DE1242204B

DE1242204B - Process for the production of heparin derivatives

Info

Publication number: DE1242204B
Application number: DER36985A
Authority: DE
Inventors: Dr-Ing Robert Bucourt
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1963-01-21
Filing date: 1964-01-16
Publication date: 1967-06-15

Description

Verfahren zur Herstellung von Heparinderivaten Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Heparinderivaten der allgemeinen Formel worin R ein Wasserstoff- oder Alkalimetallatom bedeutet.Process for the preparation of heparin derivatives The invention relates to a process for the preparation of heparin derivatives of the general formula wherein R is a hydrogen or alkali metal atom.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise das neutrale Salz des Heparins mit einer langkettigen quaternären Ammoniumverbindung mit einem Niedrigalkylchlorameisensäureester umsetzt, das gebildete gemischte Anhydrid mit Monobenzylamin umsetzt, das erhaltene Amid mit einem Alkali salz einer niederen aliphatischen Carbonsäure behandelt, das erhaltene Alkalimetallsalz des N-Benzylheparinamids isoliert und dieses gegebenenfalls durch überleiten in wäßriger Lösung über einen in der sauren Form vorliegenden Kationenaustauscher in das N-Benzylheparinamid mit freien SO3H-Gruppen überführt. The process is characterized in that one is known per se Way the neutral salt of heparin with a long-chain quaternary ammonium compound reacted with a lower alkyl chloroformate, the mixed anhydride formed reacts with monobenzylamine, the amide obtained with an alkali salt of a lower one treated aliphatic carboxylic acid, the resulting alkali metal salt of N-benzylheparinamide isolated and this optionally by passing in aqueous solution over a Cation exchangers present in the acidic form in the N-benzylheparinamide with transferred to free SO3H groups.

Das nachstehende Reaktionsschema faßt diese Umsetzungen zusammen: Quaternäres Ammoniumsalz Niedrigalkyldes Heparins >hlorameisenester, Quaternäres Ammoniumsalz des erhaltenen gemischten Monobenzylamin Anhydrids Carbonsäure-Quaternäres Ammoniumsalz alkalisalz von N-Benzylheparinamid Alkalisalz des N-Benzylheparinamids. The following reaction scheme summarizes these reactions: Quaternary Ammonium salt lower alkyl of heparin> chloroform iron ester, quaternary ammonium salt of the obtained mixed monobenzylamine anhydride carboxylic acid quaternary ammonium salt alkali salt of N-benzylheparinamide Alkali salt of N-benzylheparinamide.

Als quaternäre Ammoniumsalze des Heparins können die nach dem Verfahren der deutschen Patentanmeldung U 5756 IVb/l2o (deutsche Auslegeschrift 1 228 241) aus Heparin und Trimethyl-(methyldodecylbenzyl) - ammoniumchlorid, Alkyldimethyl - (methylencarboxyäthyl) - ammoniumbromid, Dilauryldimethylammoniumchlorid, Dimethylalkylben zylammoniumchlorid oder insbesondere dem unter der internationalen Kurzbezeichnung »Benzethoniumchlorid« bekannten Benzyldimethyl-L- [2-(p-1,1,3,3-tetramethylbutylphenoxy) - äthoxy] - äthylammoniumchlorid herstellbaren Salze verwendet werden. The quaternary ammonium salts of heparin can be those according to the process of the German patent application U 5756 IVb / l2o (German Auslegeschrift 1 228 241) from heparin and trimethyl (methyldodecylbenzyl) ammonium chloride, alkyldimethyl - (methylencarboxyethyl) - ammonium bromide, dilauryldimethylammonium chloride, dimethylalkylbene zylammonium chloride or in particular the one under the international abbreviation "Benzethonium chloride" known benzyldimethyl-L- [2- (p-1,1,3,3-tetramethylbutylphenoxy) - ethoxy] - ethylammonium chloride preparable salts can be used.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man das neutrale Benzethoniumheparinat als Ausgangsstoff, Chlorameisensäureäthylester als Niedrigalkylchloram eisen ester sowie Natriumacetat in wäßriger Lösung als Alkalicarboxylat und isoliert das N-Benzylheparinamid in Form seines Alkalisalzes durch Ausfällung mit einem Alkanol, z. B. Methanol. According to a preferred embodiment of the method according to the invention the neutral benzethonium heparinate is used as the starting material, ethyl chloroformate iron as lower alkylchloramate and sodium acetate in aqueous solution as alkali metal carboxylate and isolates the N-benzylheparinamide in the form of its alkali salt by precipitation with an alkanol, e.g. B. methanol.

