DE1622996C3 - Gefriergerät für ein Mikrotom - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Gefriergerät für ein Mikrotom, mit einem wärmeisolierten Gehäuse, das eine einen Messerhalter mit einer Klemmvorrichtung zum Befestigen des Messers sowie einen Objekthalter enthaltende Kammer bildet, und wenigstens einer in die Kammer führenden Zuführleitung zur Einführung eines Kühlmittels.

Ultramikrotome werden im großen Maße dazu benutzt, extrem dünne Schnitte eines Objekts herzustellen, die in einem Elektronenmikroskop untersucht werden. Die mit diesen Mikrotomen herstellbaren Schnitte eines Objekts weisen eine Dicke in der Größenordnung von etwa 100 Angström-Einheiten auf. Die Schnitte entstehen durch die Relativbewegung von zwei Bauteilen, von denen das eine den Halter für das Mikrotommesser trägt. Das Mikrotommesser kann aus einem Glasblock mit einem keilförmigen Abschnitt bestehen, der in einer extrem scharfen Schneidkante endet, oder aber aus einer diamantbesetzten Schneidfläche extremer Schärfe. Die Schnitte gleiten von der Messerkante in eine geeignete Flüssigkeit, die sich in einem hinter der Schneidkante des Messers angeordneten Gefäß befindet. Der Schneidvorgang wird vorzugsweise so durchgeführt, daß der Messerhalter festgehalten und der Objekthalter bzw. das den Objekthalter aufnehmende Bauteil auf einer D-förmigen Bahn geführt wird, auf der der Schneidvorgang während der Bewegung des Objekts auf dem gradlinigen Abschnitt des D erfolgt.

Um brauchbare, extrem dünne Schnitte zu erhalten, ist es erforderlich, daß das Objekt während des Schneidvorgangs vollkommen starr oder steif ist. Um

das zu erreichen, ist es bisher üblich, das Objekt zu präparieren und es in einen geeigneten polymeren Stoff einzubetten. Nachteile dieses bekannten Verfahrens bestehen darin, daß durch das Eindringen des Einbettungsmaterials in dem zu schneidenden Gewebe Artefakte gebildet werden können. Außerdem ist vor dem Schneiden ein langwieriges Präparieren erforderlich.

Frühere Versuche haben gezeigt, daß es möglich ist, die Härtung des Objekts durch zeitweise Abkühlung unter die Einfriertemperatur zu erreichen. Diese Temperatur ist natürlich von Objekt zu Objekt verschieden.

Beim Schneiden eines gefrorenen Objekts steht dieses in ständiger Berührung mit der Luft, und es ist unvermeidbar, daß sich in der Luft enthaltener Wasserdampf auf der Oberfläche des Objekts niederschlägt und zur Bildung von Eiskristallen führt. Diese Eiskristalle können Flüssigkeit aus dem hinter der Schneidkante angeordneten Gefäß an die Schneidkanten des Messers ziehen. Diese Flüssigkeit wirkt dann als ein Schmiermittel zwischen dem Objekt und dem Messer. In einem solchen Fall können extrem dünne Schnitte nicht erzielt werden, da das Messer dazu neigt, über die zu schneidende Fläche des Objektes zu gleiten, so daß es keine Schnitte abtrennt.

