-Verfahren zur Enzymbest: Die Erfindung betrifft e- .n Verfahren
zur Enzymbestimmung' das insbesondere für quantitative kolorimetrische Bestimmungen
von Leucinaminopeptidase im Blutplasma und Blutaerat1 geeignet. ist o verfahren
zur quantitativen Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Leucinaminopeptidase
(LAP) sind bekannt.. Für diese bekannten Verfahren wird als spezifisches
Sub-.etrat Leucinemid verwendet. Es wurden mehrere Nachweisverfahren verwendet Das
von der LAP a us dem Leuainamid freigesetzte Leuoin kann quantitativ durch Bestimmung
der Carbo=ylgruppen bezw, der basischen Gruppen auf - titrime.-trisohem Wege bestimmt
werden,, Mittels aufsteigender Papierohromatographie wird das durch die Enzymeinwirkung
freigesetzte Leuoin vom Leuoingmid getrennt, das Le ua in mit ii.nhyd r in z u einem
Farbstoff umgesetzt, der nach der Stabilisierung mit Cu+± Ionen kolorimetriert wird"
Weiterhin kann der duxeh das Enzym aus dem LeucHamid frei.- , gesetzte Ammoniak
durch Boxsäure chemisch gebunden und anschließend durch Säure titriert werden" -Der
durch das Enzym bewirkte Zuwachs an Aminoatickstoff kann mittels der Ninhydrinnethode
gemessen werden.
Außerdem sind noch mehrere Verfahren zur Bestimmung der LAP
mit chromogenen Substraten bekannt. Das aus Leuoinp-nitroanilid durch hAP freigesetzte
p-Nitroanilin kann auf Grund einer gelben Farbe direkt photometriert werden, Das
aus Leuoin-ß-naphthylamid durch LAP freigesetzte 8-Näphthylamin kann reit einem
Diazoniumsalz umgesetzt und der entstehende Farbstoff kolorimetrisoh bestimmt werden.
Diese
bekannten Verfahren weisen mehrere Nachteile auf. Neben einer umständlichen Arbeitsweise!
eine. hohen Zeitaufwänd, und ungenügender Empfindlichkeit beispielsweise bei den
Nachweisverfahren mit Leacinamid, sind diese Verfahren für den Routinebetrieb auch
ungeeignet. Außerdem Zeigen die Nachweisverfahren mit chromogenen -Sabetra'ten eine
ungenügende Spezifität, da p-Nitroanä.-l.dtu@d- ß-Naphthylamide vorwiegend oder
aiMaohließlieh durch' Al#,pWUUre-Aryl-amidase- hydrolysiert werden, $Wdok, ee2 Ert@ndung
ist es, eine Bestimungemethede für UP ZL twAkeln, die besonders als empfindliche
Nachweemethode .zur klinischen Diagnostik von Leberparenohymschäden im Routinebetrieb
geeignet ist. Method for enzyme test: The invention relates to a method for enzyme determination which is particularly suitable for quantitative colorimetric determinations of leucine aminopeptidase in blood plasma and blood aerate. is o methods for the quantitative determination of the enzymatic activity of leucine aminopeptidase (LAP) are known. For these known methods , leucinemide is used as a specific sub-.etrat. Several detection methods were used. The leuoin released by the LAP from the leuainamide can be determined quantitatively by determining the carbo = yl groups or the basic groups in a titrime-tri-way manner Leuoingmid separated, the Le inter alia in with ii.nhyd r in converted to a dye, which is colorimetrised after the stabilization with Cu + ± ions titrated by acid "-The increase in amino nitrogen caused by the enzyme can be measured by means of the ninhydrin method. In addition, several methods for determining LAP with chromogenic substrates are known. The p-nitroaniline released from leuoinp-nitroanilide by hAP can be directly photometry due to its yellow color. The 8-naphthylamine released from leuoin-ß-naphthylamide by LAP can be reacted with a diazonium salt and the resulting dye can be determined by colorimetry. These known methods have several disadvantages. In addition to a cumbersome way of working! one. time consuming and insufficient sensitivity, for example in the detection method with leacinamide, these methods are also unsuitable for routine operation. In addition, the detection methods with chromogenic -sabutants show insufficient specificity, since p- nitroanä.-l.dtu@d- ß-naphthylamides are predominantly or mainly hydrolyzed by 'Al #, pWUUre-aryl amidase-, $ Wdok, ee2 The aim is to develop a determination method for UP ZL, which is particularly suitable as a sensitive detection method for the clinical diagnosis of liver parenohymal damage in routine operation.