Die erfindungsgemäß herstellbaren neuen Verbindungen besitzen eine verlängerte antikoagulierende Wirkung. The novel compounds which can be prepared according to the invention have a prolonged anticoagulant effect.

Heparinderivate, die eine verlängerte antikoagulierende Wirksamkeit besitzen, sind bereits bekannt. Heparin derivatives that have a prolonged anticoagulant activity are already known.

Demgegenüber haben aber das erfindungsgemäß erhältliche N-Benzylheparinamid und seine Alkalimetallsalze eine verlängerte antikoagulierende Wirksamkeit, die schon bei verhältnismäßig geringen Mengen ausgeprägt ist. Außerdem zeigen diese Verbindungen eine erhöhte antilipämische und klärende Wirkung, die für die Behandlung oder Verhütung von Thrombosen geeignet ist, die bei K reislauferkrankungen, Arteriitis, Phlebitis sowie bei Herzkrankheiten auftreten können, wobei die bei Heparin notwendigen wiederholten intravenösen Injektionen bzw. kontinuierlichen intravenösen Perfusionen vermieden werden können.In contrast, however, have the N-benzylheparinamide obtainable according to the invention and its alkali metal salts have a prolonged anticoagulant activity that is pronounced even with relatively small amounts. Also show this Compounds have an increased anti-lipemic and clarifying effect necessary for treatment or the prevention of thromboses, which are associated with circulatory diseases, arteritis, Phlebitis as well as heart disease can occur, with those necessary with heparin repeated intravenous injections or continuous intravenous perfusions can be avoided.

Der Vorteil des erfindungsgemäß erhältlichen N-Benzylheparinamids gegenüber dem Heparin besteht besonders darin, daß bei der erfindungsgemäß herstellbaren Verbindung eine anfangs zwar nicht so hohe antikoagulierende Aktivität vorliegt, die aber für längere Zeit nach der Verabreichung aufrechterhalten bleibt. Dies ist von Wichtigkeit, da es beispiels-weise im Verlauf einer Operation eine bedeutende Gefahr darstellt, wenn das Blut des Patienten inkoagulierbar oder sehr wenig koagulierbar ist, weil die antikoagulierende Wirkung des verabreichten Mittels übermäßig hoch ist. Bei der Verabreichung des erfindungsgemäß erhältlichen N-Benzylheparinamids ist die sofort zu beobachtende Koagulierungszeit nicht so übermäßig hoch wie nach der Verabreichung des Heparins, und die Verringerung der Köagulierungszeit verläuft bei der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung viel gleichmäßiger und weniger steil, wie aus der nachstehenden Vergleichstabelle ersichtlich ist. The advantage of the N-benzylheparinamide obtainable according to the invention compared to the heparin consists in the fact that in the inventively producible Compound does not initially have as high an anticoagulant activity, but which is maintained for a long time after administration. This is of importance, for example in the course of an operation there is a significant one There is danger when the patient's blood is incoagulable or very poorly coagulable is because the anticoagulant effect of the administered agent is excessively high is. When administering the N-benzylheparinamide obtainable according to the invention the coagulation time observed immediately is not as excessively high as after administration of the heparin, and the reduction in coagulation time progresses much more uniformly with the compound obtainable according to the invention and less steep, as can be seen from the comparison table below.

Gegenüber synthetischen Antikoagulantien des Dicumarintyps besitzt das N-Benzylheparinamid den zusätzlichen Vorteil, keine verzögert einsetzende Wirkung (»tote Zeit«) und eine gut bestimmbare Wirkungsdauer zu haben. Außerdem kann im Falle einer Uberdosierung die antikoagulierende Wirkung des N-Benzylheparinamids durch Injektion von Protaminsulfat sofort gestoppt werden. Compared to synthetic anticoagulants of the dicumarin type the N-benzylheparinamide has the additional advantage of not having a delayed effect ("Dead time") and to have an easily determinable duration of action. In addition, in the In case of overdose, the anticoagulant effect of N-benzylheparinamide stopped immediately by injecting protamine sulfate.

Außerdem zeigt sich die Wirkung des N-Benzylheparinamids und seiner Alkalisalze, soweit dies bekannt ist, in allen Stufen der Gerinnung, was ihre Wirkung für den Organismus sicherer und ungefährlicher macht. In addition, the effect of N-benzylheparinamide and its can be seen Alkali salts, as far as is known, in all stages of coagulation, what their effect makes it safer and less dangerous for the organism.

