DE1225342B - Verfahren zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansaeure aus Gaerloesungen - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

C12d

Deutsche Kl.: 3Oh-6

Nummer: 1225 342

Aktenzeichen: M 53620IV a/30 h

Anmeldetag: 19. Juli 1962

Auslegetag: 22. September 1966

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren reiner 6-Aminopenicillansäure in hoher Ausbeute aus unreinen wäßrigen Lösungen, wie Penicillin-Gärlösungen.
. 6-Aminopenicillansäure

H₂N-

CH
CO-

CH

N-

CH₈
CH-COOH

wird durch Vergärung von Penicillin erzeugenden Mikroorganisamen ohne Zusatz eines Vorläufers oder durch mikrobielle Hydrolyse von Benzylpenicillin erzeugt. Nach der Isolierung und Reinigung aus der Gärlösung oder der Lösung des mikrobiellen Hydrolysate kann die 6-Aminopenicillansäure mit Acylierungsmitteln zur Herstellung neuer oder bekannter Penicilline umgesetzt werden, die sich zur Behandlung bakterieller Infektionen eignen. So wird beispielsweise so 6-Aminopenicillansäure mit Phenylacetylchlorid zu Benzylpenicillin umgesetzt.

.·' Es ist bekannt, daß 6-Aminopenicillansäure sich aus Gärungslösungen durch Adsorption an einem in der Wasserstoffionenform vorliegenden Styrol-Divinylbenzol-SuIf onsäure - Kationenaustauschharz und Eluieren bei einem pH-Wert von 7,0 gewinnen läßt (vgl. Journal of the American Chemical Society, 1960, S. 3790 bis 3791).

■ Es wurde nun gefunden, daß die Gewinnung der 6-Aminopenicillansäure bedeutend erleichtert werden kann, wenn man das Adsorbat an einem derartigen Kationenaustauschharz mit einer alkalischen wäßrigen Lösung bei pH-Werten im Bereich von 8 bis 9 eluiert, da hierbei ein sehr scharfer Eluatschnitt, der die 6-Aminopenicillansäure enthält, erhalten wird, so daß die an dem Harz adsorbierte Säure durch ein verhältnismäßig kleines Volumen an Elationsflüssigkeit eluiert werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Gärlösungen durch Adsorption der 6-Aminopenicillansäure an einem in Teilchenform vorliegenden Styrol-Divinylbenzol-Sulfonsäure-Kationenaustauschharz, Eluieren des Adsorbates mit einer wäßrigen Lösung und Gewinnen der 6-Aminopenicillansäure aus dem Eluat ist dadurch gekennzeichnet, daß das Kationenaustauschharz mit einer wäßrigen alkalischen Lösung bei einem pH-Wert von 8 bis 9 eluiert wird.

Aus der deutschen Auslegeschrift 1 075 799 und der belgischen Patenschrift 569 728 ist ein Verfahren zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure bekannt, Verfahren zur Gewinnung von
6-Aminopenicillansäure aus Gärlösungen

Anmelder:

Merck & Co., Incorporated,

Rahway,N.J. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr.-Ing. W. Abitz und Dr. D. Morf,

Patentanwälte, München 27, Pienzenauer Str. 28

Als Erfinder benannt:

John William Rothrock, North Plainfield, N. J.;
Theodore August Jacob, Westfield, N. J.;
Irving Putter, Martinsville, N. J. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 3. August 1961 (128 981)

welches darin besteht, daß die Gärungsflüssigkeit des Schimmelpilzes, in der die 6-Aminopenicillansäure enthalten ist, konzentriert und dann mit einem Ionenaustauschharz behandelt, das Eluat des Harzes konzentriert und die 6-Aminopenicillansäure daraus durch Zusatz einer Säure kristallin ausgefällt wird. Bei diesem bekannten Verfahren wird die Gewinnung der 6-Aminopenicillansäure aus der Gärlösung vorzugsweise durch Adsorption an einem hochbasischen Anionenaustauschharz und Eluieren mit verdünnter Salzsäure gewonnen. Abgesehen davon, daß dieses bekannte Verfahren eine größere Anzahl von Verfahrensstufen des Konzentrierens, Ausfällens von Niederschlägen, Abzentrufigierens und Extrahierens mit organischen Lösungsmitteln erfordert, bevor die 6-Aminopenicillansäure durch Adsorption an dem Ionenaustauschharz gewonnen werden kann, werden bei dem bekannten Verfahren auch um etwa 33% niedrigere Ausbeuten an 6-Aminopenicillansäure, bezogen auf die ursprünglich eingesetzte Gärlösung, erhalten als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Ein stark basisches Anionenaustauschharz wird auch gemäß der französischen Patentschrift 1 256 281 zur Gewinnung der 6-Aminopenicillansäure aus Gärlösungen verwendet.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Adsorption durchgeführt, indem die unreine wäßrige

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Lösung der 6-Aminopenicillansäure bei einem pH-Wert Anionenaustauschharze, vorzugsweise vom quater-

von etwa 1 bis 4 mit einem teilchenförmigen Styrol- nären Ammoniumtyp. Besonders geeignet für diesen

