DE1617741B1

DE1617741B1 - Verfahren zur Herstellung eines Glycopeptides aus Magenschleimhaut oder Zw¦lffingerdarm von Schweinen

Info

Publication number: DE1617741B1
Application number: DE1967P0043062
Authority: DE
Inventors: Gianfranco Dr Bertellini; Adriano Dr Butti; Giuseppe Dr Prino
Original assignee: PREPHAR PROSPECTION DE RECH S
Current assignee: PREPHAR PROSPECTION DE RECH S
Priority date: 1966-09-29
Filing date: 1967-09-26
Publication date: 1971-01-07
Also published as: CH494739A; NO123051B; YU31438B; DK116308B; GR34664B; AT275029B; IL28649A; SU539507A3; NL6713286A; MY7100041A; ES345550A1; BE704537A; GB1166939A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur dingungen das Material schnell zerstört wird. Aus den Herstellung eines Glycopeptides aus Magenschleim- gleichen Gründen ist bei: hohen pH-Werten (über 9) haut oder Zwölffingerdarm von Schweinen. eine besonders sorgfältige Kontrolle der angewandten

Die Existenz von Makromolekülen von zusammen- Temperatur und der Zeitdauer des Erhitzens erfordergesetzter Natur, die zwischen Proteinen und Poly- 5 lieh. Am Ende der Hydrolyse kann es zweckmäßig sacchariden Hegen, in tierischen Organen ist allgemein sein, die Ausfällung aller organischen Substanzen mit bekannt. Diese Substanzen sind als Glycoproteide saurem Charakter wie den schwefelhaltigen Mucopolybezeichnet worden. sacchariden zu bewirken. Wenn demnach die Hydro-

Die Struktur dieser Makromoleküle kann in grober lyse bei alkalischem pH-Wert durchgeführt worden ist, Annäherung als die Kombination von einem oder io kann die Mischung wieder durch Zugabe einer mehreren Molekülen eines Polysaccharides mit einem schwachen Säure (z. B. Essigsäure) auf einen sauren oder mehreren Molekülen eines Proteins vermutet pH-Wert gebra'cht werden, wodurch die Ausfällung werden. Diese Kombination ist auf Grund von kova- dieser Substanzen bewirkt wird. Das Filtrat wird dann lenten Bindungen gegeben, und aus diesem Grundeist von den Proteinabfällen durch Behandlung mit einem die gesamte Struktur nicht ein Addukt oder ein Korn- 15 Enzym (z. B. Papain) bei einem geeigneten pH-Wert plex, sondern vielmehr ein einziges Molekül. Bei befreit. Es kann auch zweckmäßig sein, vor der einigen Arten von Glycoproteiden kann der Proteid- enzymatischen Behandlung eine vorhergehende Ausanteil vorherrschen, während in anderen Arten der fällung des größten Teiles der Proteinabfälle durch Polysaccharidteil die Oberhand hat. Der letztere Typus Zugabe eines geeigneten Reagenzes, wie Trichloressigwird deshalb in der Regel als Glycopeptid bezeichnet. 20 säure zu bewirken. Durch Verdünnung des Filtrates, Zu dieser Klasse gehören einige Substanzen, die eine das nach diesen Behandlungsschritten erhalten wird, sehr große biologische Bedeutung haben, wie bei- mit organischen Lösungsmitteln (Alkohol oder Aceton) spielsweise diejenigen, die die Blutgruppen charakteri- wird das rohe. Glycopeptid in Form eines weißen bis sieren. · ■ bräunlichen Pulvers erhalten. In den Beispielen wird

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren 25 über einige chemische Analysen dieses Produktes bezur Herstellung eines Glycopeptides aus Magen- richtet, welches sich besonders durch die Abwesenheit Schleimhaut oder Zwölffingerdarm von Schweinen, das von Uronsäuren und die Anwesenheit von nur einer gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, daß Spur Schwefel auszeichnet.

man die tierischen Organe in Wasser bei 50 bis 100° C . Die anschließenden Reinigungsbehandlungen beabwährend 10 bis 45 Minuten bei pH 1,2 bis 4,5 oder 8,5 30 sichtigen insbesondere^ von dem Rohprodukt, welches bis 9,5 hydrolysiert, die sauren Mucopolysaccharide nach dem obenerwähnten Schema erhalten wurde, durch Säurezugabe abtrennt, das Filtrat mit Aceton Verunreinigungen von salzartigem.. Charakter zu ent- oder Alkohol versetzt, den Niederschlag nach Wieder- fernen und ein Material zu erzeugen, welches eine konauflösung in Wasser durch Papain oder Trypsin enz-y- ■ stante analytische Zusammensetzung aufweist,
matisch abbaut und anschließend die Glycopeptide ,35.., Die Reinigung kann im wesentlichen nach zwei mit Alkohol oder Aceton ausfällt. Methoden durchgeführt werden:

