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DE1793789C3 - Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest enthaltenden Peptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest enthaltenden Peptiden

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Publication number
DE1793789C3
DE1793789C3 DE1793789A DE1793789A DE1793789C3 DE 1793789 C3 DE1793789 C3 DE 1793789C3 DE 1793789 A DE1793789 A DE 1793789A DE 1793789 A DE1793789 A DE 1793789A DE 1793789 C3 DE1793789 C3 DE 1793789C3
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DE
Germany
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cysteine
acetamidomethylcysteine
group
acid
reaction
Prior art date
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Expired
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DE1793789A
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English (en)
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DE1793789A1 (de
DE1793789B2 (de
Inventor
Ralph Franz Plains Hirschmann
John David Rahway Milkowski
Daniel Frank Plainfield Veber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck and Co Inc
Original Assignee
Merck and Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck and Co Inc filed Critical Merck and Co Inc
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Publication of DE1793789B2 publication Critical patent/DE1793789B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE1793789C3 publication Critical patent/DE1793789C3/de
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Description

ii
R-C-NH-CH2-
schützt, in welcher R Niedrigalkyl, Aryl, Benzyloxy oder Acetonyl bedeutet, indem man den Cysteinrest mit
ai) einem N-Hydroxymethyl-niedrigalkylamid, a2) einem N-Hydroxymethyl-arylamid,
a3) N-Hydroxymethyl-benzyloxycarboxamid
oder
a4) 2-Hydroxymethyl-5-methyl-isoxazoliumchlorid
in einem Lösungsmittel unter Zugabe einer Säure, bei Verfahren a4) anschließend noch mit wäßrigem Alkali, umsetzt,
b) das jeweilige schutzgruppenhaltige Peptid in üblicher Weise herstellt und
c) anschließend die Mercaptogruppe freisetzt, indem man die Schutzgruppe unter kontrollierten pH-Bedingungen in wäßrigem Medium in der letzten Stufe de Synthese mit
Ci) einem wasserlöslichen Schwermetallsalz,
C2) einem Organometallsalz von Schwermetallen oder,
Cj) wenn R Acetonyl bedeutet, mit Hydrazin oder Phenylhydrazin abspaltet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mercaptogruppe des Cysteinrestes mit de.· S-Acetamidomethylgruppe schützt und diese mit Quecksilber(ll)-acetat abspaltet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses in Wasser als Lösungsmittel durchführt und die Schutzgruppe bei saurem pH abspaltet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die jeweilige Mercapto-Schutzgruppe mit p-Chlorquecksilber(ll)-benzoesäure bei alkalischem pH abspaltet.
Peptide, die Cystein enthalten, werden im allgemeinen synthetisiert untjr Schutz ' der funktioneilen Mercaptogruppe durch eine geeignete Gruppe. Es sind verschiedene Schutzgruppen bekannt, die für die Synthese von Cysteinreste enthaltenden Peptide brauchbar sind, aber viele der bekannten Schutzgruppen werden während des Endstadiums der Synthese unter Schwierigkeiten entfernt oder sie sind gegen einige der im allgemeinen bei Peptidsynthesen verwendeten Reagenzien instabil.
Zu den Peptiden und Proteinen, die Schwefel enthalten, gehören Verbindungen, die Cystein mit der freien Mercaptogruppe enthalten, beispielsweise Glutathion, und Verbindungen mit einer Disulfidbrücke, die »us der Dehydrierung von zwei Cysteinresten unter Bildung von Cystein stammt. Der Cystcinrcsl kann zu derselben Peptidkette gehören, wie beispielsweise in Oxytocin, Vasopressin und Ribonuclease, oder sie können verschiedenen Peptidketten angehören, wie beispielsweise im Insulin.
