DE1767285C3

DE1767285C3 - Verfahren zur Herstellung eines stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrates und Mittel zur Behandlung der Hämophilie

Info

Publication number: DE1767285C3
Application number: DE1767285A
Authority: DE
Inventors: Edward Shanbrom
Original assignee: Baxter Travenol Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1967-05-01
Filing date: 1968-04-22
Publication date: 1981-08-20
Also published as: DK119626B; IT1048951B; ES353435A1; NL162838B; JPS594402B1; FR1589414A; GB1178958A; DE1767285B2; NL6806162A; SE375008B; DE1767285A1; NL162838C; BE713764A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und Mittel zum Herstellen eines Konzentrates des antihämophilen Faktors (AHF, Faktor VIII), wie es in den Ansprüchen 1 - 3 im einzelnen gekennzeichnet ist.

Der Vorgang der Blutkoagulation ist eine wichtige Funktion, die normales Vollblut unter passsenden Bedingungen auszuführen fähig ist, um unnötige Blutverluste durch offene Wunden oder durch innere Blutungen zu verhüten.

Es ist bekannt, daß normales Vollblut einen Faktor enthält, der abwesend oder in beträchtlichem Maße bei Hämophilie (Bluterkrankheit) fehlend ist. Dieser Faktor wirkt mit der Globulinfraklion des Blutes zusammen und ist als antihämophiler Faktor (AHF, Faktor VIII) bekannt geworden.

Wissenschaftlern ist seit einiger Zeit etwas über AHF und seine Bedeutung bei der Blutkoagulation bekannt. Die Behandlung der Hämophilie hat bisher im allgimeinen in einer Auffüllungstherapie bestanden, wobei dem Patienten viele Liter frisches Vollblut oder speziell behandeltes Plasma transfundiert wurde.

Es ist bekannt, daß jedoch unter üblichen Lagerungsbedingungen Vollblut und flüssiges Plasma seine AHF-Aktivität innerhalb eines Tages oder darum herum verliert. Da es möglich ist, frisches Plasma einzufrieren und zu lagern, hai die AHF-Aktivität in gefrorenem Plasma eine relativ kurze Lebensdauer von einigen Monaten oder darum herum.

Es ist auch möglich, während der Lagerung den Verlust an AHF-Aktivität herabzusetzen durch Trocknen frisch gefrorenen Plasmas. Aber bisher ist es nicht möglich gewesen, mit Gewißheit den Gehall an AHF in diesem getrockneten Material mit Sicherheit zu kennen, weil der Gehalt an AHF in normalen Individuen, die das Plasma spenden, außerordentlich von etwa 50% bis etwa 200% des Durchschnitts schwankt.

Die konventionelle Auffüllungstherapie besitzt weitere ernst zu nehmende Nachteile, weil die Hämophilie oft allergische oder der Behandlung trotzende Zustände bei wiederholter Behandlung mit Plasma entwickelt Außerdem neigen die großen Mengen an Plasma dazu, die durch die Hämophilie benötigt werden, ein übergroßes Blutvolumen oder eine Überladung des zirkulatorischen Systems zu bewirken. Solche Überladungen rufen eine Überanstrengung des Herzens hervor und führen beim Patienten zum Herzversagen.

Wissenschaftler haben schon verschiedene Methoden für die Isolierung des AHF oder die Herstellung von Plasmafraktionen mit angereichertem AHF aus Humanoder Tierblut vorgeschlagen. In der Praxis haben sich Verfahren bisher als unzuverlässig erwiesen, weil die AHF-Aktivität der Fraktionen während der isolierung verloren zu gehen scheint. AHF ist ein labiles Spurenprotein, welches schwierig vollständig von anderen Plasmaproteinen zu isolieren ist, besonders Fibrinogen und die Ausbeute an AHF aus dem Plasma ist durch diese bisherigen Verfahren nicht hoch gewesen.

Die AHF-Wirkungen der bisher hergestellten Blutfraktionen für die Hämophilie-Therapie sind als gering bekannt und die Kosten der Behandlung sind hoch.