Es ist zwar bekannt, das Schnittobjekt innerhalb einer Kältekammer auf einem fest in dem Mikrotom verbundenen Gefriertisch anzufrieren. Auch wurde bereits vorgeschlagen, bei einer derartigen Einrichtung die Temperatur des Schnittobjektes unterhalb derjenigen der Kältekammer zu halten (deutsche Auslegeschrift 1 234 045). Beide Verfahren bzw. die Einrichtungen zur Durchführung dieser Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß einmal keines der üblichen, mit Vorrichtungen zur Aufnahme des Messerhalters und des Objekthalters versehenen Ultramikrotome verwendet werden kann. Vielmehr muß das Mikrotom von vornherein speziell für die Gefriermikrotomie konstruiert sein. Zum anderen bieten die bekannten Vorrichtungen zwar die Möglichkeit, die Temperatur des Schnittobjekts zu variieren, so daß Objekte mit verschiedenen Einfriertemperaturen jeweils auf einen bestimmten Wert unter die Einfriertemperatur gekühlt werden können. Es ist aber keine Möglichkeit vorgesehen, auch die Temperatur des Messers in entsprechender Weise zu regeln. Die Temperatur des Messers sollte aber stets um einen gewissen Betrag unter der Temperatur des Schnittobjekts liegen, damit die beim Schnitt entstehende Wärme durch das Schnittmesser abgeführt werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein in Verbindung mit einem Mikrotom verwendbares Gefriergerät zu schaffen, bei dem eine Eiskristallbildung dadurch verhindert wird, daß während des Schneidvorganges keine feuchte Luft mit dem Objekt in Berührung kommen kann. Mit dem Gefriergerät, das an üblichen Ultramikrotomen, die mit Bauteilen zur Aufnahme des Messer- und Objekthalters ausgestattet sind, ohne weiteres verwendbar sein soll, soll es dabei möglich sein, die Temperatur des Messerhalters und des Objekthalters unabhängig voneinander kontinuierlich und genau bis auf einen Wert von -150° C zu regeln.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Gefriergerät der eingangs genannten Gattung gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das wärmeisolierte Gehäuse durch einen sonst den üblichen Messerhalter tragenden Bauteil des Mikrotoms gehalten ist; daß der Messerhalter am Gehäuse befestigt ist und der Objekthalter einen durch eine Wand des Gehäuses hindurchführenden, außerhalb des Gehäuses mit dem üblichen Objektaufnehmer verbundenen Zapfen aufweist; daß in der vom Zapfen durchdrungenen Wand des Gehäuses eine die Kammer nach außen abdichtende Einrichtung vorgesehen ist, die eine die Schneidbewegung des Objekthalters in bezug auf den Messerhalter bewirkende Bewegung des Zapfens zuläßt; und daß eine Einrichtung zur Temperaturregelung des Messer- und Objekthalters sowie wenigstens eine Abzugsöffnung aus der abgedichteten, von dem Gehäuse gebildeten Kammer vorgesehen ist.

Als trockenes, relativ inertes, gasförmiges oder flüssiges Kühlmittel eignet sich beispielsweise Stickstoff in gasförmigem oder flüssigem Zustand. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Gefriergerätes liegt darin, daß bei seiner Anwendung extrem dünne Schnitte ohne die üblichen, durch das Präparieren und Einbetten hervorgerufenen Gewebeveränderungen ausgeführt werden können. Dieser Vorteil wird dadurch erreicht, daß bei dem erfindungsgemäßen Gefriergerät der Schneidvorgang in einer absolut trockenen Atmosphäre erfolgt, da das trockene Gas in der von dem Gehäuse gebildeten Kammer die Luft mit der darin enthaltenen Feuchtigkeit verdrängt. Auf dem Objekt können sich daher keine Eiskristalle bilden.

Weiterhin ist es, im Gegensatz zu der Kühlvorrichtung nach der deutschen Auslegeschrift 1 234 045, bei der die Probe, der Probenhalter, das Messer und andere funktionell Komponenten durch bloßen Kontakt mit der in der Kammer befindlichen Atmosphäre auf höchstens — 30° C gekühlt werden können, beim erfindungsgemäßen Gefriergerät möglich, sowohl das Messer als auch den Objekthalter unabhängig voneinander auf sehr tiefe Temperaturen zu kühlen, wobei über den gesamten Abkühlbereich die einzelnen Temperaturen des Messers sowie des Objekthalters unabhängig voneinander genau gesteuert werden können. Das Messer kann infolge der unabhängigen Kühlung stärker gekühlt werden als der Objekthalter, so daß die beim Schneidvorgang erzeugte Wärme abgeführt werden kann und das Messer sowie der Objekthalter auf derselben Temperatur bleiben.

Außerdem bietet das erfindungsgemäße Gefriergerät die Möglichkeit, auch ein ursprünglich nicht als Gefriermikrotom ausgelegtes Ultramikrotom ohne komplizierte Umbauarbeiten zum Gefrierschneiden zu verwenden. Zwar ist durch die Leitz-Liste 530-8d, S. 6 bis 8, 15, bereits eine unabhängige Messer- und Objekthalterkühlung bekanntgeworden, welche die Umwandlung eines üblichen Mikrotoms in ein Gefriermikrotom gestattet, jedoch handelt es sich dabei nicht um ein Ultramikrotom. Das Messer und der Objekthalter können bei der dort beschriebenen Vorrichtung zwar wahlweise gekühlt werden, jedoch sind sie beide der umgebenden Atmosphäre ausgesetzt, so daß es unmöglich ist, diese Komponenten in der erfindungsgemäß vorgesehenen Weise auf sehr tiefe Temperaturen, als etwa —150° C, herunterzukühlen. Die bekannte Vorrichtung bietet keine Möglichkeit, entweder das Messer oder den Objekthalter

