DE1768844C - Verfahren zur Herstellung von ring offenen Tetrose- und Triosephosphatacetalen bzw ketalen - Google Patents

Description

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Tetrose- und Triosephosphate sind wichtige mit Ionenaustauschern, falls die Verbindungen in

Zwischenprodukte des Inlermediärstoffwechsels. So Form von Salzen vorliegen. Soweit die Phosphcr-

treten Erythrose-4-phosphat (E-4-P) und Glyzerin- säureester als saure Salze vorliegen, erfolgt ihre wasser-

ildehyd-3-phosphat (GAP) im Hauptweg des oxy- freie Gewinnung bevorzugt durch Fällung mit or-

dativen Abbaus der Glucose (Hexosephosphat— 5 ganischen Lösungsmitteln.

Shunt) sowie der CO₂-Fixierung im grünen Blatt bzw. Die sauren Salze werden bevorzugt in Form der

einiger Mikroorganismen (CO,-Assimllation) auf, Alkali-, insbesondere der Nalriumsalze verwendet.

CAP daneben beim anaeroben Auf- und Abbau der Diese werden bei Fällung mit organischen Lösungs-

Glucose, bei der Glycolyse und Gluconeogenese. Dar- mitteln aus wäßriger Lösung in flockig-amorpher

»us resuliiert die erhebliche Bedeutung, welche diese io Form erhalten. Bei der Lyophilisierung der freien

Verbindungen als biochemische Reagenzien im Rahmen Phosphorsäureester dagegen wird ein öliges Produkt

von Stoffwechseluntersuchungen, vor allem aber zur erhalten.

Aktivitätsbesiimmung der sie umsetzenden Enzyme Die so erhaltenen wasserfreien Phosphoisäureester

erlangt haben. der Tetrosen oder Triosen oder ihre sauren Salze

Ein Nachteil der ringoffenen phosphorylierten Ver- 15 werden nun in einem geeigneten organischen Lösungsbindungen ist ihre groCe Instabilität. Die stabile Lager- mittel aufgenommen. Als wasserfrei werden hierbei form dieser Verbindungen sind daher die entsprechen- auch solche Substanzen verstanden, d>£ noch einen den Acetale bzw. Ketale. Vor der Verwendung werden geringen Wassergehalt aufweisen. Ein solcher stört diese Acetale bzw. Ketale durch saure Hydrolyse wie- überraschenderweise die spätere Acetalisierung nicht der in die enzymatisch aktiven freien Aldosen bzw. ao Die für die Acetalisierung verwendeten organischen Ketosen übergeführt. Bei den Aldosen und Ketosen Lösungsmittel müssen gegenüber der Reaktion inert handelt es sich um isomere Erscheinungsformen der sein und sowohl den Phosphorsäureester ais auch das gleichen Verbindung, und der Einfachheit halber Acetalisierungsmi'tel lösen können. Es können sowchl werden in der folgenden Beschreibung nur die Aldosen polare als auch nichtpolare organische Lösungsmittel erwähnt. Dies ist jedoch so zu verstehen, daß die Aus- as verwendet werden, wobei die lösenden Eigenschaften führungen auch in gleicher Weise für die entsprechen- nichtpolarer Lösungsmittel gegebenenfalls durch Zuden Ketosen gelten. satz von polaren Lösungsmitteln variiert werden

Die Acetalformen der phosphorylierten Tetrosen können. Geeignete organische Lösungsmittel sind und Triosen wurden bisher nach umständlichen mehr- beispielsweise die niedrigen Alkohole, Benzol und stufigen chemischen Synthesen gewonnen mit ent- 30 seine Homologen, Dimethylformamid,^ Äther und sprechend geringen Gesamtau-heuten (vgl. zum Bei- Ester. Vorzugsweise wird absolutes Äthanol verspiel C.E. B all ou et al, J. Am. Chem. Soc, 77, wendet.

S. 5967 [1955], und 78, S. 1659 [1956]). Eine direkte Dem Lösungsmittel kann eine geringe Menge einer

Acetalisierung erschien ausgeschlossen, da hierbei starken Säure oder eines sauren Salzes als Katalysator

eine gleichzeitige Veresterung der Phosphorsäure- 35 für die Acetalisierungsreaktion zugesetzt werden. Im

gruppe zu erwarten war. Fall der freien Phosphorsäureester unterbleibt der

Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, Säurezusatz vorzugsweise. Bei den sauren Salzen hindaß bei einer Acetalisierung der freien Aldosephos- gegen ist es im allgemeinen günstiger, den Säurezusatz phorsäuren oder ihrer sauren Salze in wasserfreiem anzuwenden. Als starke Säure wird Schwefelsäure Zustand in einem organischen Lösungsmittel mit aus- 40 bevorzugt, da sie sich leicht in Form eines schwergezeichneter Ausbeute die gewünschten Acetale er- lös'ichen Salzes wieder entfernen läßt. Gut geeignet halten werden, ohne daß eine Veresterung der Phos- ist auch Eisessig,
phorsäuregruppe erfolgt. Die Acetalisierung erfolgt unter üblichen Bedin-