Andere Nachteile bei früheren Versuchen, die bei der Isolierung von AHF festgestellt wurden, sind die Eigenschaften des AHF, daß es sehr leicht durch Hitze, Einfrieren, Auftauen und andauernde Lagerung denaturiert wird.

GB-PS 10 06 258 beschriebt die Behandlung mit Polyäthylenglykolen zur Einigung bzw. Fraktionierung von Proteinen in 2 Stufen nur für die Gewinnung von homogenem Gammaglobulin beschrieben ist. Für die Gewinnung von Fibrinogen ist eine Fraktionierung in nur einer Stufe mit Polyäthylenglykol vorgesehen. Da AHF mit Fibrinogen näher verwandt ist als mit Gammaglobulin Am. J. Med. Sei. 250, Dez. 1935, Seite 65/643 wird der Fachmann durch die GB-PS 10 06 258 von der Verwendung von Polyäthylenglykol abgehalten.

AO Ferner ist zu berücksichtigen, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in völlig unerwarteter Weise das von den vorhergehenden Stufen stammende Polyäthylenglykol nicht bei der Glycinfällung mit AHF ausgefällt wird, sondern in der überstehenden flüssigen Phase verbleibt. Da das Polyäthylenglykol für Patienten schädlich sein kann, wird hierdurch ein besonderer technischer (therapeutischer) Effekt erzielt.

Zu den verschiedenen Verfahren, die bisher für die Isolierung von AHF vorgeschlagen worden sind, gehören Chromatographie, stufenförmige Absorption und Elution und selektive Ausfällung. Verschiedene Ausfällungsmittel, die benutzt worden sind, sind Äthanol, Äthyläther, Ammoniumsulfat, Phosphat-Natriumcitrat, Aminosäuren und Kältefällungsverfahren.

Kürzlich wurde die klinische Verwendung von mit Glycin gefällter AHF-Fraktion des Vollplasmas durch Webster und Mitarbeiter (Amer. J. Med. Sciences, Vol. 250, Nr. 6, Seite 643-650 (1965)) beschrieben. Über klinische Versuche zur AHF-Auffüllungstherapie mit einer kältegefällten Fraktion des Vollplasmas in einem geschlossenen Beutelsystem wurde durch Pool und Mitarbeiter (New England J. Med., VoI. 273, Nr. 27, Seiten 1443-1447 (1965)) ein Bericht veröffentlicht. Keine dieser zuletzt genannten Verfahren hat sich jedoch als eine vollständig befriedigende, auch im Fabrikmaßstab ausführbare Methode zur Isolierung von AHF erwiesen, so daß ein ungelöstes und dringendes Bedürfnis an einem industriell ausführbaren Verfahren

zur Gewinnung eines stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrates besteht

Die vorliegende Erfindung, die sich gegenüber den bisherigen Verfahren auszeichnet, betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrates, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kältefällungskonzentrat aus Human- oderTier-AHF in zwei aufeinanderfolgenden Stufen durch Ausfällung von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 20 000 fraktioniert, wobei in der ersten Stufe mit 3 bis 4 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Kältefällungskonzentrat des AHF, in der zweiten Stufe mit 10Gew.-% Polyäthylenglykol bezogen auf das Oberstehende versetzt wird, wonach man die sich ergebende Ausfällung abtrennt und noch Wiederauflösen die Fraktionierung mit einer wässerigen Glycinlösung mit einer Molarität von 1,8 und nachfolgender Isolierung der Ausfällung durchführt

Eine weitere Ausführungsform der vorstehenden Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reinigungsstufe unter Verwendung von triäthanolaminoäthyliertem Celluloseharz anschließt.

Ferner betrifft die Erfindung das Mittel enthaltender Wirkstoff das nach einem oder mehreren der Verfahrens-Ausführungsformen erhaltene stabilen hochwirksamen AH F-Konzentrat. Dieses kann intravenös oder intramuskulär verabreicht werden zur Behandlung von Hämophilie bei Mensch und Tier.