Das gemäß dem Verfahren der Erfindung herge- Entweder mittels Dialyse (die Verunreinigungen sind

stellte Glycopeptid hat sich als nützlich bei der pharma- leicht dialysierbar) oder durch Überleitung über ein zeutischen Anwendung zur Heilung von Entzündungs- Ionen-Austauscherharz des sauren Typus oder des gekrankheiten im allgemeinen und von Geschwüren im 40 mischten Typus,Kjind in diesem Falle wird die Reinibesonderen erwiesen. gung dadurch erzielt, daß von dem stark sauren

Im wesentlichen besteht das Verfahren gemäß der Charakter der Verunreinigungsmaterialien Gebrauch Erfindung aus einer milden hydrolytischen Behandlung .. gemacht wird. In den Beispielen sind beide Reinigungsund einer anschließenden Entfernung des Haupt- verfahren erläutert. Die Ausbeuten der Reinigungsanteiles von Protein- und Mucopolysaccharidischen .45 operation, unabhängig von dem angewandten VerAbfällen durch Fällung und anschließende Proteölyse . .fahren, schwanken zwischen 65 und 75 Gewichtsmittels Enzymen. Es ist in diesem Zusammenhang' ",prozent, und das so erhaltene Produkt liegt in Form interessant, daß gemäß Vorveröffentlichungen in-der'' eines farblosen, geruchlosen und amorphen Pulvers Literatur betreffend andere Arten von Verbindungen vor. Die Phosphor- und Schwefelgehalte des gereinigdie enzymatische Pröteolyse vollständig die Protein- 50 ten Produktes sind praktisch vernachlässigbar. Außerketten, die als Verunreinigungen vorhanden sind, zef-''..'■ "dem sind nicht vorhanden Uronsäuren, während auf stört, jedoch den peptidischen Anteil nicht ändert, der der anderen Seite Hexosamine im Bereich von 40 bis das Extraktionsprodukt charakterisiert, 50 %, Aminosäuren im Bereich von 13 bis 18%»

Die hydrolytische Behandlung wird mit einem Organ Hexosen im Bereich von 27 bis 31 % und Derivate von durchgeführt, das vorher zerkleinert und in Wasser 55 Neuraminsäure im. Bereich von 4 bis 6% anwesend angeschlämmt wurde. Sie kann bei einem pH-Wert sind.

innerhalb eines großen Bereiches durchgeführt werden. Das Produkt scheint auf Grund der analytischen

Es werden erhöhte Temperaturen von zwischen etwa Untersuchungen einheitlich zu sein (Elektrophorese, 50 und 100°C für einen Zeitraum von etwa 10 bis Papiercromatography usw.), und es wird durch 45 Minuten angewandt. Aus Gründen einer bequemen 60 Kupfersulf at in alkalischem Medium (Biuret Reagenz) Durchführung des Verfahrens und einer einfachen inquantitativer Ausbeute gefällt.
Kontrolle wird eine Hitzebehandlung durch Erwärmen Die erwähnten analytischen Daten gestatten, das

auf den Siedepunkt, d. h. auf Temperaturen von etwa Produkt zu den Glycopeptiden zu klassifizieren, wäh* 100° C bevorzugt. Der pH-Wert kann auf Werte einge- rend auf der anderen Seite die Anwesenheit von stellt werden, die im Bereich von etwa 1,2 bis 4,5 oder 6g Hexosaminen, die nicht von Uronsäuren begleitet sind, 8,5 bis 9,5 liegen, und zwar durch geeignete Zugabe und die Abwesenheit von schwefelhaltigen Gruppen von Säuren oder Alkalien. Insbesondere Werte über aller Art ein charakteristisches Merkmal für denpolypH 10 sollen vermieden werden, da unter diesen Be- saccharidischen Teil dieser Substanz darstellen.

