kodiert vorzugswei se für einen konstitutiv aktiven HSF, wobei als aktive Form be sonders bevorzugt ist ein Fusionsprotein aus einem HSF und einem weiteren Protein bzw. Proteinfragment.The nucleic acid introduced into the plant preferably codes se for a constitutively active HSF, with be as the active form a fusion protein of an HSF and an is particularly preferred another protein or protein fragment.
Vorzugsweise enthält die eingebrachte Nukleinsäure selbst die für die Expression des gewünschten Transkriptionsaktivators er forderlichen regulatorischen Elemente, wobei die für die Expres sion in Pflanzen erforderlichen Elemente in dem Stand der Tech nik bekannt und beschrieben sind. Alternativ kann die einge brachte Nukleinsäure auch unter die Kontrolle von bereits in der Pflanzenzelle vorhandenen regulatorischen Elementen gebracht werden. F. Schöffl, M. Rieping und G. Baumann in: Developmental Genetics, Band 8, S. 365-374 (1987) beschreibt die konstitutive Expression von einem HS-Gen unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors in Tabak.The introduced nucleic acid itself preferably contains the for the expression of the desired transcription activator required regulatory elements, whereby those for the express sion required in plants in the prior art nik are known and described. Alternatively, the on also brought nucleic acid under the control of already in the Plant cell brought existing regulatory elements will. F. Schöffl, M. Rieping and G. Baumann in: Developmental Genetics, Volume 8, pp. 365-374 (1987) describes the constitutive Expression of an HS gene under the control of the CaMV-35S promoter in tobacco.
Die Verfahren zum Einbringen einer Nukleinsäure in eine Pflan zenzelle sind dem Fachmann wohl bekannt. Auch die Regeneration einer vollständigen Pflanze aus einer Pflanzenzelle, transfor miert mit einer Nukleinsäure, ist dem Fachmann geläufig und kann mit herkömmlichen Verfahren aus dem Stand der Technik erfolgen.The procedures for introducing a nucleic acid into a plant cells are well known to those skilled in the art. Regeneration too a whole plant from a plant cell, transfor mated with a nucleic acid, is familiar to the person skilled in the art and can with conventional methods from the prior art.
Die erfindungsgemäßen Pflanzen werden hergestellt durch Einbrin gen einer Nukleinsäure, die für einen konstitutiv aktiven Trans kriptionsaktivator kodiert, in eine Pflanzenzelle, und Regene rieren der transgenen Pflanze aus der mit der Nukleinsäure transformierten Pflanzenzelle.The plants according to the invention are produced by incorporation gene of a nucleic acid that is necessary for a constitutively active trans encoding activator, into a plant cell, and rain the transgenic plant with the nucleic acid transformed plant cell.
Sämtliche Maßnahmen zum Herstellen einer transgenen Pflanze sind aus dem Stand der Technik bekannt. Üblicherweise wird nach dem Einbringen einer Nukleinsäure in Pflanzenzellen nach denjenigen Pflanzenzellen selektiert, die die Nukleinsäure aufgenommen ha ben und diese stabil exprimieren. Aus diesen Transformanten wird dann mit herkömmlichen Verfahren eine vollständige Pflanze rege neriert. Besonders vorteilhaft ist es, wenn der zur Selektion der geeignet transformierten Pflanzen erforderliche Selektions marker durch das Fremdprotein bereitgestellt wird, das als Fu sionpartner des HSF dient.All measures to produce a transgenic plant are known from the prior art. Usually after the Introducing a nucleic acid into plant cells after those Selected plant cells that have taken up the nucleic acid ben and express it stably. These transformants become then stimulate a whole plant using conventional methods nerated. It is particularly advantageous if the for selection selection of the appropriately transformed plants marker is provided by the foreign protein, which is called Fu sion partner of the HSF.
