DE1238618B - Verfahren zur Konservierung biologischer Substanzen - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

A61k

DeutscheKl.: 30 h-2/04

Nummer: 1 238 618

Aktenzeichen: U7564IVa/30h

Anmeldetag: 8. November 1960

Auslegetag: 13. April 1967

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verbesserung des Wärmeaustausches beim raschen Abkühlen zum Konservieren biologischer Substanzen, wie z. B. Blut, Knochenmark oder Zellsuspensionen.

Die Konservierung biologischer Substanzen zur Verhütung der Zersetzung stellt ein schwieriges Problem dar, insbesondere bei der Konservierung von Blut (Ganzblut). Die bisherigen Verfahren oder Vorrichtungen haben sich nicht als vollständig befriedigend erwiesen.

Im Fall von Blut sind die primär lebensfähigen Bestandteile die Erythrocyten oder roten Blutkörperchen. Daher betrifft das Problem der Konservierung von Ganzblut grundsätzlich die Konservierung der roten Blutkörperchen. Die roten Blutkörperchen haben die Form runder Plättchen und enthalten eine besondere Art von Cytoplasma, das in einer halbpermeablen Membran eingeschlossen ist. Diese Membran bewahrt die Integrität des Proteins und den Elektrolytengehalt des eingeschlossenen Cytoplasmas. Die Membran ist zwar duktil, im wesentlichen jedoch unelastisch und besitzt daher ein entscheidendes Maximalvolumen, außerhalb dessen eine Beschädigung eintritt, die zu einer Freisetzung des Sauerstoff tragenden Trägers der Erythrocyten, d.h. des Hämoglobins, in das Blutplasma führt, wo dieses nicht zum Transport von Sauerstoff und Kohlendioxyd dienen kann. Die von einer gegebenen Anzahl von Zellen freigesetzte Menge an Hämoglobin Hefert ein Maß für die Wirksamkeit der verschiedenen Verfahren zur Blutkonservierung. Je geringer die freigesetzte Hämoglobinmenge ist, um so größer ist die Wirksamkeit des Verfahrens und/oder der Vorrichtung zur Konservierung der Zellen.

Im Kreislauf des Körpers besitzen die roten Blutkörperchen eine Lebensdauer von etwa 100 bis 120 Tagen. Außerhalb des Körpers verderben sie jedoch wesentlich schneller. Eine der Veränderungen, die das Blut außerhalb des Körpers beeinflussen, ist das Phänomen des Gerinnens. Für eine Lagerung ist es wichtig, daß die Blutgerinnung vermieden wird, was durch die Zugabe von Citrat-, Oxalat- oder FIuoridionen erzielt werden kann. Diese Ionen verhindern die chemische Veränderung, wie z. B. die Reaktion der Calciumionen mit bestimmten Komponenten, die gewöhnlich zum Gerinnen führt. Das Gerinnen ist jedoch nicht das einzige Problem bei der Blutlagerung.

Die roten Blutkörperchen haben ihren eigenen Stoffwechsel, und außerhalb des Körpers werden diese Stoffwechselverfahren fortgeführt, bis der Blutzucker aufgebracht und in Milchsäure umgewandelt ist. Ist Verfahren zur Konservierung biologischer
Substanzen

Anmelder:

Union Carbide Corporation,
New York, N. Y. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. W. Schalk, Dipl.-Ing. P. Wirth_l
Dipl.-Ing. G. E. M. Dannenberg
und Dr. V. Schmied-Kowarzik, Patentanwälte,
Frankfurt/M., Große Eschenheimer Str. 39

Als Erfinder benannt:

Arthur Piers Rinfret, Buffalo, Ν. Y.;
Clement William Cowley, Tonawanda, N. Y.;
Gerald Francis Doebbler, Buffalo, Ν. Y.;
William John Timson,
Harrisonburg, Va. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 9. November 1959
(851711)

dies erfolgt, so sind die zur Aufrechterhaltung der Zellstruktur wesentlichen Substanzen und Verfahren erschöpft. Weiterhin wird der pH-Wert des Plasmas durch die Akkumulierung von Milchsäure auf ein unerwünschtes Maß erniedrigt. Der osmotische Ausgleich zwischen dem intrazellularen Material und dem extrazellulären Material wird in abgezogenem Blut bald zerstört, und aus dem Plasma tritt Wasser in die Zellen ein, was ein übermäßiges Anschwellen und ein eventuelles Reißen der Membran verursacht. Diese Veränderungen treten bei Zimmertemperatur und normaler Citrat- und Glucosekonzentration schnell ein.

Das am meisten angewendete Verfahren zum Konservieren von Blut zur Verhinderung der obengenannten zerstörenden Veränderungen erfolgt, indem das Blut vom Spender in eine saure Citrat-Dextrose-Lösung aufgezogen und anschließend auf 4 bis 6°C abgekühlt wird. Dieses Verfahren ermöglicht jedoch eine sichere Lagerung von Ganzblut nur für etwa Wochen. Nach dieser Zeit ist die Zersetzung so

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weit fortgeschritten, daß die funktionelle Wirksamkeit der Blutzellen unterhalb ein annehmbares Maß abgesunken ist. Es ist daher unmöglich, diese Blutkonserven gestapelt zu lagern, da jede Einheit alle 3 Wochen ersetzt werden muß.

Auch andere Verfahren sind versucht worden, jedoch hat sich keine für eine länger dauernde handelsübliche Lagerung von Ganzblut in einzelnen Einheiten von je einem viertel oder einem halben Liter als wirksam erwiesen.

Ein weiteres brauchbares Verfahren zur Verhinderung der oben beschriebenen Zersetzungsprozesse ist eine so starke Erniedrigung der Temperatur des Blutes, daß dessen Stoffwechsel im wesentlichen aufhört. Dies erfolgt jedoch nur, wenn das Blut durch den Temperaturbereich des Einfrierens geführt wird. Ohne schützende Zusätze während des Einfrierens und Auftauens des Blutes wird die Integrität der Zellmembran so beschädigt, daß die Zellen hämolysiert werden.

Blut ist z. B. bereits in großen Mengen und auch als dünner Film gefroren worden. Wo ein Einfrieren in großen Mengen versucht wurde, wurden Schutzchemikalien, wie z. B. Glycerin, in Konzentrationen bis zu 50% verwendet, um die roten Blutkörperchen vor einer Beschädigung der Eiskristallisation zu schützen. Vor einer Transfusion müssen diese Schutzchemikalien aber wieder aus dem Blut entfernt werden. Daher haben sich diese Einfrierprozesse bei größeren Mengen als teuer und zeitraubend erwiesen. Weiterhin sind die zur Abtrennung der Schutzchemikalien aus dem Blut erforderlichen Vorrichtungen und Verfahren langwierig, teuer und zur Verwendung durch Krankenhauspersonal nicht brauchbar.

Bei einem anderen bekannten Verfahren wurde Polyvinylpyrrolidon als Schutzmedium zur Konservierung von Ganzblut verwendet (vgl. Compt. Rend. Sciences Soc Biol. 149, S. 875, 1955). Bei diesem Verfahren wird Blut mit 35 % Polyvinylpyrrolidon durch Eintauchen in ein Bad aus Trockeneis eingefroren. Dieses Verfahren hat wenig Wert, da ein großes Volumen Polyvinylpyrrohdon verwendet werden muß, anschließend die roten Blutkörperchen abgetrennt und erneut in einem Plasma suspendiert werden müssen, wobei ein mögliches Zusammenballen der Zellen, eine physikalische Zerstörung derselben usw. eintreten kann.

Weiterhin sind andere Verfahren zum Einfrieren von z. B. Nahrungsmitteln bekannt, unter anderem ein Verfahren zum Einfrieren von Kaffeeextrakt, indem der Kaffee in ein Bad aus Trifluortrichloräthan und η-Hexan bei niedriger Temperatur (—50 °C) eingespritzt wird. Dabei wird der Kaffee in das Gefrierbad am Fuß einer Kolonne eingespritzt und schwimmt aufwärts zu einer Entnahmestelle. Dieses Verfahren ist jedoch zur Konservierung von Blut nicht geeignet, da die Kohlenwasserstoffe und Halogenkohlenwasserstoffe eine Hämolyse der roten Blutkörperchen verursachen. Weiterhin verursacht das Ausspritzen des warmen Blutes direkt in das Kühlmittel von niedriger Temperatur das Einfrieren des Blutes in den Spritzdüsen und damit ein Verstopfen derselben.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Behandlung und Konservierung biologischer Substanzen, der auf einem verbesserten Wärmeaustausch beim raschen Abkühlen beruht.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zum Einfrieren und Auftauen großer Mengen Blut, wobei die Schutzzusätze nach dem Auftauen und vor der Transfusion nicht entfernt zu werden brauchen, wobei keine wesentliche Zersetzung der roten Blutkörperchen stattfindet und wobei die roten Blutkörperchen einen hohen Rückgewinnungswert besitzen.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, daß beim genügend schnellen Einfrieren und Auftauen die biologische Integrität der biologischen Substanzen, wie z. B. Blut, ohne wesentliche Beschädigung aufrechterhalten werden kann. Die Lagerdauer in eingefrorenem Zustand ist demgegenüber unerheblich. Leider können die zur Vermeidung einer biologischen Beschädigung erforderlichen, sehr hohen Einfrier- und Auftaugeschwindigkeiten durch die bisher verwendeten Verfahren, wie z. B. Eintauchen eines Blutlagerbehälters in ein Bad aus flüssigem Stickstoff, nicht erzielt werden. Bei den bekannten Verfahren lag die Geschwindigkeit des Wärmeaustausches zwischen dem flüssigen Stickstoff und dem Behälter im Bereich von 1360 g-cal/ Std. · cm² Behälteroberfläche, bis die Temperatur der Innenwand des Behälters auf etwa —175° C verringert war; an diesem Punkt erhöht sich die Geschwindigkeit des Wärmeaustausches sehr stark. Die anfängliche Wärmeaustauschgeschwindigkeit ist jedoch für ein schnelles Einfrieren, ohne daß z. B. eine wesentliche Verringerung des Prozentsatzes an zurückgewinnbaren roten Blutkörperchen eintritt, zu gering. Es wurde gefunden, daß bei einer Geschwindigkeit des Wärmeaustausches von mindestens 3660 g-cal/Std. · cm², vorzugsweise mindestens 6520 gcal/Std. · cm² während des gesamten Verfahrens das Einfrieren in genügend kurzer Zeit durchgeführt werden kann, so daß eine hohe Rückgewinnung an roten Blutkörperchen in der Größenordnung von mindestens 85% erzielt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Verbesserung des Wärmeaustausches beim raschen Abkühlen zum Konservieren biologischer Substanzen, wie Blut, Knochenmark oder Zellsuspensionen, bei dem von der äußeren Oberfläche des die betreffende Substanz enthaltenden Behälters schnell Wärme abgezogen wird, indem der Behälter mit flüssigem Stickstoff oder einem flüssigen Edelgas in Berührung gebracht wird, und dieser Wärmeentzug fortgesetzt wird, bis die biologische Substanz eingefroren ist, und ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Behälter verwendet, der auf der äußeren Oberfläche einen dünnen wärmeisolierenden Überzug aus Glycerin, Polyvinylpyrrolidon, Vaseline, Öl oder Siliconöl besitzt.