I 617 741

3 4

Pharmakologische Versuche an Laboratoriumstieren wiederholte Zugabe von 2 n-Natriumhyxkoxidlosung haben ergeben, daß dieses Glycopeptid in einer Dosis auf 8,6 gehalten. Am Ende dieser Periode wurden zu' von 12,5, 25 oder 50 mg/kg inhibierend wirkt auf das nächst 250 ml 80%iger Essigsäure zugegeben und anlokale Ödem durch Carragenin und Serotonin, die schließend eine solche Menge an Trichloressigsäure Diffusion von Blue Evans in den intradermalen 5 (etwa 160 g), als ausreicht, um den pH-Wert auf 1,8 zu Schwielen durch Serotonin, Dextran· und Bradykinin bringen. Der gebildete Niederschlag wurde durch sowie das Wachstum von Baumwoll-Kügelchen- Zentrifugieren entfernt, und das klare Filtrat wurde Granulomen bei der Ratte. Bei einer Dosis von 100 mg/ mit dem vierfachen Volumen an Aceton verdünnt. Der kg vermindert das untersuchte Produkt den Prozent- gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesamsatz an Ratten, die befallen sind, und die Schwere am io melt, mit Aceton gewaschen, unter Vakuum getrocknet Pylorus-ligation-Geschwür gemäß S h a y und an und gemahlen. Auf diese Weise wurden 47 g eines »Fast«-Geschwür. Darüber hinaus kann es die Wisder- Pulvers erhalten, welches nach Einstellung des pH-Werherstellung der Funktionsfähigkeit von entzündeten tes auf 5,7 wie im Beispiel 1 beschrieben der Papain-Gliedern (Arthritis durch AgNO₃) beschleunigen. Proteolyse unterworfen wurde. Das nach diesem Ver-

Die folgenden Beispiele erläutern, die Erfindung, 15 fahren erhaltene Rohprodukt wog 20 g. Dieses Pro-

ohne daß sie in irgendeiner Weise beschränkend dukt hatte die folgenden analytischen Werte: P = 4%;

wirken. N = 6,2%.

Beispiel 1 B e i s ρ i e 1 3

10,2 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm 20 1 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm vom vom Schwein wurden in einer Fleischhackmaschine Schwein wurde in einer Fleischhackmaschine zerzerkleinert, die mit einer durchlöcherten Platte mit kleinert, welche mit einer durchlöcherten Platte ausge-Löchern von 1,1 mm Durchmesser versehen war. Das stattet war, die 1,1 mm Löcher aufwies. Das Material Material wurde in 10 Litern Wasser suspendiert und wurde in 1 Liter Wasser suspendiert und, nachdem der unter Rühren 15 Minuten lang gekocht. Während 25 pH-Wert durch Zugabe von 80%iger Essigsäure auf 4 dieser Behandlung wurde der pH-Wert der Lösung auf eingestellt worden war, unter Rühren gekocht.
9,2 gehalten, in dem wiederholt 3 η-Natriumhydroxid- Die Mischung wurde 15 Minuten lang sieden gelösung zugegeben wurde. Am Ende dieser Periode lassen. Dann wurde sie abkühlen gelassen und zentriwurde der pH-Wert durch Zugabe von 80%iger Essig- ' fugiert. Das Filtrat wurde mit 10 g Natriumacetat besäure (etwa 600 ml) auf 4,7 eingestellt. Die Mischung 30 handelt und dann mit dem vierfachen Volumen Aceton wurde auf 30° C abkühlen gelassen und nach Zugabe verdünnt. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren von 10 Litern Aceton und 1 kg Filterhilfe filtriert, in- abgetrennt, mit Aceton gewaschen, im Vakuum gedem durch ein Tuch durchlaufen gelassen wurde. Auf trocknet und gemahlen. Es wurden so 11 g eines diese Weise wurden 22 Liter des Filtrates erhalten. Pulvers erhalten, welches der proteolytischen Papain-Diese wurden weiter verdünnt mit 55 Litern Aceton. 35 behandlung wie im Beispiel 1 beschrieben unterworfen Auf diese Weise wurde ein Produkt ausgefällt, welches wurde, nachdem der pH-Wert auf 5,7 eingestellt wordurch Dekantieren gesammelt wurde, mit Aceton ge- den war.

waschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen Das gemäß diesem Verfahren erhaltene Rohprodukt

wurde. Das Gewicht des so erhaltenen trockenen wog 5,2 g. Dieses Produkt hatte die folgenden analyti-

Pulvers betrug etwa 3 kg. , 40 sehen Werte: P = 2,5%; N = 6,03%.

Dieses Pulver wurde in 9 Litern Wasser dispergiert.