Die erfindungsgemäßen Pflanzen sind von großem Nutzen auf dem Gebiet der Landwirtschaft, insbesondere wo unter schwierigen Wachstumsbedingungen, d. h. unter dem Einfluß von Streßfaktoren Pflanzen angebaut werden müssen.The plants of the invention are of great use on the Field of agriculture, especially where under difficult Growing conditions, d. H. under the influence of stress factors Plants need to be grown.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Dabei wurden die meisten Versuche mit Arabidopsis thaliana durchgeführt, die bekanntermaßen ein beliebtes Modellsystem für Kulturpflanzen darstellt. Dieses Modell verkörpert alle wichtigen genetischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Eigenschaften hö herer Pflanzen. Insbesondere stellt diese Pflanze ein Modellsy stem für die Regulation der HS-Antwort bei Kulturpflanzen dar.The following examples illustrate the invention. In doing so most experiments with Arabidopsis thaliana performed the known to be a popular model system for crops represents. This model embodies all the important genetic, physiological, biochemical and molecular properties herer plants. In particular, this plant represents a model sy stem for the regulation of the HS response in crop plants.
Der Hitzeschockfaktor wird konstitutiv exprimiert, aber seine Aktivierung zur DNA-Bindung ist strikt an die Induktion durch Wärme gebunden (bei 37°C), und die Aktivierung erfordert den Übergang von Monomeren zu Trimeren. ATHSF1 ist ausführlich be schrieben in Hübel, A. und Schöffl, F. in Plant Molecular Biolo gy, Band 26, Seite 353-362 (1994).The heat shock factor is expressed constitutively, but its Activation for DNA binding is strictly due to induction Heat bound (at 37 ° C), and activation requires that Transition from monomers to trimers. ATHSF1 is detailed wrote in Hübel, A. and Schöffl, F. in Plant Molecular Biolo gy, vol. 26, pages 353-362 (1994).
Es wurden zwei Arten an Genfusionsprodukten, HSF-GUS (HG) und GUS-HSF (GH), hergestellt, wie in Fig. 2A gezeigt. Die Fusionen wurden konstitutiv exprimiert mit Hilfe des CaMV 35S-Promotors in transgenen Arabidopsis-Pflanzen. Es spielt für die Aktivität des Fusionsprodukts keine Rolle, ob ATHSF1 mit dem Fremdprotein am N- oder am C-Terminus fusioniert wurde. Das zur Transforma tion verwendete Konstrukt wurde hergestellt, indem ATHSF1-cDNA subkloniert wurde in dem Pflanzenvektor BIN19, der das Glucoro nidase (GUS)-Reportergen unter der Kontrolle des konstitutiven CAMV35S-Promotors, sowie die Terminationssequenz der Nopalin synthase (NOS-ter) enthält. Konstruktionstechnisch bedingt fehl te dem ATHSF1-Anteil in der HSF-GUS-Fusion 15 Aminosäuren an dem C-Terminus und in der GUS-HSF-Fusion 5 Aminosäuren an dem N-Terminus. In der GUS-HSF-Fusion ist der GUS-Anteil um 5 Ami nosäuren am C-Terminus verkürzt.Two types of gene fusion products, HSF-GUS (HG) and GUS-HSF (GH), were made as shown in Fig. 2A. The fusions were constitutively expressed using the CaMV 35S promoter in transgenic Arabidopsis plants. It does not matter for the activity of the fusion product whether ATHSF1 was fused with the foreign protein at the N- or at the C-terminus. The construct used for transformation was prepared by subcloning ATHSF1 cDNA in the plant vector BIN19, which contains the glucoronidase (GUS) reporter gene under the control of the constitutive CAMV35S promoter, and the termination sequence of the nopaline synthase (NOS-ter) . The ATHSF1 portion was missing 15 amino acids at the C-terminus in the HSF-GUS fusion and 5 amino acids at the N-terminus in the GUS-HSF fusion. In the GUS-HSF fusion, the GUS content is reduced by 5 amino acids at the C-terminus.
Die GUS-Aktititäten wurden für jedes Konstrukt ermittelt in Pro teinextrakten aus 30 verschiedenen Transformanden (F0) und der F1-Folgegeneration. Die GUS-Aktivität wurde gemessen in pMol NAD/mg Protein/Minute.The GUS activities were determined for each construct in Pro extracts from 30 different transformants (F0) and the F1 successor generation. GUS activity was measured in pmoles NAD / mg protein / minute.
Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia) wurde mit Agrobacterium tumefaciens, enthaltend die von BIN19 stammenden Vektorplasmide, mit Hilfe des von Valvekens, M. van Montagu und M. van Lÿsebet tens in: Proceedings of the National Academy of Science, USA, Band 85, S. 5536-5540 (1988) beschriebenen Verfahrens transfor miert. F1-Samen wurden erzeugt aus geselbsteten Transformanden, und die GUS-Aktivitäten wurden in den Proteinextrakten aus Blattgewebe bestimmt unter Verwendung des Fluoreszenzverfahrens, wie beschrieben von R.A. Jefferson, T.A. Kavnagh und M.W. Bevan in: The EMBO Journal, Band 6, S. 3901-3907 (1987). Die gefunde nen GUS-Aktivitäten sind in Fig. 1B gezeigt.Arabidopsis thaliana (Columbia ecotype) was treated with Agrobacterium tumefaciens, containing the vector plasmids derived from BIN19, with the aid of Valvekens, M. van Montagu and M. van Lÿsebet tens in: Proceedings of the National Academy of Science, USA, volume 85, p 5536-5540 (1988). F1 seeds were generated from self-transformants and GUS activities were determined in the leaf tissue protein extracts using the fluorescence method as described by RA Jefferson, TA Kavnagh and MW Bevan in: The EMBO Journal, Vol. 6, p. 3901- 3907 (1987). The GUS activities found are shown in Fig. 1B.
Ferner wurden die mRNA-Spiegel von HSF und der HSF-Fusionen im Wildtyp wie auch im transgenen Arabidopsis ermittelt. Hierzu wurde die Gesamt-RNA isoliert aus dem Blattgewebe von einzelnen Transformanden und von Wildtyppflanzen folgend auf oder ohne Wärmestreß (HS) bei 37°C für 3 Stunden. Die RNAs wurden analy siert durch Nothern-Blot-Hybridisierung mit Hilfe von 30 µg Ge samt-RNA/Spur und einer ³²P-markierten ATHSF1-cDNA-Probe, wie be schrieben von Severin und Schöffl in K. Severin und F. Schöffl in: Plant Molecular Biology, Band 15, S. 827-833 (1990). Die mRNA-Spiegel der chimären Gene waren signifikant erhöht im Ver gleich zu den Spiegeln des authentischen ATHSF1-Transkripts, wie aus Fig. 1C ersichtlich. Diese Daten zeigen, daß die chimären HSFs stabil in den transgenen Pflanzen zusätzlich zu dem endoge nen Wildtyp-ATHSF1 exprimiert werden.Furthermore, the mRNA levels of HSF and the HSF fusions were determined in the wild type as well as in the transgenic Arabidopsis. For this purpose, the total RNA was isolated from the leaf tissue of individual transformants and from wild type plants following or without heat stress (HS) at 37 ° C. for 3 hours. The RNAs were analyzed by Northern blot hybridization using 30 µg total RNA / lane and a 32 P-labeled ATHSF1 cDNA sample as described by Severin and Schöffl in K. Severin and F. Schöffl in: Plant Molecular Biology, Vol. 15, pp. 827-833 (1990). The mRNA levels of the chimeric genes were significantly increased compared to the levels of the authentic ATHSF1 transcript, as can be seen from FIG. 1C. These data show that the chimeric HSFs are stably expressed in the transgenic plants in addition to the endogenous wild-type ATHSF1.
Für die kleinen HSP bei Arabidopsis sind bisher 5 Gene bekannt, 3 für Klasse I (zu der auch das unten getestete HSP18 gehört), 2 für Klasse II (Vgl. Vierling, E. s. o.). mRNAs innerhalb einer Familie sind so stark konserviert, daß sie bei Hybridisierungen kreuzreagieren.So far 5 genes are known for the small HSP in Arabidopsis, 3 for class I (which also includes the HSP18 tested below), 2 for class II (see Vierling, E. see above). mRNAs within one Family are so well preserved that they hybridize cross-react.