Der vorstehend benutzte Ausdruck »Kältefällungskonzentrat aus Human- oder Tier-AHF« bezieht sich auf die Fällung, die beim Behandeln von Human- oder Tierblutplasma bei S4°C erhalten wird und von dem Überstehenden abgetrennt wurde. Bevorzugt wird, daß dieses Kältefällungskonzentrat des AHF durch sehr schnelles Einfrieren von frischem Piasma erhalten wird, aber gelagertes Plasma kann ebenfalls als Ausgangsmaterial bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Weiterhin wird bevorzugt, das Einfrieren in einem Temperaturbereich von etwa -20⁰C bis etwa -40⁰C und folgendem langsamen Tauen auf etwa 4° C durchzuführen.

Zusätzlich zu der Stabilität und der hohen Wirksamkeit der AHF-Aktivität, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, bei der das kältegefällte Konzentrat des AHF anstelle des Vollplasmas als Ausgangsmaterial benutzt wird, hat es den großen Vorteil, die Retention von anderen Plasmakomponenten wie Albumin, Gammaglobulin und dergleichen zu gestatten, welche gewöhnlich zerstört werden, wenn das Vollplasma durch die bisher bekannten Verfahren zur Darstellung von AHF-Fraktionen behandelt wird, die zur Behandlung der Hämophilie bestimmt sind.

Polyäthylenglykole sind hochmolekulare Polymere, die im allgemeinen durch Umsetzen von Äthylenoxyd mit Äthylenglykol oder Wasser hergestellt werden und die folgende Struktur

HO(C₂H₄O)_nC₂H₄OH

besitzen, in der η die üurchschnittliche Zahl an Oxyäthylengruppen angibt. Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen die Polyäthylenglykole nicht toxisch sein und können einen Molekulargewichtsbereich von etwa 200 bis etwa 20 000 besitzen.

Der ausgewählte Molekulargewichtsbereich dieser liegt zwischen etwa 400 bis etwa 6000. PEG 4000, welches ein Polyäthylenglykolprodukt mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000 ist, ist besonders geeignete von dieser Gruppe.

In der erfindungsgemäßen Polyäthylenglkyol-Fällungsstufe wird 3 bis 4Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das wieder aufgelöste AH F-Konzentrat unter Einbehaltung des Überstehenden, gefolgt von der Verwendung von etwa 10Gew.-% Polyäthylenglykol des Überstehenden unter Einbehaltung des Niederschlages, verwendet Die letztere Ausfällung wird dann abgetrennt und nach Fraktionierung mit einer wässerigen Glycinlösung mit einer Molarität von 1,8, bevorzugt in mit Citrat versetzter Salzlösung wiedergelöst

Das erhaltene AHF-Konzentrat kann eingefroren werden und bleibt stabil auch bei der Lyophilisierung und bei der Aufbewahrung unter üblichen Kühllagerungsbedingungen für Zeiten von einem Jahr und langer. Das wiedereingesetzte AHF-Konzentrat hat dann mehr als die dreißigfache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens; die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist weniger als in einem Hundertstel der im Plasma anwensenden Proteine enthalten im Vergleich zu der gleichen AHF-Aktivität im Plasma.

Das kältegefällte Konzentrat des AHF, welches fraktioniert worden ist, kann zur Reinigung weiter mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt werden. Diese Reinigung kann durch Säulen- oder absatzweise Ladungsverfahren ausgeführt werden. Das nach diesem Verfahren gereinigte Konzentrat besitzt den zusätzlichen Vorteil, daß es sowohl intramuskulär wie auch intravenös verabreicht werden kann, wobei letztere Methode allgemein verwendet wird für solche AHF-Konzentrate, die nicht mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt worden sind. Das AHF-Konzentrat, welches mit ECTEOLA-Celluloseharz gereinigt worden ist ist frei von Fibrogen durch Zugabe von Thrombin und durch Immuno-Elektrophorese gefunden worden.