Der pH-Wert der Lösung wurde mit 2 η-Salzsäure auf B e 1 s ρ 1 e 1 4
5,7 eingestellt. Dann wurden 20 g Natriumchlorid und 1 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm vom 20 g Papain zugegeben. Anschließend wurde die Schwein wurde in einer Fleischhackmaschine. zerMischung unter Rühren 24 Stunden lang auf 60° C er- 4.5 kleinert, die eine Lochplatte mit 1,1 mm Löchern enthitzt. Nach Beendigung der Papainbehandlung wurden hielt. Das Material wurde in 1 Liter Wasser suspen-50 g Filterhilfe zugegeben, und das Gemisch wurde diert und, nachdem der pH-Wert durch Zugabe von filtriert, indem es durch ein Tuch durchlaufen gelassen Trichloressigsäure auf einen Wert von 1,7 eingestellt wurde. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck worden war, auf 50° C erhitzt. Das Gemisch wurde (50 mm Hg) auf ein Volumen von 3 Litern eingeengt. 50 30 Minuten lang auf dieser Temperatur unter Rühren Anschließend wurde mit 2,7 Litern Aceton behandelt, gehalten und dann abkühlen gelassen und anschließend Es wurde auf diese Weise ein Niederschlag erhalten, zentrifugiert. Das Filtrat wurde mit 15 g Natriumder durch Dekantieren gesammelt, mit Aceton ge- acetat behandelt, und dann mit dem vierfachen waschen und unter Vakuum getrocknet wurde. Volumen Aceton verdünnt. Der Niederschlag wurde

Die Ausbeute an rohen Glycoproteinen betrug etwa 55 durch Dekantieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen,

66 g. Dieses Produkt hatte die folgenden Eigen- getrocknet und unter Vakuum gemahlen. Es wurden

schäften: P = 3,63 %; S = 0,21 %; N = 5,91 %; so 9 g eines Pulvers erhalten, welches, wie im Beispiel 1

Acetyl-Gruppen: 7,12%; Viskosität (in 1% Lösung) beschrieben, der proteolytischen Papainbehandlung

bei 20° C = 1,2699 cP; pH (1 % Lösung) = 6,9. . unterworfen wurde, nachdem der pH-Wert auf 5,7 ein-

; ·. · . ßo gestellt worden war.

B e 1 s ρ 1 e 1 2 Das gemäß diesem Verfahren erhaltene Rohprodukt

3,8 kg tiefgefrorene Magenschleimhaut vom Schwein wog 4,8 g.

wurden in einer Fleischhackmaschine zerkleinert, die Dieses Produkt hatte die folgenden analytischen

mit einer durchlöcherten Platte versehen war, welche Werte: P = 2,6%; N = 6,1%·

Löcher von 1,1 mm Durchmesser aufwies. Das Mate- 65

rial wurde in 7,5 Litern Wasser suspendiert und 15 Mi- Beispiels
nuten lang unter Rühren gekocht. Während dieser 100 g rohes Glycoprotein, wie es nach den in BeiBehandlung wurde der pH-Wert der Lösung durch spielen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren erhalten wurde,

wurden in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Teilen befreit, und das Filtrat wurde mit 2 n-Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt. Die so erhaltene Lösung wurde der Dialyse mit entionisiertem Wasser bei 20° C durch eine Zellulosemembran von 0,03 mm Stärke für einen Zeitraum von "48 Stunden ausgesetzt. Am Ende dieser Behandlung hatte die Lösung ein Volumen von 2 Litern erreicht. Die Lösung wurde auf das. "ursprüngliche Volumen (1000 ml) unter vermindertem Druck (50 mm Hg) konzentriert, mit 5 g Natriumchlorid behandelt und mit 1200 ml Aceton oder 2500 ml Methanol verdünnt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt, mit dem für die Fällung verwendeten Lösungsmittel gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen. Die Ausbeute betrug 69 g.

Dieses Produkt hatte die folgenden analytischen Werte: P= kein; S = 0,25%; N = 5,81%; CH₃CO = 9,75%; Viskosität (in 1% Lösung) bei 20°C ap = 1,6409 cP; Na = 0,71%; pH (1% Lösung) = 6,3; Hexosamine = 39,2%; Uronsäuren = keine; Proteine = 16,3% (FOLIN); Hexosen = 29,5%; Neuraminsäure-Derivate 4,55 %·