Divinylbenzol-Sulfonsäure-Kationenaustauschharz be- Zweck ist ein unter dem Handelsnamen »Dowex-lX-2«

handelt wird. Die Adsorption kann durch Perkolieren erhältliches Anionenaustauschharz, bei dem der

der wäßrigen Lösung durch eine Säule des Kationen- 5 quaternäre Stickstoff durch einen polymeren Benzylrest

austauschharzes oder durch chargenweise Adsorption, und drei Methylgruppen substituiert ist. Andere

d. h. Suspendieren des Harzes in der wäßrigen 6-Amino- Harze dieses Typs sind unter dem Handelsnamen

penicillansäurelösung für eine Zeitspanne von höchstens »Amberlite IRA-400« erhältlich,

etwa 30 Minuten und Abfiltrieren des Harzadsorbates ■· . .

von der erschöpften wäßrigen Lösung, durchgeführt io Beispiel!

werden. Zu 241 einer wäßrigen 0,lmolaren Natrium-

Die Elutionsstufe wird durchgeführt, indem das phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5

Harzadsorbat mit einer schwach alkalischen wäßrigen werden 200 g Kaliumbenzylpenicillin und 2500 g

Lösung behandelt wird, wodurch die 6-Amino- Proteus-retgerii-Zellen zugesetzt; die aus einer vege-

penicillansäure von dem Harz verhältnismäßig frei 15 tativen Kultur des Organismus erhalten wurden. Das

von Verunreinigungen eluiert wird. Der pH-Wert Gemisch wird 4 Stunden bei 37 ⁰C inkubiert, worauf

der Elutionslösung ,soll zwischen 8 und 9 liegen. Unter- die Zellen abzentrifugiert werden. ...',.

' halb des pH-Wertes von 8 wird die 6-Aminopenicillan- Der pH-Wert des Filtrates wird mit Salzsäure

säure zu langsam eluiert, und Lösungen mit einem auf pH 2,5 eingestellt und das angesäuerte Filtrat

höheren pH-Wert als 9 bewirken eine Zersetzung 20 mit 81 »Dowex-50X-4«-Harz in der Wasserstoff-!

der 6-Aminopenicillansäure. ionenform 30 Minuten gerührt. Dann wird das Harz

Die 6-Aminopenicillansäure kann aus der Eluat- mit der adsorbierten 6-Aminopenicillansäure ab-

lösung nach zwei Methoden gewonnen werden. Die filtriert und mit Wasser gewaschen,

erste dieser Methoden umfaßt die Adsorption der Die Säure wird aus dem Adsorbat durch lOminutiges

Eluatlösung an ein Anionenaustauschharz vom qua- 25 Aufschlämmen in wäßriger Natronlauge bei pH 8,0

ternären Ammoniumtyp zur Entfernung eines größeren und 5° C eluiert Das Harz wird von dem Eluat

Teiles der verbleibenden Verunreinigungen. Diese abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat

Adsorption wird mit dem Harz in der Salzform, und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und der

vorzugsweise als Chlorid, und unter Einstellung des Gefriertrocknung unterworfen, wobei man 105 g

pH-Wertes des Eluates auf etwa 7 durchgeführt. 30 teilweise gereinigte 6-Aminopenicillansäure erhält.

Nach der Adsorption wird das Harzadsorbat mit Die teilweise gereinigte 6-Aminopenicillansäure,

verdünnten sauren Lösungen eluiert. Das Eluat dieser wird in Wasser gelöst und der pH-Wert der wäßrigen

zweiten Harzadsorption wird im Vakuum eingeengt Lösung mittels Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Die

und die 6-Aminopenicillansäure aus dem eingeengten erhaltene dunkelgrüne Lösung wird durch Filtrieren

Eluat durch Einstellen des pH-Wertes der Lösung 35 durch Aktivkohle teilweise entfärbt. Das 708 mi

auf etwa 4,3 auskristallisiert. Dies ist die bevorzugte ausmachende Filtrat wird auf 5° C abgekühlt und mit

Methode zur Gewinnung, wenn die ursprüngliche konzentrierter Salzsäure auf pH 4,3 angesäuert. Die

6-Aminopenicillansäurelösung eine filtrierte Penicillin- 6-Aminopenicillansäure kristallisiert aus der Lösung

gärlösung ist. aus. Die Kristalle werden von der Lösung abfUtriert,

Die zweite Methode der Gewinnung der 6-Amino- 40 mit Eiswasser und Aceton gewaschen und im Vakuum

penicillansäure aus dem Kathionenaustauschharz- getrocknet. Die getrockneten Kristalle der praktisch

eluatist bei Lösungen des durch mikrobielle Hydrolyse reinen 6-Aminopenicillansäure wiegen 51,7 g. Zusätz-

gepufferter Penicillinlösungen hergestellten Produktes liehe Mengen des Materials werden dann aus der

anwendbar.^: In diesem Falle wird das Eluat des Mutterlauge kristallisiert.