zuverlässig auf einer festen, stark von der Umgebungstemperatur verschiedenen Temperatur zu halten, wie es mit der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Kühleinrichtung möglich ist. Das in der Leitz-Druckschrift beschriebene Mikrotom weist auch bei Verwendung als Gefriermikrotom ebenso wie das Mikrotom nach der bereits erörterten deutschen Auslegeschrift 1 234 045 lediglich eine Kühleinrichtung auf, welche das Schneiden von Proben bei Temperaturen ermöglicht, die nur wenig unterhalb der Temperatur der normalen Umgebungsluft liegen. Weder bei der Vorrichtung nach der deutschen Auslegeschrift 1 234 045 noch bei dem Mikrotom nach der Leitz-Liste ist eine Vorrichtung vorgesehen, welche die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe löst, nämlich reproduzierbar Schnitte bei konstanter, bestimmter Dicke von einem Objekt zu schneiden, welches auf einer extrem niedrigen Temperatur von bis zu —150° C gehalten wird. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß die Einrichtung zur Temperaturregelung des Messer- und Objekthalters eine elektrische Widerstandsheizvorrichtung aufweist. Dabei kann es vorgesehen sein, daß sowohl dem Messer- als auch dem Objekthalter ein den der Widerstandsheizvorrichtung zugeführten Stromzufluß regelndes Thermometer zugeordnet ist. Durch diese Temperaturregelvorrichtung wird ein Abfallen der Temperatur unter einen vorbestimmten Wert verhindert.

Weiterhin kann es erfindungsgemäß vorgesehen sein, daß die Einrichtung zur Temperaturregelung des Messerhalters einen Trog aufweist, der unterhalb der Auslaßöffnung der Zuführleitung angeordnet ist. Außerdem kann die Einrichtung zur Temperaturregelung des Objekthalters einen offenen Trog aufweisen, der unter dem Auslaß der Zuführleitung angeordnet ist. In beiden Fällen nehmen die Tröge durch die jeweilige Zuführleitung zugeführtes flüssiges Kühlmittel auf.

Ist der Objekthalter an einem einen Teil eines Objektträgers bildenden Befestigungsstück angebracht, wobei der Trog aus einem mit dem Objekthalter verbundenen, ebenfalls einen Teil des Objektträgers bildenden Behälter besteht, der mit Spiel in das Befestigungsstück eingesetzt ist, so kann sich der Behälter in bezug auf das Befestigungsstück ausdehnen und zusammenziehen.

Wird flüssiger Stickstoff als Kühlmittel verwendet, so können sowohl der Objekthalter als auch der Messerhalter auf sehr niedrige Temperaturen abgekühlt werden. Mit Hilfe der Heizvorrichtungen kann jede Temperatur zwischen 0 und — 150° C eingestellt werden, so daß auf diese Weise die jedem speziellen Objekt angemessene Temperatur gewählt werden kann. Der Schneidvorgang findet in einer wärmeisolierten Kammer statt, die von Umgebungseinflüssen praktisch nicht beeinflußt wird.

Im folgenden Teil der Beschreibung wird ein Ausführungsbeispiel des Gerätes an Hand von Zeichnungen beschrieben. Es zeigt

F i g. 1 eine perspektivische Ansicht des Gefriergeräts,

F i g. 2 eine senkrecht verlaufende Schnittansicht dieses Geräts und

F i g. 3 eine Schnittansicht eines Teils des Gefriergeräts nach der Linie III - III in F i g. 2.

Das Gefriergerät ist zum Einbau in ein Ultramikroton bestimmt, das ein erstes, aus einer waagerechten mit einer Nut versehenen Platte bestehendes Bauteil aufweist, wobei in die Nut ein üblicher, das Messer des Mikrotoms tragender Messerhalter oder Messerblock eingesetzt wird. Oberhalb dieser Platte ist ein zweites, einen Objektaufnehmer aufweisendes Bauteil angeordnet, welches in das Innere des Mikrotoms vorsteht. Der Objektaufnehmer beschreibt bei seiner Bewegung eine D-förmige Bahn. Mit dem Objektaufnehmer ist ein Objekthalter in der Weise vero bunden, daß während des Betriebs des Mikrotoms die Oberfläche, von der die Schnitte anzufertigen sind, auf dem geraden Abschnitt der D-förmigen Bahn über die feststehende Messerkante nach unten gedrückt wird. Anschließend bewegt sich das Objekt auf dem gebogenen Abschnitt der D-förmigen Bahn ohne Berührung mit dem Messer nach oben. Während der Aufwärtsbewegung wird das Objekt um einen vorher bestimmten Betrag vorgerückt.