Der- Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Substrat zu finden,
das für die LAP spezifisch ist und dessen Spaltprodukte einfach.und schnell bei
großer Empfindlichkeit der Nac@iweiereahtion zu bestimmen sind.The invention is based on the object of finding a substrate
that is specific to the LAP and its cleavage products easily and quickly
high sensitivity of the reaction reaction are to be determined.
Es wurde gefunden, daß die LAP in der Lage ist, L-Leuainhydrazid zu
L-Leuain und Hydramin hydrolytisch zu_ spalten in. gleicher Stärke, gleicher Spezifität
und unter gleichen Bedingungen wie das bekannte als spezifisehe Substrat für ZAP
verwendete L-Leaoinamid. Z'ss erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzGiehnet,
daß das Untersuchungsmaterial, in dem LAP nachgewiesen werden soll, mit DL-Leucinhydrazid
versetzt wird und das durch die LAP hydrolytisch abgespaltene Hydrazin mit einem
aromatischen Aldehyd, vorzugsweise p-Dimethyl--, . aminobenzaldehyd, zu einem gelben
Farbstoff umgesetzt wird, .. Die- üjdxol.yse des DL--Zeueinhydrazide durch die LAP
wird . je nach Inkubationsbedingungen bei einem pH-Wert zwisehen 9,o bis 1o,2 durchgeführt.
Gleichzeitig mit der ltupplung des durch die LAP aus dem DZ--Leuoinhydrazid
freigesetzten
Hydrazins mit beispielsweise p-Dimethylaminobenzaldehyd wird die Lös- _; auf einen
PH ufert unter 7 eingestellt, so daß sich aus dem durtlh Kondensation gebildeten
gelben Farbstoff ein orangerotes Farbsalz bildet:, Dieses Farbsalz hat einen hohen
molaren Abso rptionskoeffizient, so daß die Empfindlichkeit des Nachweises von LAP
gegenüber den bekannten Verfahren erheblich gesteigert iste Durch das Ansäuern der
Lcs ung wird die enzymatische Reaktion gleichzeitig unterbxochen.It was found that the LAP is able to deliver L-leucaine hydrazide
L-Leuain and hydramine hydrolytically split with the same strength, the same specificity
and under the same conditions as the known as a specific substrate for ZAP
used L-leaoinamide. Z's method according to the invention is characterized in that
that the test material in which LAP is to be detected with DL-leucine hydrazide
is added and the hydrazine hydrolytically split off by the LAP with a
aromatic aldehyde, preferably p-dimethyl--,. aminobenzaldehyde, to a yellow
Dye is converted .. Die- üjdxol.yse des DL - Zeueinhydrazide by the LAP
will . carried out at a pH between 9, o and 10, 2 depending on the incubation conditions.
Simultaneously with the coupling of the by the LAP from the DZ - Leuoinhydrazid
released
Hydrazine with, for example, p-dimethylaminobenzaldehyde is the solution _; on one
PH ufert set below 7, so that condensation formed from the durtlh
yellow dye forms an orange-red color salt :, This color salt has a high
molar absorption coefficient, so that the sensitivity of the detection of LAP
compared to the known process is considerably increased by acidifying the
The solution will stop the enzymatic reaction at the same time.