Die Verabreichung erfolgt transkutan oder rektal in Form von intramuskulären, subkutanen oder intravenösen Injektionen. It is administered transcutaneously or rectally in the form of intramuscular, subcutaneous or intravenous injections.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung. The following example illustrates the invention.

Beispiel Herstellung des Natriumsalzes von N-Benzylhparinamid In einen Dreihalskolben bringt man 100 ml Tetrahydrofuran und 10 g des aus Benzethoniumchlorid und Heparin nach dem Verfahren der Patentanmeldung U 5756 IV b112 o (deutsche Auslegeschrift 1 228 241) erhaltenen neutralen Salzes und rührt bis zur vollständigen Auflösung. Man kühlt auf 0°C, gibt 3,3 ml Chlorameisensäureäthylester zu, rührt und gibt danach 25 ml Monobenzylamin zu. Es bildet sich ein Niederschlag. Die Reaktionsmischung läßt man über Nacht in Eis stehen und dampft danach im Vakuum ein. Der Rückstand wird in 100 ml Butanol aufgenommen, und die Butanollösung wird mehrmals mit einer 200lnigen wäßrigen Natriumacetatlösung extrahiert. Dann fällt man das Natriumsalz des N-Benzylheparinamids mit Methanol aus. Der Niederschlag wird abgenutscht und mit Methanol gewaschen. Den Niederschlag nimmt man wieder in destilliertem Wasser auf. Dann gibt man 300 ml IO"joige Benzethoniumchloridlösung zu. Das Benzethoniumsalz fällt aus, wird abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Auf diese Weise erhält man 9,5 g von Benzylheparinamid in Form des Benzethoniumsalzes. Example Preparation of the sodium salt of N-benzyl parinamide In 100 ml of tetrahydrofuran and 10 g of benzethonium chloride are placed in a three-necked flask and heparin according to the method of patent application U 5756 IV b112 o (German Auslegeschrift 1 228 241) obtained neutral salt and stirred until complete dissolution. The mixture is cooled to 0 ° C., 3.3 ml of ethyl chloroformate are added, the mixture is stirred and then added Add 25 ml of monobenzylamine. A precipitate forms. The reaction mixture it is left to stand in ice overnight and then evaporated in vacuo. The residue is taken up in 100 ml of butanol, and the butanol solution is several times with a Extracted 200ligen aqueous sodium acetate solution. Then the sodium salt is precipitated of N-benzylheparinamide with methanol. The precipitate is sucked off and washed with methanol. The precipitate is taken up again in distilled water on. 300 ml of benzethonium chloride solution are then added. The benzethonium salt precipitates, is separated off, washed with distilled water and dried in vacuo. In this way, 9.5 g of benzylheparinamide are obtained in the form of the benzethonium salt.

Mit den 9,5 g des oben erhaltenen Produktes führt man eine zweite Amidierung unter den gleichen Bedingungn wie vorher durch. Man erhält so schließ lich 2,7 g Benzylheparinamidnatriumsalz. Dieses Produkt ist zu 93°l(l amidiert. A second one is carried out with the 9.5 g of the product obtained above Amidation under the same conditions as before. One obtains so close Lich 2.7 g of benzylheparinamide sodium salt. This product is 93 ° l (l amidated.

Das N-Benzylheparinamidnatriumsalz fällt in Form eines weißen amorphen Pulvers an, das in Wasser sehr leicht löslich, in verdünnten wäßrigen Säuren und Alkalien löslich, in Alkohol, Ather, Aceton, Benzol und Chloroform unlöslich ist. Sein Drehwert beträgt [«j = +69,8 (c (c = l 1010 in Wasser). The N-benzylheparinamide sodium salt falls in the form of a white amorphous Powder that is very easily soluble in water, in dilute aqueous acids and Soluble in alkalis, insoluble in alcohol, ether, acetone, benzene and chloroform. Its rotation value is [«j = +69.8 (c (c = l 1010 in water)).

Analyse (Benzylheparinamidnatriumsalz): Bruttoformel: C76H93O69N8S11Na11)n -- (2828,30)n Berechnet: C 32,27%, H 3,31 Wo, N 3,95%, Asche 27,600/0; gefunden: C 32,7°/o, H3.80io, N3,8"lo, Asche 26,85Wo.Analysis (Benzylheparinamide sodium salt): Gross formula: C76H93O69N8S11Na11) n - (2828.30) n Calculated: C 32.27%, H 3.31 wk, N 3.95%, ash 27,600 / 0; found: C 32.7 ° / o, H3.80io, N3.8 "lo, ash 26.85 wo.