Bei Benutzung des Gefriergeräts werden sowohl der übliche Messerblock als auch der übliche Objekthalter vom Mikrotom entfernt.

Das Gefriergerät weist ein Kunststoffgehäuse 10 Γ~ mit einer an seiner Unterseite angeformten Rippe 12 ■ auf, mit der das Gehäuse 10 an Stelle des üblichen

»5 Messerblocks an der Mikrotomplatte befestigt wird. Die Rippe 12 ist so ausgebildet, daß sie in die Nut paßt, die normalerweise vom Messerblock besetzt ist. Auf der Mikrotomplatte ist eine Klemmschraube vorgesehen, die im angezogenen Zustand die Rippe 12 in der Nut festhält und auf diese Weise das Kunststoffgehäuse 10 an der Mikrotomplatte sichert. Das Kunststoffgehäuse 10 bildet eine Kammer, in der der Schneidvorgang stattfindet. Das Kunststoffgehäuse 10 weist aus durchsichtigen Plastikscheiben hergestellte Wände auf. Diese Wände isolieren die Kammer thermisch gegenüber der umgebenden Atmosphäre, so daß der Schneidvorgang innerhalb der Kammer bei niedrigen Temperaturen vorgenommen werden kann, ohne daß dabei auf der Außenseite des Gehäuses eine größere Menge von Kondensat niedergeschlagen wird. Dadurch kann der Schneidevorgang zu jeder Zeit genau beobachtet werden.

Das trotzdem anfallende Kondensat wird mit einer mit der Rippe 12 (Fig. 2) verbundenen Tropfrinne 14 unterhalb der Kammer gesammelt. Der Behälter wird von einem abnehmbaren Deckel 16 abgeschlossen, der an den oberen Kanten der Gehäusewände an einer Dichtung 17 anliegt. Es sind geeignete, nicht gezeigte lösbare Befestigungseinrichtungen vorgesehen, die den Deckel in seiner Stellung halten. Der Deckel weist ein Fenster 18 aus transparentem Material auf, in dem ein elektrischer Widerstandsheizdraht 20 eingebettet ist. Das Aufheizen des Fensters 18 vermeidet eine Kondensation an diesem Fenster, so daß es klar durchsichtig bleibt und die Beobachtung des Schneidevorgangs durch ein Stereomikroskop gestattet.

In der Kammer ist ein Objektträger 22 angeordnet, der einen in einer Muffe 24 gehaltenen Objektträger23 aufweist. Die Muffe 24 ist an einem einen Trog 28 bildenden Aluminiumbehälter 25 vorgesehen. Dieser Behälter 25 ist mit Spiel in eine in einem blockförmigen Teil eines Befestigungsstückes 34 vorgesehene Ausnehmung 30 eingesetzt. Das Befestigungsstück 34 besteht aus isolierendem Material. Der Behälter 25 ist mit seiner einen Wand an einer Seitenwand 32 der Ausnehmung 30 befestigt. Das Spiel zwischen dem Behälter 25 und der Ausnehmung 30

ermöglicht es, daß sich der Behälter in bezug auf das Befestigungsstück 34 frei ausdehnen und zusammenziehen kann. Das Befestigungsstück weist einen Zapfen 36 auf, der sich durch eine in einer Wand des Gehäuses 10 vorgesehene, im übrigen mittels eines flexiblen Kragens oder eines Diaphragmas 38 aus Polyäthylen oder Silikon-Gummi abgeschlossene öffnung 37 hindurcherstreckt und bis zum Objektaufnehmer des Mikrotoms reicht. Der Zapfen 36 ist in einer Fassung des Objektaufnehmers an Stelle des üblichen Objekthalters angeordnet und mittels einer Klemmschraube befestigt. Der flexible Kragen 38 ist so nachgiebig, daß der Objektaufnehmer den Objektträger 22 mit dem daran befestigten Objekthalter 24 beim Schneiden auf der D-förmigen Bahn bewegen kann. Mit dem Innenrand sitzt der Kragen 38 dicht auf dem Zapfen 36 auf, während sein Außenrand mit dem Umfang der öffnung 37 dichtend verbunden ist.