Die konstitutive Expression von HSP18 in transgenen Arabidopsis, die HSF-Fusionsproteine überexprimieren, ist in Fig. 3 gezeigt.The constitutive expression of HSP18 in transgenic Arabidopsis that overexpress HSF fusion proteins is shown in FIG. 3.
Zur Western-Blot-Analyse wurden die Proteine isoliert ohne oder folgend auf einen HS (vgl. auch Fig. 1) durch rasches Homogeni sieren von Blattgewebe in Puffern, enthaltend 8 M Harnstoff. Analysenproben (30 µg/Spur) wurden einer SDS-PAGE unterzogen und mit Hilfe des Elektroblotverfahrens auf Nitrozellulose übertra gen. HSP18 wurde nachgewiesen durch einen Antikörper, der gegen ein rekombinantes Arabidopsis HSP17.6 gerichtet war. Die Gense quenz für HSP17.6 ist beschrieben in K.W. Helm und E. Vierling in: Nucleic Acids Research, Band 17, S. 7995 (1989). Die Banden wurden sichtbar gemacht durch Inkubation mit Mäuse-Anti-Huhn- IgG, an das alkalische Phosphatase gekoppelt war, und Anfärben mit dem Nitrotetrazoliumblau/5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat system, wie beschrieben in E. Engvall und P.J. Perlmann in: Journal of Immunology, Band 109, S. 129 (1972). For Western blot analysis, the proteins were isolated without or following an HS (cf. also FIG. 1) by rapidly homogenizing leaf tissue in buffers containing 8 M urea. Analysis samples (30 µg / lane) were subjected to SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose using the electroblot method. HSP18 was detected by an antibody which was directed against a recombinant Arabidopsis HSP17.6. The gene sequence for HSP17.6 is described in KW Helm and E. Vierling in: Nucleic Acids Research, Volume 17, p. 7995 (1989). The bands were visualized by incubation with mouse anti-chicken IgG to which alkaline phosphatase was coupled and staining with the nitrotetrazolium blue / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate system as described in E. Engvall and PJ Perlmann in: Journal of Immunology, Volume 109, p. 129 (1972).
Die Nothern-Blot-Hybridisierungen wurden durchgeführt wie be schrieben in K. Severin und F. Schöffl in: Plant Molecular Bio logy, Band 15, S. 827-833 (1990).The Northern blot hybridizations were carried out as described above wrote in K. Severin and F. Schöffl in: Plant Molecular Bio logy, vol. 15, pp. 827-833 (1990).
Das Ergebnis der HSP-Expressionsstudien zeigt, daß im Wildtyp (WT) bei Raumtemperatur (RT) keine HSP18mRNA nachweisbar ist. Mittels Antiseren, die gegen rekombinantes HSP18 aus Arabidopsis gerichtet sind, können in den transgenen Pflanzen konstitutiv exprimierte kleine HSPs nachgewiesen werden. Die Antiseren, ob wohl sie gegen ein individuelles HSP gerichtet sind, erkennen wegen der starken Konservierung der HSP-Struktur alle Mitglieder einer HSP-Familie. Im Western-Blot ist ein deutlicher Unter schied zwischen WT (keine Expression) und transgenen Pflanzen bei RT zu erkennen. Der in den transgenen Pflanzen bei Raumtem peratur aufgefundene Spiegel an konstitutiv exprimierten HSP be trägt ca. 15-20% der durch HS induzierten Menge an HSPs (ermittelt mit Hilfe der Immundiffusion). Dies entspricht etwa 1-2 ng HSP18/µg Gesamtprotein. Nach einem Hitzeschock steigt in den transgenen Pflanzen die Menge der kleinen HSP auf den Wert, der auch beim hitzeinduzierten Wildtyp erreicht wird (Vgl. Fig. 3).The result of the HSP expression studies shows that no HSP18mRNA is detectable in the wild type (WT) at room temperature (RT). Antisera directed against recombinant HSP18 from Arabidopsis can be used to detect constitutively expressed small HSPs in the transgenic plants. The antisera, whether they are directed against an individual HSP, recognize all members of an HSP family because of the strong conservation of the HSP structure. In the Western blot, there is a clear difference between WT (no expression) and transgenic plants at RT. The level of constitutively expressed HSP found in the transgenic plants at room temperature is approximately 15-20% of the amount of HSPs induced by HS (determined using immunodiffusion). This corresponds to approximately 1-2 ng HSP18 / µg total protein. After a heat shock, the amount of small HSP in the transgenic plants increases to the value which is also achieved in the heat-induced wild type (cf. FIG. 3).
