DE1598585B2 - Verfahren zur Bestimmung des Eisens im Serum - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Eisens in Serum durch Freisetzung des Eisens mit Säure, Reduzierung mit Thioglykolsäure, Eiweißfällung mit Trichloressigsäure und anschließende kolorimetrische Bestimmung der vom Eiweiß befreiten Lösung.

Die Kenntnis des Eigengehaltes von Sera sowie der Eisenbindungskapazität derselben hat für die Diagnostik verschiedener Anämieformen, der akuten Hepatitis, mechanischen Gallengangverschlüssen, speziell malignem Gallengangverschluß, Aufdeckung von latentem Eisenmangel oder auch Resorptionsstörungen eine zunehmende Bedeutung.

Allerdings ist ein zuverlässiges Bestimmungsverfahren für das Eisen die grundlegende Voraussetzung. Als solche hat sich im Prinzip die Bestimmung des zweiwertigen Eisens mit Bathophenantrolin bewährt.

Bei dieser mehrstufigen Methode wird zunächst das Eisen aus dem Transferrin-Komplex durch Behandeln mit Salzsäure in Freiheit gesetzt, anschließend das in dreiwertiger Form vorliegende Eisen durch ein Reduktionsmittel, wie beispielsweise Ascorbinsäure oder Thioglykolsäure, zur zweistufigen Stufe reduziert und schließlich das Eiweiß durch Behandeln mit Trichloressigsäure gefällt. Der Eiweißniederschlag wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, die zurückbleibende Lösung mit einem Bathophenantrolin-Reagenz versetzt und das vorhandene Eisen durch die der vorhandenen Eisenmenge proportionalen Farbintensität der durch den entstandenen Chelatkomplex rosagefärbten Lösung nach bekannten Methoden bestimmt.

Diese Bestimmung des Eisens ist jedoch in der praktischen Durchführung aufwendig und zeitraubend. Es wurde daher in neuerer Zeit der Vorschlag gemacht, zur Vereinfachung auf die Eiweißfällung zu verzichten. Nachteilig ist hierbei zwar das Mitführen eines Serumblindwertes, so daß größere Serummengen erforderlich sind, jedoch erschien die Arbeitsvereinfachung beträchtlich.

Bei einer kritischen Überprüfung dieses Vorschlags auf Grund von vergleichenden Untersuchungen zwischen der bisher durchgeführten Methode mit Eiweißfällung, wie z. B. die bekannte Methode nach Landers und Zak (J. elin. Path., 29 [1958], 590), und den Methoden ohne Eiweißfällung, wie beispielsweise unter Verwendung eines Azetatpuffers (J. F. Goodwin et al., Clin.Chem., 12 [1966], 47), oder unter Verwendung eines Phosphatpuffers (D. E. Schwarz, Bull. Schw. Vereinig, klin. Chem., 1 [1957], 1) stellte sich jedoch heraus, daß man bei den letzteren Bestimmungsmethoden des Eiweißes nur mit einem frischen Serum richtige Ergebnisse erhält.

Bei zunehmender Lagerungsdauer der Sera treten bei Pufferzugabe immer stärkere Trübungen auf, die durch den vergleichsweise ermittelten Serumblindwert nicht mehr zu eliminieren sind.

Nun ist gerade die Eisenbestimmung eine Untersuchung, bei der die Lagerung des Serums sonst ohne Einfluß auf das Ergebnis blieb. Gegen die vielfach verbreitete Übung, die Sera zur Eisenbestimmung anzusammeln und an einem Tag gemeinsam zu untersuchen, war bei Methoden mit Eiweißfällung nichts einzuwenden. Ebenso konnte zur Eisenbestimmung das Serum unbedenklich vom behandelten Arzt abgenommen und zur Untersuchung eingeschickt werden (was meist mehrere Tage erfordert), ohne daß eine Veränderung des Eisenspiegels zu befürchten war.

Bei Anwendung einer Methode ohne Eiweißfällung sind die genannten Möglichkeiten nicht mehr gegeben, sondern der gefundene Eisenwert steigt mit der Lagerung an.

Im Gegensatz dazu bringt die Methode mit Eiweißfällung keine Änderung der Eisenwerte im Verlauf der Lagerung. Nach dem Ausfall dieser Untersuchungen ist bei einer Aufbewahrung von mehr als 12 Stunden in jedem Fall eine Eiweißfällung bei der Eisenbestimmung angezeigt.

Um daher auch bei Routineuntersuchungen bei allen Seren ohne Rücksicht auf Lagerung, Serumlabilität und Trübung zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, ist es notwendig, die Eiweißfällung bei der Eisenbestimmung beizubehalten. Der Eiweißniederschlag muß also bei der Analyse weiterhin durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt werden.