Das errindungsgemäCe Verfahren zur Herstellung gungen unter Verwendung üblicher Acetalisierungs-

von ringoffenen Tetrose- und Triosephosphatacetalen 45 mittel. Besonders gut geeignet sind o-Ameisensäure-

bzw. -ketalen besteht darin, daß man die phosphori- triäthylester und Dimethylformamid-Dimethyl-acetal.

lierten Aldosen bzw. Ketosen, gegebenenfalls in Form Alkohol und gasförmiger Chlorwasserstoff ergeben

ihrer sauren Salze, aus wäßriger Lösung in an sich \ eniger gute Resultate.

bekannter Weise wasserfrei oder mit nur geringem Die Acetalisierung erfolgt bei Temperaturen

Wassergehalt gewinnt, in einem organischen Lösungs- 50 zwischen etwa —10 und 40⁰C, vorzugsweise etwa bei

mittel aufnimmt und mit üblichen Acetalisierungs- Zimmertemperatur. Die Reaktionsdauer hängt vom

bzw. Ketalisierungsmitteln behandelt. verwendeten Acetalisierungsmittel und von derTempe-

Die Phosphatester der Tetrosen und Triosen lassen ratur ab. Bei Zimmertemperatur dauert die Acetali-

sich leicht nach bekannten Methoden in wäßriger sie/ung unier Verwendung von o-Ameisensäuretri-

Lösung herstellen, beispielsweise durch Bleitetra- 55 äthylester etwa 3 bis 4 Tage, bei Dimethylformamid-

acetatspallung von Glucose-6-phosphat nach Crie- Dimethylacetal einige Stunden.

gee unter Bildung von E-4-P, durch Perjodatspaltung Bei Acetalisierung der sauren Salze werden günstig

von Fructose-6-phosphat nach Malaprade unter die stärker polaren organischen Lösungsmittel wie

Bildung von GAP oder durch Aldolaseipaltung von Alkohole oder Methylenchlorid verwendet« während Fructosediphosphat unter Bildung von OAP und DAP βο bei den freien Säuren auch die unpolaren organischen

(Dioxiacetonphosphat). Aus derartigen wäßrigen bzw. Lösungsmittel wie Toluol oder Benzol gut geeignet

essigsauren Lösungen können die Phosphatester in sind.

wasserfreier Form hergestellt werden, beispielsweise Die Aufarbeitung der beim erfindungsgemäßen Ver·

durch Fällung mit wassermischbaren organischen fahren in organischer Lösung anfallenden ringoffenen

Lösungsmitteln oder durch Lyophilisierung. Bei Vor* I5 Tetrose· und Triosephosphatacetale erfolgt durch

liegen der freien Phosphorsäureester wird die Lyo« Neutralisation, Abtrennung von unlöslichen Anteilen

philisierung angewandt, Die Herstellung der freien und Abdestillieren des organischen Lösungsmittels.

Phosohorsäureester erfolgt günstig durch Behandlung Zur Neutralisation wird eine Base verwendet, Vorzugs«

jveise eine solche, deren Salze in dem organischen mit dem Eisessig misehburen organischen Lösungs-

l-ösungsmittel unlöslich sind, wie Bariumhydroxyd. mittel zu Füllung gebracht. Der so erhaltene Nieder-

Die nach dem Abdestillieren des organischen schlag von E-4-P, als saures Natriumsalz, wird unLösungsmittels erhaltenen Produkte lassen sich noch mittelbar, ohne vorherige Trocknung, zur Acetalijveiter reinigen. Die Reinigung erfolgt beispielsweise 5 sierung, wie im Beispiel 1 beschrieben, eingesetzt. Auf-(Jurch Aufnehmen in wenig Wasser, gegebenenfalls arbeitung und Ausbeute sind völlig analog wie im Aktivkohlebehandlung und Erhitzen. Wenn zur Neu- Beispiel 1.

tralisation des Reaktionsgemisches Bariumhydroxyd Beispiel 3

verwendet wurde, so fallen beim Erhitzen die Barium- D-GlycerinaldchydO-phosphat-diätUylacetal,

kalze in mikrokristalliner Form aus und können aus m ß-iriumsalz
der heißen Lösung direkt abfiltriert werden.