Der hier benutzte Ausdruck »ECTEOLA-Celluloseharz« bezieht sich auf eine modifizierte Cellulose, die aktive basische Substituenten enthält, die in das Cellulosemolekül durch Reaktion mit Epichlorhydrin und Triäthanolamin eingeführt wurden. Verfahren zur Herstellung von ECTEOLA-Celluloseharzen sind allgemein von Sober und Peterson (J. Am. Chem. Soc'y, Vol. 76, Seiten 1711-12 (1956; a. a. O. Vol. 78, Seite 751 -55 (1956); Vol.78, Seiten 756-63 (1956); und Peterson und Sober, (Biochem. Preparations, Vol. 8, Seiten 43 — 44 (1961)) beschrieben worden.

ECTEOLA-Celluloseharze sind im Handel erhältlich. Es wurde jedoch gefunden, daß es vorteilhaft ist, eingangs diese Harze einer Natriumhydroxyd-Behandlung und Wiederauswaschung zu unterziehen, bevor diese in der schon beschriebenen Reinigungsstufe eingesetzt werden.

In der Reinigungsstufe mit ECTEOLA-Celluloseharz wird das Harz vorzugsweise erst mit einer Chloridpufferlösung, die eine Konzentration von etwa 0,8 Gew.-°/o Natriumchlorid besitzt, in das Gleichgewicht gebracht und dann in die Chromatographieglassäule eingefüllt Das AHF-Konzentrat, welches gereinigt werden soll, wird zu der Säule gegeben und schließlich mit einer Chloridpufferlösung, die eine Molarität von etwa 0,5 besitzt, eluiert.

Andere Methoden zur Reinigung der AHF-Konzentrate der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet gegenwärtig sein.

Die Herstellung, klinische Erprobung am Menschen und die Verwertbarkeit und die dabei erhaltenen Effekte der nicht nach Anspruch 3 gereinigten stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrate am Menschen sind

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vom Erfinder und Mitarbeitern in der Fachzeitschrift: »Journal of the American Medical Association« vorn 26. August 1968, Seiten 613-617 in der Arbeit mit dem Titel »A New High-Potency Glycine Precipitated Antihemophilie Factor (AHF) Concentrate« beschrieben worden.

Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung weiter. Auch ist die Erfindung nicht auf diese spezifischen Beispiele beschränkt, die lediglich zum Zwecke der Verdeutlichung und nicht zwecks Beschränkung angegeben sind. Alle Teile und Prozentangaben beziehen sich auf die Gewichtsbasis, es sei denn, daß eine andere spezifische Angabe erfolgt ist.

Beispiel 1

Ein stabiles Human-AHF-Konzentrat mit hoher Wirksamkeit wird durch die aufeinanderfolgende Fraktionierung des Humanblutplasmas hergestellt, zuerst durch Kältefällung und dann djch Polyäthylengiykol- und Glycinfällung in folgender Weise:

Reagenzien
Mit Citrat versetzte Salzlösung

Ein Teil 0,1 molares Natriumcitral auf vier Gewichtsteile 0,9% Salz.

Glycin mit Citrat versetzte Salzlösung

Das erforderliche Glycin wird zu der mit Citrat versetzten Salzlösung gegeben, um in bezug auf das Glycin eine 0,1 molare Lösung zu erhalten.

Gepuffertes Waschwassser

Zu destilliertem Wasser wird 1/100 Volumen gepufferte Citratlösung zugefügt, welche durch Einstellen 0,5 molaren Natriumeitrats mit 0,5 molarer Citronensäure auf pH 6,88 hergestellt worden ist.

Essigsäure

Man stellt 1,0 normale und 0,1 normale wäßrige Lösungen her.

Glycin

Man stellt eine 1,8 molare wäßrige Lösung her.
Arbeitsweise

Humanblutplasma wird tiefgekühlt (S 4° C) aus einem Spenderzentrum erhalten. Das Plasma wird in Pfaudlerkessel eingetaucht und auf einer Temperatur unter 4°C gehalten. Es wird im kontinuierlichen Fluß oder durch Einzelgefäßzentrifugierung zentrifugiert. Die erhaltene Kälteausfällung wird gesammelt und für weitere Fraktionierung gemäß der vorliegerden Erfindung verwendet.