Peptide, welche Cystein mit ungeschützten Mercaptogruppen enthalten, sind bisher kaum synthesiert worden wegen der Schwierigkeit beim Trennen der erhaltenen Verbindungen von den durch die Oxidation gebildeten Nebenprodukten. Während der Synthese des Peptids
ίο mit der ungeschützten Mercaptogruppe findet sehr leicht eine Dehydrierung unter Bildung de- Cystinderivate statt und dies hat oftmals weitere Komplikationen zur Folge. Cystein wird darum fast ausschließlich in Form seiner S-geschützten Form bei der Synthese von Cysteinreste enthaltenden Peptiden eingesetzt und es ist darum wünschenswert, eine geeignete Schutzgruppe zu haben, die leicht während der Synthese entfernt werden kann, die aber auch gegenüber den bei Peptidsynthesen angewendeten Reagenzien und Umsetzungsbedingungen stabil ist
Durch die Erfindung wird die Synthese von Peptiden mit einem oder mehr Cysteinresten, wie bei Glutathion, Insulin, Oxytocin oder Ribonuclease, erleichtert.
Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen
>■> gekennzeichnete Verfahren.
Von vielen Peptiden ist es bekannt, daß sie biologisch aktiv sind, einige sind nützlich für das Studium und für die Analyse von Proteinen, insbesondere für Studien, die angestellt werden, um einen Einblick in die physiologi-
jo sehe Wirkung von Enzymen, Hormonen und anderen Proteinen mit wichtigen Funktionen im Körper zu erhalten. Insulin hat beispielsweise die Schlüsselposition bei der Hormonregulierung des Zuckergleichgewichts inne und ein Mangel an Insulin verursacht das
r, metabolische Krankheitsbild diabetes mellitus. Oxytocin, ein cyclisches Nonapeptid mit einem 20gliedrigen Disulfidring stimuliert den Milchausstoß aus der Milchdrüse und wird häufig therapeutisch angewendet, um Wehen einzuleiten. Vasopressin wurde schon als
4i) Ersatzheilmittel bei diabetes insipidus zur Behandlung von Anenteroneurie angewendet.
Die am häufigsten angewendete Schutzgruppe für die Mercaptogruppe ist die S-Benzylgruppe. Die S-Benzylschutzgruppe vermindert im allgemeinen die Löslichkeit
4-, des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln. Diese Gruppe kann jedoch nur abgespalten werden, indem man Natrium in flüssigem Ammoniak verwendet. Dieses System führt jedoch zur Zersetzung vieler Peptide. Fluorwasserstoff wurde bereits zur Entfernung
mi der S-Benzylschutzgruppe verwendet, aber er ist für die Herstellung im größeren Maßstab unpraktisch, verursacht oftmals einen Abbau der Peptide und ist auch nicht ausreichend selektiv, weil er auch die Carbobenzoxy-, t-Butoxy- und t-Butoxycarbonylgruppen entfernt. Andere re Gruppen, wie die S-p-Nitrobenzyl-, S-p-Diphenylmethyl-, S-Benzylthio-inethyl und die Triphenylmethylgruppen sind bei Synthesen von Cysteinpeptiden ■ angewendet worden, aber auch sie befriedigten noch nicht vollständig. Beispielsweise erniedrigt die p-Nitro-
w) phenylgruppe die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln und kann nur durch katalytische Hydrierung in Gegenwart eines Palladiumauf-Kohle-Katalysators und von Chlorwasserstoffsäure entfernt werden. Dieses System arbeitet in Gegenwart
hi von Schwefel nicht gut, weil der Katalysator während der Umsetzung oftmals vergiftet wird und wegen der mangelnden Selektivität, falls eine Carbobenoxygruppe irgendwo in dem Molekül ist, weil diese Gruppe auch
durch dieses System entfernt wird. Beim S-Benzylthiomethylcysiein kann die Schutzgruppe durch Quecksilber(Il)-chlorid in warmer Chlorwasserstoffsäure oder durch Quecksilber(II)-acetat in 80%iger Ameisensäure entfernt werden. Sehr saure Bedingungen sind unerwünscht, weil dadurch Gruppen, welche Tryptophan enthalten, zerstört werden und unerwünschte Nebenprodukte sich bilden. Die Anwesenheit dieser Gruppe vermindert auch die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln. Die S-p-Di- ι ο phenylmethylgruppe kann durch Natrium in flüssigem Ammoniak oder durch Trifluoressigsäure entfernt werden. Das