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Her- 6,67 g Fructose-6-phosphat, Dinatriumsalz (F-6-P)

Stellung der Triose- und Tetrosephosphatacetale bzw. werden in 32 ml destilliertem Wasser gelöst, und unter

•ketale in höchst einfacher Weise mit sehr guten Aus- gutem Rühren bei U"C wird eine Lösung von 10 g Per-

bei'.ten und macht daher diese Verbindungsklasse ;5 jodsäure in 43 ml destilliertem Wasser langsam zuge-

leicht zugänglich. tropft.

Pie folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der Nach etwa 1 Stunde wird das entstandene Kristalli-

Eifindung weiter, sat vom Natriumjodat abgesaugt und d^s klare Filtrat

Beispiel 1 über einen Kationenaustauscher (z. B. Dowex 50) von

r- , . .,.._,, , „ - , a° Alkalionen befreit. Das Eluat vom Austauscher wird

n-Erythrose-4-phosphat-diathylacetal, Banumsalz lyophilisiert. Der so erhaltene ölige Rückstand wird

3,26 g D-Glucose-6-phosphat (G-6-P, Natrium^alZ) in 100 ml Toluol gelöst. Die Acetalisierung erfolgt

werden in 30 ml Eisessig aufgeschlämmt, durch Zusatz durch Zusatz von 10 g o-Ameisensäureäthylester und

von 7 ml Wasser gelöst und mit weiterem Eisessig auf 0,25 ml konzentrierter Schwefelsäure und Inkubation

1200 ml verdünnt. as bei Raumtemperatur (4 Tage).

In einem Tropftrichter wird eine Lösung von 7,44g Die äthanolhche Lösung wirti mit kalt gesättigter

Bleitetraacetat in 500 ml Eisessig und 6,3 ml 6 n- Bariumii/droxydlösung bis pH 7 neutralisiert und im

Schwefelsäure gegeben. Diese Lösung wird in einem Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand

Zeitraum von etwa 2 Stunden unter gutem Rühren zu wird in wenig destilliertem Wasser aufgenommen, vom

der Lösung d.i G-6-P zugegeben (Raumtemperatur). 30 Bariumsulfat abfiltriert und mit Aktivkohle geklärt.

Während der Zugabe darf kein Überschuß von Blei- Das klare Filtrat wird auf 9O⁰C erhitzt, wobei knstal-

tetraacetat vorliegen (Prüfen mit Jod-Stärke-Papier). lines GAP-DA-Bariumsalz ausfällt und heiß abfiltriert

Nach beendeter Oxydation, '«i der Bleisulfat aus- wird. Der Niederschlag wird in wenig eiskaltem, fällt, wird von diesem zentrifugiert und der klare Über- destilliertem Wasser gelöst und durch erneutes Aufstand lyophilisiert. Ausbeute: etwa 3,26 geiner leichten, 35 heizen auf 90⁰C zur Fällung gebracht, abfiltriert, mit weißen Substanz, die etwa 41% enzymatisch test- heißem Wasser gewaschen und im Vakuum über bares Erythrose-4-phosphat enthält. Dies entspricht Chlorcalcium getrocknet.

einer Umsetzung von etv/a 68% der Theorie. Der Ausbeute: 2,5 g GAP-D.i»hylacetal, Bariumsalz,

Rückstand, der noch etwas Eisessig enthalten kann, entsprechend etwa 30%, berechnet auf eingesetztes

braucht vor der nun folgenden Acetalisierung nicht 4° F-6-P-Natriumsal7

getrocknet zu werden. Das Beispiel wurde unter Verwendung von Benzol

Das Lyophilisat wird in 100 ml absolutem Äthyl- bzw. Methylenchlorid an Stelle von Toluol wiederholt

alkohol aufgenommen. Durch Zugabe von 10 g mit gleichem Ergebnis.

o-Ameisensäuretriäthylester und 0,25 ml konzentrierter _R . 14

Schwefelsäure erfolgt nun die Acetalysierung in 45 e 1 s ρ 1 e

75 Stunden bei Raumtemperatur. Der Umsatz erfolgt Zur Darstellung von GAP-Diäthylacetal, Barium-

zu 90%. salz, wird wie im Beispiel 2 beschrieben vorgegangen.

Nach dieser Zeit wird das Reaktionsgemisch mit Der ölige Rückstand nach der Lyophilisation wird gesättigter Bariumhydroxydlösung neutralisiert, der jedoch in 100 ml absolutem Äthano! gelöst und mit entstehende Niederschlag vom Bariumsulfat zentri- «° 10 g Dimeihylformamid-Diäthylaceta! und 0,5 ml Eisfugicrt und einige Male mit Wasser gewaschen. Die essig acetalisiert. Nach 15 Stunden wird mit kalt-Uberstände werden vereinigt. Die so erhaltene, leicht gesättigter Barytlauge neutralisiert, im Vakuum zur gelbliche Lösung wird im Vakuum zur Trockne ein- Trockne eingedampft und wie unter Beispiel 2 begeengt, in 15 ml destilliertem Wasser wieder aufge- schrieben weiter aufgearbeitet,
nommen und über Aktivkohle filtriert. 55 Ausbeute: 2,0 g GAP-DA-Bariumnalz, das sind