Bei Verwendung der angegebenen meist wasserlöslichen Überzüge wird der Wärmeaustausch in der oben angeführten Geschwindigkeit durchgeführt. Der durch das Isoliermittel gebildete Film soll so beschaffen sein, daß er so viel Isolierkraft besitzt, daß der Temperaturunterschied zwischen der Wärme zurückweisenden Oberfläche des überzogenen Feststoffes und einem siedenden Kühlmedium auf einen solchen Wert gebracht wird, wo ein wirksamerer Wärmeaustausch erfolgt.

Die Wärmeaustauschgeschwindigkeit kann weiter verbessert werden, indem man auf den obengenannten dünnen Isolierfilm, der dann als Grundüberzug dient, eine Schicht aus bestimmten pulverförmigen Mate-

rialien, nämlich Zucker, Gips, Kieselsäure oder Kieselsäure enthaltende Materialien aufbringt. Es wird angenommen, daß diese pulverige Schicht die Wärmeaustauschgeschwindigkeit aus mindestens zwei Gründen weiter erhöht: erstens wird durch die Diskontinuität der Oberfläche eine Blasenbildung beschleunigt, und zweitens werden die äußeren Teile der Pulverteilchen schnell abgekühlt, wodurch im Gebiet der Kerne schnell ein Sieden hervorgerufen wird. Glycerin eignet sich beispielsweise ausgezeichnet als Material zur Bildung des dünnen Isolierfilmes, und feinzerteilte Kieselsäure hat sich z. B. als besonders wirksam für die pulverige Schicht erwiesen.

Das Auftauen der eingefrorenen biologischen Substanz erfolgt, indem die Behälterwände mit Wasser einer Temperatur von zweckmäßig unterhalb etwa 55 ⁰C in Berührung gebracht werden. Der Isolierfilm und die pulverige Schicht werden durch diese Berührung meist entfernt. Zur Erzielung des notwendigen schnellen Auftauens besteht der Behälter zweckmäßig aus einem Material mit einem K/L-Wert von mindestens 0,3375, wobei K = g-cal/Std. · cm² · °C, und L — Wanddicke in Zentimeter ist.

Der Behälter wird zweckmäßig sowohl während des schnellen Einfrierens wie auch des Auftauens geschüttelt, um einen einheitlichen Wärmefluß durch die biologische Substanz im Behälter zu erleichtern. Die Berührung des Behälters mit der Kühlflüssigkeit erfolgt zweckmäßig so lange, daß die biologische Substanz unterhalb ihres kritischen Temperaturbereiches abgekühlt wird, wonach das gefrorene Material jede gewünschte Dauer lang gelagert werden kann. Der Ausdruck »kritischer Temperaturbereich« soll sowohl die Einfrierzone als auch die Unterkühlzone umfassen, da Zellschäden in beiden Zonen auftreten können. Im Fall von Blut liegt der kritische Temperaturbereich etwa zwischen dem Punkt, wo die Blutmischung im wesentlichen eingefroren ist, und etwa -50°C.

Obgleich die vorliegende Erfindung besonders im Hinblick auf die Blutkonservierung abgefaßt wurde, eignet sie sich selbstverständlich ebenso gut zur Konservierung anderer biologischer Substanzen, wie Knochenmark, Serum (Blut ohne Zellen und Fibrinogen), Blutplasmafraktionen und Wirbelsäulenflüssigkeiten. Auch Mikroorganismen können so konserviert werden, wie z. B. die Bakterien Azotobacter vinelandi, Escherichia coli und Micrococcus pyrogenes, der Fungus Aspergillus niger und die Hefe Saccharomyces sp.

In den Zeichnungen zeigt

F i g. 1 die Kurve des Wärmeaustausches durch Sieden und veranschaulicht das Verhältnis zwischen Wärmefluß und Temperaturdifferenz zwischen der Oberfläche eines erhitzten Feststoffes und einer siedenden Flüssigkeit;

F i g. 2 zeigt die Kurve der Kühlgeschwindigkeit für flüssigen Stickstoff, wobei die Kühlzeit gegen die Dicke des Isolierfilmüberzuges aufgetragen ist;

F i g. 3 zeigt eine Reihe von Wärmeaustauschkurven bei verschiedener Dicke eines Überzuges aus demselben Material;

F i g. 4 zeigt eine Reihe von Wärmeaustauschkurven für Überzüge aus verschiedenem Isoliermaterial ;

F i g. 5 zeigt eine Kurve, die die Verbesserung des Wärmeaustausches bei einer Probe mit einem Zucker-Glycerin-Überzug verdeutlicht;

F i g. 6 zeigt eine Reihe von Kühlkurven für Zucker-Glycerin-Überzüge, die die Wirkung verschiedener Variabler bei einem Temperaturbereich von 25 bis —196°C angeben;
F i g. 7 zeigt eine Reihe von Kühlkurven für Zucker-Glycerin-Überzüge, die die Wirkung verschiedener Variabler bei einem Temperaturbereich von O bis —75⁰C angeben;
F i g. 8 zeigt eine Reihe von Wärmeaustauschkurven für Zucker-Glycerin-Überzüge, die die Wirkung derselben Variablen von F i g. 7 bei einem Temperaturbereich von —75 bis 0°C angeben;

F i g. 9 ist eine perspektivische Draufsicht auf einen rechteckigen Behälter zur Lagerung biologischer Substanzen gemäß der vorliegenden Erfindung;

F i g. 10 ist eine perspektivische Draufsicht auf einen zylindrischen Behälter zur Lagerung biologischer Substanzen gemäß der vorliegenden Erfindung;
F i g. 11 ist eine perspektivische Draufsicht auf einen andersartig geformten Behälter zur Lagerung biologischer Substanzen, und

F i g. 12 ist ein Längsschnitt des in F i g. 11 gezeigten Behälters entlang der Linie 12-12.

Die Faktoren, die die Konservierung von Blut in großen Mengen beeinflussen, werden im folgenden im einzelnen erwähnt.

Antikoaguliermedium

Besonders geeignet als solche Medien sind übliche Citrat-Dextrose-Lösungen oder Heparinlösungen. Dies ist ein augenblicklich übliches Verfahren zur Konservierung von echtem menschlichem Blut durch Kühlung auf 4 bis 6°C

Schutzzusätze

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden bestimmte lösliche Verbindungen, die hierin als Schutzzusätze bezeichnet werden, verwendet und ermöglichen das Einfrieren und Auftauen mit einem hohen Prozentsatz an Rückgewinnung der Zellen.

Die verschiedenen Zusätze unterscheiden sich deutlich voneinander in der Geschwindigkeit, mit welcher sie in die Zellen eintreten oder von diesen aufgenommen werden; einige Verbindungen treten auf Grund von Größe oder Struktur nicht in die Zellen ein. Rote Blutkörperchen sind z. B. gegenüber Glucose permeabel, jedoch impermeabel gegenüber Lactose und Sucrose. Die in die Zellen eingehenden Materialien können durch einfache Diffusion oder »aktive Aufnahme« einverleibt werden, welch letzteres vom Enzymsystem oder den Trägersubstanzen im Zellmembran abhängt. Glycerin tritt sehr schnell ein, Glucose etwas langsamer. Wegen ihrer Molekülgröße und der Abwesenheit geeigneter Transportsysteme treten die Di- und Trisaccharide nicht ein. Diese Unterschiede der Permeabilität lassen sich leicht veranschaulichen, indem man rote Blutkörperchen Lösungen der verschiedenen Substanzen aussetzt und die zellularen Konzentrationen direkt analysiert oder die gesamte erhöhte intrazellulare Konzentration durch osmotische Verfahren bestimmt.