letztere Reagens ist aber ungeeignet, weil es nicht selektiv ist und weil es auch die lert-Butylester- und die terL-Butoxycarbonylgruppen entfernt. Die Anwesenheit einer starken Säure ist ein weiteres unerwünschtes Merkmal. Die Triphenylmethylgruppe kann mit einer schwachen Säure oder mit Quecksilbersalzen entfernt werden, aber diese Schutzgruppe wird zu leicht durch schwache Säuren unter üblichen Bedingungen entfernt und ist darum eino ungenügende Schutzgruppe für Peptidsynthesen. Darüber hinaus wird durch die Gegenwart dieser Gruppe die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln vermindert. 2>
Die erfindungsemäßen S-Schutzgruppen können wie folgt unter Verwendung des Cysteinmoleküls als Beispiel eines Cysteinrestes veranschaulicht werden:
O H COOH
Il I I
R C-N-CH,- S CH1-CH (I)
NH,
worin bedeuten: R Niedrigalkyl, wie Methyl, Äthyl, Propyl oder Butyl, Aryl, wie Phenyl oder Naphthyl oder einen Acetonyl- oder Benzyloxyrest. w
Bedeutet R in Formel 1 Niedrigalkyl oder Aryl, so kann die Schutzgruppe in einem Zweistufenverfahren eingeführt werden. In der ersten Stufe wird ein H-Hydroxymethylalkylamid oder N-Hydroxymethylarylamid hergestellt, beispielsweise N-Hydroxymethyl- 4; acetamid oder N-Hydroxymethylbenzamid durch Umsetzung einer etwa äquimolekularen Menge eines Amids, vie Acetamid oder Benzamid, und Formaldehyd in Gegenwart einer katalytischen Menge von Kaliumcarbonat. Am einfachsten kann man eine 36- bis 38%ige w wäßrige Formaldehydlösung verwenden. Die Mischung wird mehrere Minuten auf einem Dampfbad erhitzt und anschließend läßt man sie im allgemeinen mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man fügt dann Trockeneis zur Einführung von Kohlendioxid in die ■>■> Lösung, worauf anschließend die Lösung im Vakuum auf einem Dampfbad bei etwa 40 bis 500C verdampft wird. Der Rückstand wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, beispielsweise in Ace'on oder Methylenchlorid, die Lösung wird über einem geeigneten Trocknungsmit- wi tel getrocknet und das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird durch Kristallisation oder durch andere bekannte Methoden gereinigt.
In der zweiten Stufe wird Cysteinhydrochlorid-monohydrat und ein geringer Überschuß des N-Hydroxyme- b> thyl-alkylamids oder N-Hydroxymethyl-arylamids in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol oder Äthanol, gelöst. Wie das folgende Reaktionsschema veranschaulicht, verläuft die Reaktion wahrscheinlich über ein Zwischenprodukt:
Il
R-C-N=CH,
O H
Il Γ
R-C-N=CH,
-Η"1
Cystein
O H COOH
Il I I
R — C—N—CH2-S-CH2-CH
NH2
worin R Niedrigalkyl, Aryl oder Benzyloxy bedeutet. Die Lösung der Reaktionsteilnehmer wird in einem Eisbad gekühlt und unter Rühren gibt man eine Säure, wie konzentrierte Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, zu. Die Reaktionsmischung wird dann vorzugsweise unter einer inerten Atmosphäre, wie Stickstoff, verschlossen und beim Raumtemperäiur mehrere Stunden bis 1 oder 2 Tagen stehengelassen. Die Verwendung von Stickstoff ist nicht kritisch, aber seine Verwendung führt im allgemeinen zu besseren Ausbeuten an dem gewünschten Produkt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum bei etwa 40 bis 500C eingedampft. Ein Lösungsmittel, wie Benzol oder Äthanol, wird zugegeben und anschließend entfernt, um Spuren von Wasser zu entfernen, und der feste Rückstand wird aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol oder Äthanol, oder Mischungen aus Alkohol und wasserfreiem Äther, umkristallisiert. Das Produkt wird als Säuresalz erhalten, und die Abwesenheit von freiem Cystein in dem 5-Alkylamidomethylcysteinsalz wird durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die freie Aminosäure kann erhalten werden, indem man das Säuresalz mit wäßrigem Alkali behandelt, bis die Lösung genau am isoelektrischcn Punkt ist, oder indem man Silberoxid zufügt, um das Chlorid als Silberchlorid zu entfernen.