Das n-Erythrose^phosphat-diäthylacetal wird als 24,6%, bezogen auf eingesetztes F-6-P-NatriumsaIz. Bariumsalz durch Erhitzen der Lösung auf 8O⁰C

mikrokristallin ausgefällt. Die Trocknung der weißen Beispiel 5

entsprechend 50,5%, bezogen auf E-4-P, oder 34,3%, In eine auf -20⁰C gekühlte Lösung von 10 g Dibezogen auf eingesetztes D-G-6*P*Natriumsalz. hydroxyaccton in 300 ml wasserfreiem Chinolin wird

eine Lösung von 20 g Phosphorchlorid in 100 ml Chi-

Beispiel 2 _nolj_{n von} d_efse|ben Temperatur innerhalb von 10 Mi-

Es wird wie im Beispiel 1 verfahren, jedoch nach der 6s nuten eingetropft und das Reaktionsgeniisch so lange Spaltung mit Bleitetraacetat und Abzentrifugieren von bei dieser Temperatur gehalten, bis nach etwa 30 Mi-Bleisulfat das Reaktionsgemisch nicht lyophilisiert, nuten ein dicker Kristallbrei erstarrt. Der Rückstand . nndern mit Chloroform. Benzol oder einem anderen, wird in etwa dem gleichen Volumen Eiswasser auf-

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genommen und 50 nil 25"/,_;ige Calciumacetatlttsung zugegeben und mit Natronlauge bis pH 7 neutralisiert. Es wird nun vom ausgefallenen Caleiumphosphat ahiilirierl und im klaren F ill rat durch Zugabe des 3fachen Volumens Äthanol das Dioxyacetonphosphat als Calciiimsalz ausgefällt; der Niederschlag wird zentrifugiert, der Rückstand in wenig destilliertem Wasser gelost und über einen Kationenaustauscher (z. B. Dowex 50) in der Η-Form vom Calcium befreit. Das Eluat wird lyophilisiert, wobei ein gelber, öliger Rückstand verbleibt. Dieser wird in 70 ml absolutem Äthanol gelöst, mit 7 g o-Ameisensäuretriäthylester und 0,2 ml konzentrierter Schwefelsäure acetalisiert.

Nach 3lägigem Stehen bei Raumtemperatur wird mit kaltgewättigter Bariumhydroxydlösung neutralisiert, vom Bariumsulfat abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in wenig destilliertem Wasser gelöst und mit Aktivkohle geklärt. Das klare, konzentrierte Filtrat wird auf 90⁰C erhitzt und das dabei ausfallende Di- ao hydroxyacetonphosphat-diäthyLetalbariumsalz in der Hitze abfiltriert. Der Niederschlag wird in wenig eiskaltem, destilliertem Wasser gelöst und erneut durch Aufheizen auf 90⁰C zur Fällung gebracht, filtriert, mi' 'leißem Wasser gewaschen und im Vakuum über Chlorcalcium getrocknet.

Ausbeute: 2,2 g Dihydroxyacetonphosphat-diäthylketal bariumsalz, entsprechend etwa 5°/o, bezogen auf eingesetztes Dihydroxyaceton.

Beispiel 6

Glyccrinaldehydphosphat-diäthylaccial, Hariumsul/.

Die Darstellimgerfolgtwicim Beispiel 3 beschrieben; die Lösung des GAP in 100 ml absoluten» Äthanol wird mil 10 g Pimelhylformamid-diälhylaceial acelalisiert, jedoch ohne Zugabe von Säure Nach etwa Stunden wird mil kaltgesältigter Bariumhjdroxydiösung neutralisiert, im Vakuum zur Trockne eingedampft und wie unter Beispiel 3 beschrieben weiter aufgearbeitet.

Ausbeute: 3,0 g GAP-Diäthylacetal, Bariumsalz, entsprechend 24,6°/o ^üer Theorie, bezogen auf eingesetztes F-6-P, Natriumsalz.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von ringoffenen Telrose- und Triosephosphatacetalen bzw. -ketalen, dadurch gekennzeichnet, daß man

- die phosphorilie:,;n Aldosen bzw. Ketosen, gegebenenfalls in Fown ihrer sauren Salze, aus wäßriger Lösung in an sich bekannter Weise wasserfrei oder mit nur geringem Wassergehalt gewinnt, in einem organischen Lösungsmittel aufnimmt und mit üblichen Acetalisierungs- bzw. Keialisierungsmittel behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit absolutem Äthanol als organischem Lösungsmittel durchführt.