Diese Maßnahme ist auch bei einer vereinfachten zweistufigen Methode nach Gabi und Hub er (Wiener Klinische Wochenschrift, 76, [1964], S. 630 bis 633) noch erforderlich. Hier wird das an Transferrin gebundene Eisen durch Salzsäure aus der Bindung befreit, mit Thioglykolsäure zu zweiwertigem Eisen reduziert und das Eiweiß durch Trichloressigsäure gefällt. Im eiweißfreien Überstand wird das Eisen durch Bathophenanthrolinzusatz in einen roten Farbkomplex übergeführt und dieser photometrisch gemessen.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, welches eine einwandfreie Bestimmung des Eisens unter Vermeidung der bisher umständlichen und zeitraubenden Verfahrensweisen erlaubt.

Es wurde nun gefunden, daß man das Eisen im

Serum auf einfache und zeitsparende Weise dadurch bestimmen kann, daß man die Freisetzung und Reduzierung des Eisens sowie die Eiweißfällung in einem einstufigen Verfahren unter Verwendung einer Lösung von Thioglykolsäure und Trichloressigsäure durchführt.

Es ist durch das erfindungsgemäße Verfahren also möglich, folgende Arbeitsgänge in einer einzigen Verfahrensstufe unter Verwendung eines einzigen Reaktionsgemisches durchzuführen:

1. Freisetzung des Eisens aus ' der Transferrinbindung,

2. Reduktion des dreiwertigen Eisens zur zweiwertigen Form und

3. Fällung des Eiweißes.

Tabelle 1

Ergebnisse von 10 vergleichenden Eisenbestimmungen

Nr.	Bisherige	Neue
	Methode	Methode
1	33,8	37,2
2	102,5	105,5
3	131,3	138,5
4	156,2	160,5
5	131,3	134,0
6	112,5	119,0
7	113,0	106,0
8	122,0	120,0
9	128,0	137,0
10	154,0	151,0

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

B'eispiell

Eisenbestimmung

Prinzip: Das im Serumkomplex gebundene Eisen wird durch Trichloressigsäure, die als Reduktionsmittel Thioglykolsäure enthält, freigesetzt und zur zweiwertigen Form reduziert. Dabei findet auch die Ausfällung des Serumeiweißes statt. Die vom Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennte Lösung wird mit einem Bathophenantrolinreagenz versetzt. Dabei bildet sich ein rosagefärbter Chelatkomplex, dessen Farbintensität ein Maß für die im Serum vorhandene Eisenmenge ist.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren konnten zudem gegenüber den bisher üblichen Methoden fünf Pipettierungen eingespart werden, was bei Reihenuntersuchungen ins Gewicht fällt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ohne Beeinträchtigung der Zuverlässigkeit trotz Eiweißfällung insgesamt rascher durchzuführen als Methoden ohne Eiweißfällung. Zudem werden nur 0,5 ml Serum, bei einer im Mikromaßstab durchgeführten Bestimmung sogar nur 0,2 ml Serum, benötigt, wobei die ganze Bestimmung bei Zimmertemperatur durchgeführt werden kann.

Zur Überprüfung, ob die gleichzeitige Freisetzung und Reduktion des Eisens zusammen mit der Eiweißfällung nicht zu Verlusten führt und ob das Reagenz auch in der Lage ist, das gesamte Eiweiß aus seiner Transferrinbindung zu lösen, wurden 10 Sera nach der bisherigen Methode (Freisetzung und Fällung in getrennten Arbeitsgängen) und nach dem neuen erfindungsgemäßen Verfahren gleichzeitig untersucht.

Wie die nachstehende Tabelle 1 zeigt, ergibt sich eine sehr gute Übereinstimmung der gefundenen Werte (Angaben in μg^o/o).

45

50

55

60

Auch dem Serum zugesetztes Eisen wurde bei 10 Versuchen innerhalb der Fehlergrenze zu 100% wiedergefunden.

Reagenzien

1. Fällungs- und Reduktionslösung (0,65 g Thioglykolsäure werden in 100 ml 10 %iger Trichloressigsäure gelöst),

2. Eisenreagenz nach Landers und Zak (30mg Bathophenantrolin werden mit Chlorsulfonsäure sulfoniert und auf 100 ml mit einer 45%igen Natriumazetatlösung aufgefüllt),

3. Eisen-Standard (250 μg%).

Arbeitsmethode
1. Reinigung der Glaswaren

Zur Ausführung der Bestimmung ist besonderer Wert auf eisenfreie Glasgeräte zu legen. Vor dem ersten Gebrauch sind diese durch 16stündiges Einlegen in verdünnte Salpetersäure (1 Teil Salpetersäure konzentriert, 3 Teile destilliertes Wasser) zu reinigen und anschließend mit eisenfreiem Wasser zu spülen. Es empfiehlt sich, Pipetten, Zentrifugen- und Reagenzgläser für die Eisenbestimmung vor jedem Gebrauch mit eisenfreiem Wasser zu spülen, gesondert zu verwahren und nur für diese Bestimmung zu verwenden. Zentrifugengläser aus Kunststoff sind eisenfrei und zu empfehlen. Auch die Küvetten zur Messung im Photometer müssen vor Gebrauch eisenfrei gemacht werden. Dagegen braucht man wegen eines eventuellen Eisengehalts der Laborluft keine Bedenken zu haben. Durch das Mitführen des Standards und des Leerwertes wird dieser Fehler ausgeschaltet.