Bedeutet R in der Formel I Benzyloxy, so kann die Schutzgruppe in gleicher Weise wie vorher beschrieben wurde, eingeführt werden. N-Hydroxymethyl-benzyloxycarboxamid wird hergestellt, indem man Benzyloxycarboxamid mit Formaldehyd umsetzt, und die Schutzgruppe wird angefügt, indem man ungefähr äquimolekulare Mengen von Cysteinhydrochlorid-inonohydrat mit N-Hydroxymethylbenzyloxy-carboxamid umsetzt unter Bildung des Säuresalzes von S-[Benzyloxycarboxamklomethyl]-cystein. Die Abwesenheit von freiem Cystein im Produkt wird durch Dünnschichtchromatographie bestimmt.
Bedeutet R in Formel I Acetonyl, so wird die N-Hydroxymethyl-Verbindung gebildet und durch Umsetzung von ungefähr äquimolekularen Mengen S-Methyl-isoxazol und Formaldehyd in Gegenwart einer äquivalenten Menge Chlorwasserstoffsatirc. Das vorstehend beschriebene Verfahren wird im wesentlichen wiederholt, wobei sich 2-Hydroxymeihyl-5-melhyl-isov 'tliumchlorid bildet. Diese Verbindung wird mit Cjsteinhydrochlorid-monohydrat umgesetzt in Gegenwart einer Säure, wie Chlorwassersioffsaure oder
Bromwasserstoffsäure, wobei sich ein Kondensationsprodukt bildet, das isoliert, aber nicht gereinigt wird. Das Kondensationsprodukt wird mit wäßrigem Alkali behandelt, wodurch der Oxazolring sich öffnet und man S-[Acetoacetamidomethyl]-cystein erhält
Die S-Alkylamidomethylcystein-Verbindungen können hergestellt werden, indem man Derivate des N-Hydroxymethylalkylamids, wie die Ester oder HaIogenmethyl-alkylamide, verwendet. Die Ester können einfach aus den N-Hydroxymethylalkyi- oder Arylamiden durch Umsetzung mit einem Acylierungsmittel, wie Acetylchlorid, Essigsäureanhydrid, Trifluoressigsäureanhydrid, Methansulfonylchlorid oder p-ToIuoIsulfonylchlorid hergestellt werden.
Die Halogenderivate können aus einem geeigneten Amid, wie Acetamid oder Benzamid, durch Umsetzung mit Formaldehyd und trockenem Chlorwasserstoffoder Bromwasserstoffgas in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Eisessig, hergestellt werden. Die Halogenmethyl-Derivate können hergestellt werden, aus dem entsprechenden N-Hydroxymethylamid durch Umsetzung mit Phosphorpentachlorid oder Phosphortribromid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, oder einer Mischung von Äther und Dioxan.