Die Schutzzusätze lassen sich in vier Klassen einteilen:

g₅ (a) Zucker mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen

Diese sind dadurch gekennzeichnet, daß sie bekanntlich durch die Membran der roten Blutkörperchen hindurchgehen. Zu dieser Klasse gehören z. B.

Xylose, Arabinose, Ribose, Glucose, Fructose, Galactose und Mannit. Wirksame Konzentrationen für diese Klasse liegen im Bereich von 0,3 bis 0,75 Mol/1.

(b) Di- und Trisaccharide

Diese sind dadurch gekennzeichnet, daß sie nicht in die roten Blutkörperchen eindringen. Hierzu gehören Maltose, Rohrzucker, Lactose und Raffinose. Wirksame Konzentrationen liegen im Bereich von 0,075 bis 0,3 Mol/1.

(c) Hochmolekulare, wasserlösliche Polymerisate

Diese sind wie Klasse (b) dadurch gekennzeichnet, daß sie nicht in die roten Blutkörperchen eindringen.

Dazu gehören Dextran und Polyvinylpyrrolidon. Wirksame Konzentrationen liegen im Bereich von 6 bis 10 Gewichtsprozent. (Die Angabe von Gewichtsprozent an Stelle der Molarität wird auf Grund der hohen Molekulargewichte bevorzugt.)

(d) Mischungen aus mindestens je einer Verbindung der Klassen (a) und (b) oben

Eine solche Mischung sind z. B. Lactose und Glucose. Solche Mischungen sollten wirksamer sein als irgendein einzelner Zusatz, wenn sie in etwa Mindestkonzentration verwendet werden. Diese Schlußfolgerung stützt sich auf die Daten von Tabelle 1.

Tabelle

Schützende Wirkung der verschiedenen Zucker beim Einfrieren und Auftauen

Zuckerkonzentration
Mol/1

Rückgewinnung der roten Blutkörperchen in %
Temperatur des Einfrierbades, °C

-20	-40	-77	-120
7	17	62	45
9	43	72	69
18	49	83	83
2	11	35	45
3	17	51	59
9	29	61	71
13	30	65	69
25	47	76	82
38	42	84	82
44	66	87	85
47	64	86	86
44	73	88	84

Lactose 0,1

Lactose 0,2

Lactose 0,3

Glucose 0,1

Glucose 0,2

Glucose 0,3

Lactose 0,1 — Glucose 0,2
Lactose 0,1 — Glucose 0,4
Lactose 0,1 —■ Glucose 0,6
Lactose 0,3 — Glucose 0,1
Lactose 0,3 — Glucose 0,2
Lactose 0,3 — Glucose 0,3

Das Verfahren für die Versuche in Tabelle 1 war wie folgt: Proben aus 4 Vol. Blut wurden mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung und dem jeweiligen Zucker auf die angegebene Zuckerkonzentration gemischt. Dann wurden 5-ccm-Proben in dünnwandigen Aluminiumrohren eines elliptischen Querschnittes von 4 · 29 mm eingefroren, indem sie in ein geeignetes Bad aus Trockeneis und Methanol (—20, —40, —77°C) oder Isopentan, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde (—120°C) eingetaucht wurden. Das Auftauen erfolgte durch Eintauchen in Wasser von 40 °C.

Tabelle 1 zeigt, daß die Rückgewinnung der roten Blutkörperchen sich erhöht, wenn die Proben in Bädern mit niedrigeren Temperaturen eingefroren werden.

Überzüge zum besseren Wärmeaustausch

Der Wärmeaustausch tritt entweder in gleichmäßig fortlaufendem Ausmaß oder ungleichmäßig (»steady State« bzw. »unsteady State«) auf. In allen Fällen von Wärmeaustausch durch Leitung, Konvektion oder Sieden muß ein Temperaturgradient bestehen. In Fällen, wo die Temperatur bezüglich Zeit und Stellung konstant bleibt, verläuft der Wärmeaustausch als gleichmäßiges Verfahren. Wird daher ein dampferhitztes Rohr in einen Behälter mit siedendem flüssigem Stickstoff eingetaucht, so fällt die Temperatur während des ersten Teiles des Eintauchens, wird aber allmählich praktisch konstant und bleibt so unter gleichmäßigen Bedingungen, solange Wasserdampf mit konstanter Geschwindigkeit durch das eingetauchte Rohr fließen gelassen wird.

Ungleichmäßiger Wärmeaustausch herrscht in Fällen vor, wo die Temperatur im System mit Zeit und Stellung variiert. So ist z. B. ein Abschrecken ein Wärmeaustausch mit ungleichmäßigem Verlauf. Die Temperaturen an verschiedenen Stellen der Probe fallen während des Abschreckens mit verschiedener Geschwindigkeit. Da die Wärmeaustauschgeschwindigkeiten durch sich ändernde Temperaturen beeinflußt werden, sind diese Geschwindigkeiten ebenfalls veränderlich.

Siedet eine mit einem erhitzten Feststoff in Berührung stehende Flüssigkeit bei einem gegebenen Druck, so hängt die Wärmeaustauschgeschwindigkeit ab von der Temperaturdifferenz zwischen der Oberfläche des Feststoffes und der der siedenden Flüssigkeit. Diese Abhängigkeit resultiert in spezifischen Siedebereichen, die graphisch dargestellt werden können. F i g. 1 zeigt die allgemeine Form einer Wärmeaustauschkurve durch Sieden, wobei der Wärmefluß (QjA) gegen die Differenz der Temperatur zwischen der Oberfläche des erhitzten Feststoffes und der Temperatur der siedenden Flüssigkeit {AT) aufgetragen ist. Es wird bemerkt, daß die Koordinaten in logarithmischem Maßstab aufgetragen wird. Wird die Oberflächentemperatur des mit der Flüssigkeit in Berührung stehenden Feststoffes oberhalb der Sättigungstemperatur der Flüssigkeit erhöht, so bilden sich an bestimmten Stellen auf der Oberfläche Dampfblasen (Kernbildungsstellen oder Nukleationsstellen). Diese

Blasen wachsen zu einer kritischen Größe an, lösen sich von der Oberfläche und steigen durch die Flüssigkeit. Die Erhöhung der Temperaturdifferenz Δ T von A nach B gemäß der Kurve verursacht eine größere Anzahl von Kernbildungsstellen und eine größere Häufigkeit der Blasenbildung an jeder Stelle. Die durch diese Blasen hervorgerufene Durchwirbelung liefert einen stärkeren Wärmeaustausch, bis Punkt B erreicht ist. An Punkt B, der der Punkt des kritischen Wärmeflusses genannt wird, ist die Zahl der Kernbildungsstellen so groß, daß sich die Blasen .gegenseitig stören und über der Oberfläche ein Dampffilm gebildet wird. Im Δ Γ-Bereich von B nach C ist dieser Dampf film unstabil und befindet sich im Zustand der ständigen Ableitung und Erneuerung mit sehr hoher Geschwindigkeit. Die geringe thermische Leitfähigkeit des Dampffilmes verringert die Wärmeaustauschgeschwindigkeit in diesem Bereich. An Punkt C wird der Dampffilm stabil und umhüllt den Feststoff vollkommen, wodurch eine verhältnismäßig ruhende Schranke über der heißen Oberfläche gebildet wird. Jenseits von C erhöht sich die Wärmeaustauschgeschwindigkeit teilweise auf Grund der Strahlungswirkung und teilweise auf Grund der erhöhten thermischen Leitfähigkeit des Dampfes mit steigender Temperatur. Im allgemeinen können die Bereiche wie folgt definiert werden:

A Γ-Bereich	Siedebereich
A B	Kernbildung (Nukleatsieden) Steck
nadelkopfgröße oder lokal
B C	unstabiler Film
C	stabiler Film

Während die Siedekurven für alle Flüssigkeiten im wesentlichen denselben Verlauf haben, variieren die mit der Kurve verbundenen Werte erheblich. Für Wasser bei atmosphärischem Druck entspricht PunktB etwa einem Δ T von 25 °C und einem Wärmefluß von 89 500 g-cal/Std. · cm², Punkt C erscheint bei Δ T von etwa 56° C und einem Wärmefiuß von etwa 27 200 g-cal/Std. · cm². Für flüssigen Stickstoff bei atmosphärischem Druck entspricht PunktiJ etwa einem Δ T von 30° C und einem Wärmenuß von 7880 g-cal/Std. · cm² und Punkte einem Δ T von 17°C und einem Wärmefluß von 544 g-cal/Std. ■ cm². Die verschiedenen Siedebereiche können veranschaulicht werden, indem man sich eine auf einem Ofen erhitzte Pfanne mit Wasser vorstellt. Das Wasser in unmittelbarer Nähe der Wärmequelle erreicht zuerst seine Sättigungstemperatur und wird dann leicht überhitzt. Dann werden an einzelnen Stellen des Pfannenbodens Blasen gebildet. Diese Blasen steigen auf und kondensieren in der kälteren Flüssigkeit. So, wie die Wärme auf den Pfannenboden weiter angewendet wird, werden Blasen an immer mehr Stellen gebildet, und die Häufigkeit der Bildung an jeder Stelle erhöht sich. Dies ist der Bereich des »Nukleatsiedens«. Allmählich wird jedoch ein Zeitpunkt erreicht, wo so viele Blasen gebüdet werden, daß sie einander stören und auf dem Pfannenboden einen unstabilen Dampffilm bilden. Das explosive Anwachsen und Zusammenfallen dieses Filmes wird sofort deutlich an der Oberfläche der Flüssigkeit, wo verhältnismäßig große Dampfvolumen freigesetzt