C 32.90/o, H 3,9/", N 3,8°/(" Die Verbindung wurde bisher in der Literatur noch nicht beschrieben. C 32.90 / o, H 3.9 / ", N 3.8 ° / (" The compound was previously in the Literature not yet described.

Bestimmung der sofortigen antikoagulierenden Wirkung »in vitro« Man stellt ein reaktives Plasma her, das von Calcium und Prothrombin befreit ist. Durch Zusat von Thrombin zu diesem Plasma überführt man das darin enthaltene Fibrinogen in Fibrin. Hierbei erfolgt gleichzeitig eine Gerinnung und das Auftreten eine Trübung. Die vorherige Zugabe eines antikoagulierenden Mittels, wie z. B. Heparin, bewirkt ein Verlangsamung der Gerinnung und der Trübung bildung. Mißt man nun die Zeiten, die zur Erzielung eines gegebenen Trübungswertes erforderlich sind. so beobachtet man eine Beziehung zwischen diese Zeit und der Gerinnungsaktivität des Präparats Die erhaltenen Werte werden als diejenigen ausgedrückt, die mit einer titrierten Heparineichlösung erhalten werden. Diese Werte werden als antithrombische Einheiten (A. T. E.) ausgedrückt. Determination of the immediate anticoagulant effect "in vitro" Man creates a reactive plasma that has been freed of calcium and prothrombin. By When thrombin is added to this plasma, the fibrinogen contained therein is transferred in fibrin. At the same time, coagulation occurs and turbidity occurs. The prior addition of an anticoagulant such as B. heparin causes a slowing down of coagulation and the formation of turbidity. If you measure the times which are necessary to achieve a given turbidity value. so observed a relationship between this time and the coagulation activity of the preparation The values obtained are expressed as those titrated with a Heparin calibration solution can be obtained. These values are called antithrombic units (A. T. E.) expressed.

Ergebnisse: Eichheparin als Na-Salz (Vergleich) . 130 bis 140 ATE/mg N-Benzylheparinamid als Na-Salz (gemäß vorstehendem Beispiel) ... 25 bis 28 ATE/mg Bestimmung der verlängerten antikoagulierenden Wirkung »in vivo« bei intravenöser Verabreichung Die Wirkung wird am Kaninchen untersucht. Man mißt sie, indem man die Gerinnungszeit in regelmäßigen Abständen (2, 4, 6, 8, 10 Stunden nach der intravenösen Injektion der untersuchten Verbindung) bestimmt.Results: Eichheparin as sodium salt (comparison). 130 to 140 ATE / mg N-Benzylheparinamide as Na salt (according to the previous example) ... 25 to 28 ATE / mg Determination of the prolonged anticoagulant effect "in vivo" with intravenous Administration The effect will be investigated in rabbits. You measure it by the clotting time at regular intervals (2, 4, 6, 8, 10 hours after the intravenous Injection of the compound under investigation).

Die Verbindungen wurden in Dosen von 10 und 20 mg/kg verabreicht. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten: Antikoagulierende Aktivität Verabreichte Verbindung 10 mg1 kg 20mg/kg Zahl der Einheiten Wirkungsdauer Zahl der Einheiten Wirkungsdauer pro Kilogramm Stunden pro Kilogramm Stunden Heparin als Na-Salz (Vergleich) . . 1300 4 2600 6 bis 7 N-Benzylheparinamid als Na-Salz (Beispiel) ...... . 250 3 bis 4 500 7 bis 8 Dauer der antikoagulierenden Aktivität nach einer einzigen intravenösen Injektion Verabreichte Substanz Zeitpunkt der Entnahme Heparin 20 rng;kg N-nenzyl-heparinamid 20 mg kg Kontrolle (normale Koagulierungszeit vor der Injektion ) l 9 Minuten 19 Minuten 2 Stunden nach der Injektion .. ......... 180 Minuten 109 Minuten 4 Stunden nach der Injektion .. ..... 123 Minuten 90 Minuten 6 Stunden nach der Injektion ........ ........ 18 Minuten 79 Minuten 8 Stunden nach der Injektion . .................. i 17 Minuten 47 Minuten Wie sich aus den Tabellen ergibt, besitzt das N-Benzyllleparinamid eine verlängerte antikoaguliegende Wirkung bei viel kleineren antikoagulierenden Dosen (ausgedrückt in Einheiten), als sie bei Heparin zur Erzielung einer Wirkung von gleicher Größenordnung erforderlich sind.The compounds were administered in doses of 10 and 20 mg / kg. The following results were obtained: Anticoagulant activity Compound administered 10 mg 1 kg 20 mg / kg Number of units of effect duration Number of units of effect duration per kilogram of hours per kilogram of hours Heparin as sodium salt (comparison). . 1300 4 2600 6 to 7 N-Benzylheparinamide as Na salt (Example) ...... . 250 3 to 4 500 7 to 8 Duration of anticoagulant activity after a single intravenous injection Administered substance Time of removal Heparin 20 mg; kg N-nenzyl-heparinamide 20 mg kg Control (normal coagulation time before injection) l 9 minutes 19 minutes 2 hours after the injection .. ......... 180 minutes 109 minutes 4 hours after the injection .. ..... 123 minutes 90 minutes 6 hours after injection ........ ........ 18 minutes 79 minutes 8 hours after the injection. .................. i 17 minutes 47 minutes As can be seen from the tables, the N-benzylleparinamide has a prolonged anticoagulant effect at much smaller anticoagulant doses (expressed in units) than are necessary for heparin to achieve an effect of the same order of magnitude.