Ein Platin-Widerstandsthermometer 31 und eine elektrische Widerstandsheizvorrichtung 34' sind in der Ausnehmung 30 außerhalb des Behälters 25, aber in gutem Wärmekontakt mit diesem angeordnet und stehen mit an dem Zapfen 36 vorgesehenen Kontaktstiften 39 in Verbindung, die in entsprechende Buchsen im Sockel des den Zapfen 36 tragenden Objektaufnehmers eingreifen. Aus Gründen der besseren Darstellbarkeit sind das Thermometer 31 und die Widerstandsheizvorrichtung 34' in der Zeichnung ein wenig von dem Behälter 25 weggerückt.

In der Kammer ist am Boden des Gehäuses ein Messerhalter angeordnet, der einen Aluminiumblock 42 aufweist. Dieser Block ist mit einer Ausnehmung oder Fassung 44 versehen, in die eine das eigentliche Messer 48 tragende Klemmvorrichtung 46 aus Metall eingesetzt ist. An der Seite der Fassung ist eine nicht gezeigte Schraube vorgesehen, deren Schaft durch eine in einer Wand der Kammer angeordnete Buchse hindurch in Richtung auf einen Klemmknopf verläuft, der von außerhalb des Gehäuses 10 betätigt werden kann, um die Klemmvorrichrung 46 fest mit dem Block 42 zu verbinden. Die Klemmvorrichtung 46 weist eine Nut 50 auf, in die das Messer 48 eingesetzt ist, das von einem Glasprisma von rechtwinkligdreieckiger Form gebildet wird. An der Klemmvorrichtung 46 befinden sich zwei nicht gezeigte Schrauben, die das Messer 48 fest einspannen. Die Schneidkante des Messers liegt in der Schnittlinie der Hypothenusenfläche des Glasprismas mit einer senkrechten, unter einem Winkel von 45° zur Hypothenusenfläche verlaufenden Fläche. An Stelle des Glasprismas kann eine Diamantschneide eingesetzt werden. Die Schneidkante verläuft horizontal unmittelbar unterhalb des Objekts, wenn sich der Objekthalter am Anfang der senkrecht nach unten gerichteten, dem linearen Abschnitt des D entsprechenden Schneidbewegung befindet.

An der Hypothenusenfläche des Messers 48 ist ein Gefäß 52 vorgesehen, das aus einem Streifen aus inertem Kunststoff oder aus einem Metallstreifen besteht, der mittels eines inerten Wachses an dem Glasprisma in der Nähe der Schneidkante befestigt ist. Das Gefäß erstreckt sich quer über die Hypothenusenfläche in einigem Abstand von der Schneidkante. Während des üblichen Schneidvorgangs ist das dreieckige Gefäß, das zwischen dem Kunststoff oder Metallstreifen und der geneigten Hypothenusenfläche liegt, mit einer geeigneten Flüssigkeit gefüllt, so daß von dem Objekt abgetrennte Schnitte auf die Oberfläche der in dem Gefäß befindlichen Flüssigkeit abgleiten und darauf schwimmen.

Der Block 42 weist einen Trog 54 auf und ist mit einer aus einem Platinwiderstandsthermometer und einem Widerstandsheizgerät bestehenden Widerstandsheizvorrichtung 56 versehen, die in dem Block eingebettet und an geeignete, nicht gezeigte Leitungen, die vom Gehäuse 10 ausgehen, angeschlossen ist.

Durch eine Wand des Gehäuses 10 erstrecken sich eine obere und eine untere Zuführleitung 58 und 59 in die von dem Gehäuse gebildete Kammer hinein. An seinem innerhalb der Kammer liegenden Ende ist die Zuführleitung 58 nach unten abgebogen und hat unmittelbar über dem Trog 28 des Objektshalters eine Ausflußöffnung. Die Leitung 59 ist an seinem Ende innerhalb der Kammer über dem Trog 54 ebenfalls nach unten abgebogen.

Bei der Benutzung sind die Zuführleitungen 58 und 59 über nicht gezeigte magnetbetätigte Ventile und Silikon-Gummischläuche mit dem unteren Abschnitt eines unter Druck stehenden Behälters verbunden, in dem sich ein Kühlmittel, beispielsweise flüssiger Stickstoff, befindet. Die magnetbetätigten Ventile der Zuführrohre und die Heizvorrichtungen in dem Messer- und dem Objekthalter sind mit einer geeigneten, selbsttätig arbeitenden elektrischen Steuereinrichtung verbunden und werden durch zugehörige Platin-Widerstandsthermometer gesteuert, so daß, wenn die Temperatur des Objekthalters über einen bestimmten Grenzwert ansteigt, das Magnetventil geöffnet wird und die Zufuhr von flüssigem Stickstoff in die Tröge 28, 54 ermöglicht, um die Halter zu kühlen. Wenn die Temperatur der Halter unter einen vorbestimmten Grenzwert abfällt, wird Strom in die Heizvorrichtung geleitet. Die obengenannten Grenzwerte sind so gewählt, daß sie so dicht wie möglich beiderseits einer gewählten Temperatur zwischen 0 und —150° C liegen, die auf einer Scheibe oder Skala der Steuereinrichtung eingestellt wird. Auf diese Weise wird der Halter im wesentlichen immer auf der gewünschten Temperatur gehalten.