werden, die eine starke Durchwirbelung und damit manchmal ein »Überkochen« der Flüssigkeit verursachen. Dies ist das Sieden mit unstabilem Film. Wenn man sich vorstellt, daß die Pfanne leergekocht ist und eine geringe Menge Wasser auf den Pfannenboden gefallen ist, so erscheint nun das sogenannte »Leidenfrost«-Phänomen, d. h., die Wasserbläschen tanzen ohne merkliche Verdampfung auf der heißen Oberfläche. Dies geschieht, weil ein Film aus überhitztem Dampf unterhalb jedes Wasserbläschens besteht und als thermische Isolierung zwischen der erhitzenden Oberfläche und dem Wasser dient. Dies ist das Sieden mit stabilem Film.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Konservierung von Blut in großen Mengen muß die Wärme durch die festen Wände eines Lagerbehälters für die Blutmischung zu einem siedenden Kühlmittel ausgetauscht werden. Die Geschwindigkeit des Wärmeaustausches erhöht sich um das mehrfache, indem man die Temperaturdifferenz so verändert, daß sich das System in den Siedebereichen des unstabilen Films oder Nukleatsiedens befindet. F i g. 1 zeigt, daß die Art des Siedens und damit die Geschwindigkeit des Wärmeaustausches verändert werden kann durch eine Änderung der Temperaturdifferenz AT zwischen der siedenden Flüssigkeit und der Oberfläche, mit der sie in Berührung steht. Daher ergibt sich eine Verminderung des Wertes von Δ T von z. B. Punkt C zu beispielsweise einem Punkt irgendwo zwischen C und A' mit einer Erhöhung des Wärmeflusses vom Feststoff zur siedenden Flüssigkeit. Dies geschieht, indem man zwischen einem Feststoff und einer Flüssigkeit an ihrem Siedepunkt ein Material mit genügend geringer thermischer Leitfähigkeit zwischenschiebt, damit die Temperaturdifferenz AT zwischen der siedenden Oberfläche und der Flüssigkeit auf einen Wert eingestellt wird, der eine größere Wärmeaustauschgeschwindigkeit ermöglicht. Der Feststoff ist zweckmäßig ein Metall und vorzugsweise ein stark leitendes Metall, so daß der Widerstand gegen den Wärmefluß durch die Masse einer Trennwand möglichst verringert wird.

Das Isoüermaterial kann irgendeine Substanz sein, die im angewendeten Temperaturbereich chemisch und thermisch stabil ist und die eine geringere thermische Leitfähigkeit hat als das Material des Lagerbehälters für die Blutmischung. Die thermische Leitfähigkeit des Isoliermaterials liegt zweckmäßig unter 0,00062 g-cal/sec ■ cm² · ° C Das Isoüermaterial sollte so dick sein, daß der Wert von Δ T zwischen der siedenden Oberfläche und der Sättigungstemperatur des flüssigen Kühlmittels auf einen Punkt eingestellt wird, wo ein wirksamerer Wärmeaustausch eintritt. Die Dicke des Isolierfilmes, die zur Einstellung der Temperaturdifferenz Δ Tzwischen der siedenden Oberfläche und dem flüssigen Kühlmittel auf den wirksamsten Wert notwendig ist, ist eine Funktion seiner thermischen Leitfähigkeit und Dicke und der thermischen Leitfähigkeit der Behälterwand sowie der Siedeeigenschaften des flüssigen Kühlmittels.

Zur Veranschaulichung der Wirkung von dünnen Isolierüberzügen auf das Sieden von Feststoffen unter nicht gleichmäßigen Bedingungen wurden Aluminiuni2ylinder von 9,6 mm Durchmesser und 2,5 cm Länge mit und ohne Isolierüberzügen plötzlich in flüssigem, bei etwa —196 ⁰C siedendem Stickstoff eingetaucht. Ein Thermoelement wurde in die Mitte des Aluminiumzylinders gegeben und mit einem

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Temperaturmeßgerät verbunden, das die Temperatur an der Achse als eine Funktion der Zeit angab. Die zur Kühlung des Alunriniumzylinders von 25 auf —196°C erforderliche Zeit wurde notiert. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen für einen nicht isolierten Zylinder sowie für Zylinder mit verschieden dicken Isolierungen aus Petroleumparaffinrückständen (als »Vaseline« im Handel) sind in F i g. 2 angegeben.

Aus dem Abfallen der Kühlkurven des Temperaturmeßgerätes wurden die Wärmeaustauschgeschwindigkeiten in g-cal/Std. · cm² berechnet und, wie in F i g. 3 gezeigt, als Funktion der Zylindertemperaturen eingetragen.

Wie aus F i g. 2 hervorgeht, benötigte der nicht isolierte Zylinder etwa 55 Sekunden zur Abkühlung von 25 auf —196 ⁰C, während nur etwa 14 Sekunden zum Abkühlen eines identischen, jedoch mit 0,1 mm Petroleumparaffin isolierten Zylinders erforderlich waren. Eine Untersuchung von F i g. 3 zeigt, daß der nicht isolierte Zylinder mit einer Geschwindigkeit von weniger als 1630 g-cal/Std. · cm² von 0 auf etwa —150° C abkühlt und dann bei einer niedrigeren Temperatur eine schnelle Wärmeaustauschspitze von etwa 8150 g-cal/Std. · cm² durchläuft. Bei stärkerer Dicke der Isolierung wird die Wärmeaustauschspitze im Hinblick auf die Temperatur verbreitert. Wie oben angegeben, wurde gefunden, daß die Wärmeaustauschgeschwindigkeit mindestens 3310 g-cal/ Std. ■ cm² während des gesamten Temperaturbereiches betragen muß, um große Mengen Blut mit genügender Schnelligkeit für anschließende hohe Rückgewinnungswerte der roten Blutkörperchen einzufrieren. Falls daher die oben beschriebenen Aluminiumzylinder zur Aufnahme von Blut zwecks Einfrieren durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff verwendet werden sollen, so zeigt F i g. 3, daß ein Überzug aus Petroleumparaffin von mindestens 0,15 mm Dicke erforderlich wäre. Es wurden auch andere isolierende Filmüberzüge auf die Aluminiumzylinder aufgebracht und die zur Abkühlung von 25 ⁰C auf etwa —196° C in siedendem flüssigem Stickstoff erforderlichen Zeiten notiert. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Erforderliche Zeit zum Abkühlen eines Aluminiumzylinders von 9,5 mm Durchmesser und 2,5 cm Länge

von 25 auf —196°C ^

Kuhlzeit

Sekunden

1. Nicht überzogener Zyhnder 55

2. Gewundener Zylinder, nicht überzogen 40

3. Gehärtetes Epoxyharz, 0,04 mm 40

4. Gehärtetes Epoxyharz, 0,23 mm 28

5. Gehärtetes Epoxyharz, 0,75 mm 25

6. Klarer Lack, 0,04 mm 29

7. Klarer Lack, 0,10 mm 20

8. Vulkanisierter Kautschuk, 0,04 mm 26

9. Vulkanisierter Kautschuk, 0,23 mm 15

10. Haushaltsparaffin, 0,025 mm 36

11. Haushaltsparaffin, 0,27 mm 23

12. Haushaltsparaffin, 0,34 mm 26

13. Kautschukpräparat, 0,028 mm 38

14. Kautschukpräparat, 0,28 mm 17

15. Kautschukpräparat, 0,39 mm 19

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Kühlzeit Sekunden

16.

17.
18.

19.

20.

21.
22.

23.

24.

25.
26.

27.

Papierklebstreifen, 0,30 mm 19

Papierklebstreifen, 0,60 mm 32

Papierklebstreifen, 0,90 mm 38

Isolierband aus Kautschuk, 0,16 mm ... 18

Isolierband aus Kautschuk, 0,33 mm ... 26

IsoHerband aus Kautschuk, 0,50 mm ... 32

Vaseline, 0,01 mm 36

Vaseline, 0,025 mm 24

Vaseline, 0,05 mm
Vaseline, 0,10 mm
Vaseline, 0,15 mm

Vaseline, 0,20 mm 14

28
29.
30.

31. Asbest, 0,25 mm 42

32. Asbest, 0,95 mm 64

33. Natriumsilicat, 0,11 mm 33

34.
35.