Diese Derivate können mit Cystein in einem weiten pH-Bereich umgesetzt werden unter sauren oder basischen Bedingungen, wobei sich das entsprechende S-Alkyl- oder S-Arylamidomethylcystein bildet. Man kann beispielsweise S-Acetamidomethylcystein aus O-Methansulfonyl-N-hydroxymethylacetamid durch Umsetzung mit Cystein in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser oder Äthanol, oder einer Mischung von Lösungsmitteln, herstellen. Die Umsetzung wird bei pH 5 unter Verwendung etwa äquimolekularer Mengen der Reaktanten durchgeführt. Der pH wird durch Zugabe von Alkali, wie Natriumhydroxid kontrolliert. Nach der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird das Produkt durch Umkristallisation aus Methanol/ Äther oder durch andere bekannte Methoden gereinigt. Die S-Alkylamino-Schutzgruppe kann vollständig von dem einen Cysteinrest enthaltenden Peptid abgespalten werden, indem man etwa ein Moläquivalent eines wasserlöslichen Salzes eines Schwermetalles, wie die Acetate oder Nitrate von Quecksilber, Silber, Cadmium, Zinn, Antimon, Platin, Gold, Blei oder Wismut oder Organometallsalze von Schwermetallen, wie p-Chlormercuri-benzoesäure, mit einer wäßrigen Lösung des S-Alkylamidomethylcystein 1 bis 2 Stunden rührt. Dabei können Lösungsmittel, wie Methanol, Dimethylformamid oder Mischungen dieser Lösungsmittel verwendet werden. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei Raumtemperatur durchgeführt, aber andere Temperaturen als Raumtemperatur können auch angewendet werden. Das feste Metallsalz wird im allgemeinen zu der Lösung des Cysieinderivates zugegeben, aber man kann das Salz auch als Lösung zusetzen. Dabei bildet sich im allgemeinen ein Niederschlag und man läßt die Reaktion etwa 30 bis 90 Minuten laufen. Die Umsetzung kann in einem weiten pH-Bereich unter sauren oder basischen Bedingungen durchgeführt werden, je nachdem welches spezielle Mittel zur Entfernung der Schutzgruppe verwendet wird. Die besten Resultate werden jedoch bei pH 4 erhalten, wenn man anorganische Salze als Schutzgruppen-Abspaltungsmittel verwendet, und bei pH 9, wenn Organometallsalze von Schwermetallen als Schutzgruppen-Abspaltungsmittel verwendet werden. Werden diese Salze in Lösung zugegeben, so wird der pH der Losung im allgemeinen dem pH, bei dem die Reaktion durchgeführt wird, angepaßt Nachdem die Umsetzung vollständig ist leitet man Schwefelwasserstoffgas in die Mischung ein, um das Metall zu entfernen oder man kann dieses durch Dialyse gegen eine Chelatverbindung, wie Äthylendiamintetraessigsäure entfernen. Die vollständige Abwesenheit der Schutzgruppe wird durch Dünnschichl-Chromatographie bestimmt. Bedeutet R Acetonyl, so kann die Schutzgruppe durch
ίο Hydroxylamin, Hydrazin oder Phenylhydrazin in Eisessig bei Raumtemperatur abgespalten werden. Das Hydrazin reagiert mit den funktionellen Carbonylresten unter Bildung eines cyclischen Hydrazids und des S-Aminomethylcystein als Rückstand. Dieser Rückstand ist im wäßrigen Medium instabil und durch Zugabe von Wasser oder wäßrigem Alkohol bricht er auf unter Bildung von Ammoniak, Formaldehyd und dem freien Peptid. Das Produkt wird im allgemeinen mit Äther als bromwassestoffsaures Salz ausgefüllt Ist in dem als Endprodukt hergestellten Peptid eine Disulfidbindung erwünscht, so läßt man nach Entfernung der Schutzgruppen in die Reaktionsmischung Luft einperlen, wobei sich das Disulfid durch Luftoxidation bildet.