Die mRNA-Spiegel für HSP70, das konservierteste aller Schutzpro teine, sind in HSF-GUS (GUS-HSF) transgenen Pflanzen ebenfalls stark konstitutiv erhöht im Vergleich zum nicht induzierten Wildtyp. Dies zeigt, daß die konstitutive Streßreaktion nicht nur auf die kleinen HSP beschränkt ist, sondern auch HSP70 und weitere HSP umfaßt. Dies heißt mit anderen Worten, daß der kon stitutiv aktive HSF eine Palette von HSPs induziert.The mRNA levels for HSP70, the most conserved of all protection pro teine, are also in HSF-GUS (GUS-HSF) transgenic plants strongly constitutive increased compared to the non-induced Wild type. This shows that the constitutive stress response is not is limited to the small HSP, but also HSP70 and includes other HSPs. In other words, this means that the con tripitatively active HSF induced a range of HSPs.
Die Derepression der HSF-Aktivität der in Arabidopsis exprimier ten Fusionsproteine (HSF-GUS und GUS-HSF) konnte durch dreierlei Experimente bewiesen werden:Depression of HSF activity expressed in Arabidopsis fusion proteins (HSF-GUS and GUS-HSF) were able to do three things Experiments are proven:
- 1. Es erfolgt eine konstitutive Trimerisierung der HSF-Fusionsproteine.1. The HSF fusion proteins are constituted by trimerization.
- 2. Die HSF-Fusionsproteine binden konstitutiv an HSE-Sequenzen.2. The HSF fusion proteins bind constitutively to HSE sequences.
- 3. Die Hitzeschockproteine werden konstitutiv exprimiert.3. The heat shock proteins are expressed constitutively.
Es wurde gezeigt, daß bei Normaltemperatur (20-25°C), d. h. unter streßfreien Bedingungen, die HSF-Fusionsproteine aktiv sind, der natürlich vorkommende HSF jedoch inaktiv ist. Erst nach einem HS kann auch die Aktivität des natürlich vorkommenden ATHSF1 beob achtet werden.It has been shown that at normal temperature (20-25 ° C), i.e. H. under stress-free conditions that HSF fusion proteins are active, the naturally occurring HSF is however inactive. Only after an HS can also observe the activity of the naturally occurring ATHSF1 be respected.
Die oben beschriebenen HSF-GUS- bzw. GUS-HSF-Genkonstrukte er lauben die heterologe Expression in anderen Pflanzen als Arabi dopsis. Dabei führen die Fusionsprodukte aus Arabidopsis zur konstitutiven Expression von HSPs in heterologen Pflanzen.He described the HSF-GUS or GUS-HSF gene constructs described above leave the heterologous expression in plants other than Arabi dopsis. The fusion products from Arabidopsis lead to constitutive expression of HSPs in heterologous plants.
Weiterhin lassen sich in anderen Pflanzen als Arabidopsis die entsprechenden HSFs in analoger Weise zu der oben ausgiebig aus geführten Aktivierung in Arabidopsis ebenfalls aktivieren, so daß es zu einer konstitutiven Expression der HSPs durch die ho mologen konstitutiv aktiven HSFs kommt. Furthermore, the plants can be found in plants other than Arabidopsis corresponding HSFs in a manner analogous to that detailed above activate activation in Arabidopsis, too that there is a constitutive expression of the HSPs by the ho mologically constitutive active HSFs comes.
Claims (21)
- a) Einbringen einer Nukleinsäure, die für einen konstitutiv aktiven Transkriptionsaktivator kodiert, in eine Pflanzen zelle, und
- b) Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der in Schritt a) erzeugten Pflanzenzelle.
- a) introducing a nucleic acid, which codes for a constitutively active transcription activator, into a plant cell, and
- b) Regeneration of a transgenic plant from the plant cell produced in step a).
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