36. Alabastergips, 0,19 mm 10

Vaseline, 0,25 mm
Vaseline, 0,37 mm
Vaseline, 0,45 mm

Natriumsilicat, 0,17 mm
Kaolin, 0,11 mm

Die Versuche zeigen, daß die Verwendung dünner Isolierfilme aus der obengenannten »Vaseline« auf Behältern zur Blutlagerung wesentlich schnellere Kühlzeiten ermöglichen und nach dem Auftauen eine erhöhte Rückgewinnung an roten Blutkörperchen ergeben. So war z. B. menschliches Blut, das 0,3 Mol/1 Lactose als Schutzzusatz enthielt, in den beschriebenen Aluminiumbehältern durch Eintauchen in ein Bad aus flüssigem Stickstoffvon —196 ⁰C eingefroren worden. Auf die Behälter wurden »Vaselinee-Überzüge mit sich verstärkender Dicke aufgebracht und nach dem Auftauen die Rückgewinnung an roten Blutkörperchen bestimmt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse:

Tabelle 3

Dicke des Vaselineüberzuges in mm	°/o Rückgewinnung der roten Blutkörperchen
0	65
0,001	69
0,023	73
0,16	78
0,24	82
0,26	82

Es wurde gefunden, daß die Wärmeaustauschgeschwindigkeit zwischen dem Kühlmittel und der Behälterwand weiter verbessert werden kann durch Aufbringung eines pulverigen Materials auf den dünnen Überzug des Isolierfilmes. Die Pulverschicht liefert eine diskontinuierliche Oberfläche zur beschleunigten Blasenbildung, und die äußeren Teile der Pulverteilchen kühlen schnell ab. Diese Eigenschaften verbessern die Geschwindigkeit, mit welcher das Sieden im Nukleatsiedebereich eintritt. Pulvereigenschaften, die vom Standpunkt des wirksamen Wärmeaus-

Tausches wichtig scheinen, sind die Teilchengröße und die Verteilung der Teilchengröße. Sind die physikalischen Eigenschaften der verwendeten Pulver ähnlich, und die Teilchengröße wird variiert, so ist ein etwas dickerer Isolierfilm notwendig, wenn die Teilchengröße des Pulvers verringert wird. Ein Kieselsäure-Aerogel-Pulver mit einer Teilchengröße von 0,04 Mikron lieferte die besten Ergebnisse mit einer 127 Mikron dicken Glycerinunterschicht, während pulverige, kristalline Metaaluminiumsilicatzeolit-Molekularsiebe mit einer Teilchengröße von 2 bis 4 Mikron optimale Wärmeaustauschgeschwindigkeiten zeigten, wenn sie auf einen Glycerinfilm von etwa 102 Mikron Dicke aufgebracht wurden.

Ist das Pulver ein verhältnismäßig schlechter Wärmeleiter, wie die nicht metallischen Substanzen, z. B. das obengenannte Kieselsäure-Aerogel- und Zeolitpulver, so helfen die Isoliereigenschaften beim Bilden einer Temperaturbeziehung zwischen Oberfläche und siedender Flüssigkeit, die zum Nukleatsieden benötigt wird, und es ist dabei nur eine verhältnismäßig dünnere isolierende Grundschicht notwendig als wenn ein guter Wärmeleiter, wie z. B. pulverisierte Metalle, verwendet werden.

Auf Grund der Beziehungen der Teilchengröße des Pulvers und der Dicke des Grundfilmes ist eine gewisse Einheitlichkeit der Teilchengröße des Pulvers notwendig. Allgemein werden Pulver mit kleinerer Größe bevorzugt, und diese sind gewöhnlich einheitlicher als gröbere Pulver.

Neben der feinzerteilten Kieselsäure, wie ζ Β. Kieselsäure-Aerogel, mit Agglomeratteilchengrößen von weniger als etwa 0,1 Mikron und kristallinen Zeolit-Molekularsieben A und X, die beide eine Agglomeratteilchengröße von 2 bis 4 Mikron besitzen, können Zuckerpulver verwendet werden. Kieselsäure-Aerogel wird gegenüber Zucker bevorzugt, da es in überfeinen Größen leichter erhältlich und einheitlicher ist, was in der Praxis zur Erzielung der besten Ergebnisse wünschenswert ist, während der Zucker zur Erzielung eines optimalen Überzuges auf die genaue Mesh-Größe vermählen werden muß. Zeolit A und X sind in den USA.-Patentschriften 2 882 243 bzw. 2 882 244 beschrieben.

Soll eine Pulverschicht verwendet werden, so muß für geeignete Filmüberzüge ein weiteres Erfordernis beachtet werden, d. h., der Grundüberzug muß aus einem Material bestehen, das das Pulver aufnimmt und festhält. Sowohl Glycerin wie auch Polyvinylpyrrolidon sind erfolgreich verwendet worden. Glycerin ist allein und in Verdünnung mit Methanol verwendet worden. Andere geeignete Materialien für Grundschichten sind Öle im allgemeinen und flüssige Silicone. Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Blutkonservierung wird ein wasserlöslicher Grundüberzug bevorzugt, der sich während des Auftauens abwaschen läßt. Jedes der obengenannten Materialien ist entweder wasserlöslich oder kann in einer wasserlöslichen Form erhalten werden. So sind z. B. viele Reinigungsöle erhältlich. Auch das Lösungs- oder Verdünnungsmittel, wie das obengenannte Methanol, kann variiert werden. So können z. B. Äthanol, Wasser oder Substanzen, die die Mischbarkeit des Filmes mit Wasser nicht beeinträchtigen, verwendet werden. Aufgabe des Verdünnungsmittels ist es, die Eigenschaften des Isoherfilmes so 6g einzustellen, daß (a) ein gut haftender einheitücher Film erhalten wird, ob er nun durch Sprühen, Eintauchen oder sonstwie aufgebracht wird, (b) er min-

destens so lange fließbar bleibt, bis die Zugabe des Pulvers erfolgte und (c) in manchen Fällen als Weichmacher dient und das Austrocknen und Abblättern während der Kühlstufe verhindert.

Der dünne Isolierfilm und die pulverige Schicht können auf die äußeren Wände des Blutlagerbehälters in irgendeiner geeigneten Weise, z. B. durch Eintauchen des Behälters in eine das Isoliermaterial enthaltende Lösung, erfolgen. In diesem Fall kann die Dicke des Isolierfilmes z. B. durch Einstellung der Konzentration der Lösung und der Zahl der Eintauchvorgänge geregelt werden.

Es kann z. B. eine Glycerin-Methanol-Lösung als Verdünnungsmittel hergestellt werden, die mindestens 20% Glycerin enthält. Dann wird der Behälter in diese Lösung eingetaucht, herausgenommen und etwa 30 Sekunden an der Luft stehengelassen. Das spätere »Altern« stabilisiert den Film vor der Aufbringung der pulverigen Schicht. Mindestens ein Teil des Lösungsmittels wird abgedampft, und der erhaltene Film wird einheitlicher, möglicherweise auf Grund einer Erhöhung der Viskosität. Einige Filmpräparate können merklich durch ein zu langes Altern leiden, indem ein zu großer Lösungsmittelverlust eine geringe Haftfähigkeit vor oder während des Einfrierens verursacht. Das Altern erfolgt zweckmäßig vor der Pulverzugabe zum Film, obgleich es auch hinterher geschehen kann.

Versuche haben gezeigt, daß der optimale Wärmeaustauschkoeffizient in der kritischen Temperaturzone erhalten wird, wenn eine 50°/oige Glycerin-Methanol-Lösung (gegenüber Lösungen oberhalb oder unterhalb dieses Wertes) verwendet wird, wobei das Pulver feinzerteiltes Kieselsäure-Aerogel ist. Wird ein Zuckerüberzug verwendet, so wird eine 22°/oige Glycerinlösung in Methanol bevorzugt. Die 50%ige Glycerinlösung liefert eine Filmdicke von etwa 0,13 mm im Vergleich zu 0,038 mm bei einer 22%igen Glycerinlösung. Wie erwähnt, liegt die bevorzugte Teilchengröße bei Kieselsäure bei weniger als 0,1 Mikron, während die bevorzugte Teilchengröße von Zucker bei einer Größe der Sieböffnungen von 0,221 bis 0,107 mm liegt.

Anstatt den dünnen Isoherfilm durch Eintauchen aufzubringen, können auch andere Verfahren, wie Besprühen von Hand, angewendet werden. Das Pulver wird zweckmäßig mit einem Treibgas auf den gealterten IsoHerfilm aufgesprüht.

Es wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, die die Zweckmäßigkeit von Glyceringrundschichten mit Schichten feinzerteilter Kieselsäure und Zucker zur Erhöhung der erfindungsgemäßen Wärmeaustauschgeschwindigkeit zeigt. Bei diesen Tests wurde ein 10,2 cm langes Rohr aus echtem Kupfer mit 4,13 cm Durchmesser mit einem Thermoelement in der Nähe der Oberfläche und einem anderen Thermoelement in der Mitte versehen. Auf das Rohr wurde ein Glycerinfilm durch Eintauchen in die angegebene Glycerinlösung, Herausnehmen und 30 bis 60 Sekunden langes Stabihsierenlassen aufgebracht, worauf das angegebene Pulver durch Besprühen des Filmes aufgebracht wurde. Das erhaltene Rohr wurde in flüssigen Stickstoff eingetaucht und die Kühlgeschwindigkeit an den beiden Thermoelementen bestimmt. Die Kühlzeit war diejenige vom Zeitpunkt, wo das äußere Thermoelement O⁰C unterschritt, bis das innere Thermoelement —46 ⁰C erreicht hatte. Dies umfaßt den kritischen Temperaturbereich beim Einfrieren von Blut. Es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

Tabelle 4

Kühlzeit, Sekunden (0° bis -46° C)	Glycerin- konzen tration in		Pulver
Methanol,
°/o	mm
10,5	20	0,038
6,8	30	0,051	sphärisches
7,1	42	0,076	Kieselsäurepulver
5,4	60	0,127	' mit Agglomerat-
großen von	6,9	80	0,203	Π 1 A/TiVrrvn VJ3 x IVJLIjS.! Lill	6,8	100	0,431
12,1	22	0,038	gekörnter Zucker
(90% größer als 0,221 mm)
8,1	22	0,038	gekörnter Zucker (im Mörser grob gestoßen)
7,0	22	0,038	>0,221 mm
5,7	22	0,038	0,221 bis 0,107 mm
6,2	22	0,038	0,107 bis 0,046 mm
8,0	22	0,038	Puderzucker (handelsübüch)

Eine Untersuchung der in Tabelle 4 angegebenen Daten zeigt, daß ein Glycerinfilmdicke um 0,13 mm die höchste Wärmeaustauschgeschwindigkeit liefert, wenn feinzerteilte Kieselsäure als pulveriges Material verwendet wird. Weiterhin wird ein maximaler Wärmeaustausch erhalten mit einer Glycerinfilmdicke von 0,038 mm und einem Zuckerüberzug einer Teilchengröße im Bereich von 0,221 bis 0,107 mm.