Das Verfahren der Erfindung ist nützlich bei Peptidsynthesen, weil die Schutzgruppen unter den verschiedenen Reaktionsbedingungen, wie sie im allgemeinen bei Peptidsynthesen angewendet werden, stabil sind. So sind die Schutzgruppen z. B. unter sauren
jo und basischen Bedingungen im pH 0 bis 13, in konzentriertem Ammoniak und in Trifluoressigsäure stabil. S-Acetamidomethylcystein, ein nützliches Zwischenprodukt bei der Synthese von cysteinenthaltenden Peptiden ist sehr löslich in Wasser, eine Eigenschaft, die
j5 bei einigen Peptidsynthesen sehr nützlich ist
Die neuen Schutzgruppen können bei der Synthese von bekannten Peptiden, die allgemein bekannte biologische Eigenschaften haben, wie Oxytocin, welches die Milchbildung reguliert, und Vasopessin, welches
κι blutdrucksenkende Eigenschaften hat, verwendet werden.
So wurde z. B. bei der Synthese von Oxytocin festgestellt, daß die Mercaptogruppe geschützt werden kann, indem man zunächst S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid mit Propyl-leucylglycinamid in Gegenwart von Kaliumborat bei einem pH von etwa 10 bis 11 umsetzt, wobei im allgemeinen ein etwa l°/oiger molarer Überschuß des Carboxyanhydrids verwendet wird. Nach der Zugabe des N-Carboxyanhydrids wird
so der pH auf etwa 3 mit einer Mineralsäure, wie konzentrierte Schwefelsäure, eingestellt, und das Reaktionsgefäß wird zur Entfernung von Kohlendioxid etwa 15 Minuten mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann wiederum auf 10 bis 11 mit Kaliumhydroxid einreguliert und anschließend wird Asparagin-N-carboxyanhydrid zu der Mischung gegeben. Die vorstehend genannte Reihenfolge, nach welcher der pH auf 3 gesenkt und dann wieder auf 10 erhöht wird nach der darauffolgenden Zugabe des Carboxyanhydrids, wird während der
bo Zugabe von Glutamin-N-carboxyanhydrid, Isolucin-N-carboxyanhydrid und Tyrosin-N-carboxyanhydrid wiederholt, bis die letzte Verfahrensstufe erreicht wird, wo der pH auf etwa 8 erhöht wird und ein etwa 10%iger Überschuß an N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethyl-
b5 cystein-N-hydroxycussinimidester zugefügt wird. Der pH wird dann erniedrigt und etwa 15 bis 20 Stunden bei 1 gehalten, um die t-Butoxycarbonylgruppe zu entfernen und die S-Acetamidomethyl-Schutzgruppe wird
durch Zugabe von Quecksilber(ll)-acetat bei einem pH von etwa 4 bis 5 entfernt. In die Mischung läßt man zur Entfernung des Quecksilbers Schwefelwasserstoffgas perlen und anschließend Luft, um den Rückstand zu Oxytocin zu oxidieren. Es wurde auch festgestellt, daß man anstelle von N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein-p-nitrophenylester verwenden kann, um das Endprodukt zu erhalten.
S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid wird hergestellt indem man S-Acetamidomethylcystein mit Phosgen in einem geeigneten trockenen Lösungsmittel, wie peroxidfreiem Tetrahydrofuran, umsetzt. Phosgen wird unter Rühren in die Reaktionsmischung eingeleitet und man erhält nach Beendigung der Reaktion eine klare Lösung. Das Produkt wird durch Verdampfen des Lösungsmittels gewonnen und dann in bekannter Weise gereinigt.