Das Gehäuse 10 weist einen nicht gezeigten Abfluß auf, der durch eine Wand hindurchführt und die von dem Gehäuse gebildete Kammer mit der Atmosphäre verbindet.

Eine Spritzvorrichtung 54' weist einen Bund auf, der dichtend und herausnehmbar in einer Wand des Gehäuses oberhalb der Ebene der Messeranordnung vorgesehen ist. Ein Kolben 58' der Spritzvorrichtung ist auf der Außenseite des Gehäuses abnehmbar angeordnet, während die eine Kapillare 60 aufweisende Nadel der Spritzvorrichtung in die Kammer hineinreicht und mit ihrem Ende nach unten hin in das Gefäß 52 abgebogen ist. Die Spritzvorrichtung ist mit einer Flüssigkeit, beispielsweise Alkohol, gefüllt, mit der das Gefäß von Zeit zu Zeit während des Betriebs des Mikrotoms aufgefüllt werden kann.

Das Gefriergerät wird auf das Mikrotom aufgesetzt und in der folgenden Weise benutzt:

Die den üblichen Messerblock an der Mikrotomplatte haltende Klemmschraube wird gelöst und der Messerbiock und der mit dem Objektaufnehmer ver-_: bundene Objekthalter werden entfernt. Danach wird das Gehäuse 10 auf die Mikrotomplatte so aufgesetzt, daß auf seiner Unterseite die Rippe 12 in die

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-iut eingreift, die zuvor von dem üblichen Messerjlock besetzt war. Danach wird die Klemmschraube /ieder angezogen, um das Gehäuse 10 auf der Mirotomplatte festzuhalten. Die Zuführleitungen 58 ;nd59 werden über ihre Magnetventile und Gumaischläuche mit dem unteren Abschnitt des das kühlmittel enthaltenden Behälters verbunden, in jem sich beispielsweise flüssiger Stickstoff befindet, dieser Behälter ist abgeschlossen, so daß die teilweise Verdampfung des flüssigen Stickstoffs den Belälter unter Durck setzt. Der Behälter ist mit einem überdruckventil versehen, das den Druck im Behälter auf maximal etwa 0,28 kp/cm² begrenzt.

Der Objekthalter 23 wird mit dem Befestigungsstück 34 verbunden, welches daraufhin in die Kammer eingesetzt wird. Der Zapfen 36 wird durch die mittlere öffnung des flexiblen Kragens 38 hindurch-•^eführt, dessen Stellung annähernd der Stellung des oeweglichen Objektaufnehmers des Mikrotoms entspricht. Der Zapfen 36 wird anschließend mit dem Objektaufnehmer des Mikrotoms verbunden. Dann wird die innere Kante des flexiblen Kragens dicht auf den durch den Kragen hindurchführenden Zapfen 36 aufgeklemmt. Der Kragen ist dabei jedoch so nachgiebig, daß der Zapfen 36 sich frei auf der D-förmigen Schneidbahn bewegen kann.

Die Klemmvorrichtung 46, mit der das das Gefäß 52 tragende Messer 48 bereits verbunden ist, wird an den Block 42 angesetzt und durch Anziehen der außerhalb der Klammer angeordneten Klemmschraube befestigt. Das Messer wird durch die ihm zugeordneten Klemmschrauben in der Klemmvorrichtung gehalten. Die einzelnen Teile dieser Vorrichtung sind dabei so angeordnet, daß die Schneidkante des Messers zu Beginn der Abwärtsbewegung unmittelbar unterhalb des Objektes in waagerechter Richtung verläuft.

Die Spritzvorrichtung 54' ist bereits vorher mit einer geeigneten Flüssigkeit, beispielsweise Alkohol, für das Gefäß 52 gefüllt worden. Der Deckel 16 wird auf das Gehäuse 10 aufgesetzt und mit diesem fest verbunden.