Es wurde eine weitere Testreihe durchgeführt, die die weitere Verbesserung des Wärmeaustausches durch Verwendung einer pulverartigen Schicht auf der Grundschicht des dünnen Isolierfilmes klar zeigt. Bei diesen Tests wurde ein dünner Überzug aus Glycerin auf einen 5,1 cm langen KupferzyHnder mit 4,13 cm Durchmesser gesprüht, worauf ein Überschuß an pulverisiertem Zucker zugegeben wurde. Die mit dem Zuckerüberzug erzielte Wärmeaustauschgeschwindigkeit war durchschnittlich 16mal größer als die mit einem nicht überzogenen Behälter erzielbare Geschwindigkeit. Zum Abkühlen eines nicht überzogenen Zylinders in flüssigem Stickstoff von 25 auf —196° C wurden 350 Sekunden benötigt, während derselbe Zylinder mit einem Glycerin-Zucker-Überzug in 22 Sekunden abkühlte. F i g. 4 zeigt die Wärmeaustauschgeschwindigkeiten, die mit solchen Überzügen erzielt werden, als eine Funktion der Temperatur der Probe. Fig. 5 zeigt die Verbesserung des Wärmeaustausches bei verschiedenen Probetemperaturen. Die Verbesserung des Wärmeaustausches kann bis zum 35fachen betragen, bei einer Probetemperatur von -IOO⁰C Bei dieser Temperatur ist die Wärmeaustauschgeschwindigkeit einer nicht überzogenen Probe sehr gering, d. h. etwa 544 g-cal/Std. · cm². Aus F i g. 4 und 5 geht hervor, daß überlegene Einfriergeschwindigkeiten mit Glycerin-Zucker-Überzügen erzielt werden können.

Es wurden Versuche durchgeführt zur Bestimmung, ob die Wärmeaustauscheigenschaften der Glycerin-Zuckerpulver-Überzüge reproduzierbar sind, und es wurde eine optimale Überzugskombination für das

erfindungsgemäße Bluteinfrierverfahren ermittelt. Dies umfaßt die Untersuchung der folgenden Variablen:

1. Dicke des Glycerin-Zuckerpulver-Überzuges,

2. Gewicht des Glycerin-Zuckerpulver-Überzuges,

3. Siebgröße des für den Überzug verwendeten Zuckerpulvers,

4. Altern des Glycerin-Zuckerpulver-Überzuges.

F i g. 6 zeigt die zum Abkühlen des obengenannten Kupferzylinders von 25 auf —196 ⁰C erforderliche Zeit als Funktion der vier obigen Variablen. Die vier Kurven haben lange Strecken, bei denen die Kühlzeiten konstant sind, wodurch angenommen werden kann, daß die Wärmeaustauscheigenschaften der Überzüge in den flachen Bereichen der Kurven leicht reproduzierbar sind. Beim Einfrieren des Blutes ist die Wärmeaustauschgeschwindigkeit bis hinunter zu etwa —50° C von größerer Wichtigkeit als die gesamte Wärmeaustauschgeschwindigkeit. Fig. 7 zeigt die Wärmeaustauschgeschwindigkeiten im Bereich von 0 bis —75 ⁰C als Funktion der gleichen genannten vier Variablen. Wieder haben die Kurven einen verhältnismäßig langen flachen Abschnitt oder sind flach, was zeigt, daß die Wärmeaustauschgeschwindigkeiten über verhältnismäßig weite Bereiche der Überzugsbedingungen reproduzierbar sind.

Die Wärmeaustauschgeschwindigkeit oberhalb —50° C beim Auftauen des gefrorenen Blutes ist ebenfalls wichtig, weil eine Beschädigung der roten Blutkörperchen in diesem Temperaturbereich beim Auftauen ebenso wie beim Einfrieren auftreten kann. Fig. 8 zeigt die Wärmeaustauschgeschwindigkeiten der überzogenen Zylinder während des Erwärmens in einem gleichmäßigen Wasserstrom als Funktion der vier Variablen. Eine Untersuchung von F i g. 8 zeigt, daß die Wärmeaustauschgeschwindigkeiten im Temperaturbereich von —75 bis 0°C durch diese Variablen nicht beeinflußt werden. Dies ist sehr wünschenswert zur Reproduzierbarkeit des Auftauens des Blutes.

Die Überzugsmaterialien sind nicht giftig, billig und leicht erhältlich. Der Überzug stört das Sammeln oder die Transfusion des Blutes nicht, wenn der Behälter nach der Blutzugabe überzogen wird. Der Glycerin-Zucker-Überzug löst sich während des Auftauens leicht in Wasser und stört daher nicht das Verabreichen des Blutes an einen Patienten.

Kühlmittel

Das erfindungsgemäß verwendbare Kühlmittel muß selbstverständlich kalt genug sein, um die biologische Substanz einzufrieren. Im Fall von Blut heißt das, daß das Kühlmittel eine Temperatur unterhalb etwa —120° C haben muß, um eine angemessene Rückgewinnung der roten Blutkörperchen zu gewährleisten.

Flüssiger Stickstoff ist ein bevorzugtes Kühlmittel, da er die Vorteile hat, verhältnismäßig inert, sicher handhabbar und relativ billig zu sein. Er besitzt weiterhin einen außerordentlich niedrigen Siedepunkt, nämlich —196°C bei atmosphärischem Druck. Der verwendete flüssige Stickstoff kann z. B. durch bekannte Verfahren aus der Luft gewonnen werden. Es können jedoch auch flüssige Edelgase, wie Helium, Neon, Argon und Krypton, verwendet werden.

Flüssiger Stickstoffund die anderen niedrigsiedenden Kühlmittel sind gesättigte fließbare Materialien bei atmosphärischem Druck und sieden heftig, wenn ein warmer Gegenstand, wie z. B. der Lagerbehälter für

Blut, darin eingetaucht wird. Der Wärmeaustausch hängt, wie erwähnt, von der Temperaturdifferenz Δ T zwischen dem fließbaren Material und dem warmen Gegenstand ab. Bei sehr hohen Werten von Δ T wird um den warmen Behälter ein Dampffilm gebildet, was einen sehr geringen Wärmeaustausch mit sich bringt. Dieser Dampffilm wird immer unstabiler, je mehr der Wert von Δ T verringert wird, und der Wärmeaustausch wird besser. Bei einem Wert von Δ T von etwa 3°C (für flüssigen Stickstoff) wird ein maximaler Wärmeaustausch erzielt, der nachläßt, wenn Δ T auf 0 verringert wird. Im Hinblick auf das Δ -T-Wärmeaustauschgeschwindigkeitsdiagramm könnte es scheinen, daß eine viel zu geringe Wärmeaustauschgeschwindigkeit erzielt würde, wenn der Lagerbehälter für das Blut plötzlich bei 25 ⁰C in flüssigen Stickstoff von —196 ⁰C eingetaucht wird. Die Verwendung der obengenannten Überzüge auf den Außenwänden des Behälters ermöglicht es jedoch, daß die mit dem flüssigen Stickstoff in Berührung stehende Oberfläche sehr schnell abgekühlt wird und liefert einen Δ -Γ-Wert näher bei 3 °C.

Um einen Behälter mit gefrorenem Blut aufzutauen, ist es nötig, ihn nochmals so schnell wie möglich durch den kritischen Temperaturbereich von —50°C bis zum Schmelzpunkt hindurchzuführen. Leider gibt es eine weitere Erschwerung, daß nämlich Blut schnell und irreversibel bei Temperaturen über 50⁰C zerstört wird. Die Temperatur des zum Auftauen verwendeten fließbaren Materials sollte daher nicht wesentlich über diesem Wert liegen. Als Auftaumedium wird Wasser bevorzugt, es können jedoch auch andere Auftauverfahren, wie z. B. mittels Radiowellen, angewendet werden.

Der genaue Grund für die Beschädigung der Zellen im kritischen Temperaturbereich ist nicht bekannt, er kann jedoch entweder (1) in der fortgesetzten Vergrößerung der Eiskristalle und/oder (2) in der Erhöhung der Elektrolyt- oder Salzkonzentration, wenn Wasser aus der Lösung herausgefroren wird, Hegen. Es soüte daher nicht notwendig sein, die zur Entfernung der Schmelzwärme für das gesamte Blut erforderliche Zeit in Betracht zu ziehen, sondern nur den letzten Teil derselben. Es wurden Versuche gemacht, um die Zeit, die das Blut in einem Temperaturbereich von —10 bis —50 ⁰C gehalten wurde, mit der Rückgewinnung der roten Blutkörperchen in Relation zu bringen. Dies erfolgte, indem ein Thermoelement in das Zentrum der Blutmasse bei Versuchen eingeführt wurde, in welchen der Behälter sowohl während des Einfrierens wie auch während des Auftauens geschüttelt wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß es mit 0,3 Mol/1 Lactose (10,7%) als Schutzzusatz notwendig ist, das Blut sowohl während des Einfrierens als auch während des Auftauens in weniger als 15 Sekunden durch diese Temperaturzone zu führen, um eine Rückgewinnung von roten Blutkörperchen von 85 % oder mehr zu erzielen. Wird diese Zeit auf 10 Sekunden oder weniger verringert, so ist eine 90%ige Rückgewinnung möglich. Mit einem Schutzzusatz von 5% Glucose und 7,5% Lactose soUte eine Gesamtzeit von weniger als ^Sekunden eine 85%ige Rückgewinnung und eine Gesamtzeit von 25 Sekunden eine 90%ige Rückgewinnung der roten Blutkörperchen ergeben.