N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester kann hergestellt werden, indem man t-Butoxy-S-acetamidomethylcystein mit N-Hydroxysuccinimid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie trockenem Dioxan, umsetzt. t-Butoxycarbonyl-S-acetarnidomethylcystein erhält man, indem man S-Acetamidomethylcystein mit t-Butoxycarbonylazid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, in Gegenwart einer Base, wie Magnesiumoxid, umsetzt. N-o-Nitrophe-
nylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein-p-nitrophenylester kann hergestellt werden, indem man N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein mit Nitrophenol in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, in Gegenwart eines Überschusses des Dicyclohexylcarbodiimids umsetzt. N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein erhält man durch Umsetzung von S-Acetamidomethylcystein mit o-Nitrophenylsulfenylchlorid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, in Gegenwart einer Base, wie Magnesiumoxid.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht können die neuen Schutzgruppen bei der Synthese einer Anzahl von verschiedenen Peptiden, die einen oder mehrere Cysteinreste enthalten, verwendet werden. Die nachgewiesene chemische Stabilität der neuen Schutzgruppen und die Leichtigkeit, mit der sie mit spezifischen Reagenzien wieder entfernt werden können, sind ganz besondere Vorteile gegenüber den zur Zeit verwendeten Schutzgruppen bei Peptidsynthesen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung. Das als Ausgangsmaterial verwendete S-Acetamidomethylcystein und sein Hydrochlorid können nach Beispiel 1 und der N-tert-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester nach Beispiel 3 der DE-AS 17 93 119 hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele 1 und 2 zeigen die Verarbeitungsmöglichkeit des in der Stufe a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Peptids zum schutzgruppenhaltigen Peptid in der Stufe b).
Beispiel 1
S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid
1,0 g S-Acetamidomethylcystein wird in einem trokkenen Dreihalskolben, der mit einem Gaseinleitungsrohr und einem Kühler mit Trockenrohr versehen ist, vorgelegt. Dazu gibt man 50 ml trockenes peroxidfreies Tetrahydrofuran und rührt die Suspension, während ein Phosgenstrom bei Raumtemperatur eingeleitet wird. Nach 3 Stunden hat sich praktisch alles gelöst und die Lösung wird filtriert und im Vakuum abgedampft unter Bildung von S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid in Form eines gelben Öls. Das öl wird durch das Infrarotspektrum als das gewünschte Produkt identifiziert.
Beispiel 2
N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acelamidomethylcystein-p-nitrophenylester
N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein
22,8 g (0,1 Mol) S-Acetamidomethylcystein-hydrochlorid werden in 250 ml 50%igem peroxidfreiem Dioxan in einem 500 ml Dreihalskolben, der mit einem mechanischen Rührer und einem Kühler ausgerüstet ist, gelöst. Man gibt 12 g (0,3 Mo!) Magnesiumoxid zu und rührt die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur. Dazu werden 0,11 Mol o-Nitrophenylsulfenylchloid gegeben und die Mischung wird 3 Stunden auf einem Ölbad bei 45° C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt und 1 I Wasser wird zugefügt. Die wäßrige Mischung wird zweimal mit 200 ml Äthylacetat gewaschen, auf einem Eisbad gekühlt und mit Zitronensäure auf den pH 3 angesäuert.
Die Lösung wird dann mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden zweimal mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand
jo kristallisiert aus Äthylacetat/Benzol.
N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcysein-p-nitrophenylester
0,025 Mol N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidome-
j5 thylcystein werden in einem trockenen Kolben in 100 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird auf einem Eisbad gekühlt und 0,025 Mol o-Nitrophenyl werden zugefügt Nachdem alles gelöst ist, wird ein 10%iger molarer Überschuß von Dicylohexylcarbodiimid zugefügt, die Mischung wird 1 Stunde auf einem Eis/Salz-Bad gerührt und dann übernacht bei 0 bis 5° C stehengelassen. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, einmal mit 1 η Natriumbicarbonat und dann dreimal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum abgedampft Beim Kristallisieren aus Chloroform/Äther erhält man praktisch reinen N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein-p-nitrophenylester.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die Abspaltung der S-Acetamidomethyl-Schutzgruppe in der Stufe c) des erfindungsgemäßen Verfahrens:
96 mg (0,5 Millimol) S-Acetamidomethylcystein werden in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung wird mit 0,25η Chlorwasserstoffsäure auf pH 4 eingestellt Dazu gibt man eine Lösung von 159 mg (03 Millimol) Quecksiiber(H)-acetat in 5 ml Wasser, welches zuvor auf pH 4 eingestellt worden war. Beim Mischen bildet sich sofort ein Niederschlag. Der pH fällt und wird 1 Stunde lang auf pH 4 eingeregelt Während der Umsetzung entnimmt man in 15minütigen Abständen 2 ml Proben.