Zu der Kälteausfällung wird Glycin- mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt. Die Menge beträgt ein Zehntel des Plasmavolumens, aus dem die Kälteausfällung stammt. Die Auflösung wird d'irch Mischen der Kälteausfällung einer warmen Umgebung (Raumtemperatur, aber nicht 30⁰C übersteigend) bewirkt.

Wenn die Kälteausfällung sich aufgelöst hat, kann diese, falls erforderlich, (in Abhängigkeit von der anwesenden Menge an roten Blutkörperchen und anwesenden denaturiertem Protein) durch weiteres Zentrifugieren und/oder Filtration geklärt werden.

Die aufgelöste Kältefällung wird dann auf pH 6,5 mit 0,1 normaler Essigsäure eingestellt.

Es wird Polyäthylenglykol 4000 zugefügt bis dessen

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65 Konzentration 3,5% beträgt Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert Das Oberstehende wird dekantiert und mit 0,1 normaler Natriumhydroxydlösung auf pH 6,88 eingestellt Es wird zusätzliches Polyäthylenglykol 4000 zu der Lösung zugefügt bis die Polyäthylenglykolkonzentration 10% erreicht Das Gemifch wird milde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und eine halbe Stunde bei 5000 Umdrehungen zentrifugiert Das Oberstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in kaltem Wasser (2° C) gewaschen. Das Schleuderwaschen wird durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minute bei einer Temperatur bei —4° C durchgeführt Das Oberstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst

Der wiederaufgelöste Niederschlag wird durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure auf pH 6,88 eingestellt. Durch geeignete Mittel (beispielsweise Benutzung eines Kühlschrankes oder Verwendung eines Isopropanol-Trockeneisbades) wird die Lösung auf eine Temperatur von 6 bis 10" C abgekühlt. Zu der gekühlten Lösung wird die erforderliche Menge 1,8 Molare Glycin gegeben, um die Lösung in bezug auf Glycin 1,2 molar zu erhalten. Die Mischung wird sanft 45 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von 2° C bis 10° C gerührt und dann im kontinuierlichen Fluß oder gefäßweise zentrifugiert Die sich ergebende Glycinausfällung wird gesammelt und vorsichtig gewaschen mit gepuffertem Wasser bei einer Temperatur zwischen 0⁰C bis 4° C.

Zu der Glycinausfällung wird mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt, die Menge beträgt ein Zwanzigstel des Plasmavolumens, dem die Glycinausfällung entstammt. Die Auflösung wird durch Mischen der Glycinausfällung und der mit Citrat versetzten Salzlösung in einer warmen Umgebung (Raumtemperatur aber nicht 30⁰C übersteigend) bewirkt.

Wenn sich die Glycinausfällung aufgelöst hat, wird es bevorzugt, die Lösung durch Zentrifugieren und/oder Filtration unter Verwendung eines 293 mm Milliporefilters (benutzte Membrane: 1,2 μίτι, 0,45 μπι und 0,3 μπι) zu klären. Das Konzentrat, nach diesem vorliegenden Beispiel hergestellt, besitzt eine über 30fache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens und die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist in weniger als einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteinmenge anwesend und zeigt einen gleichen Zahlenwert an AHF-Aktivität

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt einschließlich der zusätzlichen Reinigungsstufe der AHF-Fraktion mit ECTEO-LA-Celluloseharz in der folgenden Weise.

Reagenzien
ECTEOLA-Celluloseha-.-z

1. Man mitscht 60 g Natriumhydroxyd mit 150 ml Wasser.

2. Man läßt die Mischung abkühlen.

3. Man gibt 60 g Cellulose (Whatman Cellulose Pulver CF 11) in einen Becher und vermischt sorgfältig mit der vorstehend genannten Natriumhydroxydlösung.

4. Man läßt die Mischung über Nacht (12 Stunden) stehen.

5. Am nächsten Tage wird eine Lösung von 35 ml

Triäthanolamin und 60 ml Epichlorhydrin hergestellt. Man mischt gut unter einem Abzug.

6. Man gießt diese Lösung schnell zu der vorstehend genannten Cellulose und durchmischt gut. Das Reaktionsgefäß wird aus der Zugrichtung genommen. (Die Reaktion ist exotherm und die Temperatur steigt auf £twa 100⁰C. Das Gemisch wird braun in ein bis zwei Stunden.