Die Temperaturen des Objekt- und des Messerhalters werden auf den Temperaturwählscheiben der Steuereinrichtung eingestellt. Die Steuereinrichtung wird mit einer geeigneten Energiequelle verbunden und eingeschaltet. Da zu Beginn dieses Vorgangs die Temperaturen des Objekt- und des Messerhalters über den gewählten Temperaturen liegen, öffnet die Steuereinrichtung die Magnetventile selbsttätig.

Flüssiger Stickstoff fließt durch die Magnetventile, die Gummischläuche und die Zuführleitungen 58 und 59 in die beiden Tröge 28 und 54, in denen er zunächst sehr schnell verdampft.

Das durch diese schnelle Verdampfung des flüssigen Stickstoffs entstehende trockene, kalte Gas wird in die durch das Gehäuse 10 gebildete Kammer geleitet und drückt dabei die Luft und die in ihr enthaltene Feuchtigkeit durch den Abfluß oder die Abzugsöffnung aus der Kammer heraus.

Der in der Kammer verdampfende Stickstoff bildet eine kalte, trockene Inertgasatmosphäre, die ideale Bedingungen für die Ausführung der Schnitte schafft.

Die Temperatur der Halter fällt so lange ab, bis sie die untere Grenze unterhalb der gewählten Temperatur erreicht. Danach wird das zugehörige Magnetventil mittels der Steuereinrichtung geschlossen, und die entsprechende Heizvorrichtung wird eingeschaltet, um die Temperatur wieder auf den gewählten Wert zu bringen. Sobald die Temperatur die obere Grenze oberhalb des gewählten Wertes erreicht, öffnet sich das Magnetventil wieder, und die Heizvorrichtung wird abgeschaltet.

Die Steuereinrichtung, die hier auch als Regeleinrichtung bezeichnet werden kann, ist mit zwei weiteren Scheiben oder Skalen versehen, die jede Abweichung der eingestellten Temperaturen infolge eines falschen Funktionierens der Einrichtung anzeigen. Wenn das Objekt und das Messer die für den Schneidvoigang optimalen Temperaturen erreicht haben, wird das Mikrotom betätigt, um Schnitte der gewünschten Stärke oder Dicke abzuschneiden. Diese Schnitte werden nacheinander dem Gefäß 52 zugeführt, in dem sie auf der Flüssigkeit schwimmen. Die Flüssigkeit ist so ausgewählt, daß sie bei den Temperaturen des Schneidvorgangs nicht gefriert.

Von Zeit zu Zeit muß das Gefäß 52 mit Flüssigkeit nachgefüllt werden, was mittels der Spritzvorrichtung 54' geschehen kann.

Nachdem die gewünschte Anzahl von Schnitten hergestellt worden ist, wird der Deckel 16 des Gehäuses abgenommen. Die Schnitte werden mittels eines Präparatnetzchens von der Flüssigkeitsoberfläche des Gefäßes abgehoben und dann in einem Elektronenmikroskop untersucht.

Bei einer nicht gezeigten einfacheren Ausführungsform des Gefriergerätes ist die selbsttätig arbeitende Steuereinrichtung weggelassen. Das Gehäuse weist zwei Behälter für flüssigen Stickstoff auf, von denen der eine über eine Abzugsöffnung mit der Kammer verbunden ist, um dieser verdampften Stickstoff zuzuführen. Der andere Behälter ist abgeschlossen und mit einem Überdruckventil versehen, um unter Druck stehenden flüssigen Stickstoff über eine Leitung und über ein handbetätigtes Nadelventil dem an dem Objekthalter angeordneten Trog zuzuführen. Bei dieser Ausführungsform des Gefriergeräts wird der an dem Messerblock angeordnete Trog weggelassen. Es fehlt ferner die zugehörige Rohrleitung zur Zuführung des flüssigen Stickstoffs. Der Messerblock ist wärmeleitend mit dem Behälter über einen unterhalb des Behälters verlaufenden Kupfersteg verbunden. Beide Halter weisen Platin-Widerstandsthermometer und elektrische Heizvorrichtungen auf, wobei diese Thermometer allerdings nur eine Temperaturablesung auf der Skalenscheibe einer von Hand betätigten Steuereinrichtung gestatten. Die Heizvorrichtung und das Nadelventil werden von Hand eingestellt, um die gewünschte Temperatur einzuschalten.

Die oben beschriebenen Gefriergeräte ermöglichen die Anfertigung von extrem dünnen Schnitten gefrorener Materialien unter verhältnismäßig idealen Temperatur- und Druckbedingungen und vermeiden die Gefahr der Eiskristallbildung auf der Oberfläche des Objekts. Ferner wird der Schneidvorgang in einer vollkommen trockenen Atmosphäre durchgeführt.