Zu jeder Probe gibt man Schwefelwasserstoff, um die Reaktion abzubrechen. Die klare, überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und ein Dünnschicht-Chromatogramm wird von jeder Probe in einem Butanol-Essig-
säure-Wassersystem durchgeführt. Die nach 30 und 45 Minuten gezogenen Proben enthalten kein S-Acetamidomethylcystein. Sie enthielten nur Cystein und Cystin.
Beispiel 4
Im folgenden wird die Verwendung der S-Acetamido-Schutzgruppe bei der Gesamt-Synthese eines Cystein enthaltenden Peptids beschrieben.
Synthese von Oxytocin
2 Millimol Propyl-leucyl-glycinamid und 20 ecm Kaliumborat-Puffer (pH 10,2) werden in einem Waring-Mischer bei 00C gefüllt. Dazu gibt man unter Rühren einen 1 °/oigen molaren Überschuß an S-Acetamidomethylcysteirt-N-carboxyanhydrid. Der pH wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3,0 eingestellt und das System wird 15 Minuten zur Entfernung von Kohlendioxid mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann mit 50%igem Kaliumhydroxid auf 10,2 erhöht und ein 2%iger molarer Überschuß Asparagin-N-carboxyanhydrid zugefügt. Der pH wird auf 3,0 mit konzentrierter Schwefelsäure eingestellt und das System wird wiederum mit Stickstoff gespült Man erhöht den pH dann auf 10,2 mit 5O°/oigem Kaliumhydroxid und gibt einen 3%igen Überschuß Glutamin-N-cabonsäureanhydrid zu. Der pH wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 erniedrigt und das System mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann mit 5O°/oigem Kaliumhydroxid auf 10,2 erhöht und ein 5%iger Überschuß Isoleucin-N-carboxyanhydrid zugegeben. Dann wird der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt und das System wird wieder zur Entfernung von Kohlendioxid mit Stickstoff gespült. Dann wird der pH wieder auf 10,2 mit 50%igem Kaliumhydroxid erhöht und ein 5%iger Überschuß Tyrosin-N-carboxyanhydrid zugegeben. Der pH wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt und
ίο das System wird wiederum zur Entfernung von Kohlendioxid mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann auf 8,0 mit 5O°/oigem Kaliumhydroxid erhöht und ein
10%iger molarer Überschuß von N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinirnidester wird zugegeben. Der pH wird zur Entfernung der tert.-Butoxycarbonylgruppe mit konzentrierter Schwefelsäure auf 1 erniedrigt und 15 Stunden dabei gehalten. Dann wird der pH auf 4 eingestellt und ein 10%iger molarer Überschuß einer wäßrigen Lösung von QuecksilberiJO-acetat wird zu der Reaktionsmischung zugegeben. Der pH wird durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4 gehalten. Zur Entfernung der Quecksilber-Ionen wird Schwefelwasserstoffgas in die Reaktionsmischung eingeleitet und zur Oxidation des Produktes zum
2r> Oxytocin wird Luft durch die Reaktionsmischung geleitet. Das Produkt wird chromatographisch über Kieselgel gereinigt.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest enthaltenden Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß maii
a) die Mercaptogruppe des Cysteinrestes mit einer Schutzgruppe der allgemeinen Formel
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