7. Man kühlt das Gemisch auf Raumtemperatur unter dem Abzug.

8. In kleinen Anteilen gibt man 350 ml 2 molare Kochsalzlösung zu.

9. Diese Mischung wird durch ein grobkörnig gesintertes Glasfilter filtriert.

10. Der Niederschlag wird zweimal mit 500 ml 1 N Natriumhydroxydlösung gewaschen. (Dies entfernt die starke Verfärbung).

11. Man suspendiert den Niederschlag in 350 ml 1 N Salzsäure in der Filternutsche. Man legt Vakuum an.

12. Man wiederholt Stufe 11 mit 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung.

13. Man wiederholt die Stufe 11 mit 250ml IN Salzsäure.

14. Man wiederholt Stufe 11 mit 250 ml 1 N Natriumhydroxylösung.

15. Man füllt den Niederschlag in einen 3 Literbecher.

16. Man fügt 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung zu und mischt.

17. Man fügt destilliertes Wasser zu der Mischung, um den Becher zu füllen; man mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.

18. Man dekantiert das Überstehende.

19. Man setzt Wasser zu dem Niederschlag, um den Becher zu füllen und mischt.

20. Man wäscht die Mischung auf dem Filter mit Wasser (vier Liter oder mehr, bis ein negativer Test für Alkali mit l°/oiger alkoholischer Phenolphthaleinlösung erhalten wird).

21. Man führt eine Schlußwaschung mit zwei 250 ml Portionen absoluten Alkohols durch.

22. Man breitet das Produkt auf Filterpapier aus. Man zerdrückt und breitet das Produkt aus, um es über Nacht zu trocknen.

Chloridpuffer:

0,80/0 NaCl (8 g/L)

0.02MImidazol(l,36g/L)

Man stellt auf pH 6,9 mit 1 N Salzsäure ein.

Eluierpuffer:
0.5 M NaCl

0.02 M Imidazol(l,36 g/L)
Man stellt auf pH 6,9 mit 1 N Salzsäure ein.

Ein im Handel erhältliches ECTEOLA-Celluloseharz, welches erst mit NaOH behandelt worden und ausgewaschen worden ist, beispielsweise wie in der folgenden Weise, kann an Stelle des vorstehend hergestellten ECTEOLA-Celluloseharzes verwendet werden.

Auswaschungscyclus von im Handel erhältlichem ECTEOLA-Celluloseharz:

1. Man mischt 60 g handelsübliches ECTEOLA-Celluloseharz mit 350 ml 2 M Kochsalzlösung.

2. Man filtriert dieses Gemisch durch ein grobkörniges gesintertes Glasfilter.

3. Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 ml 1 N Natriumhydroxydlösung.

4. Man wäscht einmal mit 350 ml 1 N Salzsäure.

5. Man wäscht einmal mit 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung.

6. Man wäscht einmal mit 250 ml 1 N Salzsäure.

7. Man wäscht einmal mit 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung.

8. Man überführt den Niederschlag in einen 3 !θ Literbecher, fügt 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung zu und mischt.

9. Man fügt destilliertes Wasser zu dem Gemisch, um den Becher zu füllen, mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.

10. Man dekantiert die Flüssigkeit ab, fügt 3 Liter Wasser zum Niederschlag, mischt und filtriert.

11. Man wäscht den Niederschlag mit Wasser bis der Phenophthaleintest negativ ist.

12. Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 ml absolutem Äthylalkohol.