Kationenaustauschharzes eingeengt und der pH-Wert 45 Die oben beschriebene Isolierung kann auch unter

auf 4,3 eingestellt, worauf praktisch reine 6-Amino- Verwendung der Harze Dowex-50 X-2, Dowex-50X-8

penicillansäure aus den Lösungen auskristallisiert. oder Amberlite IR-120 als Adsorbens durchgeführt

Als Kationenaustauschharz wird ein saures Sulfon- werden. Im allgemeinen haben die Dowex-Harze mit

säureharz verwendet, das durch Kernsulf onierung von verhältnismäßig niedrigem Vernetzungsgrad ein

Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisatkörnern erhal- 50 höheres Adsorptionsvermögen für 6-Aminopenicillan-

ten wird. Eine bekannte Gruppe derartiger Harze säure.

ist unter dem Handelsnamen »Dowex-50« erhältlich. Beisoiel 2
Diese Harze werden aus Styrol-Divinylbenzol-Misch-

polymerisaten hergestellt, die verschiedene Ver- Zwei Chargen Penicillin-Gärlösung werden hernetzungsgrade je nach dem bei der Herstellung des 55 gestellt, indem die Fermentation mit einem ausHarzes verwendeten Verhältnis von Divinylbenzol zu gewählten Stamm von Pemcillium chrysogenum Styrol besitzen können. Ein Harz mit »4% Vernetzung« ohne Zugabe eines zusätzlichen Penicillinvorläufers, ist ein aus Körnern, die aus 4% Divinylbenzolein- wie beispielsweise Phenylessigsäure, durchgeführt heiten und etwa 96 % Styroleinheiten bestehen, wird. Das Mycel wird aus der Gärlösung abfütriert, hergestelltes Harz. Die »Dowex-50«-Harze haben 60 und die Filtrate werden vereinigt, wobei man 9271 »X«-Nummern hinter dem Namen zur Angabe des filtrierte Gärlösung mit einem durch biologische Vernetzungsgrades. So ist »Dowex-50X-4« aus einem Prüfung ermittelten 6-Amino-penicillansäuregehalt von Mischpolymerisat hergestellt, das 4% Divinylbenzol etwa 520μ/πύ erhält. Die Prüfung wurde durch Umenthält. Andere Harze dieses Typs sind unter dem Setzung einer Probe mit Phenylacetylchlorid und Be-Handelsnamen »Amberlite IR-120« erhältlich. 65 Stimmung des nach der von N. G. Heatley in

Die zur weiteren Reinigung der in den Penicillin- Biochem. J., 1944, Bd. 38, S. 61, beschriebenen

Gärlösungen enthaltenen 6-Aminopenicillansäure ver- Methode gefundenen Penicillins unter Verwendung

wendeten Anionenaustauschharze sind stark basische von B. Subtilis als Testorganismus durchgeführt.

Die ursprüngliche Probe wird ebenfalls auf Penicillin, ohne Phenylacetylchloridbehandlung, geprüft. Die Differenz zwischen den biologischen Bestimmungen erwies sich als zuverlässige Bestimmung der vorhandenen 6-Aminopenicillansäure. Zu diesem Filtrat werden 1901 Dowex-50X-4-Harz in der Wasserstoffionenform zugesetzt. Der pH-Wert der filtrierten Gärlösung wird auf 2,1 eingestellt und auf diesem Wert gehalten, während das Gemisch aus Harz und Gärlösung 20 Minuten bei 5°C gerührt wird. Das Harz wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die 6-Aminopenicillansäure wird von dem Harz eluiert, indem das Harz in Wasser suspendiert und der pH-Wert mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak auf 8,5 eingestellt wird. Die Suspension wird 15 Minuten bei 5°C gerührt und zur Entfernung des eluierten Harzes filtriert.

Das die eluierte 6-Aminopenicillansäure enthaltende Filtrat wird auf pH 7 neutralisiert und durch eine Säule perkoliert, die 191 Amberlite IRA-401-Harz in ao Chloridform enthält. Das Harz mit der adsorbierten 6-Aminopenicillansäure wird mit Wasser gewaschen und mit O,05n-Salzsäure eluiert, und die Eluatfraktionen, die 90 g 6-Aminopenicillansäure enthalten, werden vereinigt und im Vakuum auf 1190 ml eingeengt. Das Konzentrat wird zur Entfernung unlöslicher Verunreinigungen filtriert. Das Filtrat wird auf 8°C abgekühlt und mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,3 angesäuert. 65 g kristalline 6-Aminopenicillansäure scheiden sich aus der Lösung ab und werden abfiltriert, gewaschen und getrocknet.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Gärlösungen durch Adsorbieren der 6-Aminopenicillansäure an einem in Teilchenform vorliegenden Styrol-Divinylbenzol-Sulfonsäure-Kationenaustauschharz, Eluieren des Adsorbates mit einer wäßrigen Lösung und Gewinnen der 6-Aminopenicillansäure aus dem Eluat, dadurch gekennzeichnet, daß das Kationenaustauschharz mit einer wäßrigen alkalischen Lösung bei einem pH-Wert von 8 bis 9 eluiert wird.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 075 799;
   französische Patentschrift Nr. 1256 281;
   belgische Patentschrift Nr. 569 728.

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