Bestimmung der klärenden Wirkung »in vitro« Die klärende Wirkung von N-Benzylheparinamid wurde unter Verwendung der von C. P l o t k a und R. J e q ti i e r (Areh. Int. pharmacodyn. 1960, 126, S. 140) beschriebenen Arbeitsweise bestimmt. Nachdem man sich an verschiedenen Heparinproben vergewissert hat, daß die Anderungen des antikoaguleerenden und des antilipämischen Titers immer parallel erlaul'en nimmt man als Bezugsstandard ein Heparin mit einem Titer von 150 antikoagulierenden Einheiten pro Milligramm und ordnet diesem willkürlich den Titer von 150 klärenden oder antilipämischen Einheiten zu, wodurch es möglich wird, anschließend das N-Benzylheparinamid in antilipämischen Einheiten zu bestimmen. Hierzu mißt man die Anderungen der Trübung bei der Einwirkung von steigenden Mengen von Standardheparin in Gegenwart von CaCI, am gleichen Volumen eines künstlichen Substrats aus Eidotter. Innerhalb bestimmter Konzentrationsgrenzen von Heparin ergibt die graphische Darstellung eine Gerade. Dann wiederholt man den Versuch mit N-Benzylheparinamid, und durch Auftragen auf die Bezugskurve erhält man den Titer der Probe in antilipämischen Einheiten (A. L.). Determination of the clarifying effect "in vitro" The clarifying effect of N-benzylheparinamide was obtained using the method described by C. P l o t k a and R. J e q ti i e r (Areh. Int. pharmacodyn. 1960, 126, p. 140) described procedure certainly. After checking various heparin samples to ensure that the changes in the anti-coagulant and anti-lipemic titers always parallel erlaul'en is taken as a reference standard a heparin with a titer of 150 anticoagulant Units per milligram and assigns this arbitrarily the titer of 150 clarifying or anti-lipemic units, which makes it possible to subsequently add the N-benzylheparinamide to be determined in anti-lipemic units. To do this, the changes in turbidity are measured when exposed to increasing amounts of standard heparin in the presence of CaCl, on the same volume of an artificial substrate made from egg yolk. Within certain Concentration limits of heparin, the graph shows a straight line. Then repeat the experiment with N-Benzylheparinamid, and by applying the reference curve gives the titer of the sample in anti-lipemic units (A. L.).

Der gefundene Titer beträgt 145 Einheiten pro Milligramm. The titer found is 145 units per milligram.

Claims

Claims: 1. Process for the preparation of heparin derivatives of the general formula wherein R denotes a hydrogen or alkali metal atom, characterized in that the neutral salt of heparin with a long-chain quaternary ammonium compound is reacted with a lower alkyl chloroformic acid ester in a manner known per se, the mixed anhydride formed is reacted with monobenzylamine, the amide obtained is reacted with an alkali salt Treated lower aliphatic carbonic acid, the alkali metal salt of N-benzylheparinamide obtained is isolated and this is optionally converted into the N-benzylheparinamide with free SO3H groups by passing in aqueous solution over a cation exchanger in the acidic form.

2. The method according to claim 1, characterized in that in the first stage the neutral benzyldimethyl-2- [2- (p- 1, I, 3,3-tetramethyS hutylphenoxy) - Ethoxyl - ethylammonium salt of heparin is reacted with chloroformic acid ethyl ester, that sodium acetate is used in aqueous solution as the alkali metal salt of a carboxylic acid and that the N-benzylheparinamide in the form of the sodium salt by means of precipitation of an alkanol isolated.

Publications considered: Announced documents of the Belgian patent specification No. 605170.