13. Man breitet den Niederschlag zur Lufttrocknung auf Filterpapier aus.

Das ECTEOLA-Celluloseharz wird über Nacht (12 Stunden) in einem 5°C Schrank im Gemisch mit Chloridpuffer im Verhältnis 15 g Harz zu 600 ml Puffer behandelt. Der erhaltene Harzbrei wird in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,54 cm bis 3,81 cm Durchmesser und 45,72 cm Höhe eingefüllt. Nachdem der Puffer sich bis zu dem Spiegel des Harzes abgesenkt hat, wird die AHF-Fraktion auf 2'/2 ml pro Minute eingestellt und die Menge der AHF-Fraktion, die zu einer Einzelsäule gegeben wird, enthält 1000 bis 2500 Einheiten AHF. (Eine Einheit AHF entspricht der AHF-Aktivität in einem cm³ des normalen Humanblutplasmas). Nachdem das AHF in die Säule gegeben worden ist, wird das Harz mit 200 bis 500 ml Chloridpuffer ausgewaschen. Wenn der Chloridpuffer bis zu dem Spiegel des Harzes sich abgesenkt hat, wird der Eluierpuffer in die Säule gegeben. Das Eluat wird in Zehn-ml-Portionen gesammelt und auf Protein-Fibrogen- und AHF-Aktivität geprüft

Die F.luatteile, die die größte wirksame AHF-Aktivität besitzen, werden zurückbehalten und durch die Zugabe von 1% Albumin stabilisiert Die stabilisierte Lösung wird dann unter Benutzung eines 293 mm Milliporefilters, wie im Beispiel 1 beschrieben, filtriert. Ein Silberfilter der gleichen Größe kann anstelle des Milliporefilters benutzt werden. Das endgültige flüssige Produkt wird dann verschlossen eingefroren und dann in einem Schnellgefrieren noch mindestens 3 Stunden aufbewahrt und unter gewöhnlichen Kühlbedingungen in der Art des Endproduktes gemäß Beispiel 1 aufbewahrt

Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt und zwar bis .zu der Arbeitsstufe, bei der die sich ergebende Glycinausfällung in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst wird. Die aufgelöste Glycinausfällung wird auf pH 63 durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure eingestellt Es wird Polyäthylenglykol 4000 zugefügt bis dessen Konzentration 3,5% beträgt Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert Das Überstehende wird dekantiert und mit 0,1 normaler Natriumhydroxydlösung auf pH 6,88 eingestellt Es wird zusätzliches Polyäthylenglykol 4000 zu der Lösung zugefügt bis die Polyäthylenglykolkonzen-

tration 10% erreicht Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und eine halbe Stunde bei 500 Umdrehungen zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in kaltem Wasser (2⁰C) gewaschen. Das Schleuderwaschen wird durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minute bei einer Temperatur bei -4°C durchgeführt. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst.

Der wiederaufgelöüte Niederschlag wird durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure auf pH 6,88 eingestellt und dann mit Glycin gemäß dem Arbeitsverfahren des Beispiels 1 ausgefällt. Die Glycinausfällung

wird gewaschen und geklärt und dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, eingefroren.

Das AHF-Konzentrat, hergestellt nach dem Verfahren dieses Beispiels, enthält weniger als 0,05% (allgemein um etwa 0,01%) zurückgebliebenes PoIyäthylenglykol.

Das Konzentrat, nach diesem vorliegenden Beispiel hergestellt, besitzt eine über 30fache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens und die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist in weniger als einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteinmenge anwesend und zeigt einen gleichen Zahlenwert an AHF-Aktivität.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrates, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kältefällungskonzentrat aus Human- oder Tier-AHF in zwei aufeinanderfolgenden Stufen durch Ausfällung mit Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 20 000 fraktioniert, wobei in der ersten Stufe mit 3 bis 4 Gew.-°/o Polyäthylenglykol, bezogen auf das Kältefällungskonzentrat des AHF, in der zweiten Stufe mit 10Gew.-°/o Polyäthylenglykol bezogen auf das Oberstehende versetzt wird, wonach man die sich ergebende Ausfällung abtrennt und nach Wiederauflösen die weitere Fraktionierung mit einer wässerigen Glycinlösung mit einer Molarität von 1,8 und nachfolgender Isolierung der Ausfällung durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reinigungsstufe unter Verwendung von triäthanolaminoäthyliertem Celluloseharz anschließt.

3. Mittel zur Behandlung der Hämophilie bei Mensch und Tier, enthaltend als Wirkstoff das nach Anspruch 1 oder Anspruch 1 und 2 hergestellte AHF-Konzentrat.