Zum In-Berührung-bringen der Wärmeaustauschenden fließbaren MateriaUen mit den Wänden des Blutlagerbehälters kann irgendein Verfahren angewendet werden, obgleich in den obengenannten Tests die

Berührung einfach durch Eintauchen des Behälters in ein fließbares Bad erfolgte. Ein anderes Verfahren besteht in einem fließbaren zirkuHerenden System, in welchen das Kühlmittel und/oder die Auftauflüssigkeit über die Behälterwände geleitet oder getrieben wird, wobei ein möglicher Vorteil die größere Geschwindigkeit des Wärmeaustausches als beim Eintauchsystem ist. Weiterhin können die wärmeaustauschenden fließbaren MateriaHen an die Behälteroberflächen gesprüht werden, und Versuche mit flüssigem Stickstoff haben gezeigt, daß dies gegenüber dem einfachen Eintauchen beträchtliche Vorteile bezüghch des Wärmeaustausches mit sich bringt. Dies liegt möglicherweise an der abkratzenden Wirkung des Spray, die die Bildung eines kontinuierlichen Dampffilmes verhindert.

Behälter

Es wurde gefunden, daß wesentlich verbesserte Prozentzahlen der Rückgewinnung an roten Blutkörperchen unter bestimmten Bedingungen erzielbar sind, wenn der Blutlagerbehälter während des Einfrierens und Auftauens geschüttelt wird. Dies liegt vermutHch daran, daß die Wirksamkeit des Wärmeaustausches durch das ZirkuHeren des schmelzenden oder einfrierenden Blutes im Vergleich zu einem stationären Behälter, bei dem die Wärme von und zum mittleren Teil des gelagerten Blutes durch das umgebende, mit den Behälterwänden in Berührung stehende Blut geführt werden muß, verbessert wird.

Die Gründe hierfür sind am besten verständlich, wenn man den Einfrier- und Auftauvorgang untersucht. Sobald der kalte Behälter mit warmem Wasser in Berührung kommt, bildet sich unmittelbar an der Behälterwand eine Schicht aufgetauten Blutes. Diese Schicht besitzt ein Drittel der thermischen Leitfähigkeit des Eises und eine viel geringere Leitfähigkeit als die Behälterwand, so daß sie sofort den Wärmeaustausch von der Behälterwand verlangsamt. Durch Schütteln der flüssigen Schicht wird ein besserer Wärmeaustausch zwischen derselben und der vereisten Oberfläche des restlichen gefrorenen Blutes erzielt. Wird der Behälter daher während des Auftauens geschüttelt, so besteht eine relative Bewegung zwischen der Flüssigkeit und dem Eis, die den Wärmeaustausch durch den flüssigen Film verbessert. Versuche haben gezeigt, daß beim Schütteln des Behälters während des Auftauens keine wesentlichen Vorteile erzielt werden, wenn die Blutmasse eine Dicke von 6 mm oder weniger besitzt; Hegt diese Größenordnung jedoch bei 10 mm oder höher, so bewirkt ein Schütteln während des Auftauens einen entscheidenden Vorteil. Versuche haben weiter gezeigt, daß bei einer Dicke der Blutmasse von 17 mm oder mehr ein Schütteln während des Einfrierens bessere Ergebnisse Hefert. So kann z. B. ein Schütteln eines 17-mm-Behälters während des Einfrierens eine Verbesserung der Rückgewinnung an roten Blutkörperchen von 1 oder 2% Hefern. Bei einem 33-mm-Behälter kann diese Verbesserung in der Größenordnung von 20 bis 25 % Hegen.

Es wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, die deutlich die Verbesserung durch derartiges Schütteln während des Auftauens zeigen. Hierfür wurde ein Glycerin-Zucker-Überzug auf dem Behälter aufgebracht, und das Blut enthielt 0,3 Mol/1 Lactose als Schutzzusatz. Das Blut wurde in einem Lagerbehälter durch Eintauchen in ein Bad aus flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend durch Ein-

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tauchen in ein Wasserbad der angegebenen Temperatur aufgetaut. Der Behälter wurde mechanisch geschüttelt, und die in Tabelle 5 angegebene Amplitude gibt den Abstand zwischen dem maximalen

Ausschlag in einer Richtung zum maximalen Ausschlag in der anderen Richtung an. Die Schüttelfrequenz wurde konstant auf 188 Schwingungen/min gehalten.

Tabelle 5

Zeit, die das im Zentrum angebrachte Thermoelement in der Temperaturzone von —10 bis —50° C verbracht hat

Temperatur	Amplitude	Während des	Während des	Gesamtzeit	% Rückgewinnung
des Auftaubades,	Einfrierens	Auftauens	der roten Blut
°C	cm	Sekunden	Sekunden	Sekunden	körperchen
45	0	4	> 30	>34	61
45	3,2	4	21	25	61
45	6,4	4	15,5	19,5	79
45	10,2	4	15,0	19,0	83
55	0	4	20,4	24,4	66
55	3,2	4	21,2	25,2	84
55	6,4	4	13,0	17,0	86,5
55	10,2	4	6,4	10,4	90,5

Tabelle 5 zeigt die Verbesserung der Rückgewin- rechteckiger Form aufgebracht wurden. In allen

nung der roten Blutkörperchen auf Grund des Schüt- Fällen war das Kühlmittel flüssiger Stickstoff, der

telns des Behälters während des Auftauens. In ähn- 25 Schutzzusatz 0,3 Mol/1 Lactose, die Temperatur des

licher Weise werden höhere Rückgewinnungszahlen Auftaubades 45 °C und die Schüttelfrequenz 180

an roten Blutkörperchen durch Schütteln während Schwingungen pro Minute. In diesen Tests wurden

des Einfrierens erzielt. Dies geht deutlich aus einer verschiedene Dicken der Blutmasse verwendet (vgl.

anderen Testreihe hervor, in welcher verschiedene Tabelle 6).

Überzüge auf Blutlagerbehälter von zylindrischer und 30

Tabelle 6

Behälter form	Kühlbedingungen Überzug | Verfahren	Amplitude cm	Zeit Sekunden	Erwärmungsbedingungen Verfahren !Amplitude! Zeit cm Sekunden	% Rückgewinnung der roten Blutkörperchen Dicke der Blutmasse in mm 6 j 14 1 17 ι 33
zylindrisch (Wanddicke 0,9 mm)	kein	Eintauchen			Ein tauchen			83	47
desgl.	Polyvinyl pyrrolidon, Methanol	desgl.			desgl.			89	70
desgl.	Zucker- Glycerin	desgl.			desgl.			81,5	81,5	81
desgl.	desgl.	desgl.			Schütteln	6,4	45		88*)	93
desgl.	desgl.	desgl.			desgl.	10,2	45		92*)	93	72,5
desgl.	desgl.	Schütteln	10,2	60	desgl.	10,2	45				89,0
desgl.	desgl.	desgl.	10,2	45	desgl.	6,4	30		92
rechteckig (Wanddicke 1 mm)	desgl.	Eintauchen		_	desgl.	6,4	45		14	19 59	33
desgl.	Kieselsäure- Glycerin	Schütteln	6,4	30	desgl.	6,4	30		84	83
desgl.	Zucker- Glycerin	desgl.	10,2	45	desgl.	6,4	45			89
desgl.	desgl.	desgl.	10,2	45	desgl.	10,2	45			87,5
desgl.	Kieselsäure- Glycerin	desgl.	10,2	45	desgl.	10,2	60				89

*) Es wurde 30 Sekunden lang geschüttelt.

Eine weitere Versuchsreihe zeigte die Wirkung des Verhältnisses von Blutvolumen zu Behältervolumen. In diesen Tests wurde ein Glycerin-Zucker-Überzug auf einen 35-ccm-Behälter aufgebracht und die Blutproben mit 0,15 Mol/1 Lactose als Schutzzusatz

hineingegeben. Das Einfriermedium war flüssiger StickstofFbei —196°C, und das Auftaumedium war Wasser von 45° C. Die Schüttelamplitude betrug 10,2 cm für 30 Sekunden. Die Ergebnisse dieser Teste sind wie folgt:

Tabelle 7

Behältermaterial	Volumen der Blutprobe ecm	% Behälter kapazität	Einfrierzeit Sekunden	% Rückgewinnung der roten Blutkörperchen
Aluminium	15	43	52	82,5	86
30	86	54	75,5	76,5
Magnesium	15	43	48	82	80
30	86	49	82	72
Rostfreier Stahl	15	43	71	80	78
26	74	69	75,5	70

Aus den Daten von Tabelle 7 geht hervor, daß, wenn die Probe zu viel des verfügbaren Volumens einnimmt, das Maß an innerer Durchwirbelung bei jedem Schütteln verringert wird, was zu einem geringen Prozentsatz an Rückgewinnung der roten Blutkörperchen führt. Dem entgegen stehen jedoch Überlegungen bezüglich des Raumes (der Größe) und der Tragbarkeit, und es wird ein Volumen der Blutmischung, das etwa 60% der Behälterkapazität einnimmt, als optimaler Ausgleich zwischen zwei extremen Durchführungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung angesehen.