Die Extinktion des der der LAP proportionalen Menge en
Farbsalz
wird dann anschließend am Absorptionsmaximum von 455 nm gemessen Durch das erfindungegemäßc
Nachweß.everfahren ist man in der Zage, die LAP im Blutserum oder Blutplasma schnell
und quantitativ zu bestimmen, Außerdem hat die erfindungsgemäße Nachweisreaktion
gegenüber den bekannten Nachweisverfahren den Vorteil., daß sie äußerst spezifisch
ist und eine .hohe Eri"afindlichkeit aufweist. Die Erfindung soll nachsterend an.
zwei Ausführungsbeispielen näher erläutert i,,#rerden: Arbeitsweise 1@. Methode
ohne zusätzliche Aktivierung 0 ,,5 ml @ubstra @.-.pufz"cr-.Lös ung (aus 4 Teilen
0e2 M Nonoäthanolamin..,l'uff er von PH 1 o e 15 und 1 Teil ä 9 T mhI wässriger
Leucinhydrazid-Lösung) werden auf 25o C temperiert und mit 0,2 ml Serum oder Enzymlösung
eine bastimm+~ .alt... (für Serum 6o Min.) irrkubiert, 5 ml Farbreagens, bestehend
aus 1 Teil einer Lösung . von 4 g p--Dimethylaminobenzaldehyd in Zoo ml 96%igem
Äthanol oder Methanol und 17 Teilen 0p1 N Salzeäure$ werden zugegeben und nach 3o
Min".Farbentwieklung werden die Ansät,@e bei 455 nm gegen das Farbreagens gemessene
Ein Leerwert w-Ard analog behandelt, nur
erfolgt die Zugabc der
vexivandeten-..Enzymlös ung Grat nach der Zugabe des.. Reagena@ 2. Mathoda
mit Mg24 --Aktivierung 0,3 -M1. Puffer--Aktivator-Lös un-'_ (aus 5 @@on
0925 M Monoäthanoa.amin-Puffcr von pH 9$25 und 1 Teil 4o mM MgC12 .-Lösung)
worden mit 0!1 ml Serum oder. En.zyrnlösung 2 Stunden bei 250C pr äinkubiezt. Danaßh
werden 0,1 m:l So mM wässriger Leucinhydrazid-Lösungzugegeben - und
30 Müh. bei 250C inkubiert. -läch Zugabe von 4,5
ml Farbreagens erfolgt
die Farbentwicklung Land Messung wie unter 1, bcsehricbeno Ein Leerwert wird analog
behandcit! nur erfolgt die Zugabe der Enzymlbsung . Erst nach der Zugabo des FalbrcagenasThe absorbance of the LAP proportional quantity en dye salt is then subsequently measured at the absorption maximum of 455 nm by the erfindungegemäßc Nachweß.everfahren one is Zage to determine the LAP in the blood serum or blood plasma rapidly and quantitatively, Moreover, the detection reaction according to the invention against the known detection methods have the advantage that they are extremely specific and have a high level of sensitivity. The invention is to be explained in more detail below using two exemplary embodiments: Method of operation 1 @. Method without additional activation 0 ,, 5 ml @ ubstra @ .-. pufz "cr solution (from 4 parts of 0e2 M nonoethanolamine .., l'uff er of PH 1 oe 15 and 1 part of 9 T mhI aqueous leucine hydrazide solution) are heated to 25o C and with 0.2 ml serum or enzyme solution a bastimm + ~ .alt ... (for serum 60 min.) Incubated, 5 ml color reagent, consisting of 1 part of a solution. of 4 g of p-dimethylaminobenzaldehyde in zoo ml of 96% ethanol or methanol and 17 parts of 0p1 N hydrochloric acid are added and after 30 min Treated analogously, except that the vexivandeten - .. enzyme solution is added after the addition of the .. Reagena @ 2. Mathoda with Mg24 -activation 0.3 -M1. buffer - activator solution -'_ (from 5 @@ on 0925 m-Monoäthanoa.amin Puffcr of pH 9 $ 25 and 1 part 4o mM MgC12 solution.) was 0 with 1 ml serum or En.zyrnlösung äinkubiezt 2 hours at 250C pr Danaßh be 0, 1 m!..: 1 So mM aqueous leucine hydrazide solution is added - and incubated for 30 minutes at 250 ° C. - After adding 4.5 ml of color reagent, the color develops. Measurement as under 1, bcsehricbeno A blank value is treated analogously! the addition of Falbrcagenas