Daraus ergibt sich, daß die Objekte in zufriedenstellender Weise geschnitten werden können, ohne, wie das bisher als unerläßlich erachtet wurde, das Objekt vorher präparieren und einbetten zu müssen.

Hierzu 1 Blati Zeichnungen

Claims (12)

Patentansprüche:

1. Gefriergerät für ein Mikrotom, mit einem wärmeisolierten Gehäuse, das eine einen Messerhalter mit einer Klemmvorrichtung zum Befestigen des Messers sowie einen Objekthalter enthaltende Kammer bildet, und wenigstens einer in die Kammer führenden Zuführleitung zur Einführung eines Kühlmittels, dadurch gekennzeichnet, daß das wärmeisolierte Gehäuse (10) durch einen sonst den üblichen Messerhalter tragenden Bauteil des Mikrotoms gehalten ist; daß der Messerhalter am Gehäuse (10) befestigt ist und der Objekthalter (23) einen durch eine Wand des Gehäuses (10) hindurchführenden, außerhalb des Gehäuses mit dem üblichen Objektaufnehmer verbundenen Zapfen (36) aufweist; daß in der vom Zapfen durchdrungenen Wand des Gehäuses (10) eine die Kammer nach außen abdichtende Einrichtung (38) vorgesehen ist, die eine die Schneidbewegung des Objekthalters (23) in bezug auf den Messerhalter bewirkende Bewegung des Zapfens (36) zuläßt; und daß eine Einrichtung zur Temperaturregelung des Messer- und Objekthalters sowie wenigstens eine Abzugsöffnung aus der abgedichteten, von dem Gehäuse (10) gebildeten Kammer vorgesehen sind.

2. Gefriergerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Temperaturregelung des Messer- und Objekthalters eine elektrische Widerstandsheizvorrichtung (34', 56) aufweist.

3. Gefriergerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl dem Messer- als auch dem Objekthalter ein den der Widerstandsheizvorrichtung (34', 56) zugeführten Stromfluß regelndes Thermometer (31) zugeordnet ist.

4. Gefriergerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Temperaturregelung des Messerhalters einen Trog (54) aufweist, der unterhalb der Auslaßöffnung der Zuführleitung (59) angeordnet ist.

5. Gefriergerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Temperaturregelung des Objekthalters (23) einen offenen Trog (28) aufweist, der unter dem Auslaß der Zuführleitung (58) angeordnet ist.

6. Gefriergerät nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Objekthalter (23) an einem einen Teil eines Objektträgers (22) bildenden Befestigungsstück (34) angebracht ist; und daß der Trog (28) aus einem mit dem Objekthalter (23) verbundenen, ebenfalls einen Teil des Objektträgers (22) bildenden Behälter (25) besteht, der mit Spiel in das Befestigungsstück (34) eingesetzt ist.

7. Gefriergerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die oberhalb der Tröge (28, 54) angeordnete Auslässe aufweisenden Zuführleitungen (58, 59) in Abhängigkeit von der Haltertemperatur steuerbare Ventile besitzen.

8. Gefriergerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die die aus dem Gehäuse (10) gebildete Kammer nach außen abdichtende Einrichtung (38) ein flexibler, undurchlässiger Kragen ist, der sowohl mit dem Zapfen (36) als auch mit der zugeordneten Gehäuseöffnung (37) dichtend verbunden ist.

9. Gefriergerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse (10) einen abnehmbaren, durchsichtigen Deckel (16) aufweist, der auf eine Zugangsöffnung der von dem Gehäuse gebildeten Kammer aufgesetzt ist.

10. Gefriergerät nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Deckel (16) eine Widerstandheizvorrichtung (20) aufweist.

11. Gefriergerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Messerhalter mit einem Messer (48) und einem an diesem angeordneten, mit Flüssigkeit gefüllten Gefäß (52) zur Aufnahme von Schnitten versehen ist.

12. Gefriergerät nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch eine mit dem Gehäuse (10) lösbar verbundene, zum Nachfüllen des Gefäßes (52) dienende Spritzvorrichtung (54') mit einem sich durch eine Wand des Gehäuses (10) erstreckenden zylindrischen Körper, einem auf der Außenseite des Gehäuses (10) angeordneten Kolben (58') und einer Nadel, die innerhalb der von dem Gehäuse gebildeten Kammer angeordnet ist und mit ihrem abgebogenen, freien Ende in das an dem Messer angeordnete Gefäß (52) hineinragt.