2. Blutentnahme

Die Blutentnahme erfolgt mit Hilfe von V 2 A-Kanülen in eisenfreien Spritzen, z. B. Einwegkanülen und Kunststoffspritzen oder in eisenfreien, sogenannten Venülen.

3. Arbeitsgang

(zur besseren Übersicht schematisch in Tabelle 2
dargestellt)

Die Analyse wird im Zentrifugenglas angesetzt. Es sind unterschiedliche Mengen an eingesetztem Serum berücksichtigt.

Tabelle 2

Arbeitsgang bei Eisenbestimmung

Normalmethode Mikromethode

Analyse Standard Leerwert Analyse Standard Leerwert

1,2 1,0 0,5 0,5

Fällungs- und	2,0	"to
Reduktionslösung
Serum	0,5	—
Standard	—	0,3
Destilliertes Wasser

— — 0,1 —

0,3 — — 0,1

Viertelstunde stehenlassen, dann Analyse zentrifugieren.

Vom Überstand 1,5 ml (bzw. 0,6 ml Mikromethode) weiter verwenden.

Überstand	1,5	1,5	1,5	0,6	0,6	0,6
bzw. Gemisch
Eisenreagenz	0,4	0,4	0,4	0,2	0,2	0,2

Die Extinktion von Analyse und Standard kann sofort gegen den Leerwert bei 510 bis 560 nm gemessen werden.

„ . Extinktion Analyse ... „, „.

Berechnung: - 250 = μg^o/o Eisen.

Extinktion Standard

Beispiel 2 ' schütteln, 5 Minuten stehenlassen; + Natrium-

Eisenbindungskapazität karbonatlösung 0,5 ml: 40 Minuten unter gelegentlichem Umschutteln stehenlassen, dann abzentn-

Prinzip: Zur Bestimmung der EBK wird das nicht fugieren.

mit Eisen beladene Transferrin durch Zusatz einer 35 Vom klaren Überstand werden 0,5 ml zur Eisen-Eisenlösung abgesättigt. Das überschüssige Eisen bestimmung eingesetzt. Bestimmung wie oben bewird an frisch gefälltes Magnesiumkarbonat quan- schrieben. An Stelle von Serum 0,5 ml Überstand, titativ absorbiert und durch Zentrifugieren entfernt.
Mit dem klaren Überstand wird eine Eisenbestimmung durchgeführt, deren Wert die totale EBK 4° Berechnung: darstellt.

Wie bei der Eisenbestimmung. Zusätzlich: _{m 1QQQ =} ^,^ _EßK ^^ _

Extinktion Standard

1. Eisen-Magnesium-Lösung (95,0 g MgCl₂ · 6 H₂O 45
und 24,2 g FeCl₃ · 6 H₂O werden in destilliertem

Wasser gelöst, mit 0,"5 ml konzentrierter HCl (Der Faktor 1000 resultiert aus der Konzentration

versetzt und auf 1000 ml mit destlliertem Wasser des Standards [250 μg^o/o] und der Verdünnung, die

aufgefüllt), das Serum durch die Behandlung zur Fällung mit

2. Natriumkarbonatlösung (200,0 g Na₂CO₃ [was- 50 Magnesiumkarbonat erfährt [1:4].) serfrei] und undestilliertes Wasser auf 1000 ml).

Arbeitsmethode

Serumeisen , ,

Analyse im Zentrifugenglas ansetzen. Serum -=— · 100 = prozentuale

0,5 ml + Eisen-Magnesium-Lösung 1,0 ml kräftig 55 ^töK-^total Transferrinsättigung.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung des Eisens in Serum durch Freisetzung des Eisens mit Säure, Reduzierung mit Thioglykolsäure, Eiweißfällung mit Trichloressigsäure und anschließende kolorimetrische Bestimmung der vom Eiweiß befreiten Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Freisetzung und Reduzierung des Eisens sowie die Eiweißfällung in einem einstufigen Verfahren unter Verwendung einer Lösung von Thioglykolsäure und Trichloressigsäure durchgeführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Lösung Thioglykolsäure in einer Gewichtskonzentration von 0,05 bis 3 %>, vorzugsweise 0,1 bis 1%, und Trichloressigsäure in einer Gewichtskonzentration von 3 bis 15%, vorzugsweise 5 bis 10⁰/o, vorhanden sind.