Im Hinblick auf das Material, aus welchem der Blutlagerbehälter besteht, wurde gefunden, daß geeignete Materialien einen K/L-Wert von mindestens 0,3375 aufweisen müssen, wobei K = thermische Leitfähigkeit des Materials in g-cal/Std. · cm² •⁰C ist und L = Wanddicke des Behälters in Zentimeter ist. Ist der Ä/L-Wert geringer als 0,3375, so kann die Wärme durch die vorzugsweise nicht überzogenen Behälterwände während des Auftauens nicht mit genügender Geschwindigkeit eingeführt werden, um wesentliche Schäden der roten Blutkörperchen zu vermeiden. Zu den Materialien, die sich zur Herstellung der Behälter als zweckmäßig erwiesen haben, gehören z.B. Aluminium, Magnesium und rostfreier Stahl. Eine erneute Untersuchung der Daten von Tabelle 7 zeigt, daß aus jedem dieser Materialien 35-ccm-Behälter hergestellt wurden und daß bei identischen Tests nur wenig Unterschiede in ihrem Verhalten bestanden.

Es wurden auch verschiedene Behälterformen getestet und als erfindungsgemäß zweckmäßig gefunden. Es gibt hauptsächlich zwei übliche Formen: eine flache und eine zylindrische oder eine Kombination der beiden Formen. An sich ist die zyHndrische Form wirksamer als die flache, da sie für eine gegebene Dicke der Blutmasse zweimal das Verhältnis von Fläche zu Volumen liefert, das die flache Form aufweist. Vom praktischen Standpunkt bietet jedoch die flache Form gewisse Vorteile. Sie kann z. B. für das gleiche Volumen in kleineren physikalischen Maßen gebaut werden als die zylindrische Form. Weiterhin ist sie vermutlich in der Herstellung billiger. So ist z.B. ein flacher, rechteckiger Behälter gemäß Fig. 9 mit Einlaß- und Auslaßleitungen 50 und 51 besonders geeignet, da er von den verschiedenen Formen, die möglich sind, mit dem höchsten Stapelfaktor (geringster Zwischenraum) gelagert werden kann. Dies führt zu einem wirtschaftlichen Stapelsystem, und eine solche Formgebung erfordert nur billige Herstellungskosten. Die Brauchbarkeit des in Fig. 9 gezeigten Behälters ist eine Funktion der Dickendimension C Ein erfindungsgemäß brauchbarer Behälter muß bis zu 500 ecm Blut sowie den Schutzzusatz aufnehmen können. Wird angenommen, daß der Schutzzusatz 10% des Blutvolumens benötigt und wird 10% freier Raum zur möglichen Ausdehnung des Eises während des Einfrierens vorgesehen, dann muß die Gesamtkapazität 600 bis 650 ecm betragen. Selbstverständlich ist es zweckmäßig, den Behälter so klein wie möglich zu machen, was bedeutet, daß die Dickendimension C so groß wie mögüch sein muß unter Berücksichtigung annehmbarer Rückgewinnungswerte für rote Blutkörperchen.

Erfolgt das Einfrieren durch einfaches Eintauchen in flüssigen Stickstoff unter Verwendung von Glycerin-Zucker-Überzügen und das Auftauen durch Eintauchen in warmes Wasser, so braucht die Dicke C vermutlich nicht größer als etwa 6 mm zu sein. Dies kommt daher, weil mit der größeren Dicke der innere Widerstand gegen den Wärmeaustausch zu groß wird für ein genügend schnelles Abkühlen und Erwärmen. Ein solcher Wert für die Dicke C führt zu einer Größenordnung der Breite A und der Höhe B von etwa 40 cm. Es wird jedoch bevorzugt, wie bereits erwähnt, den Behälter sowohl während des Einfrierens als auch während des Auftauens zu schütteln. Unter diesen Umständen ist C zweckmäßigerweise größer als 10 mm. Weiter wird bevorzugt, daß nur 60 % der Behälterkapazität durch die das Blut enthaltende Mischung ausgefüllt werden, was eine Behälterkapazität von etwa 900 ecm erfordert.
Es wurde gefunden, daß befriedigende Rückgewinnungswerte der roten Blutkörperchen mit einem rechteckigen Behälter mit einer Dicke C von 19 mm erzielt werden. Es ist jedoch auch möglich, rechteckige Behälter mit noch größeren Dicken zu verwenden.

Auch der in Fig. 10 gezeigte zylindrische Behälter eignet sich zur erfindungsgemäßen Blutlagerung. Für das bevorzugte Verfahren, bei welchem der Behälter während des Einfrierens und Auftauens geschüttelt wird, soll der Behälterdurchmesser C größer als 10 mm und kleiner als 33 mm sein. Es wäre eine Gesamtkapazität von 900 ecm erforderlich.

Weitere praktische Behälterformen werden in Fig. 11 und 12 gezeigt. Dieser Behälter besteht aus

Claims (3)

einem halbzylindrischen Schalenkörper 52, der an beiden Enden durch Platten 53 und 54 verschlossen ist. Die Platten sind mit einer Vielzahl einheitlich angebrachter Öffnungen 55 versehen, und jede Öffnung ist um die gleiche Längsachse wie die entsprechende Öffnung in der entgegengesetzten Platte angebracht. Die entsprechenden Öffnungen sind mittels einer Leitung 56, die an jedem Ende an die Plattenwände geschweißt ist, wodurch diese Öffnungen entstehen, miteinander verbunden. Die Leitungen 56 führen durch die gesamte Länge des Körpers 52 und bilden Durchfiußwege für den Fluß der Gefrier- und Auftauflüssigkeiten, wie dies in Fig. 12 gezeigt wird. Die Blutmischung wird eingeführt und entleert durch Einlaß- und Auslaßöffnungen 50 und 51, die über die obere Platte hinausführen. Die Wärmeaustauschflüssigkeit kann z. B. kontinuierlich durch den Durchflußweg 56 zirkuliert oder der Behälter kann in ein Kühlbad eingetaucht werden, um das sogenannte »Thermalsyphon«-Phänomen auszunutzen. Dies tritt ein, wenn ein Rohr vertikal in eine siedende Flüssigkeit eingetaucht wird. So wie die Flüssigkeit in den Boden des Rohres eintritt, wird sie teilweise durch die warmen Wände des Rohres verdampft. Der Dampf expandiert in die Flüssigkeit und übt eine »kolbenartige« Bewegung auf die Flüssigkeit aus, wodurch sie mit hoher Geschwindigkeit ins Rohr hinaufgedrängt wird. Das gesamte erfindungsgemäße Verfahren und seine Vorteile werden in Tabelle 8 veranschaulicht, die die Daten einer Reihe von Tests mit verschiedenen erfindungsgemäßen Merkmalen angibt. Dicke derBlutmassein mmSchutzzusatz1)Verdünnung2)ÜberzugKühlbediiAmplitudecmlgungen3)ZeitSekundenWassertemperatur0CErwärmungsbedingungen3)Ampli- 1 Zeittude ! Seem j künden0U Rückgewinnungder rotenBlutkörperchen 0,3 Mol/1 Lactose 0,3 Mol/1 Lactose 7% Polyvinylpyrrolidon 0,3 Mol/1 Lactose

1. Zylindrische Form (0,9 mm dicke Aluminiumwand)

4:5 — 0 ! — 45 10,2

4:5 — 6,4 I — 45 10,2

2. Flache Form (0,9 mm dicke Aluminiumwand)

1:2

PVP*)
Methanol

j 1 bis Min.

45

30
45

1 bis 2
Min.

(1 mm dicke Aluminiumwand)

4:5 Kiesel- 6,4 45 45 säure- Glycerin

6,4

30

3. Kombination aus flacher und zylindrischer Form (0,9 mm dicke Aluminiumwand) 12,5% Glucose

94
89

94

93

4 bis 5

1:2 PVP*) 45 0 I 1 bis 2 92 Methanol 0 j — I Min.

Ο Schutzzusatz = die Molarität bezieht sich auf die verdünnte Blutlösung.

²) Verdünnung = Volumen des Blutes: Gesamtvolumen des fertigen Präparates.

³) Kühl- und Erwärmungsbedingungen = die angegebenen Zeiten sind die Gesamtzeiten, die die Probe den Kühl- oder Erwärmungsbedingungen unterworfen war. Die Angaben geben keine Auskunft über das Zeitintervall zum Durchgang durch einen gegebenen Temperaturbereich.

*) PVP = Polyvinylpyrrolidon.

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Verbesserung des Wärmeaustausches beim raschen Abkühlen zum Konservieren biologischer Substanzen, wie Blut, Knochenmark oder Zellsuspensionen, bei dem von der äußeren Oberfläche des die betreffende Substanz enthaltenden Behälters schnell Wärme abgezogen wird, indem der Behälter mit flüssigem Stickstoff oder einem flüssigen Edelgas in Berührung gebracht wird und dieser Wärmeentzug fortgesetzt wird, bis die biologische Substanz eingefroren ist, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Behälter verwendet, der auf der äußeren Oberfläche einen dünnen wärmeisolierenden Überzug aus Glycerin, Polyvinylpyrrolidon, Vaseline, Öl oder Siliconöl besitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Behälter verwendet wird, dessen wärmeisolierender Überzug auf der äußeren Oberfläche mit einer Schicht aus pulverisiertem oder körnigem Zucker, Gips, Kieselsäure oder kieselsäurehaltigem Material versehen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter während des Einfrierens geschüttelt wird.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Neumann, »Grundriß der Gefriertrocknung«, '55, S. 104 bis 106 und 208.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

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