Beispiel 6

. 100 g des gemäß den in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren erhaltenen Glycoproteids wur-, 'den in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Anteilen befreit, und das Filtrat wurde mit 150 ml eines stark sauren, — SO₃H-Gruppen enthaltenden Kationenaustauschers auf Polystyrolbasis bei Zimmertemperatur ^u/₂ Stunde lang behandelt. Das Harz wurde dann mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen, und die Waschflüssigkeiten wurden mit der Hauptlösung vereinigt. Dann wurden 5 g Natriumchlorid zugefügt, und die Lösung wurde durch Verdünnen mit 1320 ml Aceton gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt und 3mal mit Aceton gewaschen. Der Niederschlag wurde dann in 750 ml Wasser wieder gelöst und der pH-Wert der Lösung durch Behandlung mit 2 n-NaOH auf 6,2 eingestellt. Dann wurden 3 g Natriumacetat zugegeben, und die wäßrige Lösung wurde¹ mit dem 2,5fachen Volumen Aceton verdünnt. Dabei wurde ein Niederschlag gebildet, der durch Dekantieren gesammelt, mit Aceton gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen wurde. Die Ausbeute betrug 67 g.

Bei Arbeiten in industriellem Maßstab kann die Behandlung mit dem Ionen-Austauscherharz in geeigneterer Weise mittels eines Kolonnendurchlaufs durchgeführt werden. Das Verfahren selbst wird aber ■dabei im wesentlichen nicht geändert. Das Produkt hatte die folgenden analytischen Werte: P = 0,08%; -S = 0,2%; N = 6,03%; CH₃CO = 9,34%; Na = 0,43%; pH (1% Lösung) = 6,2; Hexosamine ■= 39,5%; Uronsäuren — keine; Hexosen = 29,5%; Viskosität (in 1% Lösung) bei 2O⁰C = 1,9189 cP; Proteine (FOLIN) = 14,0%; Neuraminsäure-Derivative = 5,33%.

Beispiel 7

100 g des nach den in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren erhaltenen rohen Glycoproteids wurden in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Anteilen befreit, und das Filtrat wurde mit 100 ml eines stark sauren Kationenaustauschers (Säureform, aktiviert mit 10% HCl) behandelt. Nach 30 Minuten langer Dauer dieser Behandlung wurde das Harz durch Filtration entfernt und mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Waschlaugen wurden- mit dem Filtrat vereinigt. Diese Lösung wurde wiederum mit 100 ml eines stark basischen Anionenaustauschers auf Polystyrolbasis mit — [NR₂Rⁱ]-Gruppen, wobei R¹ keine Methylgruppe ist (basische Form, aktiviert mit 5 % NaOH), für einen zusätzlichen Zeitraum von 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und mit 150 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeiten wurden mit dem Filtrat vereinigt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von ^:2 n-NaOH auf 6,2 gebracht. Dann wurden 5 g Natriumacetat zugefügt, und anschließend wurde mit dem gleichen Volumen Aceton verdünnt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt, mit Aceton gewaschen, im Vakuum getrocknet und gemahlen. Ausbeute: 70 g.

Beim Arbeiten im technischen Maßstab ist es bequemer, die Behandlung mit dem erwähnten Ionen^ Austauscherharz dadurch auszuführen, daß durch eine geeignete Kolonne durchlaufen gelassen wird, wobei jedoch keine wesentliche Modifikation dieses Prozesses vorgenommen wird.

Das erhaltene Produkt hatte die folgenden analytischen Werte: P = 0,04%; S = 0,11 %; Na = 0,27 %; Acetylgruppen—9,93%; N = 5,74%; Hexosamine = 40%; Uronsäuren = keine; Proteine (POLIN) = 14,5%, Hexosen = 31%; pH (1% Lösung) = 6,3; Viskosität (in 1% Lösung) bei 20°C = 1,9004; Neuraminsäure-Derivative = 5,20 %.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Glycopeptide aus Magenschleimhaut oder Zwölffingerdarm von Schweinen, - d a d u r ch g ek e η η ζe i c h η et', daß man die tierischen Organe in Wasser bei 50 bis 100° C während 10 bis 45 Minuten bei pH 1,2 bis 4,5 oder 8,5 bis 9,5 hydrolysiert, die sauren Mucopolysaccharide durch Säurezugabe abtrennt, das Fil·· trat mit Aceton oder Alkohol versetzt, den Niederschlag nach Wiederauflösung in Wasser durch Papain oder Trypsin enzymatisch abbaut und anschließend .die Glycopeptide mit Alkohol oder Aceton ausfällt.

2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekeimt zeichnet, ,daß man die nach Anspruch 1 erhältlichen Glycopeptide nach Wiederauflösung in Wasser durch Dialyse oder Behandlung mit Ionenaustauschern entsalzt.